JPH05508659A - 新規ヌクレオシドアナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規ヌクレオシドアナログ 発明の分野 本発明は、新規オリゴヌクレオシドアナログ、その成分およびその製剤および使 用の方法に関する。そのようなヌクレオシドアナログは、治療用、診断用および 研究用の試薬を含む広い有用性がある。

発明の背景 様々な目的のために、ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびある種のオリゴヌク レオチドを修飾することが知られている。前記の核酸の分子種の糖部分に結きす る基への修飾は、そのような既知の修飾の中に含まれる。したがって、核酸中に 実在するホスホジエステル結合を変化させて特に細胞による取り込みを改善した 、構造が改善されたことが認識できるものを提供することが知られている。ホス ホチオエート、置換したホスホン酸エステルおよび他の物を含む、多数のそのよ うな修飾が知られている。そのようなアナログに到達するための一般的な合成計 画には、重合体キャリアーへ、または五優または三価の酸化状態のリン原子を含 む配列特異的な３“−ヌクレオチドのいづれかへ結合させたヌクレオシドまたは そのヌクレオチドの５゛−水酸基を含むことになった。特別な結合の手順は、リ ン酸トリエステル、リン酸ジエステル、亜リン酸トリエステル、およびホスホン 酸エステル水素のリン酸化の手順と呼ばれている。貯蔵を可能にし、結合の工程 の際の非特異的な反応を防ぐために、市販されているモノマーおよびポリマーの キャリアに結合したモノマーを、保護したリン原子とともに、保護の原理（Ｇ、 Ａ、Ｃ，Ｔ、Ｕおよび他の複素環）を用いるそのような方法のために用いること ができる。５′−水酸基の電子性を増強するための触媒は必要ではないが、利用 できる。

非イオン性のホスホン酸メチルおよびイオン性のホスホロチオエステルの合成は 同じように知られており、両オリゴヌクレオチドアナログの種類は遺伝子の調節 薬として現在注目を集めている。糖の間を結合する基を修飾するそのような前記 の試みから、治療論などにおいていくつかの約束が明らかになったが、各々が本 質的な欠点がある。例えば、ホスホン酸メチルのジエステル結合のような結合を 用いて、キラリティーを系に導入する。そのようなキラルな物質は形態が異なる と、一般に異なる速度で細胞に吸収されるので、そのような物質の異なる形態は 、最適以下の達成度になると思われている。

天然に存在するホスホジエステルの形態を含む他の物質は、細胞の吸収を妨げる と信じられるイオン化の状態を示す、実質的に非イオン性の物質は細胞によって より迅速に吸収されて、治療などにおいてより効果的であろうと思われる。

オリゴヌクレオチドのホスホン酸メチルおよびホスホロチオエステルの修飾の両 方によって、ヌクレアーゼ耐性の性質が与えられ、オリゴマーの細胞の輸送をあ る程度増強し、そして標的の核酸の配列へのオリゴマーのハイブリダイゼーショ ンの活きを強化すると信じられている。しかし、効果的な治療論、診療論、およ び研究の手段として利用できるようにするには、これらの質をさらに大きく改善 する必要がある。したがって、改善されたオリゴヌクレオチドアナログ、対応す る成分のヌクレオシド、および実質的にキラルでなく同時に非イオン性のヌクレ オチドアナログの製剤のために有用な組成物が長い間必要とされている。そのよ うな物質が本発明に従って提供されて、優れた細胞の取り込みの質、ヌクレアー ゼ耐性および標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの改善をもたらすと思われ る。

発明の目的 本発明の目的は、炭素鎖のエーテル官能基のような炭素のような官能基で７クレ オシドの標準的な糖部分に結合する基を置換したヌクレオシドアナログを提供す ることである。

本発明の別の目的は、オリゴヌクレオシドその他の合成に使用するための改善さ れたヌクレオシドアナログの製剤方法と提供することである。

本発明のさらなる別の目的は、治療、診断および研究のための組成物および方法 と提供することである。

さらなる別の目的は、標準的なシクロフラノースの代わりのシクロペンタン誘導 体を含めた新しい一連のヌクレオシドアナログを提供することである。

さらなる目的は、治療、診断、および試案で使用する自動化工程を介してオリゴ ヌクレオチドへ合成できる新規で有用なヌクレオシドアナログの一団を提供する ことである。

さらなる別の目的は、実質的にキラルではなく、同時に非イオン性であるヌクレ オシドアナログおよびそのき成のためのヌクレオシド前躯体を提供することであ る。

さらなる別の目的は、細胞の取り込みの改善、ヌクレアーゼ感受性の低下、およ び標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの改善を可能にするオリゴヌクレオチ ドアナログを提供することである。

本発明のこれらの目的およびその他は、本明細書および添付の請求の範囲の吟味 から当業者には明らかになるだろう。

図の筒車な説明 図ＩＡからＩＤでは、好ましいヌクレオシドアナログを自動合成するための好ま しい工程を説明する。

図２には、図ＩＡからＩＤの過程から得られた結合と示す。

発明の概要 本発明は、炭素およびエーテル結合したオリゴヌクレオシドおよびその炭素環式 誘導体の供給を対象とする。オリゴヌクレオシドおよびヌクレオチド中の標準的 なホスホジエステル結合を２−５および３−炭素／エーテル結合で改変すること によって、多くの情況での作用の能力が改善されたヌクレオシドおよびヌクレオ チドの誘導体を作成しやすいことが明らかになった。特に、本発明で開示される ようにアナログから調製されたオリゴヌクレオチドは、細胞への優れた取り込み があることが証明されるだろうと信じられている。さらには、そのようなアナロ グはヌクレアーゼの効果に対して耐性であると信じられて、ＲＮＡとのハイブリ ダイゼーションの改善につながりやすい、さらに、本発明に従ったアナログはよ り簡単に合成できる傾向にあり、ヌクレオシドおよびヌクレオチドで使用するた めの現在既知の骨格であり、特にリン酸エステルおよび置換したホスホン酸エス テル骨格である。

本発明の物質はとても容易に自動合成できて、広範なヌクレオシドおよびヌクレ オチドと本発明に従って処方できる０本発明の実施に従ったＲ、が２または３炭 素骨格から成る基である、式−〇−Ｒ，−０−を含む基に結合した少なくとも２ つの糖または環アナログ部分から成るオリゴヌクレオシドアナログを提供する。

核酸会式に関連して使用できる任意の糖を本発明で使用できる。さらに、炭素環 部分、特にシクロペンタン類も用いることができる。複素環式塩基、特に窒素を 含む複素環も本明細書のある種の態様に従い、有用性を見い出すことができる。

糖または糖アナログのための結合基を含む２つまたは３つの炭素の骨格基に広く 官能基を導入できる０例えば、その基はエチル、エチレン、アセチレン、シクロ プロピル、シクロブチル、エチレンオキシド、エチルアジリジンおよび置換した アジリンであってよい、プロピル、イソプロピル、メチル−シクロプロピル、Ｃ ３からＣ１の炭素環式の、および四、五および六員環の窒素を含む複素環式の部 分を含む他の環状構造も使用できる。２つまたは３つの炭素の結合部分および環 状構造を、製剤の溶解性および細胞の透過のようなオリゴヌクレオチドの性質を 増強できるアミノ基、水酸基、カルボン酸、および他の基で広範に置換できる。

前記のオリゴヌクレオシドを処方するときに使用できる組成物も、本発明に従っ て提供される。一般に、これらは以下のような構造をもつ：式中、Ｐは酸素また は炭素であり、 Ｒ５は２つまたは３つの炭素骨格を含む基であり、Ｔは選択的に除去できる水酸 基の保護基であり、Ｒ２は脱離基であり、 Ｒ８は不特定のヌクレオシドの塩基または塩基アナログであり、そしてＲｏはＨ 、ハロゲンまたは、好ましくはＯＨである。

好ましい野様に従い、Ｔ基は酸に不安定で、そしてＲ２基は、環構造の３゛炭素 が類似の部分の請求核基によって攻撃されるときに、３．２型置換反応を起こし やすい、他の好ましい！！！様に従って、Ｒ３を１つ以上のイオン化できる官能 基、特にアミノ基、水酸基、およびカルボン酸エステルの官能基で置換できる。

その部分が希望の配列の末端にあるところでは、Ｔは、ポリアミンまたはポリエ チレングリコールのような任意の都合の良い末端の官能基である。

固体の支持体に除去できるように結合させたヌクレオシドアナログであり、しか も次の構造中でＲ４は２つまたは３つの炭素の骨格を含む基であり、そしてＴは 選択的に除去できる水酸基の保護基である、構造−〇−Ｒ，−０−Ｔを含む４′ 夏換基をもつヌクレオシドアナログを提供する段階から成る、本発明に従ったオ リゴヌクレオシドアナログを調製するための方法も提供する。さらにその過程は 、水酸基の保護基の除去および、以下の構造をもつ合成物と、保護基をはずした 水酸基との反応から成る： 式中、Ｐは酸素または炭素であり、 Ｒ１は２つまたは３つの炭素骨格を含む基であり、Ｔは選択的に除去できる水酸 基の保護基であり、Ｒ２は脱離基であり；および Ｂ、は不特定のヌクレオシドの塩基または塩基アナログであり、そしてＲ１はＨ 、ハロゲンまたは、好ましくはＯＨである。

再び繰り返すと、好ましい態様に従って、Ｔ基は酸に不安定で、そしてＲ２基は 、環構造の３°炭素が類似の部分の４′位の核基によって攻撃されるときに、５ Ｎ−２型置換反応を起こしやすい、他の好ましい態様に従って、Ｒ２を１つ以上 のイオン化できる官能基、特にアミノ基、水酸基、およびカルボン酸塩の官能基 で置換できる。その部分が希望の配列の末端にあるところでは、Ｔはポリアミン またはポリエチレングリコールのような任意の都合の良い末端基である請求核置 換反応の前に、適当な塩基をもつ構成物を反応させることによって、保護基をは ずした水酸基の核性を改善することが好ましい。

任意の合理的に希望した長さおよび同一性のオリゴヌクレオチドアナログを提供 するために、固相合成として当業者に知られた方法で、前記の過程を順番に、繰 り返し使用することが好ましい。

前記の考慮に従って、動物が１つ以上の疾病または異常な状態にある、動物のＲ ＮＡ、好ましくはメツセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズさせるために 設計した塩基単位Ｂ、などをもつオリゴヌクレオチドを調製できる。したがって 、オリゴヌクレオチドのメツセンジャーＲＮＡとの「アンチセンス」ハイブリダ イゼーションを、そのＲＮＡの不活性化およびそれをコードするタンノ（りの変 調をおこすために起こすことができる。この関係を、診断の目的のために活用す ることもできる。さらに、核酸の研究のための試薬を設計するために、特異的な ハイブリダイゼーションを使用することができる。

発明の詳細な説明 通常のヌクレオシドおよびヌクレオチドのホスホジエステル構造は、以下に示す ようなものである： 天然に見い出されるこの電荷をもった、プロキラルな構造を、アンチセンス治療 、診断および試薬のために設計するオリゴヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシ ドアナログの合成のために使用できる。しかし、この天然の構造式を使用すると 、一般にそのような目的のために特別に有用なオリゴヌクレオチド分子種は作成 できない。したがって、ホスホジエステル基の電荷をもった性質のために、細胞 内の空間へのオリゴヌクレオチドの侵入が困難になる。ホスホジエステル結合の 構造において硫黄での修飾を使用するような、上で論議したようなこの構造の修 飾によって、含まれる電荷を調節するが、得られる修飾した構造にキラリティー を導入することになる。このキラリティーは、標的細胞への得られたオリゴヌク レオチドの侵入に間して不利に作用すると考えられる。同時に、これらの分子種 の各々は動物細胞中に償在するヌクレアーゼによる加水分解を受けやすい、さら に、これらのヌクレオチド中の結合基の硫黄による修飾は、ＲＮＡとのこれらの 物質のハイブリダイゼーションを妨害すると思われている０期待される結果は効 力の低下である。

本発明に従って、以下の一般的な骨格構造をもつ化合物が提供される。

好ましいエーテル結合になるような、各々の糖（または糖アナログ）部分に結合 させた炭素骨格、好ましくは２つまたは３つの炭素原子をもつ炭素骨格によって 置換して、そのような分子中のへテロ原子であるリンを除去する。この構造は天 然のホスホジエステル結合に実在する立体関係にとてもよく似ていることが、モ デルの研究で明らかになった。したがって、そのような修飾を施して調製したオ リゴヌクレオチドの、メツセンジャーＲＮＡとのハイブリダイゼーションでは良 い結果が期待できる。さらに、炭素骨格は実質的に非イオン性であり、同時にマ ラルではないので、これらの修飾ｊ７た分子種の細胞内の空間への侵入が改善さ れると期待できる。同時に、これらの改善によって、ハイブリダイゼーションの 効率は低下しないだろうから、この改善は、このタイプの結合基を用いた薬剤、 診断法、および研究用試薬の効力の改善につながりそうだと期待される６５′炭 素原子がｉｆｆ換されていることが注目されるであろう、それの代わりに、炭素 骨格の断片に結合した４″の酸素官能基が存在し、これは順に２番目の糖または 糖アナログ部分の３゛位へ結きする。この配列は、得られたヌクレオチドのハイ ブリダイゼーションの特色を妨害せず、これによって本明細書の以後に開示する ように簡単な合成技術を使用できるようになることが明らかになった。

１番目の糖または環アナログと２番目のそれとの間の結合を作るための典型的な 合成手順は以下のようである： 本明細書を通して、Ｂ１、Ｂ２および８８種は核酸中に見い出せる天然のまたは 合成した塩基を指す。これらは、アデニン、チミン、および他の天然に存在する 塩基部分、および現在知られているまたは今後発見されるかもしれないようなそ のような塩基化き物の様々な簡単なまたは複雑な修飾物を含むだろう。本明細書 中に記述した合成手順は間中、そのような塩基の部分が発明の糖または糖アナロ グ上に存在することが好ましいのだが、そのような存在は厳守されなければなら ないものではなくて、糖または環アナログの間の結きを作った後に塩基または塩 基アナログを加えることができる。

同様に、本発明に従った糖または環アナログに関するヒドロキシル化のパターン は、たとえあるとしても５当業者が考慮して設計する余地を残している。標的に したＲＮＡとのハイブリダイゼーションを最適にするために、水酸基が２゛位（ Ｒ）＝ＯＨ）に存在することが一般的に好ましい、他の官能基、特にフッ素を使 用してよい。

前記の手順中で、結きさせた４゛の核性の置換基であるｒｏ−Ｒ，をもつ最初の 糖または環アナログは、２番目の糖または糖アナログ部分からの脱離基を置換す る性質を示す、脱岬基は請求核剤としてはたら＜　ｒｏ−ＲＪ官能基との５ｌｌ −２反応に加わる９本発明の実施において、好ましいエポキシ基を含めた広範な 核基を使用できる。細胞の取り込みを増強するポリアミンオリゴヌクレオチドと 標題のついた、１９９０年７月２４日に出願された特許出願事５５８，６６３号 中で示されるように、他の好ましい態様において、オリゴヌクレオシドの性質を 増強するために、４゛−デスメチル末端（標準的なオリゴヌクレオチドの５′− 末端）を、ポリアミン類またはポリエチレングリコール類で置換することができ る。なお上記の特許出願の内容はこの言及によって本明細書中に含まれるものと する。

本発明に従い、自動合成手順を容易にする計画が、特に面相合成計画が好ましい 。多くの方法論を用いることができるのだが、１つの好ましい方法論を以下に説 明する。ヌクレオシドアナログを、任意の都合の良い方法で固体の支持体に結合 させる。３′の位置で、ポリマーのキャリアのような固体の支持体へ結合させる ためのリンカ−を使用することが通例であり、そして好ましい。これを図ＩＡ中 に示す。任意の塩基または塩基アナログである肌および、Ｐが酸素であるペント フラノシル部分またはＰが炭素であるシクロペンタン官能基のいずれかを用いて その部分を調製する。２′に水酸基が存在することが好ましく（Ｒ３＝ＯＨ）、 得られたオリゴヌクレオシドはＲＮＡとのハイブリダイゼーションで優れた性質 を示すだろう。図ＩＡに示すように、その部分は５′に炭素をもたないことが好 まＬいが、４゛位で置換されていることがむしろ好ましい。したがって、示すよ うに、４′の位置が水酸基が適当な保護基またはブロッキング基Ｔによってふさ がれているしドロキシエーテルで置換される。Ｒ２基は、場合によっては環構造 の置換されて、与えられた部分であってもよく、さもなければ広範に修飾されて もよい、２つまたは３つの炭素の骨格鎖を含む、好ましい２゛の水酸基は、当業 者によく知られた方法によって必要に応じて保護できる。この官能基およびその 保護基に対して唯一要求されることは、本発明に従った本質的な反応を妨げない ようにそれを設計することである。

４゛位のしドロキシエーテル官能基の第一級水酸基を保護するために多くの基を 使用できる。したがって、Ｔ基は、選択的に除去できることができてしかも本明 細書に示す反応手順に矛盾しない、任意のブロッキング基または保護基と含んで よい。比較的温和な条件下で、そのようなブロッキング基は酸に不安定であるこ とが好ましい。したがって他のものと同様に、テトラヒドロピラニルＪｅｒｔ− ブチル、ビス（Ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル（ＤＭＴ＞も使用してよ い。ｔ−ｅ　ｒ　ｔ〜ブチル基き使用することが好ましい。水酸基から保護基が はずれるような酸性条件下で、保護基Ｔを除去する。保護基をはずした水酸基を 次に、第一級水酸基を艮い核剤へ変えるのに適当な特色をもつ塩基で処理するの が好ましい、水素化ナトリウム、グリニヤール試薬、特に塩化メチルマグネシウ ム、塩化ｔ−ブチルマグネシウム、リチウムジイソプロピルアミド、メチルリチ ウム、ｎ−ブチルリチウムおよびＤＢＵを含めた広範なそのような塩基も使用で きる。

一般に無水条件が必要である。

この反応は任意の適当な溶媒、好ましくはアセトニトリル、テトラヒドロフラン またはジオキサンのような非プロトン性の溶媒中で起きる。そのような処理によ って、図４Ｂに示す、固体の支持体へさらに結合させる分子種ができる。図４０ に示すように、この活性分子種を次にモノマー単位と反応させる。再び、希望す るように七ツマ一単位はペントフラノシル部分またはシクロペンチル部分のいず れかであってよい、任意の塩基、修飾した塩基または塩基アナログも選択できる ということを理解した上で、塩基丈たは塩基アナログ単位を再び記号Ｂ、で表現 する。再び、２°の水酸基が好ましい。２つまたは３つの炭素の骨格を含む基を 含む、４′の保護されたヒドロキシエーテルを提供する。

この官能基は前の段階で選択したものと同じであってもよく、また異なってもよ く、そして１つのオリゴヌクレオチドにおいて、実に多くの変法を用いることが できる。しかし説明の目的で、図１では同じ基Ｒ３を用いて示した。さらなる官 能基を３°の位置でそのようなモノマー中に提供する。したがってα−３°の脱 離基、Ｒ２を提供する。示すようにこの脱離基を核剤との５ｌｌ−２反応に関与 させることができる０図ＩＢの核剤を図ＩＣのモノマーへ接触させることで、モ ノマーの３゛位での核置換反応が起きる。２つの糖または環アナログの結合がで きるように、これを図ＩＤに示す。この結合は、たとえあるとしても追加した官 能基のある２つまたは３つの炭素の単位Ｒ１を含むジエーテルから成る。

当業者によって認識されるであろうように、任意の合理的に希望する長さのオリ ゴヌクレオチドを作り上げるために、この手順を順番に繰り返すことができる。

様々な数の塩基Ｂ、、２°の炭素原子での様々な水酸基の置換基、および様々な 結合のための官能基Ｒ０を取り込めるように多くの七ツマ−の分子種を鎖の中へ 挿入できる。そのうえ、酸素環および炭素環の温き物を希望に応じて使用してよ い。したがって、この反応計画は実に一般性があり、モノマー中の置換基の完全 な導入のために適当でありそうだろうと評価すべきだ。

オリゴマーの伸長反応を任意の都合の良い所で終結させることができて、支持体 から従来の方法でオリゴマーととりはずせる。この合成計画の結果を図２に示す 。２つの糖または糖アナログ分子種が結合基で結合するオリゴヌクレオシドの断 片を示す。それは、そこへ結合した塩基単位Ｂ８をもつことが好ましいので、そ れはオリゴヌクレオチドアナログであるように見えるかもしれない０本発明の使 用に好ましい脱離基Ｒ２は、３′の炭素でＳ。−２Ｍ換反応ができる任意の脱離 基から成る。そのような脱離基の中でも好ましいのは、トリフルオロメチルスル ホニル基（トリフレート基）、メチルスルホニル基（メシル基）、ハロゲン類、 ０−トリクロロアセチミデート、アシルオキシ基、および２．４．６−１−リク ロロフェニル基であるのだが、最初の２つの基が最も好ましい。

当業者にとって認識もされるであろうように、様々な補助的な段階も、本発明の 推進のために加えることができる。したがって、これらの過程の効率および収量 を最大にするためＣ１洗浄、中和およびその他の反応または工程を用いてよい。

そのうえ、各ヌクレオシドのサブユニットの付加が実質的に完全に進むことが保 証されるように、各段階を数回行うことができる０本発明に従って、核酸分子種 の糖および糖アナログ間の、２つまたは３つの炭素の骨格を含む結合基を提供す るために、多くの他の反応計画と使用できる０本発明のある態様に関連して、ア ミド、スルフィドなどを含めたエーテル官能基以外の官能基も使用できることが 同様に理解できる。

本発明に従ってヌクレオシドから作成したオリゴヌクレオチドアナログを、治療 において、診断藁として、および研究のために使用できる。米国特許証について の一部係続出願として、本発明の指定代理人に選定され、表題をつけられたオリ ゴヌクレオチドの相互作用を通してＲＮＡ活性の調節が改善できる多くの手段が 開示されている：　１／１１／９０出願、ＲＮＡ活性を調節するための組成物お よび方法、第４６３，３５８号；　１２／４／８９出願、パピローマウィルスの アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤、第４４５，１９６号；　２／２６／９ ０出顧、ヘルペスウィルスの効果５：調節するためのオリゴヌクレオチド療法、 第４８５゜２９７号；３／２１／９０出願、ＲＮＡの類似を用いた遺伝子発現を 調節するための試薬と方法、第４９７，０９０号；　４／３０／９０出願、脂質 代謝のオリゴヌクレオチドによる調節、第５１６，９６９号；　５／１１／９０ 出願、ヒト免疫不全ウィルスのアンチセンス阻害剤、第５２１，９０７号；　７ ／２７／９０出願、遺伝子発現の調節のための、ヌクレアーゼ耐性のピリミジン を修飾したオリゴヌクレオチド、第　号；　７／２７／９０出願、細胞の取り込 みを増強させるためのポリアミンオリゴヌクレオチド、５５８，６６３号；およ び５／４／９０出願、ＲＮＡの二次構造を妨害することによる遺伝子発現の調節 、第５１８．９２９号０本明細書に開示された各々の構造の修飾および各々の過 程を、本発明の組成物および方法と関連させて使用することができて、全てのそ のような使用および組み合わせは本明細書中に記述されている。よって、前記の 米国特許出願の内容はこの言及によって本明細書中に含まれるものとする。同様 に、本明細書に示す修飾を、前記の特許出願の発明に関連して使用できる。

本発明に従って、本明細書中では一般にＲ１で示す広範な基を本明細書中のリン カ−として使用できる。そのような種は一般に２つまたは３つの炭素の骨格単位 から成る。本発明のある態様に従って、リンカ−Ｒ１としての使用に好ましい物 の中にはエチル基、エチレン、アセチレン、シクロプロピル基、シクロブチル基 、エチレンオキシ基、エチルアジリジン、および置換したエチルアジリジンがあ る。有用な他の部分は、プロピル基、イソプロピル基、メチル−シクロプロピル 基、Ｃ３からＣ６の炭素環式部分、および四、五、六員環の窒素を含む複素環式 部分を含む０本発明で使用される「２つまたは３つの炭素の骨格」という用語は 、１つの糖または糖アナログの４゛の位置につながる原子と、２番目の糖または 糖アナログの３°位に結きするリンカ−につながる原子の間に２つまたは３つの 炭素原子をもつ鎖があるということを意味する。全てのあいまいさを除くために 、シクロプロピル官能基は、１つの炭素単位も存在するが、２つの炭素の鎖であ る骨格が存在するので、この基準に合致するということを理解してもらいたい、 １゜２位をつなぐシクロヘキシル官能基は、４つの炭素単位が末端をつなぐが、 ２つの炭素鎖も存在す之ので、同様にこの基準に合致するだろう。

製剤の溶解性および細胞への透過のようなオリゴヌクレオチドの性質分増強する であろうアミン基、水酸基、カルボン酸、およびその他の基で、２つまたは３つ の炭素の結合部分および環状構造を広範に置換できる。

本発明に従って結合を形成できる多くの置換基、複素環、およびその他の種の全 てを完全に評価することはまだできない、前記の全ての考慮を満たす限りは、全 てのそのような官能基もここに含めることができることが理解されるであろう。

実施例 今度は本発明を実施例で説明する１本発明は、例示した資料によってではなくて 、添えた請求の範囲によってのみ限定されると考えるべきであることを理解され るであろう。

実施例１−　炭素環式４°−デスメチルリボ−または−２′−デオキシ−ヌクレ オシド Ａ、ＣＰＧに結合した炭素環式デスメチル−リボ−または一２′−デオキシ−ヌ クレオシド ３−　（Ｎ６−ベンゾイルアデニル）−５−トリフェニルメトキシ−１，２−シ クロペンテンを提供するために、トロスト（Ｔｒｏｓｔ）らの方法に従ってシク ロペンタンエポキサイドおよびアデニンを結合させて得られる３−（アゾン−９ −イル）−５−ヒドロキシ−１，２−シクロペンテンを、標準的な手順に従って 連続的にシリル化、ベンゾイル化、およびトリチル化する。シス−ヒドロキシル 化および選択的なｔ−ブチルジメチルシリル化によって２’−ｏ−ｔ−ブチル− ジメチルシリル誘導体を提供する。Ｔ、アトキンソン（Ｔ、Ａｔｋｉｎｓｏｎ＞ およびＭ、スミス（Ｍ、Ｓｍ１ｔｈ）の標準的な手順（オリゴヌクレオチドの合 成。

実用的な方法、（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＡＰ ｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、）Ｍ、Ｊ、ガイド（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ） 絹、ＩＲＬ出版（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、ワシントン、Ｄ、Ｃ，，１９８５年。

４９ページ）に従って、この炭素環式ヌクレオシドの遊離の３゛−水酸基をコン トロール−ガラスボアシリカゲル（ＣＰＧ）へ結合させる。４°−０−トリメチ ル保護基を除去するために、ＣＰＧに結合した炭素環式アデニンを酸で処理して 、４’−ｏ−ｔ−ブトキシエチル誘導体を提供するために、得られた水酸基を後 に臭化ｔ−ブトキシエタンおよび塩基と反応させる。最終生産物である、４′− デスメチル−４’−ｏ−ｔ−ブトキシエチル−２°−ｔ−ブチルジメチルシリル −３’−ＣＰＧ−Ｎ６−ベンゾイルアデニンをカラム中に入れて、ＡＢ　ｌ−３ ８０Ｂ自動ＤＮＡシンセサイザーまたは７５００ミリゲン／バイオサーチＤＮＡ シンセサイザーへ取り付ける。フッ化テトラブチルアンモニウム、チオカルボニ ルイミダゾール、および水素化トリブチルスズを用いてポリマーを連続的に処理 することによって、ＣＰＧに結合した４′−デスメチルリボヌクレオシドをその ２′−デオキシ型へ変換することができる。これらの手順は、他の天然に存在す る塩基または核酸の塩基アナログの、ＣＰＧに結合した炭素環式４′−デスメチ ル誘導体の調製のために適当である。

Ｂ、炭素環式デスメチル−リボ−モノマー　−一第１手順３−　（Ｎ６−ベンゾ イルアデニル）−５−トリフェニルメトキシル−１，２−シクロペンテンを提供 するために、トロスト（Ｔｒｏｓｔ）らの方法に従ってシクロペンタンエポキサ イドおよびアデニンを結合させて得られる３−（アゾン−９−イル）−５−ヒド ロキシ−１，２−シクロペンテンと、標準的な手順に従つて連続的にシリル「ヒ 、ベンゾイル化、およびトリチル化する。シス−ヒドロキシル化および選択的な ｔ−ブチルジメチルシリル化によって２”−ｏ−ｔ−ブチル−ジメチルシリル誘 導体を提供する。　ｆ＆に水でＳ、２置換するトリクロロアセチミデートを提供 するために、この化合物を無水アセトニトリル中でトリクロロ−アセトニトリル および水素化ナトリウムを用いて処理する。トリクロロアセチミデートの調製お よび反応性は記述されている。生じたβ−３′−水酸基を、トリクロロアセトニ トリル／水素化ナトリウムの作用によってＳｓ　２反応のために、活性化する。

β−３゛−水酸基を、トリフルオロメタンスルホン酸無水物およびピリジンを用 いた処理によっても、Ｓ、２反応のために活性化することができる。

この手順によって、４′−デスメチル−４’−ｏ−ｔ−ブトキシエチル−２′− ｔ−ブチルジメチルシリル−Ｎ６−ベンゾイルアデニンの３°位にトリフレート 基を提供する。この手順は一般性があり、任意の炭素環式４゛−デスメチル−リ ボヌクレオシドの合成に応用できる。

Ｃ１炭素環式デスメチル−リボ−モノマー　−一第２手順炭素環式ヌクレオシド の抗生物質である（−）−ネブラノシンＡは発酵および全合成から得られて、そ の記載はＣ，Ｒ，ジョンソン（Ｃ，Ｒ，Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄ ｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２８巻、４１３１−４１３４ページ（１９８７年）中 にあり、（−）−ネプラノシンの塩基アナログの記載はＡ、に、ビガダイク（Ａ 、に、Ｂｉｇｇａｄｉｋｅ）ら＝Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ。

５ｏｃｉｅｔ　、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、４５８巻。

（１９９０年）中にあるのだが、そのＮ６−ベンゾイル誘導体としての（−）− ネプラノシンをボラン試薬を用いて還元し、次にそのイソプロピリジンとして保 護する。保護基のついていない５゛−水酸基を、酸素及び酸化プラチナを用いて 酸化して、後にテトラ酢酸鉛を用いて還元的に脱炭酸して、４′−デスメチル炭 素環式アデノシンを提供する。この酸化／還元は既知の手順によく従って行う。

α−３′−水酸基が保護されていない４゛−デスメチル炭素環式誘導体を提供す るために、４“−デスメチル炭素環式アデノシン２，３−イソプロピリジンを連 続的に臭化ｔ−ブトキシエタンおよびピリジン、温和な酸、およびピリジン中の 活性化したβ−３′−脱離基への変換はＢ項で記述する。

Ｄ、炭素環式デスメチル−２−デオキシリボーモノマー核酸塩基の天然のヌクレ オシド塩基またはアナログのシクロペンチル化した塩基を提供するために、４− ｐ−トシレート−１，２−シクロペンテンを適当に保護した塩基を用いて処理す る。後ろの面（β−面）でのヒドロキシル化によって、臭化ｔ−ブトキシエタン を用いて処理する、３．４−ジヒドロキシシクロペンチル基で保護した塩基を提 供し、異性体はクロマトグラフィーで分離する。４゛−デスメチル−４’−ｏ− ｔ−ブトキシエチル−３“−０−β−トリクロロアセチミジル−２“−デオキシ 炭素環式ヌクレオシドを提供するために、適当な異性体をトリクロロアセトニト リルおよびアセトニトリル中の水素化ナトリウムを用いて処理する。

実施例２４゛−デスメチルリボ−または−２°−デオキシ−ヌクレオシドの合成 Ａ、ＣＰＧに結きしたデスメチル−リボ−または２“−デオキシリボーヌクレオ シド　−一第１手順 ４゛−デスメチル−４°−カルボキシル化誘導体と提供するために、市販されて いるＣＰＧに結合したリボまたは２′−デオキシリボヌクレオシドを、酸素で飽 和させたアセトニトリルおよび酸化プラチナを用いて処理する。結合したヌクレ オシドを還元的に脱炭酸するために、ＣＰＧカラムをテトラ酢酸鉛で処理する。

ＣＰＧに結きした４゛−デスメチル−４’−ｏ−ｔ−ブトキシエチル−２゛−デ オキシ（または２゛−ｔ−ブチルジメチルシリル）ヌクレオシドを提供するため に、生成した４°−水酸基をピリジン中で臭化−ｔ−ブトキシエタンを用いてア ルキル化する。

Ｂ、ＣＰＧに結きしたデスメチル−リボ−または一２′−デオキシリボーヌクレ オシド　−−第第２原 原゛−水酸基を提供するために、２゛、３°−０−インプロビリジニル基または ３’−ｏ−ベンゾイル基のような標準的な手順によって複素環および２′。

３°−〇−位または３゛−ｏ−位を保護した市販のリボまたは２゛−デオキシリ ボヌクレオシドを酸素／酸化プラチナおよびＬＴＡを用いて連続的に酸化して、 還元的に脱炭酸した。臭化ｔ−ブトキシエタンおよびピリジンで処理することに よって、これらの保護したヌクレオシドを４′−デスメチル−４’−ｏ−ｔ−ブ トキシエチル誘導体へ変換する。３°−〇−ベンゾイル基または２′、３′−〇 −イソプロピリジン基の除去および標準的な手順に従ったコントロールガラスポ アシリカゲルへの後の固定によって、面相の自動核酸合成に適する、ＣＰＧに結 合したデスメチル−リボ−または一２′−デオキシリボーヌクレオシドを提供す る。

０．４′−デスメチルリボ−および２°−デオキシリボモノマー適当に塩基を保 護した市販の２′−デオキシフラノシルヌクレオシドおよびキシロフラノシルヌ クレオシドを５′−位で選択的にトリチル化して、次に糖の環をモノまたはジ− ベンゾイル化する。今度はトリチル保護を除去するためにヌクレオシドを酸で処 理する。酸素／Ｐ　ｔ　０２およびＬＴＡの連続的な作用によって、後に臭化ｔ −ブトキシエタンを用いてアルキル化する４′−デスメチルヌクレオシドを提供 する。ヌクレオシドの塩基の脱保護により４゛−デスメチル−２′−デオキシリ クンフラノシルヌクレオシドおよび４゛−デスメチルキシロヌクレオシドを提供 する。３′−上の水酸基を活性化させてＳ、Ｌ２反応を行うために、４゜−デス メチル−２゛−デオキシリクツヌクレオシドをトリクロロアセトニトリルおよび 水素化ナトリウムを用いて処理する。４“−デスメチルキシロヌクレオシドを２ ′−位で選択的にｔ−ブチルジメチルシリル化して、次に、３゛−上の水酸基を 活性化させてＳ、２反応を行うためにトリクロロアセトニトリルおよび水素化ナ トリウムを用いて処理する。そのヌクレオシドの３゛−上位にトリフレート脱離 基を導入したものも容易に調製できる。

実施例３　エチレングリコールを介して結合した炭素環式４゛−デスメチルリボ −または２°−デオキシ−オリゴヌクレオシドおよび４°−デスメチルリボ−ま たは−２′−デオキシ−オリゴヌクレオシドの合成３゛末端塩基になるであろう 、適当にＣＰＧに結合した４′−デスメチルヌクレオシド（リボまたは２′−デ オキシリボまたは炭素環式リボまたは２′−デオキシリボ）をアブライトバイオ システムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、）（ＡＢＩ） のカラム中に入れて、ＡＢＩ３８０Ｂ自動ＤＮＡ合成機に取り付ける。デスメチ ルヌクレオシド単位を伸長させる鎖に結きさせるのに必要なサイクルの自動化し た（コンピューター制■御の）段階は以下の通りである。

段階　試薬または溶媒混き物　時間（分／′秒）１、　ジクロロエタン　２：３ ０ ２、　ジクロロエタン中の３％ＤｃＡ　３　：　００３、　ジクロロエタン　１ ：３０ ４、　テトラヒドロフラン　１：３０ ５、Ｔ）（Ｆ中の３モル濃度の塩化メチルマグネシウム　１：００６、　テトラ ヒドロフラン　１．：００７、ＣＰＧに結きしたヌクレオシドの１０等量の４′ −デスメチル−４’−ｏ−ｔ−ブトキシエチル　２：００３゛−上トリクロロア セチミデートヌクレオシド８、７へ繰り返す　２：００ ９、　塩化上−ブチルジメチルシラン／ピリジン　２：００１０、　繰り返す一 １段階へ行く 合成の終了時の保護基の除去／精製の課程は以下の通りである：段階　試薬また は溶媒混会物　時間（分／秒）１、　ジクロロエタン中の３％ＤＣＡ　３　：　 ００２、　アセトニトリルでの洗浄　３：００３、ＴＨＦ中でのフッ化テトラブ チルアンモニウムの１モル濃度の溶液　５：００ ４、　アセトニトリル　２：００ ５、１５％水酸化アンモニウム／エタノール（１：１）。

５０℃　５：００ ６、　２７’過、１５９ｇＮＨ，ＯＨ／ＥｔＯＨを用いてＣＰＧ樹脂を洗浄 ７、３０％ＮＨ，ＯＨ，５０℃　２４時間８、　溶液を蒸発させて乾燥せよ り、ＨＰＬＣでの精製 実施例４　エチレングリコールを介して結合した炭素環式４°−デスメチルリボ −または〜２′−デオキシーヌクレオシドおよび４°−デスメチルリボ−または ＝２゛−デオキシーオリゴヌクレオシドのポリアミンおよびポリエチレングリコ ール誘導体の調製 き成の終了時に、末端をアルキルブロマイドにしたポリエチレングリコール顕（ ＰＥＧ、）　、または末端をアルキルブロマイドにした、フタロイル基およびト リフルオロアセチル基で保護したポリアルキルアミン票を塩基の存在下でＣＰＧ に結きしたオリゴヌクレオシドと反応させる。保護基の除去、精密検査、および 精製によって、エチレングリコール部分を介して結合した４′−ポリエチレング リコールまたは４”−ポリアミン顛ヌクレオシドおよび炭素環式ヌクレオシドを 提供する。

Ｆｉｇ、　２ 要約書 改良された細胞への取り込み、改良されたヌクレアーゼ耐性および標的ＲＮＡへ のよいハイブリダイゼーションを有するオリゴヌクレオチドアナログが提供さた は３つの炭素骨格値から成る結き官能基により結合する。好適な態様によれば、 に影響を与える。オリゴヌクレオチドアナログを自動合成するための方法も提供 される。

＋ｍｍｉ＊　字 平成５年上月ン名日

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．構造； ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中で、Ｐは酸素または炭素であり、 Ｒ１は２つまたは３つの炭素の骨格を含む基であり、Ｔは選択的に除去できる水 酸基の保護基であり、Ｒ２は脱離基であり、 Ｂｘはヌクレオシドの塩基または塩基アナログであり、そしてＲ３はＯＨ、ハロ ゲン、またはＨである，を有する組成物。
2. ２．Ｔが酸に不安定である請求項１に記載の組成物。
3. ３．Ｔがテトラヒドロビラニル基、ｔｅｒｔ−ブチル基およびビス−（ｐ−メト キシフェニル）フェニルメチル基から成る群から選択される請求項１に記載の組 成物。
4. ４．Ｒ２がトリフルオロメチルスルホニル（トリフレート）、メチルスルホニル （メスチル）、ハロゲン、ｏ−トリクロロアセチミデート、アシロキシおよび２ ，４，６−トリクロロフェニル基から成る群から選択される請求項１に記載の組 成物。
5. ５．Ｒ１が複素環を含む請求項１に記載の組成物。
6. ６．Ｒ１が複素環を含む請求項１に記載の組成物。
7. ７．Ｒ１がエチル、エチレン、アセチレン、シクロプロピル、シクロブチル、エ チレンオキシ、エチルアジリジン、および置換されたエチルアジリジンから成る 群から選択される請求項１に記載の組成物。
8. ８．Ｒ１がプロピル、イソプロピル、メチルシクロプロピル、Ｃ３からＣ６の炭 素環部分、および四、五、および六員環の窒素を含む複素環部分から成る群から 選択される請求項１に記載の組成物。
9. ９．Ｒ１がエチレンオキシ基である請求項１に記載の組成物。
10. １０．Ｒ３が水酸基である請求項１に記載の組成物。
11. １１．式中でＲ１が２つまたは３つの炭素の骨格から成る基である、式−Ｏ−Ｒ １−Ｏ−を含む基によって結合した、少なくとも２つの糖または糖アナログ部分 を含むオリゴヌクレオチドアナログ。
12. １２．Ｒ１が炭素環を含む請求項１１に記載のアナログ。
13. １３．Ｒ１が複素環を含む請求項１２に記載のアナログ。
14. １４．Ｒ１が、エチル、エチレン、アセチレン、シクロプロピル、シクロブチル 、エチレンオキシ、エチルアジリジン、および置換されたエチルアジリジンから 成る群から選択される請求項１１に記載のアナログ。
15. １５．Ｒ１が、プロピル、イソプロピル、メチル−シクロプロピル、Ｃ３からＣ ６の炭素環部分、および四、五、および六員環の窒素を含む複素環部分から成る 群から選択される請求項１１に記載のアナログ。
16. １６．前記の結合が、１つの糖または糖アナログ部分の４′と２番目の糖または 糖アナログ部分の３′との間に存在する請求項１１に記載のアナログ。
17. １７．工程 Ａ．固体の支持体へ除去できるように結合させた、かつ式中でＲ１が２つまたは ３つの炭素の骨格を含む基であり、かつＴが選択的に除去できる水酸基の保護基 である構造−Ｏ−Ｒ１−Ｏ−Ｔを含む４′置換基をもつヌクレオシドアナログを 提供すること； Ｂ．水酸基の保護基を除去すること；およびＣ．保護基をはずした酸基を、以下 の構造をもつ組成物と反応させること▲数式、化学式、表等があります▼ 式中で、Ｐは酸素または炭素であり、 Ｒ１は２つまたは３つの炭素の骨格を含む基であり、Ｔは選択的に除去できる水 酸基の保護基であり、Ｒ２は脱離基であり、かつ Ｂｘはヌクレオシド塩基または塩基アナログである；から成るオリゴヌクレオチ ドアナログの調製方法。 １７．工程Ｂ．およびＣ．を複数回繰り返すことをさらに含む請求項１６に記載 の方法。
18. １８．請求項１６の方法に従って調製したオリゴヌクレオチドアナログ。
19. １９．式中でＲ１が２つまたは３つの炭素の骨格から成る基である式−Ｏ−Ｒ１ −Ｏ−を含む基によって結合した少なくとも２つの糖または糖アナログを含むオ リゴヌクレオチドアナログにＲＮＡを接触させることから成る、ＲＮＡの活性の 調節方法。