JPH05509223A

JPH05509223A - エンドグルカナーゼ酵素を含んでなるセルラーゼ調製物

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Publication number: JPH05509223A
Application number: JP3509707A
Authority: JP
Inventors: ラスムッセン，グレテ; ミッケルセン，ヤン　メラー; シューレイン，マルティン; パトカル，シャムカント　アナント; ハーゲン、フレッド; ヨルト、カルステン　マイランド; ハルストプ、スベン
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1990-05-09
Filing date: 1991-05-08
Publication date: 1993-12-22
Anticipated expiration: 2015-11-20
Also published as: JP2001057894A; FI103985B; JP3110452B2; ATE118545T1; DK0531372T3; JP2000217583A; FI925079L; US6423524B1; KR930700649A; CA2082279C; JP3330123B2; EP0531372B2; EP0531372B1; FI103985B1; EP0531372A1; WO1991017243A1; KR100237148B1; FI925079A0; ES2068586T5; BR9106435A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】エンドグルカナーゼ酵素を含んでなるセルラーゼ調製物発明の分野本発明は単一成分エンドグルカナーゼを含んでなるセルラーゼ調製物、そのセルラーゼ調製物を含んでなる洗剤添加剤、そのセルラーゼ調製物を含む洗剤組成物ならびにそのセルラーゼ調製物によるセルロース含有織物の処理方法に関する。

発明の背景当該技術分野では、一般に、綿含有織物の反復洗濯が織物に非常に不快なごね付きを起こすことが周知であり、そして当該技術分野ではこの問題を解決する数種の方法が既に提案されてきた０例えば、ユニリーバ−社（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ　Ｌｔｄ、）の英国特許第Ｌ３６８，５９９号明細書は綿含有織物のごね付きを低減するセルロース分解酵素の使用を教示する。また、米国特許第４，４３５，３０７号（ノボインダストリーＡ／Ｓ）明細書は、ごわ付き低減洗剤添加剤として、フミコーラ　インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）由来のセルロース分解酵素ならびにＡＣｘｌと称されるその断片の使用を教示する。

当該技術分野で認識されているセルロース分解酵素の他の用途としては、織物からよごれの除去およびその色の澄明化（例えば、ヨーロッパ特許第２２０，０１６号参照）、水吸収性の向上（特公昭５２−４８２３６号）および色の局所的な変化を処理された織物に与える「ストーンウォッシュ（Ｓｔｏｎｅ−ｅｉａｓｈｅｄ）　Ｊ外観の提供（ヨーロッパ特許第３０７．５６４号）が挙げられる。さらに、セルロース分解酵素は、醸造酒業でβ−グルカンの分解に、製パン業では小麦粉の特性の改善に、製紙業ではセルロースの非晶質部分を除去してパルプ中の結晶セルロース含有率の向上のために、そしてパルプの排液特性の改善に、さらに飼料業でグルカンの消化の改善に使用される可能性がある。

セルロース分解酵素の実用上の開発は、ある程度まで、複合混合物である既知セルラーゼ調製物の性質により抑制されてきた。複数酵素系の製造の最適化は困難であるため、セルロース分解酵素類の工業的に有効なコストでの製造の実施が困難であり、そしてそれらの実用化は、セルロース系織物に対して所望の効果を奏するには多量のセルロース分解酵素を使用する必要から生しる困難性によって妨げられてきた。

上記に指摘したセルラーゼ調製物の短所は、多量のエンドグルカナーゼを含む調製物によって改善される可能性がある。エンドグルカナーゼ活性を増強したセルラーゼ調製物は、国際公開第一０８９１０００６９号明細書で公表されている。

発明の要約セルロース含有材料に対して好ましい活性レベルを示す単一エンドグルカナーゼ成分がここに単離された。

従って、本発明はフミコーラ　インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）ＤＳＭ１８００由来の高度に精製された〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼに対して産生される抗体と免疫反応性であるか、またはその〜４３ｋＤエンドグルカナーゼに対する相同体である均一のエンドグルカナーゼを必須のものとして含んでなるセルラーゼ調製物に間する。

セルラーゼのこの特定のエンドグルカナーゼ成分は、相当な実用上の重要性を有するセルロース含有材料の処理にとって有益であることが見い出された。すなわち、このことが、例えば前記活性成分の生産に組換えＤＮＡ技術を使用することによってセルラーゼの原価上有効な製造を可能にし、そしてセルロース系材料に所望の作用を提供するのに少量のセルラーゼ調製物が必要とされるにすぎない点で酵素の現実的な使用を可能にする。

発明の詳細な記述本発明のセルラーゼ調製物は、そのエンドグルカナーゼ成分が総タンパク質当り少なくとも約５ＱＣＭＣエンドアーゼ単位のＣ？ＩＣエンドアーゼ活性を示す有益なものである。

本明細書の文脈上、ｒ　ＣＭＣエンドアーゼ活性」の語は、以下に詳述されるように、本発明のセルラーゼ調製物とインキュベーシゴン後、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液の粘度の低下によって測定されるような、セルロースのグルコース、セロビオースおよびトリロースへの分解能の観点によるエンドグルカナーゼ成分のエンドグルカナーゼ活性を意味する。

本発明の好ましいセルラーゼ調製物は、エンドグルカナーゼ成分が総タンパク質１１１ｇ当り少なくとも約６０の、特に、少なくとも約９０のＣＭＣエンドアーゼ単位のＣＭＣエンドアーゼ活性を示すものである。

とりわけ好ましいエンドグルカナーゼ成分は、総タンパク質ｌａｇ当り少なくとも１０１００Ｃエンドアーゼ単位のＣＭＣエンドアーゼ活性を示す。

ＣＭＣエンドアーゼ（エンドグルカナーゼ）活性は、次のようにＣＭＣの低下する粘度から測定できる。

ｐＨ’ｌＬ、０の０．ＩＭＦリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液中３５ｇ／ＬのＣＭＣ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ７ＬＦＤ）を含む基質溶液を調整する０分析すべき酵素試料をこの緩衝液に溶解する。

基質溶液１０−Ｌと酵素溶液０．５ｑＬを混合し、４０°Ｃに温度を調節した粘度計（例えば、Ｈａａｋｅ　ＶＴ１８１．　ＮＶセンサー、　１３１ｒｐｍ）に移す。

混合直後に粘度を読み取り、３０分後に再度粘度を読み取る。これらの条件下で１／２に粘度を低下する酵素量を、ＣＭＣエンドアーゼ活性】単位と定義する。

当業者に既知の方法でマーカータンパク質と共にＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）および等電点電気泳動を行って、本発明のセルラーゼ調製物のエンドグルカナーゼの分子量と等電点（ｐＩ）をそれぞれ測定した。この方法により、特定のエンドグルカナーゼ成分の分子量は、〜４３ｋＤと決定された。このエンドグルカナ−６の等！虞は約５．１と決定された。このエンドグルカナーゼの免疫化学的特性は、実質的に国際公開第ｗｏ８９１０００６９号に記載されるように実施したところ、フミコーラ　インソレンス０５Ｍ１８００由来の高度に精製された〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼに対して産生された抗体と免疫反応性であることが確認された。セロビオヒドロラーゼ活性は、セロビオースｐ−ニトロフェニルに対する活性として特定できる。この活性は、３７ °ＣおよびｐＩ（７，０において１分間当りに放出されるニトロフェニルのマイクロモルとして測定される。本発明のエンドグルカナーゼは、実質的にはまったくセロビオヒドロラーゼ活性を示さないことがｆ！認された。

本発明のセルラーゼ調製物のエンドグルカナーゼ成分は、例えば、米国特許第４，４３５，３０７号明細書に記載の粗フミコーラ　インソレンス　セルラーゼ混合物の逆相ＨＰＬＣ精製を始めとする大規模な精製操作により最初のうちは単離されてきた（後記実施例１を参照）。この操作は、驚くべきことに、非常に高いエンドグルカナーゼ活性に起因して、予想外に好ましい特性を有する単一成分として〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼの単離物をもたらした。

他の態様では、本発明はエンドグルカナーゼ活性を示す酵素（以下、「エンドグルカナーゼ酵素」と称する）であって、添付の配列表１０１１２に示されるアミノ酸配列を有する酵素またはエンドグルカナーゼ活性を示すその相同体に関する。本明細書における文脈上、「相同体」の語は、ある特定の限定された条件下〔例えば、５ｘｓｓｃでの予備ソーキングし、２０％ホルムアミド、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、５０＋Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８、および５０μｇの変性超音波処理されたウシ胸腺ＤＮＡの溶液中、約４０°Ｃで１時間予備ハイブリダイゼーションし、次いで１００μＭのＡＴＰを加えた同じ溶液中、約４０゛Ｃで１８時間ハイブリダイゼーションする］で、このアミノ酸配列のエンドグルカナーゼ酵素をコードするＤＮＡと同じブローフ゛にハイフ゛リノダイズするＤＮＡによってコードされたポリペプチドを示すことを意図している。この語は、もとの配列のＣ末端およびＮ末端のいずれかもしくは両方に１個以上のアミノ酸残基が付加するか、あるいはもとの配列の１箇所以上の部位における１個以上のアミノ酸残基が置換するか、あるいはもとのアミノ酸配列のいずれかもしくは両末端におけるかまたはもとの配列内の１箇所以上の部位における１個以上のアミノ酸残基が欠失するか、あるいはもとの配列における１箇所以上の部位へ１個以上のアミノ酸残基が挿入することにより得られる前記配列の誘導体を包含することを意図している。

本発明のエンドグルカナーゼ酵素は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定に従ってＤｅｕｔｓｈｅ　Ｓａｓｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ、　Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　ＨｅｇＩＢ、　Ｄ−３３００８ｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、　ＦＲＧに１９８１年１０月１日付で寄託され、フミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）　、例えばＤＳＭ１８００株のようなフミコーラの−の種によって生産可能なものであってもよい。

さらなる態様では、本発明は、添付の配列表ＩＤＩ４に示されるアミノ酸配列を有するエンドグルカナーゼ酵素またはエンドグルカナーゼ活性を示すその相同体（上記の定義に同じ）に関する。このエンドグルカナーゼ酵素は、フザリウム　オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ辺扛肛肥）のようなフザリウムの−の種、例えばブダペスト条約の規定に従いＩ）ｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｇｓ！ｕｎｇ　ｖａｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｓｅｎ、　Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅ＋Ｗｅｇ　１Ｂ、　Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、　ＦＲＧに１９８３年６月６日付で寄託された０５Ｍ２６７２株によって生産可能なものであってもよい。

さらに、相同的なエンドグルカナーゼは他のセルロース分解酵素産生微生物、例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）　、ミセリオフトーラ　（Ｍ　ｃｅｌｉｏ　ｈｔｈｏｒａ）　、ファネロシェーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、シソ゛フィラム（Ｓｃｈｉｚｏ　ｈ　１ｌｕ−）　、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｗ）、アスペルギルス（ハト四山ハ■）およびゲオトリカム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕ＊）の種から誘導されうることも予期されている。

また、本発明は上記のようなエンドグルカナーゼ酵素またはその酵素の前駆体をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構成物にも関する。特に、このＤＮＡ構成物は、添付の配列表ｒＤ＃ＩもしくはＩＤ＃３に示されるようなりＮＡ配列か、またはそれらの変性体を有する。これらのＤＮＡ配列の適当な変性体の例は、上記エンドグルカナーゼの他のアミノ酸配列を生じないヌクレオチド置換体であるが、ＤＮＡ構成物が導入される宿主有機体の使用可能なコドンに相当するか、または異なるアミノ酸配列を生しるためのもとの酵素と、場合によって異なる特性を有するエンドグルカナーゼ変異体を生しる可能性のある異なるタンパク質構造を生しるヌクレオチド置換体である。可能な変性の別の例は、配列中への１個以上のヌクレオチドの挿入、配列のいずれかの末端における１個以上のヌクレオチドの付加、あるいは配列のいずれかの末端または配列内での１個以上のヌクレオチドの欠失である。

上記エンドグルカナーゼ酵素をコードする本発明のＤＮＡ構成物は、確立された標準的な方法、例えばＳ、　１．、　Ｂｅａｕｃ、ａｇｅおよびＭ、　Ｈ。

Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２．１９８１＋　１８５９−１８６９ページに記載されるホスホアミシト法またはｈａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎｔリ一旦。

”　１９８４．８０１〜８０５ページに記載される方法、により合成的に調製できる。ホスホアミシト法によれば、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーにより合成され、精製され、アニール化され、連結され、次いで適当なベクターにクローニングされる。

エンドグルカナーゼ酵素またはその前駆体をコードするＤＮＡ構成物は、例えば、フミコーラインソレンス（ＤＳ？１１８００）のようなセルラーゼ産生微生物のｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーを創製し、次いで標準的な技法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８９、参照）に従うエンドグルカナーゼの全体もしくは一部のアミノ酸配列に基づき合成されたオリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーション、または適当な酵素活性（すなわち、上記に定義したようなＣＭＣエンドアーゼ活性）を所持するクローンの選択、またはもとのセルラーゼ（エンドグルカナーゼ）に対する抗体と反応性を示すタンパク質産生クローンの選択、などの常用されている操作による陽性クローンのスクリーニングによって単離されうる。

最後に、このＤＮＡ構成物は、標準的技法に従う合成起源のフラグメント、ゲノム起源のフラグメントまたは（適当なものとして）ｃＤＮＡ起源のフラグメント　（これらのフラグメントは完全なりＮＡ構成物の様々な部分に相当する）の連結によって調製される合成およびゲノム起源の混合物、合成およびｃＤＮＡ起源の混合物またはゲノムおよびｃＤＮＡ起源の混合物であってもよい。また、Ｉ）ＮＡ構成物は、例えば米国特許第４，６８３，２０２号明細書またはＲ，Ｘ、　５ａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅη９．１９８８．４８７〜４９１ページに記載されるような特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により調製することもできる。

さらに、本発明は、本発明の上記１１ＮＡ構成物が挿入された組換え発現ベクターにも関する。これは、組換えＤＮＡ法を行うのに都合のよいいずれかのベクターであることができ、ベクターの選択はそれが導入される宿主細胞に左右されることが多いい。従って、ベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えプラスミドであることができる。また、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組込まれ、それが組込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。

ベクターでは、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ配列が、適当なプロモーターおよびターミネータ−と調節可能に関連付けられている必要がある。プロモーターは、選んだ宿主細胞において転写活性を示し、そしてその宿主細胞と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されうるいずれかのＤＮＡ配列であることができる。エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネータ−をそれぞれ連結し、次いでそれらを適当なベクター中に挿入するのに使用する操作は当業者に周知である　（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、参照）。

また、本発明は、本発明のＤＮＡ構成物または発現ベクターで形質転換された宿主細胞にも関する。例えば、宿主細胞は、アスペルギルス（Ｂｙ二庄四■）のある種、最も好ましくは、アスペルギルス、ｔｌＪ−４（旦ｐ　ｏｒ■憇）またはアスペルギルス　ニガー（匙月」工四服　胆１」）であることができる。カビ細胞は、それ自体既知方法によりプロトプラストを形成し、プロトプラストを形質転換し、次いで細胞壁を再生できる。宿主微生物としてのアスペル　Ａギルスの使用は、ヨーロッパ特許第２３８，０２３号明細書（Ｎｏｖ。

Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ）に記載されており、その内容は引用することにより本明細書の内容となる。宿主細胞は、酵母細胞、例えばす、力ロマイセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の−菌株であってもよい。

また、宿主有機体は、細菌、特に、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ）　、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびイー・コリー（Ｅ。

並置）の１菌株であってもよい。細菌細胞の形質転換は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８９に記載されるような常法によって行うことができる。

さらに本発明は、本発明のエンドグルカナーゼ酵素の生産方法であって、そのエンドグルカナーゼ酵素を発現する条件下で上記のような宿主細胞を適当な培地で培養する工程、次いで培養物からそのエンドグルカナーゼ酵素を回収する工程を含んでなる方法に関する。

形質転換された宿主細胞を培養するのに使用する培地は、問題の宿主細胞を増殖するのに適するいずれかの常用されている培地であってもよい。発現されたエンドグルカナーゼは培養物中に分泌されることが都合よく、そして培養物から周知の手法、例えば、遠心もしくは濾過による培地からの細胞の分離、硫酸アンモニウムのような塩による培養物のタンパク質性成分の沈殿、次いでイオン交換クロマトグラフィー、もしくはアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフ法により回収できる。

上述のような組換ＤＮＡ法ならびに当該技術分野で周知のタンパク質精製法、発酵法および変法もしくは他の方法を使用することにより、高純度のエンドグルカナーゼを提供できる。

本発明のセルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵素を、浸清、洗濯またはすすぎ操作中に他の洗剤と一緒にセルロース含有織物へ添加することが都合よい。従って、他の態様では、本発明は本発明のセルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵素を含んでなる洗剤添加物に関する。この洗剤添加物は、粉化しない顆粒、安定化された液体または保護された酵素の形態であることが適当である。

粉化しない顆粒は、例えば米国特許第４．１０６．９９１号および同４，６６１．４５２号（両者とも、Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ＾／Ｓ）明細書に従って調製でき、そして場合によって当該技術分野で既知の方法により被覆してもよい。

液体酵素調製物は、例えば、ポリプロピレングリコールのようなポリオール、糖もしくは糖アルコール、乳酸もしくはホウ酸の確立された方法による添加によって安定化できる。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第２３８．２１６号明細書に公表された方法により調製できる。

本発明の洗剤添加物は、本添加物１ｇ当り１〜５００ｍｇ　、好ましくは５〜２５０ｍｇ　、最も好ましくは１０〜１００＋ｓｇ含むことが適当であろう。

この洗剤添加物は、洗剤添加物に通常音められるプロテアーゼ、リパーゼ、パーオキシダーゼまたはアミラーゼのような他の酵素をさらに１種以上含めることができるものと理解されるであろう。

本発明によれば、プロテアーゼがバチルス　レングス（ＢａｃｉｌｌｕｓＩｅｎ　ｔｕｓ）セリンプロテアーゼより高い特異性を示すものである場合には、エンドグルカナーゼ酵素の向上した貯蔵安定性が得られることが見い出された。（本発明の目的上、バチルス　レングス　セリンプロテアーゼより高い特異性を示すプロテアーゼは、ＢおよびＲ緩衝液（ｐＨ９，５）中１ｍｇ／ｍＬのヒトインスリン０．５＋ＩＬＬを１リットル当り０．６ＣＰＬｌの酵素溶液７５μＬ　［Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｎｏ、ＡＰ２２８／１　、参照〕と３７°Ｃ”ｉｎ’１２０分間インキュヘーシ、７し、ＩＮのＭＣＩ　５０μして反応を停止する条件下でバチルス　レングス　セリンプロテアーゼを使用する場合よりも少ない成分にヒトインスリンを分解するものである。このようなプロテアーゼの例は、ズブチリシン　ノボ（Ｎｏｖｏ）もしくはその変異体（例えば、米国特許第４，９１４，０３１号明細書に記載される変異体）、ノカルディア　ダッソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）　ＮＲＲ１８１３３から誘導されうるプロテアーゼ（国際公開第４０８８１０３９４７号明細書記１１２）、バチルス　リケニホルミス（Ｂａｃｈｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から生産可能な、グルタミン酸およびアスパラギン酸に特異的なセリンプロテアーゼ（このプロテアーゼは同時係属中の国際特許出願第ＰＣＴ／ＤＫ９１１０００６７号明細書に詳述されている）、またはフザリウム　エスピー（Ｆｕｓａｒｉｕｓｓｐ、）　０５Ｍ２６７２から生産可能なトリプシン様プロテアーゼ（このプロテアーゼは国際公開第一０８９１０６２７０号明細書に詳述されている）である。

さらなる別の態様では、本発明は、本発明のセルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵素を含んでなる洗剤組成物に関する。

本発明の洗剤組成物は、アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤または両性イオン界面活性剤、ならびにこれらの界面活性剤の混合物であってもよい界面活性剤をさらに含んでなる。アニオン界面活性剤の代表例としては、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）　、アルファオレフィンスルホン酸塩（ＡＯ５）　、アルコールエトキシ硫酸塩（ＡＥＳ）および天然脂肪酸のアルカリ金属塩が挙げられる。しかしながら、エンドグルカナーゼはアニオン界面活性剤の存在下で安定性に乏しく、そして、一方、非イオン界面活性剤またはポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールもしくはポリビニルアルコールのような一定のポリマー化合物の存在下でより安定であることが見い出された。従って、本発明の洗剤組成物は、低濃度のアニオン界面活性剤および／または一定量の上述のような非イオン界面活性剤もしくは安定化ポリマーを含むことができる。

本発明の洗剤組成物は、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、抗凝集剤、金属イオン封鎖剤、土質再付着防止剤、香料、酵素安定化剤、などの当該技術分野で既知の他の洗剤成分を含んでもよい。

本発明の洗剤組成物は、いずれか適当な形状、例えば粉末または液体状に調製することができる。酵素は、上記のような酵素安定化剤を含めることにより液体洗剤中で安定化することができる。一般的に、本発明の洗剤組成物の溶液ｐＨは、７〜１２であり、そしである例えでは７．０〜１０．５である。プロテアーゼ、リパーゼまたはアミラーゼのような他の洗剤酵素を、上記の添加剤と独立にまたは組み合わせて本発明の洗剤組成物に含めることができる。

本発明のセルラーゼ調製物による柔軟化、土質除去および色の澄明化効果を得るには、洗濯液中のセルラーゼ調製物濃度が１リンドル当り０．０００１〜１００　、好ましくは０．０００５〜６０、そして最も好ましくハ０．０１〜２０＋ｍｇであることが必要である。

本発明の洗剤組成物は、典型的には、洗濯液中０．５〜２０ｇ／Ｌの濃度で使用される。〜般的に、この洗剤組成物当り０．１〜５重量％、または、好ましくは０．２〜２重量％の量で洗剤添加物を加えることが最も都合がよい。

さらなる別の態様では、本発明は、セルロース含有織物の手触りが悪くなる速度を低減するか、またはセルロース含有織物の硬さを低減する方法であって、上記のようなセルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵素によりセルロース含有ｍ物を処理する工程を含んでなる方法に関する。さらに本発明は、着色セルロース含有織物の色の澄明化をもたらす方法であって、セルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼで着色セルロース含有ｌ＠物を処理する工程を含んでなる方法、ならびに着色セルロース含有織物の色の局所的な変化をもたらす方法であって、本発明のセルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼにより着色セルロース含有織物を処理する工程を含んでなる方法に関する。本発明の方法は、洗濯中にセルロース含有織物を処理することにより実施できる。しかしながら、織物の処理は、場合によって、ソーキングもしくはすすぎ中に、あるいは織物が浸漬されているかもしくは浸漬されうる水にセルラーゼ調製物もしくはエンドグルカナーゼ酵素を単に添加することによって実施してもよい。

本発明によれば、紙パルプの排液特性が強度の著しい低下を伴うことなく本発明のエンドグルカナーゼによる処理で有意に改善できることが見い出された。従って、本発明は、さらに、バルブ排液の特性の改善方法であって、本発明のセルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵素で紙バルブを処理する工程を含んでなる方法にも関する。本発明の方法で処理できるバルブの例としては、故紙バルブ、再循環板紙バルブ、クラフトバルブ、亜硫酸バルブまたは加工熱処理バルブおよび他の高収率バルブが挙げられる。

本発明は、以下の実施例の好ましい態様を参照しながらさらに詳細に説明されるが、これらの実施例のいずれかの態様に本発明の範囲が限定されることを意図するものでない。

実施例 ■よ４３ｋＤのエンドグルカナーゼと　・　のウサギ　のｉ米国特許第４，４３５，３０７号明細書の天施例６に記載されるようにフミコーラ　インソレンスＤＳＭｉ８００を培養することによりセルラーゼを生産した。粗セルラーゼを、珪藻土による濾過、超遠心、活性含有物の凍結乾燥によって培養ブロスから回収した（米国特許第４．４３５．３０７号明細書の実施例１および６、参照）。

国際公開第８９１０９２５９号明細書に記載されるように粗セルラーゼを精製し、得られた画分ＦＩＰＩＣ２をマウスの免疫感作に使用した。免疫感作は２週間の間隔で５回行い、各毎にフロインドアジュバントを含むタンパク質２５μｇ使用した。Ｅｄ　ＨａｒｌｏｗおよびＤａｖｉｄ　Ｌａｎｅ。

ハ旦ｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１９８８に記載されるようにハイブリドーマ細胞系を樹立した。この操作は以下のごとく具体的に記載できる。

マウスを放血した後、マウスの血清はＦＩＰＩＣＺ画分に存在するタンパク質と反応することを示したので、牌臓を採取し、そして均質化し、次いでＰＥＧおよびＨｙｃｌｏｎｅ　（Ｌｌｔａｈ、　ＵＳＡ）由来のフォクス・リバー　（Ｆｏｘ−ｒｉｖｅｒ）　ミエローマ細胞と混合した。

これらのハイブリドーマを確立したＨＡＴスクリーニング法により選択した。

再クローン化されたハイブリドーマ細胞系を樹立した。これらの細胞系によって産生される抗体を、スクリーニングし、市販のマウスモノクローナルタイピングキット　（Ｓｅｒｏｔｅｃ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ由来）を使用してＩｇＧ、サブクラスに属するものについて選んだ９次に、常用のＥＬＩＳＡによりＦＩＰＩＣ２との反応性について陽性抗体をスクリーニングしたところ、５Ｏ５−ＰＡＧＥで粗フミコーラ　インソレンス０５Ｍ１８００セルラーゼを使用するイムノプロ７テイングに異なる応答を示し、次いでウェスターンプロットによりそれらが異なるエピトープを認識することを示すことが見い出されたが、それらのすべてがＥＬｒＳＡ応答に非常に良好であるようなＦ４．Ｆ１５およびＦ４１の選択物を得た。

これら３種の抗体は、ＣＲＢＦ　ｌマウスの腹水中に多量に産生されていた。セファロースに結合したプロティンＡ（にｅｖａ、　Ｅｎ、　Ｔｅｋ、。

Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用するプロティンＡ精製法により腹水からマウスガンマグロブリンをＭ製した。

異なるモノクローナルガンマグロブリン類を、捕捉抗体としてモノクローナル抗体、抗原としてセルチーム（Ｃｅｌｌｕｚｙ＋ｓｅ）の各種ＨＰＬＣ画分、および検出抗体としてセルチーム由来のエンドグルカナーゼＢに対して産生されるウサギ抗体をそれぞれ使用するサンドイッチＥＬＩＳＡでの応答について試験した。

ＥＬＩＳＡにおけるパインディングを可視化するために、Ｄａｋｏｐａｔｔｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）由来のペルオキシダーゼへウサギＩｇＧに対するブタ抗体を共有結合し、次いで０ＰＤ（１，２−フェニレンジアミン塩酸塩）　／Ｈｚｏｔで可視化した。

最も高いＥＬＩＳＡ応答は、モノクローナル抗体Ｆ４１で得られたので、それを免疫アフィニティー精製工程で使用した。

精製したマウスガンマ−グロブリンＦ４］を、製造者（Ｐｈａｒｖａｃｉａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）に説明されるようにＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ４３ｇに結合し、次いで洗浄した。

フミコーラ　インソレンス　セルラーゼ混合物（上記）を３％乾燥物まで希釈し、４°Ｃで１５分以内にｐＨを３．５に調節した。　ｐＨを７．５にｉｌ！節した後、沈殿物を濾去した。次に、４０°Ｃで硫酸ナトリウムを加えて活性酵素を沈殿させた（ｐｌ（５，５で１ｋｇ当り２６０　ｇ　）。この沈殿物を水に溶解して濾過した。酸処理を繰り返した。最後に、１０．０００ｈ力、トオフのポリビニルスルホネート膜を使用する限外濾過により濃縮した。

次に、セルラーゼ生成物を３％乾燥物になるまで希釈し、ｐＨを９．０に調節した後、製造元（Ｐｈａｒ＋ｗａｃｉａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）により推奨されるようにＤＥＡＥセファロースカラムによりアニオン交換クロマトグラフィーにかけた。

リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）にて上記Ｆ４１ガンマグロブリン結合セファロースカラムに上記プロテアーゼを含まない生成物をかけた。

カラムにかけた後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む同し緩衝液で洗浄した。次に、このカラムを０．５Ｍの塩化ナトリウムを含有する０、１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）で洗浄した後、カラムを５讃Ｈの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１４．５）で洗浄した。最後に、０．１Ｍのクエン酸で〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼを溶離した。

総収量：　１５６３ＣＭＣエンドアーゼ単位のエンドグルカナーゼ活性物２５ｍｇ。

溶離されたタンパク質は、５Ｏ３−ＰＡＧＥにより単一バンドで門−〜４３ｋＤを示すように泳動し、等電点電気泳動後のｐＴは約５．０〜５．２であった。

不活性タンパク質を逆相精製法で除去した。

不活性タンパク質と活性タンパク質を、２−プロパツールのグラージエントを使用するＨＰＬＣで分離した。不活性タンパク質は約２５％２−プロパツールで７８Ｍし、そして活性の〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼは３０％の２−プロパツールで溶離し、この活性エンドグルカナーゼはＣＭＣ−コンゴーレッド清浄区分によって検出可能である。

この方法で、１２２ＣＭＣエンドアーゼ単位を有する活性タンパク質０．７ｈｇを回収した。この操作を３０回繰り返した。

〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼを上記ＴＦＡとプロパツールを除去するために凍結乾燥して回収し、次いでリン酸緩衝液に溶解した。

精製物のエンドグルカナーゼ活性は、タンパク質ｌａｇ当り１５６ＣＭＣエンドアーゼ単位であり、凍結乾燥を含む総収量は、エンドグルカナーゼ活性の６５％であった。

こうして得られた〜４３ｋＤの酵素を使用して、Ｎ、　Ａｘｅｌｓｅｎら、Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｉａ＋ｍｕｎｏｌｅｌｅｃｔｒｏ　ｈｏｒｅｓｉｓ、　ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　１９７３　、第２３章に記載される方法に準してウサギを免疫感作した。精製イムノグロブリンは、それ自体既知の、硫酸アンモニウム沈殿、次いで透析、そしてＤＥＡＥセファデックスによるイオン交換クロマトグラフィーにより抗血清から回収した。

エンドグルカナーゼに対する精製イムノグロブリンのパインディングを測定し、ウサギイムノグロブリン＾５１６９をさらなる研究用としアミノ酸組成：完全加水分解によるアミノ酸分析後に次の組成がＣｙｓ　２０Ｖａｌ　１４アミノ酸組成より非グリコジル化タンパク譬のＭ−は３０，０６９　と推定された。グリコジル化は、と測定され、Ｍｎ２．８４０に相当する。こうして、エンドグルカナーゼの総Ｍ −は３６，９００（＋／−２，４００）であった、１分子当りの吸収係数は次のように推定されたニトリブトファン　ｇ　ｘｓ６９０チロシン　６Ｘ１２８０システイン　２０Ｘ　１２０合　計　１分子当り６１２９０２８０ｎａ＋における９収係数１．６６は、１ｍＬ当りタンパク質ｌｌ１ｇに相当する（文献：Ｓ、　ｃ、Ｇ１１１およびＰ、　Ｈｉｐｐｅｌ、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｒ耳刑、３１２〜３２６　（１９８９））。

アミノ酸配列を、エドマン分解法によりアプライド・バイオシステムズ・４７５Ａ−プロテインシクエネータ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７５＾Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ）で決定した。唯一の配列はこのタンパク質が純粋であることを示した。このアミノ配列を、添付の配列表１０１２に示す。

■索車立性：この酵素はｐＨ３と９．５との間で安定である。

この酵素は、結晶セルロースまたは基質セルビオースβ−ｐ−ニトロフェニル（セロビオヒドロラーゼの基質）をあまり分解しないが、非晶質セルロースを主としてセロビオース、セロトリオースおよびセロテトラオースに分解するので、この酵素は不溶性非晶質セルロースからセロデキストリン類を生産するのに使用できることを示す。

この酵素は約５０″Ｃで最大活性を示すと共にｐＨ６，０と１０．０との間で活性である。

斑Ｉアスペルギルス　第１−ゼ（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｏｒ　ｚａｅ）にお各る〜４３ｋＤの上９エンドグルカ　−ゼのクローニングと皿分堕Ｕ：ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ　（１９８２）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、２．　１６１〜１７０ページの方法に従いフミコーラ　インソレンスＤＳＬ ’１１８００株のｍＲＮＡ（Ｋａｐｌａｎ　ら、（１９７９）　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋、　Ｊ、　１８３．　１８１〜１８４ページ）がらｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーを放射活性４１ｍオリゴヌクレオチド類とハイブリダイゼーションし、組換え体から不動化したＤＮＡ　と共に濾過した（Ｇｅｒｇｅｎら、（１９７９）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、７．２１１５〜２１３６ページ）、これらのヌクレオチドプローブ類は、精製〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼの代表的フラグメントのアミノ酸配列に基づき作製した。３種のプローブ（ＮＯＲ１２５１，２０４８および２０５０）にハイブリダイゼーションする１種のコロニーを見い出し、それを単離した。この配列は、挿入された６８０ｂｐのｃＤＮＡが上記〜４３ｋ［ｌのタンパク質のＣ末端の１８１アミノ酸をコードし、そして３′の翻訳されないｍＲＮＡであることを示す。このクローン由来の２３７ｂｐｔＷ長のＰｖｕ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉフラグメントを、フミコーラ　インソレンスｍＲＮＡとのノーザンブロノト法（Ｓａｌｗｂｒｏｏｋら、上記、７．４０〜７．４２ページおよび７．４６〜７．４８ページに記載）のプローブに使用したところ、完全な〜４３ｋＤのｍＲＮＡは約１１００ｂｐの鎖長を有することを示した。同じ菌株由来のゲノムライブラリーのプローブとして同じ２３７ｂｐのフラグメントを使用した。

ゲノＪ（冨−ｌ−Ｚ：フミコーラ　インソレンス０５Ｍ１８００株のゲノムライブラリーを、Ｙｅｌｔｏｎの方法（Ｍ、門、Ｙｅｌｔｏｎら、（１９８４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 −λε司ニー繻Ｉ４凹、　８１．１４７０〜１４７４ページ）により調製した総ＤＮＡから作製し、次いで５ａｕ３Ａで部分消化した。４ｋｂを越えるフラグメントをアガロースゲルから単離し、次いでＢａｇ　８１で消化しそして脱リン酸化したｐＢＲ３２２に連結した。この連結生成物を、常法によりｒ−ｍ”にした換え体を「部分ｃＤＮＡ　Ｊの欄に記載した２３７ｂｐのＰｖｕ　Ｉ　−Ｘｈｏ　１部分ｃＤＮＡフラグメントでスクリーニングした。完全な〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼ配列を含む２つのコロニーを選び、その遺伝子を製造元の説明書に従いシークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）　（商標）キット（Ｕｎ　ｉ　ｔｅｄｓｔａｔｕｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ジデオキシ法で配列決定した。この配列は、ゲノム遺伝子中の１つのイントロンを除き完全鎖長のｃＤＮＡ遺伝子（下記「完全鎖長のＣＤＮＡ　Ｊの欄を参照）の配列と同一であった。

コノゲノム遺伝子を、パーキン・エルマー／シータスＤＮＡ　７’ンプリフイケー’／ａンシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓ　ＬｅＩｌ）を使用し、製造元の説明書に従うＰＣＲ法により増幅した。

この遺伝子の５′末端ではプライマーＮ０Ｒ２３７８を使用した。このプライマーは、Ｂｃｌ　１部位で１つのＣのＴへの置換が起っている以外、その遺伝子の５′非翻訳末端とマツチする２５ｍｅｒである。この遺伝子の３′末端では、プライマーＮ０Ｒ２３８９を使用した。このプライマーは、２１塩基がその遺伝子の３′非翻訳末端とマツチし、そしてプライマーの５′端の５塩基がＳａｌ　１部位を完成する２６ｍａｒである。

アスペルギルス発現ヘクターｐＴｏｃ６Ｂは、プラスミドｐ７７５　（この構築はヨーロッパ特許第２３８，０２３号明細書に記載されている）から以下のリンカ−を挿入することにより構築した。

ＫＦＮ　５１４：　５’−ＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＧＧＣＣＡ−３’ＫＦＮ５１５：　３１−ＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＣｇＣＣＧＧＴＴＣＧＡ−５’Ｓａｃエエ　ＨｉｎｄエエエＥｃｏＲ工　Ｎａｔｌ　Ｓｔｉ工ｋＣＦＮ　５１６：　５’−ＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣ−３＋ＫＦＮ　５ユ９：　コ書−ＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＣｑΩ工ΔぐΩＴＣＣＧＧＴＴＡＡ−５’Ｎｃｏ工Ｐｒｏｃの構築は、添付の図１に示す。

上記で得られたＰＣＲフラグメントを、Ｂｃｌ　ＩおよびＳａｌ　Ｉで消化し、次いでＢａｇ旧およびＸｈｏ　Ｉで消化したｐＴｏｃ６８に挿入した。得られたプラスミド（ｐＤａｌｌｊ　１０９）のインサートを配列決定したところ、もとのクローンと同一であることを示した。

先遣」Ｕ［ｑ弛Ｎし− 第一鎖ｃＤＮＡを既知配列（ＮＯＲ２１５３）の特定のプライマーから合成し、そして第二鎖の合成はＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎ　（１９８３）　ＧＥＮＥ　２５゜２６３〜２６９ページに記載される方法に従って行った。ゲノム遺伝子の配列は、ｍＲＮＡの５′部をとらえると同時にＡＴＧ開始コドンの前の右にＢａｍ旧部位を導入するようなＰＣＢプライマーＣＮ０Ｒ２３３４＞を設計できるようにした。５′末端でこのプライマーを使用し、３′末端でＮ０Ｒ２１５３を使用することにより二木鎮ｃＤＮＡ生成物上でＰＣＲを行った。

次に、ＰＣＢ−ｃＤＮＡの一部をコードする完全鎖長を、３　’　Ｐｖｕ　Ｉ　 −Ｅｃ。

Ｏ■０９と共にＰＣＲ反応由来の５　’　Ｂａｔｅ　）ＩＩ−Ｐｖｕ　Ｉフラグメントを、クレノウボリメラーゼでそれをプラント端とするように満たし、ＢａｎＩＩＩ−Ｎｒｕ　Ｉで切断したアスペルギルスの発現ヘクターｐＴｏｃ６８ニクローニングして構築しく図１）、そして挿入されたＤＮＡを検査した（ｐｓＸ３２０）　（図２参照）。この完全鎖長ｃＤＮへの配列を添付の配列表＋ｏｉｉに示す。

したオリゴヌクレオチドプーイマー　：ＮＯＲ１２５１：　５’　−ＡＡＹＧＣＹＧＡＣＡＡＡＹＣＣ−３’ＮＯＲ２０４８：　５１−　ＡＡＣＧＡＹＧＡＹＧＧＮＭＹＴＴＣＣＣ−３”ＮＯＲ２０５０：　５’−ＭＹＧＡＹＴＧＧＴＡＣＣＡＹＣＡＲＴＧ　−３’ＮＯＲ２１５３：　５＋−ＧＣＧＣＣＡＧＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＧＣＴＴＧＡＧＧＧ　−３瞥ＮＯＲ２３３４：　５’−ＡＣＧＴＣＴＣＡＡＣＴＣ弱醒匡ＡＡＧＡＴＧＣＧＴＴ　−３’ＮＯＲ２３７８：　５＋−ＣＴＣＡＡＣＴＣ工５１ａ３コ〜ＡＧＡＴＧＣＧＴＴＣＣ−３１ＮＯＲ２３８９：　５１−　ＴＧＴＣＧＡＣＣＡＧＴＡＡにＧＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧ　−３’Ｎ：全４種の塩基太字：もとの配列に対する変化または挿入部。

下線：ｐｃＲにより導入された制限部位。

〜４３ｋＤ（７）工Ｚ上り旦九−ゼの免１上アスペルギルス　オリーゼ（ｂ−ｐｒｙ４鱈）ＩＦＯ４］−７７のプロテアーゼ欠失誘導体であるアスペルギルス　オリーゼＡ１．５５０−７４０をプラスミドｐＳ　Ｘ　３２０で形質転換し、ｐ　１１　Ｃ１９ベクター（Ｙａｎｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、（１９８５Ｌ　ＧＥＮＥ　３３．　１０３〜１１９ページ）上に２．７ｋｂのＸｂａ　Ｉフラグメントとしてアスペルギルス　ニヅランス（−珈ｎ１ｄｕｌａｎｓ）由来のａＩｌｄｓ遺伝子を担うｐＴｏｃ９０で同時形質転換することによりアセトアミドによる選択に使用した（Ｃｏｒｒｉｃｋら、（１９８７）　。

■…　邸、６３〜７１ページ）、形質転換は、ヨーロッパ特許出願公開第２３８．０２３号明細書に記載されるように行った。多数の形質転換体を〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼの同時発現についてスクリーニングした。形質転換体を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ｐ、３）とＣＭＣエンドグルカナーゼ活性により評価した。

ゲノム遺伝子を含有するプラスミド（ρＣａＨｊ　１０９）で上記のようにアスペルギルス　オリーゼＡ１５６０−７４０を形質転換した。これらの形質転換体の評価は、発現レベルがｃＤＮＡの形質転換体のそれと類似であることを示した。

精製された〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼをそのＮ末端配列と糖含量について分析した。Ｎ末端配列は、ＨＰＬＣ精製〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼのそれと同一であることを示した。糖含量は、グルコースよりも１モル当り１０±／− ８のガラクトースを組換え酵素が含む点で■ＰＬＣ精製４３ｋＯの酵素のそれと異なる。

五１フザリウム　オキシスポラムの凍結乾燥培養物をリン酸緩衝液で元へ戻し、５枚のフォックス（ＦＯＸ）培地（酵母エキス６％、　ＫＪＰＯ４１，５％、Ｍｇ５Ｏ，・７１１□０　０．７５％、グルコース　２２．５％、寒天１．５％。

ｐ＋（５，６）プレートの各々に５度スポットし、３７°Ｃでインキュベーションした。インキュベーションの６日後、ブレートからコロニーをがきとり、０．００１％のツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）−８０１５Ｉ＠Ｌに入れ、濃く曇った懸濁液を得た。

液体フォックス（ＦＯＸ）培地３００ｏ＋Ｌをそれぞれ含む４個の１リツトルフラスコに上記胞子懸濁／Ｆｉ、２ｍＬで植菌し、２４０ｒｐｍの３０’Ｃでインキュベーションした。インキュベーションの４日目に培養物を４１Ｎの滅菌ガーゼを通して濾過し、滅菌水で洗浄した。菌体をワンドマン濾紙上で乾燥し、液体窒素で凍結し、冷却乳鉢で微粉末にすりつぶし、新鮮な溶菌緩衝液（１０ＩＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、　ｐＨ７，４，１％５０５．５０ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１００　μＬ　ＤＥＰＣ）　７５ＩＩＬに加えた。十分に混合した懸濁液を１時間６５°Ｃの湯浴でインキュベーションし、ヘンチトノプ型遠心機により５”Ｃ４０００ＰＰＭで１０分間回転した。上澄をデカントし、エタノールで沈殿させた。氷上で１時間後、その溶液を２０分闇１９．００Ｏｒｐｍで回転させた。上澄をデカント後、イソプロパツールで沈殿させた。１Ｏ分間１０、０ＯＯｒｐｎ＋で遠心後、上澄をデカントし、ペレットを乾燥させた。

ＴＥＲ’ＩＦＮ　（１０１１Ｍ　Ｔｒｉ−１４ＣＩ、　ｐＨ７，４，１＃１Ｍ　ＥＤＴＡ　２０００．１００μｇ　ＲＮＡ５ｅＡ）を各チューブに加え、それぞれのチューブを２日間４　”Ｃで貯蔵した。これらのチューブを取り出して６５ °Ｃの湯浴中に３０分間置き、不溶性のＤＮＡを浮遊させた。溶液をフェノール／ＣＨＣｌ、　／イソアミルアルコールで２度、Ｃ）ＩＣ１３／イソアミルアルコールで２度抽出し、次いでエタノール沈殿した。ペレットを沈殿させ、エタノールを除去した９７０％エタノールを加え、ＤＮＡを一２０’Ｃで一夜貯蔵した。デカントおよび乾燥後、ＴＥＲＩＩＩＬを加え、１時間６５゛ｃでチューブをインキュベーションすることでＤＮＡを熔解した。こうしてゲノムＤＮＡ　１．５１ｗｇを得られた。

フザリウム　オキシスポラム　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘ　ｓ　ｏｒｕｍ）の〜４３ｋＤエンフミコーラの〜４３ｋＤセルラーゼに対するフザリウムの相同体を単離するために、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３．１９５号および同４．６８３．２０２号明細書に記載されるように）およびクローン化を行った。次に、この生成物を配列決定し、ＰＣＲ増幅用プローブのライブラリーとして使用するプライマー類を横築した。これらのオリゴヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡライブラリーから対応するクローンを単離した。

ＰＣＲを使用して４３ｋＤの相同体の部分鎖長ｃＤＮＡとゲノムのフラグメントを単離した。ＰＣＲ反応では、鋳型としてｃＤＮＡまたはゲノムＩＩＮＡのいずれかと共に高変性のオリゴヌクレオチド（下記表を参照）の７種の組み合わせを使用した。ただ１種の組み合わせがフザリウムの４３ｋＤ相同体の部分クローンを生成しただけである。２つの個別のセントのＰＣＲ条件を各オリゴヌクレオチド対について使用した。第一のセットは非常に少ない生成物を調製するが非常に高い特異性をもつように設計した。このセットの２８サイクルで各種ファクターが特異性を保持した。６５°Ｃのアニーリング温度はこれらのオリゴヌクレオチドにとっては非常に高温であった。この温度のアニーリング時開ばほんの３０秒間に設定した９反応液１００μＬ当り各変性プライマー混合物２０ピコモルを使用した。使用したオリゴヌクレオチドは、「クローニング要素（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｅｌｅｍｅｎｔ）を含まないデジェネレート（ｄｅｇｅｎａｒａ　ｔｅ）　ＳＪｉ域だけを含み、Ａｍｐｌｉｔａｑ　（商標）　（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）　１単位を反応液１００μＬ当りに使用し、そしてＥＤＴＡを最後の１０分間の７２°Ｃインキュベーションの終りに反応チューブに加えてＰＣＲサイクル後の低温でのミスマンチプライマーによる伸長を防いだ。第一セットのサイクルの生成物は、高い特異性を確保するのに必要な低い効率の増幅のためにアガロース電気泳動のエチジウムブロマイド染色により可視化されることは期待できないであろう。しかしながら、第二セットの増幅は、第一セットからの生成物を効率よく増幅するように設計された。このことを達成するファクターとしては、アニーリング温度を５５°Ｃに低下すること、アニーリング時間を１分まで延長すること、オリゴヌクレオチドの量を反応液１００μＬ当り各混合物を１００ピコモルまで増加すること、デジェネレートタンパク質に沿った「プライム（Ｐｒｉｍｅ）　Ｊクローニング要素を含む別の１組のオリゴヌクレオチド類を使用すること（溶融温度を極端に高める）、および反応液１００μＬ当りＡｍｐｌｉｔａｑ　（商標）ポリメラーゼを２．５単位使用することが挙げられる。

ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓにより推奨されるように行った。

マスター混合物を２つのＤＮＡＪ　（ゲノムおよびｃＤＮＡ）のそれぞれにツイテ作製した。これは、Ｉ　Ｘｐｃｌ？　（Ｄ緩衝液（１０＋ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＭＣＩ、　１．５ｗＭ　ＭｇＣ１ｚ、０．０１％ゼラチン、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）、０．２ｍＭのデオキシヌクレオチド（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ　（商標’）　ｄｌｌＴＰの１００ｍＭ溶液、Ｐｈａｒｎａｃｉａ）、１単位のＡｓｐｌｉｔａｑ　（商標）ポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）および反応混合物１００μＬ当り０．５ｕｇのゲノムＤＮＡまたは５０ｎｇのｃＤＮＡを含んでなり、そして脱イオン水で反応液１００μＬ当り９８μＬに容量を調節した。ラベルを貼った０、５チユーブ（エソペントルカに各オリゴヌクレオチド混合物（下記参照）２０ピコモル（２０ピコモル／μＬｆｉ度の液１μＬ）を加えた。これらを、０．５ｍＬチューブ中にまた、マスター混合物と軽質硬油とを含め、パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）サーマルザイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）中へ入れた。適当なマスター混合物９８μＬと軽質硬油５５ μＬをオリゴヌクレオチド類と共に各チューブに加えた０次に、順次段階的なサイクル（パラメーターについては下記チャートを参照のこと）で反応を開始した。最後の７２°Ｃインキュヘ−シａ　７　（７）終りに、１０ｍＭノＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０）　５０μＬを各チューブに加え、７２°Ｃでさらに５分間インキュベーションした。

４３ｋＤの相同体のＰＣＲに使用したオリゴヌクレオチド対の表＝１　１１　ＺＣ３４８５対ＺＣ３５５８ＺＣ３４８６対ＺＣ３５５９２２８２１２ＺＣ３４８５対ＺＣ３５６０Ｚ（：３４８６対ＺＣ３５６１５１０３１３ＺＣ３４８５対ＺＣ３２６４ＺＣ３４８６対ＺＣ３２５４７５６４１４ＺＣ３５５６対ＺＣ３５６０ＺＣ３５５７対ＺＣ３５６１１５９５１５ＺＣ３５５６対ＺＣ３２６４ＺＣ３５５７対ＺＣ３２５４４０５６１６ＺＣ３５５６対ＺＣ３４６５ＺＣ３５５７対ＺＣ３４６６４０５７１７ＺＣ３４８５対ＺＣ３４６５ＺＣ３４８６対ＺＣ３４６６７５６注）オリゴヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチド表を参照のこと一連のＰＣＲ工程サイクル条件は次のとおりであった。

セット１：　セント２：９４°Ｃ１分　９４°ｃ　１分２８Ｘ６５°Ｃ３０秒　２８Ｘ５５°ｃ　１分７２°Ｃ２分　７２°ｃ　２分７２°Ｃ１０分　７２°Ｃ１０分ＰＣＲサイクルの第一セット後、イソプロピルアルコール沈殿により反応混合物からＤＮＡを精製し、サイクルの第二七、トで使用した。

軽１ｔＦｉ、油の大部分を各試料の上部から除いた後、試料を新たなラベルを貼ったチューブに移した。次に、各チューブを等量のＰｃｔ　（４９％フェノール：４９％クロロホルム：２％イソアミルアルコール）で、次いで等量のクロロホルムで抽出した。次に、反応液へ７．５Ｍの酢酸アンモニウム７５μＬ、グリコーゲン１ａＬおよびイソプロピルアルコール２２６μＬを加えてＤＮＡを沈殿させた。ペレットを脱イオン水２０μＬに再懸濁した。再懸濁液各２μＬをラベルを貼ったチューブに入れ、それぞれ新たなプライマー（上記表参照）　１００ピコモル（２０ピコモル／μＬ濃度の液５μＬ）と共に第二回のＰＣ１１増幅を行った。マスター混合物は、アレゲノム（Ａｌｅｇｅｎｏｍｉｃ）およびｃＤＮＡ鋳型の除去ならびに反応チューブ中のオリゴヌクレオチドとＤＮＡ容量を添加する水の量を減らすことにより増加するように補足したこと以外上記のように調製した。反応とサイクルは上記のように設定した（上記表を参照）。

２８サイクルが袢了した後、軽質鉱油を試料の」二部ら除去し、次いでＰＣＲ混合物を新たなチューブに採取した。各試料１０μＩ２をパラフィン上にスポントし、約５分間４５°Ｃでインキュベーションして、残存する軽質鉱油をパラフィンに吸収させ試料容量を減少させた。次に、これらの液滴を６倍の色素２μＬと共に１％アガロースゲル（Ｓｅａｋｅｎ　ＧＴＧ（商標）　、ＦＭＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　ＭＥ）にのせて電位泳動を行った。鋳型がｃＤＮＡであって反応番号２に約５５０塩基対の単一バンドが見られた。鋳型がゲノムＤＮＡであって反応番号１２に約６２０塩基対のハンドが見られた。これらの反応液をオリゴヌクレオチドＺＣ３４８６およびＺＣ３５６１（表１）でプライムした。これは、アミコーラ４３ｋＤ配列との比較から予期される５１０塩基対ＰＣＲ生成物と非常に近領していた。ゲノム鋳型による反応でより大きな生成物が合成されるのは、二の領域内にイントロンが存在することによる。これらの２つのバンドを含むアガロースを切り出し、製造業者の説明書に従ってＰｒｅｐ−八−Ｇｅｎｅ　（商標）キット（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）を使用することによりＤＮＡを抽出した。　ＤＮＡは脱イオン水５０μＬで溶離し、３Ｍの酢酸ナトリウム、グリコーゲン１μＬおよびエタノール１４０μして沈殿させた。ＤＮＡペレントを乾燥し、ＴＥ　（１０ｓＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣＩ、　ｐＨ８，０，１＋Ｍ　ＥＤＤＭＡ　７　ｕ　Ｌで再懸濁させた。

ｐＢＳｓｋ−’　ベクターにクローニングしたＰＣＲフラグメントを、１初にＥｃｏ　Ｒ１と共にｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ｓｋ−＜Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）で消化して調製し、次いで切断プラスミドを０．８％の５ｅａｐｌａｑｕｅ　ＧＴＧ（商標）アガロース（Ｆ門Ｃ）からＰｒｅ−Ａ−Ｇｅｎｅ　（商［）キット（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）を使用し、製造業元の指示に沿って精製した。オリゴヌクレオチドＺＣ１７７３およびＺＣ１７７４（表１）を、パーキン・エルマーシークス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）　ＰＣＲサーマルサイクラ−により各オリゴヌクレオチド２ピロモルずつ混合し、アニーリング緩衝液（２００霧門Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐ）！７．６．５０ｗＭ　ＭｇＣ１ｇ）　０．５ｔｌ　Ｌを加えた脱イオン水で反応液量を４μＬまで増量し、次いで３０秒間６５°Ｃの温度に保持しそして２０分かけてゆっくり２０℃まで冷却することによってアニーリングした。次に、これらのオリゴヌクレオチドをＥｃｏ　Ｒ１消化ｐＢＩｕｅｓｃｏｒｉｐｔベクターへ次のようにして連結した。脱イオン水５．５μＬ１アニーリングされたオリゴヌクレオチド２ μＬ、消化されたベクターの脱イオン水による１：３希釈物１　ｔｔ　Ｌ、　１０ＸＴ４　ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋１ｃａｌｓ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ　ＩＮ）　１μＬおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）　０．５を混合し、次いで２．５時間１６℃で混合物をインキュベーションした０次に、連結混合物を脱イオン水ｔ’　１００μＬの容量に調節し、次いでＰＣＩおよびクロロホルムで抽出した。！気穿孔法の（エレクトロポレーション）の効率を高めるために、次に　酢酸アンモニウム５０μし、グリコーゲンＬ　ｔｔ　Ｌおよびインプロパツール１５１μＬでＤＮＡを沈殿させた。ハイオラ、ド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　ｉｉｉ気穿孔法装置により、製造業光の指示に従って、脱イオン水による再懸′ｆｊｉ液１０μＬの１μＬのイ・コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｄ）１１０−８エレクトロマツクス（ｅｌｅｃｔｒｏ調ａｘン細胞（Ｇｉｂｃｏ−８ＲＬ）中へ電気穿孔法を実施した。電気穿孔法の直後に、キュヘットへ２ＸＹＴブロス（１リットル当りニドリブトン１６ｇ、酵母エキスＬｏｇ、ＮａＣ１１０ｇ）Ｉ■Ｌを加えて混合した。各種希釈物を、１１００ｐ／ｍＬのアミピシリンを含み、ジメチルホルムアミド中２０ｍｇ／ｍＬのＸ−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−６−Ｄ−ガラクトロピラノシド、Ｓｉｇｍａ、　ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）　１００μＬとＩＭのｒＰＴＧ　（Ｓｉｇｓ＋ａ）　２０ｕ　Ｌを塗布した１００ｍ＋ｉのＬＢプレート　（１リンドル当りニドリブトン１０ｇ、酵母エキス８　ｇ、　ＮａＣ１５ｇ、寒天１４．５　ｇ　）上へのせた。１夜生育後、上記バクテリアプラークについて上述する条件に従って、オリゴヌクレオチドＺＣ３４２４（ブルースクリプトリバースブライマー）およびＺＣ３４２５（Ｔ　７プロモーターブライマー）（表１）を使用する小さなインサートについてのＰＣＲにより各種青色コロニーと白色コロニーを解析した。最初に１分４５秒９４ °Ｃで変性後、４５秒間９４°Ｃ１３０秒４０°Ｃおよび１分間７２°Ｃを３０サイクル行った。ＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動により、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔクローニング領域中に小さなインサートを含むＰＣＲバンドを与える１つの青色コロニーを、１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＢ（１リットル当りニドリブトン１２ｇ、酵母エキス２４ｇ、グリセロール４ＭＬをオートクレーブした後、０．１７Ｍ　ＫＨｚＰＯａ、０．７２ＭＫｚ［ＰＯｎ　１００ｍＬを加えた。Ｓａ＋ｎｂｒｏｃｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、第２版、１９８９．　Ａ、２）の液体培地１００ｍＬ中で１夜生育した。配列分析は正しくオリゴヌクレオチドが挿入されたことを示すが、プロモーターのフレームのｐＢ１ｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に存在するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は保持されたままであった６、１）ＮＡ調製物のｓｏｔｌｇをεｃｏ　Ｒ１で消化し、ＰＣＩとクロロホルムで抽出し、次いで酢酸ナトリウムとエタノールで沈殿させた。ＤＮＡベレットを脱イオン水５０μＬに再懸濁した。消化されたｐｕｓ　ｓｋ−’を、１ＯＸＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液Ｃ０，３３Ｍ　Ｔｒｉｓ　／酢酸、ｐＨ８，０，０，６６Ｍ　酢酸カリウム、０．１Ｍ酢酸マグネシウム、５＋ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ　ＢＳＡ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　）　４０μＬ、脱イオン水２６０μＬ、１ｍＭのｄＴＴＰ　（ｌＪＩｔｒａｐｕｒｅ　（商標）　、ＰｂａｒＩＩＩａｃｉａ）　４０１ＩＬおよびＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉ　Ｕ／μＬ　）　（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）　４０μＬを１ｍｇ／ｍＬのベクターＤＮＡに加えることによりカットバックした。混合物を１５分Ｈ１２”Ｃでインキュベーションし、次いで１０分間７０℃でインキュベーションした。連結に使用するＤＮＡを調製するために、ＰＣＩとクロロホルムで抽出し、次いで酢酸ナトリウムとエタノールで沈殿させた。

ペレットを脱イオン水２００μＬに再懸濁し、濃度０．１μｇ／μＬとした。上記カットバンクｐＢｓｓｋ−’ベクターへの挿入用４３ｋＤ相同的ＰＣＲ生成物を調製するために、ｄＴＴＰの代りにｄＡＴＰを含めた１０μＬ容量の反応液中で丁４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、）によりそれらをカットバックした。得られたＤＮＡ溶液をＰＣＩとクロロホルムで抽出し、次いで酢酸ナトリウム、グリコーゲンおよびエタノールによって沈殿した。　ＤＮＡペレットを脱イオン水１０μＬに再懸濁した。

ＤＮＡ試料７．５ｔｔＬを、１０×リガーゼ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１μＬおよびＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ− 門ａｎｎｈｅｉｍ）　０．５ｕ　Ｌで０．１μｇのカットバックｐＢＳ　ｓｋ− ’　（０，１ｔＩｇ／μＬ）に連結した。次に、この連結反応混合物を脱イオン水で１５０μＬ容量まで増量し、次いでＰＣＩとクロロホルムで抽出した。！気穿孔法の効率を高めるために、次に、酢酸ナトリウム１５μし、グリコーゲンエ μＬおよびインプロパツール１６６μしてＤＮＡを沈殿させた。脱イオン水再懸濁液１０μＬのうちｌμＬを、製造元の指示に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ電気電気穿孔室装置りイ・コリーＤＨＩＯ−Ｂエレクトロマンクス細胞（ＢＲＬ）中に電気穿孔した。電気穿孔法の直後、ＳＯＢブロス　（１１ツノトル当りニトリブト７２０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１１０ｍＬ、Ｉ　Ｍ　ＫＣＩ　２．５ｎ＋Ｌをオートクレーブした後、Ｉ　Ｍ　ＭｇＣＩｚ　ｌｏｍＬとＬＭ　ｑｇｓｏ、１０ｍＬを加えた）をキュヘットに加え、次いで細胞混合物を１０Ｏｎ＋＠チユーブに移し、好気下で１時間３７°Ｃにてインキュベーションした。各種希釈物を、アンピシリン１００μｇ／ｍＬを含み、ジメチルホルムアミド中２０Ｉ１ｇ／ｍ１．のに−Ｇａｌ　（Ｓｉｇ＋ｗａ）とＩＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｕ＋ａ）を塗布した１００ｍ５のＬＢプレート上にのせた。２種の形質転換（ｃＤＮＡとゲノム）のそれぞれ３個の白色コロニーを採取し、配列決定した。配列分析は、インサートがアミコーラの４３ｋＤセルラーゼと高度に相同性であることを示した。ゲノムのインサートは、イントロンの存在を除きｃＤＮＡと同一であった。

２つの４２ｍａｒオリゴヌクレオチドＺＣ３７０９およびＺＣ３７１０（表１）は、ライブラリープローブおよびＰＣＲプライマーと使用する配列から設計した。これらのオリゴヌクレオチドはＰＣＲ生成物の逆の末端に由来し、ＤＮＡの対向する鎖にハイプリントするように設計されているので、それらはライブラリーのスクリーニングの際に可能性のあるクローンを試験するためのＰｃｔ？反応のプライマーとして使用できる。

フサ１ウム　オキシスボーム　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘ　ｓ　ｏｒｕｍ）　ｃＤＮＡ−イブラコニが旧１巌フザリウム　オキシスポラムを発酵によって生育し、いろいろな時間に試料を採取してＲＮＡを抽出し、セルラーゼ活性を分析した。

活性の分析には、総セルラーゼ活性のアンセイと色澄明化のアッセイを含む。最高の色澄明化を示すフザリウム　オキシスポラ云試料は、ポリ　（Ａ）　＋ＲＮＡが単離された全体のＲＮＡから抽出された。

フザリウム　オキシスポラムのｃＤＮＡライブラリーを構築するために、第−鎖ｃＤＮＡを２種の反応液（一つは放射能標識したｄＡＴＰで、他の一つは放射能標識しないｄＡＴＰ　）で合成した。２．５×反応混合物を、以下の試薬を次の順序で混合することにより室温で調製した。５×の逆転写酵素緩衝液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）１０μＬ％２００１のジチオスレイトール（−７０°Ｃで保蔵された原液由来または新たに調製）２．５μＬおよび各オリゴヌクレオチドチド三リン酸（ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰおよび５−メチルｄＣＴＰ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢＢｌｏｔｅｃｈｎｏＩｏｇｙ、　Ａｌａ＊ａｄａ＋　ＣＡ、から得た）　１０＋１Ｍを含む混合物２．５μＬ０反応混合物を２つのチューブに７．５ＩＬずつ分注した。１０μＣｉ／μ１．の”Ｐａ　−ｄＡＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｓ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）　１．３μＬを一つのチューブに加え、もう一方のチューブには水１，３μＬを加えた。各混合物の７μＬを最終反応チューブに移した。それぞれのチューブで、５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｆｌＨ７，４）および５０ｕＭのＥＤＴＡ　１４μＬ中フザリウム　オキシスポラムのポリ　（Ａ）＋　ｌ？Ｎ４５μｇを、１μｇ／μＬの第−鎖プライマー（ＺＣ２９３８：　ＧＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＧＴＧＡＧＣＴＣＴＩ５）　２μＬと混合した。このＲＮＡプライマー混合物を４分間６５°Ｃに加熱し、氷水で冷却し、次いで微量遠心管で短時間遠心した。ＲＮＡプライマー混合物８μＬを最終反応チューブに加えた。

２００Ｕ／μＬの５ｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）　５　ｕ　Ｌを各チューブに加えた。ゆるやかに撹拌した後、チューブを３０分間４５°Ｃでインキュベーションした。　１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　、１　曽ＭのＥＤＴＡ　８０μＬを各チューブに加え、試料を回転させて、簡単に遠心した。各チューブから３μＬを採取し、ＴＣＡ沈殿により取り込まれたカウントと反応液中の総カウントを測定した。各ナユーブからの試料２μＬをゲル電気泳動で分析した。各試料の残りを、オイスターグリコーゲンの存在下でエタノール沈殿処理した。核酸を遠心によりペレット化し、次いでこれらのペレフトを８０％エタノールで洗浄した。エタノール洗浄後、試料を１０分間通気乾燥した。第−鎖の合成は、ポリ　＜Ａ）　＋ＲＮＡからＤＮＡの転換率３３％に相当するフザリウムオキシスポラムｃＤＮＡ　１．６μｇを与えた。

第二鎖の合成は、ヘアピンＤＮＡをもたらす第二鎖合成の第−鎖プライミングを促進する条件下で第−鎖反応液由来のＪｉＮＡ　−ＤＮＡハイブリダイゼーソランによって行った。２つの第−鎖反応液のれぞれに由来する第一１生成物を、水７１μＬに再懸濁した０次の試薬、５×第二鎖緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４，４５０＋ｍＭ　ＫＣＩ、　２３ｍＭ　ＭｇＣｈおよび５０１１Ｍ　（ＮＨ４）　ｚｓＯ４）　２０　ｕ　Ｌ　、５　ｓＭβ−ＮＡＤ３／ｌ／Ｌおよび各１０ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸混合物３μＬを、室温で上記反応チューブに添加した。α−”ＰｄＡＴＰ　１μＬを、第−鎖合成用の未標識ｄＡＴＰを含む反応混合物に加え、一方、−鎖合成用の標識ｄｐ、Ｔｐを含むチューブには水１μＬを含めた。次に、各チューブに、７Ｕ／μＬのイ・コリーＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ。

ＩＮ）　０．６　μＬ、８Ｕ／μＬのイ・コリーＤＮＡポリメラーゼＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）３．１　ｐ　Ｌおよび２Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ　Ｈ（Ｇｉｂｃｏ− ＢＲＬ）を加えた。反応液を２時間１６°Ｃでインキュベーションした。インキュベーション後、各反応液由来の２ｕＬを使用してＴＣＡ沈殿性カウントと反応液の総カウントを測定し、次いで各反応液由来の２μＬをゲル電気泳動により分析した。各試料の残りに、２．５μｇ／μＬのオイスターグリコーゲン２μＬ、０．５のＥＤＴＡ　５　ｔｔ　Ｌおよび１０＋ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）、１１のＥＤＴＡ　２００μＬを加えた。試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、次いでイソプロパツール沈殿させた。

遠心後、ペレフトを８０％エタノール１００μして洗浄し、通気乾燥した。反応の各々によって得られた二本鎖ｃＤＮＡは、約２．５μｇであった。

ムングビーン（ｓｕｎｇ　ｂｅｅｎ）ヌクレアーゼ処理によりヘアピンの一本１１ＯＮＡを切り取った。各ｃＤＮＡペレットを水１５μＬに再懸濁し、次いで各チューブにＩＯＸムングビーン暖衝液（０，３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６、３Ｍ　ＮａＣ１および］、ＱｍＭ　Ｚｎ５Ｏｎ）　２．５ｕ　Ｌ　１０ｍＭのＯＴＴ　２．５μし、５０％のグリセロール２．５μＬおよび１０Ｕ／μＬのムングビーンヌクレアーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）２．５　ａ　Ｌを加えた０反応液を３０分間３０“Ｃでインキュベーションし、各チューブに１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）および１　ｓＭ　ＥＤＴＡ　７５＃　Ｌを加えた。　２μＬのアリコートをアルカリ性アガロースゲル分析により分析した。１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　１００μＬを各チューブに加え、試料をフェノール−クロロホルムで２度抽出した。　ＤＮＡをイソプロパツールで沈殿させ、次いで遠心によりペレット化した。遠心後、ＤＮＡのベレットを８０％エタノールで洗浄し、通気乾燥した。２つの反応のそれぞれからのＤＮＡの収量は、約２μｇであった。

このｃＤＮＡの末端を７４　ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑にした。水２４ μＬの合計容量で２つの試料に由来するＤＮＡを再懸濁した後、合わせた。このＤＮＡに、１０ＸＴ４緩衝液（３３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−酢酸塩１．Ｒ７，９，６７０ｍＭ　ＫＡｃ、１００ｍＭ　ＭｇＡｃおよびｌａｇ／ｍＬのゼラチン）４μ Ｌ、１−門のａＮＴＰ　４　ａ　Ｌ、５０ａ＋ＭのＤＴＴ４μＬおよびＩＵ／μ ＬのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｃ＋ｈｅｉｍ）　４　ｐ　Ｌを加えた。これらの試料を１時間１５°Ｃでインキュベーションした。インキュベーション後、１０ｓ＋ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）および１ｍＭのＥＤＴＡ　１６０μＬを加え、次いで試料をフェノール−クロロホルムで抽出した。　ＤＮＡをイソプロパツールで沈殿させ、次いで遠心によりペレット化した。遠心後、ＤＮＡを８０％エタノールで洗浄し、次いで通気乾燥した。

このＤＮＡを水６．５μＬで再懸後、Ｅｃｏ　Ｒ１アダプターを平滑化されたＤＮＡに付加した。このＤＮＡに、１μｇ／μＬのＥｃｏ　ＲＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡカタログ＄４０９−２０）　１μＬＩＯＸリカ゛−ゼ緩衝液（０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，８および５〇一台ＭｇＣ１ｚ）　１μし、１０ｍＭのＡＴＰＯ１５μＬ、１００ｍＭのＤＴＴ　Ｏ，５μＬおよびＩＵ／μＬのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　１　ｇ　Ｌを加えた。この試料を室温で１夜インキユヘーシヨンした後、リガーゼを１５分間６５°Ｃで変性した。

第−鎖プライマーによってコードされたＳｓｌ　クローニング部位を、Ｓｓｉエンドヌクレアーゼで消化することにより露出させた。このＤＮＡに水３３μＬ、１０ｘｓｓ　Ｉ￥ｆｋ衝液（０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０，Ｉ　Ｍ　ＭｇＣ１ｚおよび０．５Ｍ　ＮａＣ１）　５　ＩＩ　Ｌおよび５Ｕ／ｕＬの５ｓ１２ μＬを加え、この試料を２時間３７°Ｃでインキュベーションした。１（１ｗＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）およびＩＩｍＭのＥＤＴＡ　１５０μＬを加え、試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、次いでＤＮＡをイソプロパツールで沈殿させた。

ｃＤＮＡをセファ０−スＣＬ２Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇいカラムでクロマト処理してｃＤＮＡのサイズを選択し、そしてアダプターを含まないものを除去した。セファロースＣＬ２ＢカラムＩ　、　ＩｍＬを１＋［、のプラスチック使い捨てピペットに流し込み、そのカラムを５０倍カラム容量の緩衝液（１０ｍＬ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４およびＩ　ｔｍＭ　ＥＤＴＡ）で洗浄した。試料をのせ、１滴ずつ画分を集め、ボイド容積中のＤＮＡを集めた。両分したＤＮＡをイソプロパツールで沈殿させた。遠心後、ＤＮＡを８０％エタノールで洗浄し、次いで通気乾燥した。

フザリウム　オキシスポラムのｃＤＮＡライブラリーを、Ｅｃｏ　Ｒ１およびＳｓｔ　Ｉで消化したベクターｐＹｃＤＥ８’　（国際公開第一０９０／１０６９８号参照）にそのｃＤＮＡを連結することにより樹立した。１０×リガーゼ緩衝液８μし、１０ｄの八ＴＰ　４μし、２００ｗＭの［ｌＴＴ　４μＬおよび１単位の７４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含むリゲーシゴン反応溶液８μＬ中、ｃＤＮＡ　４００ｎｇに３９０ｎｇのベクターを連結した。室温で１夜インキユヘーシヨン後、オイスターグリコーゲン５μｇおよび１１０ｆｆ１のＴｒｉｓ−ｆｌｃＩおよび１ｍＭのＥＤＴＡ　１２０μｇを加え、試料をフェノール−クロロホルムで抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＤＮＡベレントを８０％エタノールで洗浄した０通気乾燥後、［ｌＮＡを水３μＬに再懸濁した。電気穿孔性成分ＤＨＩＯＢ細胞（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）　３７μＬを上記ＤＮＡに加え、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ　（Ｍｏｄｅｌ　１１６５２０７６）およびＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｐｕ１ｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ　（Ｍｏｄｅｌ　＄１６５２０９８）　エレクトロポレーションニント　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ＋　ＣＡ）により電気穿孔法を完了した。ＳＯＣ（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、６６（１９８３）。

５５７〜５８０）の４■Ｌをエレクトロポレーション処理した細胞に加え、次いで細胞懸濁液４００μＬを１０枚の１５０ｍ５　ＬＢチアンシリンプレートの各々に広げた。１夜インキユベーシヨン後、ＬＢａｍｐ培地１０培地１冬ラスミド調製物を各プレートから作製した．ライブラリーのバックグランド（インサートを含まないベクター）を、インサートを伴わないベクターの連結と電気穿孔性後の数個のクローンの力価測定によって約１％において樹立した。

４３ｋＤ相同体の完全鎖長ｃＤＮＡクローンを単離するため、１，１００，０００コロニーのライブラリーを１００μｇ／ｓＬのアンピシリンを含む１５０１のＬＢプレート上にまいた．各１０枚のプレート上にグリセロール原液由来の１００，０００コロニーをまき、そして各５枚のプレート上に２０、　０００コロニーをまいた，上記のように釣菌を２度行った。予備ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄も上記のように実施した。ハイブリダイゼーションでは、２つの末端が標識された４２＋ｓｅｔのオリゴヌクレオチド類、ＺＣ３７０９およびＺＣ３７１０　（４３ｋｄ相同体に特異性である）を使用した。

フィルターは、７７°ＣでＴＭＡＣＬにより２０分間１度洗浄した。複写フィルター上に現われる２２個のスポットが観察された。プレートの対応する領域をピペントの大きい端を使用してそぎ取り、１ＸＰＣＲ緩衝液に入れた。単離されたこれラヲ、各車履物に対して２セントのオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ分析した。２種の４３ｋＤ特異性オリゴヌクレオチドを含む一つのセットを、ハイブリダイゼーションプローブとして使用し、そしてもう一つのものは、一つの４３ｋＤ特異性オリゴヌクレオチド（ＺＣ３７０９）と一つのベクター特異性オリゴヌクレオチド（ｚｃ３６３４）を含む、　ＰＣＲは、パーキンエルマーシータスの指示に従って上記のように行った。

各プライマー２０ピコモルと細胞＠濁液５μＬを、５０ｕＬの各反応液中で使用した。９４°Ｃにおける１分３０秒の最初の変性後、９４°Ｃ１分と７２°Ｃ２分の３０サイクルを使用し、最後の伸長は７２°Ｃで１０分の時間とした。結果は２２個のうちエフが上記２つの４３ｋＤ特異性オリゴヌクレオチド認識部位を含むことを示した。残りの５つのクローンは、上記２つの部位の一つ（ＺＣ３７０９）を含むが、ベクター特異性プライマーを使用するＰＣＲにより切り縮められそして十分な長さでないので他の部位を含まないことが明らかにされた。９種の最も長いクローンをスクリーニングの別のレベルで単一コロニーを単離目的で選んだ。

各５つの１０倍希釈物を、第一セントのリフト（ｌｉｆｔ）について上記したような操作でまいた。９種のすべてが二次レベルのスクリーニングのオートラジオグラフ上にシグナルを示した。コロニーは非常に密集していたので、放射能シグナルの頭域内の数個の分離したコロニーヲ単一コロニーとして７０μｇ、／ａＬのアンピシリンを含む１５０閣ｍＬＢプレート上で単離した。コロニーをつまようしでそぎ取りマスター混合物２５μＬに入れたこと以外第一レベルのスクリーニングについて記載したようにオリゴヌクレオチドＺＣ３７０９およびＺＣ３７１０を使用するＰＣＲによって〜４３ｋＤエンドグルカナーゼに対する相同性を試験した。９個のクローンのうち７個について予期したサイズのハンドが得られた。これらの培養を１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むテリフィ’７り　ブロス　（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ）　２０ｍＬで開始した。　ＤＮＡを、上記のようなアルカリ溶菌およびＰＥＧ沈殿によって単離した。

助Ｍオ側圧近これらのｃＤＮＡを、酵母発現ベクターｐＹＣＤＥ８　’により配列決定した。

Ｎｅｗ　ＥｎｇＩａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒからの３５−５ｄＡＴＰ　（Ｍ、　Ｄ、　Ｂｒｇｇｒｎら、ナμ−Ｎａｔ１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８０．１９８３．３９６３〜３９６５ページ、参照）を使用スるジデオキシチェインターミネーション法（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒら、兄邸匹９１１ａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．１９７７、５４６３〜５４６７ベージ）を、すべての配列決定反応に使用した。これらの反応は、Ｐｈａｒ■ａｃｉａからの変性ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓ、　ＴａｂｏｒおよびＣ，Ｃ，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４．１９８７．４７６７〜４７７１ページ、参照）で触媒され、そしてＡＤＨＩプロモーター（ＺＣ９９６：ＡＴＴ　ＧＴＴ　ＣＴＣＧＴＴ　ＣＣＣＴＴＴ　ＣＴＴ）に相補的なオリゴヌクレオチド、ＣＹＣＩターミネータ−（ＺＣ３６３５：　ＴＧＴ　ＡＣＧ　ＣＡＴ　ＣＴＡ　ＡＣＡ　ＴＴＡ）に相補的なオリゴヌクレオチドまたは目的のＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドによりプライムされた。二本鎖鋳型はＮａＯＨで変性（Ｅ、Ｙ、ＣｈｅｎおよびＰ、１１．Ｓｅｅｂｕｒｇ。

ＤＮＡ　４．１９８５．１６５〜１７０ページ）した後、配列決定用オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさた。オリゴヌクレオチド類は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０Ａ　ＤＮＡシンセサイザーにより合成した。配列決定反応に使用したオリゴヌクレオチド類を下記シーケンシングオリゴヌクレオチド表に列挙する。

ＺＣ３４８５ＴＧＧ　ＧＡ（Ｃ／Ｔ）　ＴＧ（Ｃ／Ｔ）　ＴＧ（Ｃ／Ｔ）　ＡＡ（Ａ／Ｇ）　ＣＣＺＣ３４８６ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＣＧＡ（Ｃ／Ｔ）ＴＧ　（Ｃ／Ｔ）ＴＧ　（Ｃ／Ｔ）ＡＡ（Ａ／Ｇ）　ＣＣＺＣ３５５６ＣＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）　ＧＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）　ＧＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）　ＧＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＴ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＧＺＣ３５５７ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣ（＾／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＣＧ　（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＧ　（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＴ　（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＧＺＣ３５５８ＡＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）　Ａ（Ｃ／Ｔ）ＣＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）　（Ｇ／Ｔ）Ｔ／Ｃ／Ｔ）　ＴＴ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＣＣＺＣ３５５９ＧＡＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　Ｃ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）Ａ　（Ｃ／Ｔ）ＣＡＴ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ｔ）　Ｔ（Ｃ／Ｔ）Ｔ　Ｔ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＣＣＺＣ３５６（１（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＧ　（Ａ／Ｇ＞ＴＴ　（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ｔ）（Ｃ／Ｔ）　（Ｃ／Ｔ）Ｔ（Ｃ／Ｔ）　（Ａ／Ｇ）ＡＡ　ＣＣＡＺＣ３５６１ＧＡＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）　ＧＧ（Ａ／Ｇ）　ＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）　ＧＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）　（Ｇ／Ｔ）（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／Ｔ）　Ｔ（Ｃ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）ＡＡＣＣＡ４３ｋＤ６　クローニング　オＩゴヌクレオチ′　：ＺＣ３７０９ＧＧＧ　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣＡＣＡ　ＴＴＣＧＣＴ　ＴＣＧ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＡＣＣＧＣＣＴＡＺＣ３７１０ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＧＣＧ　ＧＡＡ　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＡＣＧ　ＣＣＣＴＧＹＤＣＥ８　’へり　−第１ゴヌクレオチド　：ＺＣ３６３５ＴＧＴ　ＡＣＧ　ＣＡＴ　ＧＴＡ　ＡＣＡ　ＴＴＡ　ＣＹＣ１ターミネータ−ＺＣ３６３４ＣＴＧ　ＣＡＣＡＡＴ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＡＧＣＡＤＨ１プロモーター４３にＤ　西　・　１°　ブーイマー　：ＺＣ３７０９ＧＧＧ　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＡＴＣＡＣＡ　ＴＴＣＧＣＴ　ＴＣＧ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＡＣＣＧＣＣＧＴＡＺＣ３７１０ＣＴＴ　ＣＴＴ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＧＣＧ　ＧＡＡ　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＡＣＧ　ＣＣＣＣＴＧＺＣ３８７０ＡＣＣＴＴＣＴＣＡ　Ａ［、Ｇ　ＡＣＧ　ＧＴＴＺＣ３８８１ＡＡＣＡＡＧ　ＧＧＴ　ＣＧＡ　ＡＣＡ　ＣＴＴＺＣ３８８２ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＣＣＡＡ　ＧＧＡ　ＴＴ倒」ユ色」」ＩｕＫ験アミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）　〜４３ｋＤエンドグルカナーゼ（３０の精製実施物の混合′ｌ＃Ｊ）を、色澄明試験について米国特許第４，４３５，３０７号の実施例６に記載のアミコーラ　インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ調製物と比較した。

試験材料として、使い古した黒色綿スワッチを使用した。澄明試験は、３回反復洗浄するターボトメ−ターで行った。各洗濯の間にスワンチを１度乾燥した。

１佳：３０分間４０’Ｃで２ｇ／Ｌの液体洗剤および水の硬度９＠ｄＨゆスワツチの大きさは１０　Ｘ　１５Ｃ１１であり、各ビーカー中に２枚のワンチを入れる。

洗剤の組成は次のとおりである。

アニオン界面活性剤（Ｎａｎｓａ　１１６９／ｐ）　１０％非イオン界面活性剤（Ｂｅｒｏｌ　１６０）　１５％エタノール　１０％トリエタノールアミン　５％水　６０％（塩酸でｐＨを８．０にＵ！４＃シた）。

ｌｉＬ：２種の酵素を６３および１２５ＣＭＣエンドアーゼ単位／Ｌで使用した。

！！Ｌｔ：結果は、１〜７点の範囲でスワソチを評価する２２人のパネラ−によって評価された。より高い点数はより良い澄明化が得られたものである。

本発明の〜４３ｋＤエンドグルカナーゼは、従来技術のアミコーラインソレンス（Ｈ，１ｎｓｏｌｅｎｓ）より約３０倍優れた性能を示し、そして国際公開第一０８９１０９２５９号に従うセルラーゼ調製物より約６倍優れた性能を示すことがわかる。

ブローアーゼの　でのアミコー”’　Ｈｕｍｉｃｏｌａ）　〜４３ｋＤエンドグルカ　−ゼの異なるプロテアーゼが存在する液体洗剤中の本発明の〜４３ｋＤエンドグルカナーゼの貯蔵安定性を、以下の条件下で測定した。

算粟本発明の〜４３ｋＤエンドグルカナーゼＧｌｕ　／ＡｓｐＡｓ性バチルス　リケニフオルミス（Ｂ、　１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｓｉ；）セリンプロテアーゼトリプシン様フザリウムエスピー（Ｆｕｓａｒｉ＋＋ｓ＋　ｓｐ、）０５Ｍ２６７２プロテアーゼバチルス　レングス（Ｂ、　１ｅｎｔｕｓ）セリンプロテアーゼ５ｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　Ｎｏｖ。

喪ヱ乳白剤、香料または酵素（実験で添加されるもの以外）のどれも含まれていない米国で市販されている液体洗剤。酵素安定則として＋１−１％（重置／重量）のホウ酸。

見ｌエンドグルカナーゼ：洗剤１ｇ当り１２ＣＭＣＩプロテアーゼ：洗剤１ｇ当り０．２ｍｇ茨存盟血相当するプロテアーゼと共にインキュベーシゴン７日後のエンドグルカナーゼ残存活性は、そのＣＭＣアーゼ活性（ＣＭＣＵ）で測定した。

ＣＭＣアーゼ活性は次のように測定した。

脱イオン水中３０　ｇ　／　ＬのＣＭＣ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ　７ＬＦＤ）基質溶液を調製した。測定すべき酵素試料を０．ＯＩＭのリン酸緩衝液（ρ）１７．５）に溶解した。酵素液１．０ｍＬと０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　２．抛りを試験管中で混合し、酵素反応はその試験管に基質溶液１　、０ｍＬを加えることにより開始した。混合液を２０分間４０’Ｃでインキュベーションし、その後反応を０．１２５Ｍのリン酸三ナトリウム・１２Ｈ２０２，０ＩＩＬ添加するすることにより停止した。ブライド試料はインキュベーションすることなく調製した。

フェリンアニド溶液（脱イオン水ＩＬ中フェリシアン化ナトリウム１．６０ｇおよびリン酸三ナトリウム・１２Ｈ，０１４，Ｏｇ）　２．０れを試験試料ならびにブラインド試料に加え、直ちに沸騰水に浸した後１０分間インキユヘーションした。インキュベーション後、試料を水道水で冷却した。４２０ｒ＋ｍで吸光度を測定し、標準曲線はグルコース溶液で作成した。

Ｉ　ＣＭＣアーゼ単位（ＣＭＣＵ）は、上記に特定される条件下で、１分間にグルコース１マイクロモルに相当する量の還元糖を生成する酵素量として定義されている。

本発明のエンドグルカナーゼの貯蔵安定性は、上記条件下でその残存活性（ＣＭＣＵ％として）として測定された。

プロテアーゼ　残存活性（％）＋ホウ酸　−ホウ酸Ｇｌｕ／ＡＳｐ特異性　１０５　９３トリプシン様　６３Ｌ　圏旦旦セリン　５７２４Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ　Ｎｏｖｏ　６３　５５これらの結果は、５ａｖｉｎａｓｅより高度の特異性をもつプロテアーゼが洗剤組成物に含められた場合に、本発明のエンドグルカナーゼの液体洗剤中での貯蔵安定性が改善されることを示す。

夕Ｌ【「ストーンウォッシュ」の外観に近似するジーンズの表面の色に局所的な変化を付与するために、１２ｋｇの「ウオ・ンシュコーター（Ｗａｓｃａｔｏｒ）　Ｊ　ＦＬ１２０洗濯物抽出機中でデニムジーンズを〜４３ｋＤエンドグルカナーゼ処理にかけた。

機械負荷量当り４本のジーンズを使用した。実験条件は以下のとおりであった。

間抜Ｎ４０Ｌの水１００ｍＬのＬ憇云劇士凹庄眩匡匣アミラーゼ”、１２ＯＬ７０ｇのに８２ＰＯ４３０ｇのＮａｚＨＰＯ４５５°Ｃ１０分ｐＨ６，８＊Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓより入手可糊抜きの後排水した。

エル４０Ｌの水１２０ｇのＨ，１ｎｓｏｌｅｎｓセルラ一ゼ混合物または×ｇの〜４３ｋＤエンドグルカナーゼ７０ｇのＫＨｚＰＯ４３０ｇのＮａ、ＨＰｏ。

５５°Ｃ７５分ｐｕｓ、ｓ摩耗処理後、排水、すすぎ、後洗濯およびすすぎを行った。

結果は、ジーンズの視覚的外観を判断することにより評価した。

各種用量の〜４３ｋＤエンドグルカナーゼを使用してアミコーラインソレンスＣＨ，１ｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ混合物１２０ｇによって得られるのと等価の摩耗レベルを得た。この等価のレベルは、〜４３ｋＤエンドグルカナーゼ１．０〜１．２５ｇで得られた。処理被服の引裂強さの測定値は、両酵素処理間で有意差が示されなかった。

鼾ｏ−の、へのアミ’：ｌ−−Ｈｕ＋＋１ｃｏｌａ）　〜４３ｋＤエントゲ、少オｌガ！８九尻新しい織物に対して高度の柔軟性を付与する酵素の効力を検査するために、１２ｋｇの「ウォッシュコーターＪ　ＦＬ１２０洗濯抽出機中で綿１００％のｗｉ物を〜４３ｋＤエンドグルカナーゼで処理した。

実験条件は次のとおりであった。

肚綿１００％の織物は、Ｎｏｒｄｒｓｋ　Ｔｅｘｔｒｌより漂白済み（Ｎ丁２１２６−ｂ）または未漂白（ＮＴ２１．１６−ｕｂ）のものを入手した。織物４００ｇを機械負荷量当り使用した。

血抜Ｎ４０Ｌの水２００糺のＬ１ジ±蛙Ｕ朋り巴倶Ｕアミラーゼ、１２０Ｌ６０ｇのＫＨｌＰＯ。

２０ｇのＮａ、ＨＰｏ。

６０″Ｃ１０分ｐＨ１６，４糊抜き処理後、排水した。

ま迭１４０Ｌの水０−６００　ｇのＬｉｎ５ｏｌｅｎｓセルラーゼ調製物またはＸｇの〜４３ｋＤエンドグルカナーゼ６０ｇのＫｌ（！Ｐ０゜４０ｇのＮａＪＰＯａ６０℃ ６０分ｐＨ６，７摩耗処理後排水した。

盪逸１４０Ｌの水４０ｇのＮａ２ＣＯ３ＬｏｇのＢｅｒｏｌ　０８８０°Ｃ１５分ｐＨ１０，１後洗濯後排水した。

〜４３ｋＤエンドグルカナーゼを３段階の濃度で主洗濯で使用した。

織物試料の重量減小を処理前後に測定した。重量減小を％で表示し、そして糊抜された織物と比較した。

織物の厚さを、厚さ測定器Ｌ＆Ｗ、タイプ２２／１によって測定した。

織物のスワッチ（１０Ｘ６Ｃ１１）２枚を測定し、μｍによる５箇所の測定値を各スワッチについて記録した。スワッチは、９８．０７ｋＰａの加圧下で測定された。保持された厚さを％で表示し、糊抜き織物と比較した。

織物の強度は、引裂試験機（Ｅｌｅｍｅｎｄｏｒｆ　０９）によって測定した。

６枚のスワノチ（１０Ｘ６ｃｍ）をたて方向に切断し、そして６枚のスワノチ（１０Ｘ６ｃ＋ａ）をよこ方向に切断した。引裂強さは、ＡＳＴＭ　０１４２４に従い４Ｎで測定した。酵素処理織物の織物強度は、糊抜き織物との比較において％で表示される。

ｍ物の剛性は、キングフアプリックスティフネステスター（ＫｉｎｇＦａｂｒｉｃ　５ｔｉｆｆｎｅｓｓ　Ｔｅ５ｔｅｒ）で測定した。４枚のスワノチ（１０Ｘ２０Ｃ１１；たて方向に１０　ＣＩ＋　）を織物から切り取り、各スワノチを裏返しに折りＭ　（１０Ｘ１０ｃｍ）　、そして中央に開口リングを備えたテーブル上に置いた。織物を、ダラムで教示される一定の力のピストンでリングを介して押した。ＡＳＴＭ　Ｄ４０３２円形折り円形状験法（Ｃｉｒｃｕｌａｒ　ＢｅｎｄＴｅｓｔ　Ｍｅｔｈｏｄ）に従い測定を行った。保持織物曲げ剛性は、糊抜きされた織物と比較において％で表示される。

これらの試験の結果は、次の表に示される。

！藍パ西ブΩ臭−に２辺１ユツ＝ｉ」叩旦坦−ａ）　−４３ｋＤゴンドグルカナ二叉■使且パルプ排液に対する酵母の効果を検査するために、各種タイプの祇バルブの処理に〜４３ｋＤエンドグルカナーゼを使用した。

実験条件は次のとおりであった。

バフヒ１１、回収紙混合物：新聞紙３３％、雑誌３３％およびコンピューター用紙３３％からなる。脱インク薬品の使用または不使用（それぞれ、ｗｐｃまたは−Ｐ）。

２、再循環ボール箱（ＲＣＣ）。

３、漂白クラフトパルプ：マツ製（ＢＫ）。

４、未漂白熱砕木パルプ：モミ製（ＴＭＰ）。

皇止立二ヱＬ五−遷違し■遣定トリス　（丁ｒｉｓ）　Ｍ衝液（ｐＨ９，０）中３３．３ｇ／ＬのＣＭＣ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ７ＬＦＤ）含有基質溶液を調製した。測定すべき酵素試料を上記緩衝液に溶解した。基質溶液１０ｓ＋Ｌと酵素溶液０．５ｍｌ、を混合し、４０゛Ｃに温度調節された粘度計（Ｈａａｋｅ　ＶＴ１８Ｌ　ＮＶ　５ｅｎｓｏｒ＋　１８１ｒｐｍ）に移した。

１セルラ一ゼ粘度単位（ＣＥＶＵ）は、ノボノルディスクアナリティカルメソノド（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ）　Ｎｏ、ＡＦ２５３　（ノボノルディスクより入手可）により定義される。

バ土プ且黴辺剖淀」之１１ベニ土ニーニブｊニリーショノバー・リーグラー（Ｓｃｈｏｐｐｅｒ−Ｒｉｅｇｌｅｒ）　（ＳＲ）数は、２ｇ／Ｌの粘度をもつ均質パルプに対するＩＳＯスタンダード５２６７　（パート１）に従って測定した。

既知量のパルプを金属製の篩を通して漏斗中へ流した。この漏斗には、軸方向の孔と横方向の孔が設けられている。横方向の孔を通過する濾液量をシヲッパー・リーグラ一単位が目盛られた容器で測定する。

鼓粟処理〜４３ｋＤエンドグルカナーゼ調製物を７ＣＥＶＵ／ｍＬに希釈し、上記パルプ（５０ｇ　０５、粘度３％）に加えた。酵素用量は、乾燥バルブ１ｋｇ当り２４００ＣＥＶｔｌであった。酵素処理は、６０分間ゆるやかに撹拌しながらｐＨ７，５および４０°Ｃで行った。試料を３０分間後に採取して反応の進行をモニターした。６０分後、反応を停止するためにパルプを冷水（＋４°Ｃ）で粘度０．５％に希釈した。

？ｌＩ！バルブの排液を上記のように測定し、ショツパー・リーグラ−（ＳＲ）値をめた。減圧下での排液時間も測定した。

結果を下記表にまとめる。

対照実験は、酵素処理と同し条件。

上記表から、〜４３ｋＤエンドグルカナーゼ処理は、製紙で使用されるパルプのＳｔ？値の著しい低下をもたらし、そして排液が有意に改善されることを示す。

ラピッド　カーテン（Ｒａｐｉｄ　Ｋｏｔｈｅｎ）装置により各種パルプがら紙ンートを作製し、各種パラメーター（破壊長を含む）に関する強度を測定した。

酵素の作用に起因する強度特性の低下はみられながった。

配列表（１）一般的な情報（１）出願人：ノボ　ノルディスク　アクティーデルスヵブ。

エヌ　エヌ（１、発明の名称：セルラーゼ調製物（ｉｊ）配列番号＝４（ｉｖ　）通信の住所：（Ａ）住所：ノボ　ノルディスク　アクティーデルスヵブ。

パテント　デパートメント（Ｂ）通り二ノボ　アレ（Ｃ）市：バグスハエルト（Ｅ）国：デンマーク（Ｆ）郵便番号：デーコー−２８００（Ｖ）コンピューター読み取り可能な型式：（Ａ）媒体型式：フロノビ−ディスク（Ｂ）コンピュータｍ：アイビーエム　ビーシーコムバーチプル（Ｃ）オヘレーティングシステム：ピシードス／エムニストス（Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン　リリース＃１．０゜バージョン１１１．２５（ｖｉ）現出願のデータ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）　出願臼：（Ｃ）分類：（ｖｉ）代理人情報：（Ａ）　氏名：タルソーマドセン　バージ、ト（ｉｘ）を話先：（Ａ）　を話：　＋４５４４４４８８８８（Ｂ）テレファックス：　＋４ｓ　４４４９３２５６（Ｃ）テレンクス：　３７３０４（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１の情報：（１）配列の特性：（Ａ）長さ：　１０６０　塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）　Ｈの数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（１１）配列の種１ｉ　：　ｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル二Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）　”［１名：アミコーラ　インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）（Ｂ）株名：　ＤＳＭ　１８００（ＩＸ）配列の特徴：（Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　−ａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）存在位置：　７３．．９２７（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ｓｉｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）存在位置：　１０．．７２（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ｃｐｓ（Ｂ）存在位置：　１０．．９２７（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　１　：ｆｆｌ工：ＡＡＧＡτＧ　ＣＧＴ　Ｔｍ　ＴＣＣ（ＩＩＣＣＫ：　ＣＴＣ（ＩＩＧ　ＴＣＣＧＣＣＧｒｒ　Ｇｌ ’Ｇ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２の情報：（１）配列の特性：（Ａ）長さ＝３０５アミノ酸（８）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ＩＩ）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２　：Ｖａｎ、　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　誼Ｃｙｓ　’Ｉｈｒ　Ｄｐ　ｎａ　Ａｓｎ　ｊｌｉｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　）ｉｉｓ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓｘｕ（２）　ＳＥ口ＩＤＮ０：３の情報；（１）配列の特性：（Ａ）長さ：　１４７３　塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ（ｉｉｉ　）ハイボセティヵル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二ＮＯ（ｖｉ　）起ａ：（Ａ）生物名：フザリウム　オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｓ＋）（Ｂ）株名：　ＤＳＭ　２６７２（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ　：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置：　９７．、Ｉ２２４（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　３　：ＧＧＡ　ＡＡＧ　ＧＣｒ　ＧＣｒ　ｃｒｃＡＡＣＧＣＣＱ？ｒαコ−λＡＣｒπ；”ｒ　ｃａｒ　ＮＣ八へＣ（ＩＣ２５８ＴＣｒ　ＧＣｒ　ＴＡＴ　ＧＣｒ　ＴＧＣＡＣＣＭＣＴＡＣＴＣＴ　ＣＣＣＴＧＧ　ＧＣｒ　ＧｒＣＭＣＧＡＴ　（、ＡＧ　３５４ＡＡＧ　ＡＣＣＡＯ：ｌ’　ＴＣＣＧＣｒ　ＧＣｒ　ＧＣｒ　ＧＣＣＧＣｒ　ＣＡＧα：ＣＣＡＧ　ＡＡＧ　ＡＱ：　ＡＡＧ　ＧＡＴ　８８Q ＴＣＣＧＣｒ　ＣＣＴ　ＧＩＴ　ＧＴＣＣＡＧ　ＭＧ　ＴＣＣ！　ＡＣＣＡへＧＣＣｒＧＣＣＧＣｒＣＡＧＣＣＣ９３０ＧＡＧ　Ｑ？ｒ　ＡＣｒ　ＡＡＧ　ＣＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＡＣＣＧＡＣＭＧ　ＣＣｒ　ＧｒＣＧＣＣ９７８ＡＣＣＭＧ　ａ？ｒ　ＧＣｒ　ＧＣｒ　ＡＣＣＡＡＧαｍｅ　ＧｒＣＣＡＡ　ＣＣｒ　ＣＩＯＭＣＡＡＧ　ＣＣＣＡＡＧ　１０２６ＡＣＡ　ＡＣＣＣＡＧ　ＡＡＧ　ＧＴＣＣＧＴαａ　ＡＣＣＡＭ　ＡＣＣα込α込ＡＧＣＴＧＣＣＣＩ：；　ＧＣＣ１０７４ＡＣｒ　ＧＧＡ　ＡＧＣＡＡＧ　ｒ　に’に：　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＭＣＧＡＧ　ＴｈＣχ’ＫＩ：　ＣＡＧ　ＴＧｒ　Ｇ’Ｋ　Ｌ２１８ｒｏＡｓｎ（２）　ＳＥ［ｌ　１０　Ｎｏ：　４の情報：（１）配列の特性：（Ａ）長さ＝３７６アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＱ　Ｎｏ：　４　：Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　５ｅｒＴｒｐ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ’Ｉｈｒ　Ｃｙｓ　ＡＳｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＡＬＰ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ工１ｅ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　ＡｓｎＧｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　’Ｉｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　ＰｒB Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｉｈａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ＨｅＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　’Ｉｈｒ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　Ｆｈｅ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＡｌａ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　’ＩｙｒＧｌｙ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｓａｒ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　ＣｙｓＡｓｐ　Ｓａｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌ８ｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　）Ｌｉｓ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｆ’ｎｅ　Ａ唐■ Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｆｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｎ　Ｇ１ｎＰｒｏ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　ｓ４ｉ！ｒＡｌａ　Ｌｙｓ　−’Ｉｈｒ　’ｌｈｒ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ａｌａλ−Ａｌａに−ａ　Ｇ１ｎ＋　壷 −目　Ｈ目 γＨ℃　γｌ−１ｍ＋− ０−−−ｃ　８−−５−９２８石 ωω工　−い工鎮ω２（ＡｍｐＲ（ＡｍｐＲｐＵｃ１９　１１２−１＋ＫＮＦ　”４１５１５７シ７＋−＝％−で４＝〕”２　”　６１５１９−〇〇＜、＋　Ｏ・−〇〇Ｃ／’１ＺＺＬｉＪ　（／ｌ　工ＶＩＩＩＩＺ□　□・。

′＝′″′、ｃｏＲＩＦｉｇ、　２アミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）　ＤＳＭ１８００から誘導される高度に精製された〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼに対して産生される抗体と免疫反応性であるか、またはその〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼと相同的である均質なエンドグルカナーゼ成分を必須のものとして含むセルラーゼ調製物は、セルロース含有織物のごわ付きを低減または色の澄明化用またはこのような織物の色の局所的な変化の提供するための処理に使用できるか、あるいは紙バルブの処理に使用できる。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　年１１月　ら日

Claims

【特許請求の範囲】

１．フミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）ＤＳＭ１８００から誘導される高度に精製された〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼに対して産生される抗体と免疫反応性であるか、または前記〜４３ｋＤのエンドグルカナーゼの誘導体である均質エンドグルカナーゼ成分を必須のものとして含むセルラーゼ調製物。
２．前記エンドグルカナーゼ成分が、タンパク質１ｍｇ当り少なくとも５０ＣＭＣエンドアーゼ単位を示す請求の範囲第１項のセルラーゼ調製物。
３．前記エンドグルカナーゼ成分が、総タンパク質１ｍｇ当り少なくとも６０ＣＭＣエンドアーゼ単位、特に総タンパク質１ｍｇ当り少なくとも９０ＣＭＣエンドアーゼ単位、好ましくは総タンパク質１ｍｇ当り少なくとも１００ＣＭＣエンドアーゼ単位を示す請求の範囲第２項のセルラーゼ調製物。
４．前記エンドグルカナーゼ成分が、実質的にセロビオヒドロラーゼ活性を示さない請求の範囲第１項のセルラーゼ調製物。
５．前記エンドグルカナーゼ成分が、等電点約５．１をもつ請求の範囲第１〜４項のいずれかのセルラーゼ調製物。
６．エンドグルカナーゼ活性を示す酵素であって、添付の配列表ＩＤ＃２に示されるアミノ酸配列を有する酵素またはエンドグルカナーゼ活性を示す前記酵素の相同体。
７．フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属の一の種、例えばフミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏｌｅｎｓ）によって生産できる請求の範囲第６項のエンドグルカナーゼ酵素。
８．酵素が添付の配列表ＩＤ＃４で示されるアミノ酸配列をもつエンドグルカナーゼ活性を示す酵素またはエンドグルカナーゼ活性を示す前記酵素の相同体。
９．フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属の一の種、例えばフザリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）により生産できる請求の範囲第８項のエンドグルカナーゼ酵素。
１０．請求の範囲第６〜９項のいずれかに記載されたエンドグルカナーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構成物。
１１．前記ＤＮＡ配列が、添付の配列表ＩＤ＃１もしくはＩＤ＃３に示されるか、またはそれらの変性体である請求の範囲第１０項のＤＮＡ構成物。
１２．押入された請求の範囲第１０または１１項のＤＮＡ配列を担持する発現ベクター。
１３．請求の範囲第１０もしくは１１項のＤＮＡ構成物または請求の範囲第１２項の発現ベクターで形質転換された細胞。
１４．糸状菌細胞、例えばトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）もしくはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の一の種に属する、特にアスペルギルスオリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）もしくはアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、あるいは酵母細胞、例えばハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）もしくはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の一の種に属する、例えばサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である請求の範囲第１３項の細胞。
１５．請求の範囲第６〜９項のいずれかに記載されるようなエンドグルカナーゼ酵素の生産方法であって、前記エンドグルカナーゼ酵素の発現が可能な条件下の適当な培地で請求の範囲第１３もしくは１４項の細胞を培養する工程、ならびにその培養物からエンドグルカナーゼ酵素を回収する工程を含んでなる方法。
１６．請求の範囲第１〜５項のいずれかのセルラーゼ調製物または請求の範囲第６〜９項のいずれかのエンドグルカナーゼ酵素を、好ましくは粉立ち性のない顆粒状、安定化された液体状または保護された酵素状で含有する洗剤添加剤。
１７．前記添加剤の１ｇ当り、酵素タンパク質を１〜５００ｍｇ、好ましくは５〜２５０ｍｇ、最も好ましくは１０〜１００ｍｇ含む請求の範囲第１６項の洗剤添加剤。
１８．プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼおよび／またはアミラーゼのような別の酵素をさらに含んでなる請求の範囲第１６項の洗剤添加剤。
１９．前記プロテアーゼが、バチルスレンタス（Ｂａｃｃｉｌｌｉｓｌｅｎｔｕｓ）セリンプロテアーゼよりも高度の特異性をもつものである請求の範囲第１８項の洗剤添加剤。
２０．前記プロテアーゼが、ズブチリシンノボ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎＮｏｖｏ）もしくはその変異体、ノカルディアダッソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉａｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）ＮＲＲＬ１８１３３から誘導されるプロテアーゼ、バチルスリケニフォルミス（ＢａｃｉｌｌｉｓＩｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）によって生産できるグルタミン酸およびアスパラギン酸に特異的なセリンプロテアーゼ、またはフザリウムエスピー（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ．）ＤＳＭ２６７２によって生産できるトリプシン様プロテアーゼである請求の範囲第１９項の洗剤添加剤。
２１．請求の範囲第１〜５項のいずれかのセルラーゼ調製物または請求の範囲第６〜９項のいずれかのエンドグルカナーゼ酵素を含んでなる洗剤組成物。
２２．プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼおよび／またはアミラーゼのような別の酵素をさらに含んでなる請求の範囲第２１項の洗剤組成物。
２３．前記プロテアーゼが、バチルスレンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｎｔｕｓ）セリンプロテアーゼよりも高度の特異性をもつものである請求の範囲第２２項の洗剤組成物。
２４．前記プロテアーゼが、ズブチリシンノボ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎＮｏｖｏ）もしくはその変異体、ノカルディアダッソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉａｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）ＮＲＲＬ１８１３３から誘導されるプロテアーゼ、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）によって生産できるグルタミン酸およびアスパラギン酸に特異的なセリンプロテアーゼ、またはフザリウムエスピー（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐ．）ＤＳＭ２６７２によって生産できるトリプシン様プロテアーゼである請求の範囲第２３項の洗剤組成物。
２５．洗浄液１リットル当り、前記セルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵素が酵素タンパク質として０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５〜６０ｍｇ、長も好ましくは０．１〜２０ｍｇに相当する濃度で存在する請求の範囲第２１項の洗剤組成物。
２６．請求の範囲第１６〜２０項のいずれかの洗剤添加剤を含んでなる洗剤組成物。
２７．セルロース含有織物がごわ付き始める速度を低減するかまたはセルロース含有織物のごわ付きを低減する方法であって、セルロース含有織物を請求の範囲第１〜５項のいずれかのセルラーゼ調製物または請求の範囲第６〜９項のいずれかのエンドグルカナーゼ酵素で処理する工程を含んでなる方法。
２８．着色されたセルロース含有織物の色を澄明化を行う方法であって、着色されたセルロース含有織物を請求の範囲第１〜５項のいずれかのセルラーゼ調製物または請求の範囲第６〜９項のいずれかのエンドグルカナーゼ酵素で処理する工程を含んでなる方法。
２９．着色されたセルロース含有織物の色の局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセルロース含有織物を請求の範囲第１〜５項のいずれかのセルラーゼ調製物または請求の範囲第６〜９項のいずれかのエンドグルカナーゼ酵素で処理する工程を含んでなる方法。
３０．セルラーゼ調製物による織物の処理がその織物の浸漬、洗濯またはすすぎを通じて実施される請求の範囲第２７，２８または２９項の方法。
３１．パルプの排液特性の改善方法であって、紙パルプを請求の範囲第１〜５項のいずれかのセルラーゼ調製物または請求の範囲第６〜９項のいずれかのエンドグルカナーゼで処理する工程を含んでなる方法。