JPH05509294A - 血栓症治療のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血栓症治療のための方法および組成物 発明の背景 本発明は、概して血栓症の治療法に関するものであり、さらに詳しくは、ペプチ ドを用いる方法に関する。

血栓症と称される血管内での血餅の形成は、組織損傷を誘引し得る、そしてもし 治療されなければ、ついには死に至る重篤な状態である。血栓形成は、血小板凝 集に依存する。血小板と、損傷した血管の内皮表面との相互作用および他の血小 板との相互作用が、血栓の生成を引き起こす主要因である。

アスピリン、ジピリダモール、およびヘパリンのような、このような血餅を溶か すための種々の製品が、今日入手可能である。これらの製品は、概して、血小板 を破壊または除去してその結果血餅を排除するが、長引く出血を引き起こす、潜 在的な重篤な副作用を有する。さらには、このような製品の影響は、生成される かあるいは供給される新しい血小板によってのみ、消失され得る。

血小板凝集は、フィブリノーゲンおよび他の血清タンパク質の、血小板血漿膜上 の糖タンパク質ＧＰ　ｌｌｂ／Ｉｆｌａ複合体への結合に依存する。ＧＰ　Ｉｌ ｂ／ｌ１ｌａは、インテグリンとして知られている、細胞付着レセプターのラー ジファミリーのメンバーであり、それらの多くは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｒ ＧＤ）　）リペプチド認識配列を認識することが知られている。個々のレセプタ ーの特異性は、個々のリガンドにおいて採用されるＲＧＤ配列のフンフォメーシ コンによって決定される。他の細胞付着レセプターの抑制を伴わない、ＧＰ　Ｉ ｌｂ／ｌ１ｌａレセプター結合の抑制、およびそのことによる血小板凝集の抑制 が、冠状動脈血栓症の予防に必要である。

従って、血小板を除去および破壊することなく、そして長引く出血のような有害 な副作用を引き起こすことなく、特異的に血小板凝集レセプターＧＰ　Ｉｌｂ／ ｌ１ｌａを抑制し得、モして血餅を溶解し得る組成物の必要性が存在する。本発 明は、この必要性を満たし、さらに関連する有益性をも提供する。

発明の要旨 本発明は、出血時間の延長を引き起こすことなく、血小板凝集を抑制する環状ペ プチドを提供する。本発明は、環状であって、モしてＲＧＤ配列のカルボキシ末 端に隣接する疎水性部分を有する、ＲＧＤあるいはＫＧＤを含むペプチドを提供 する。この種類のペプチドは、さらに、疎水性部分に加えて、隣接するプラスに 荷電した部分を含むものとしても提供される。このようなペプチドは、レセプタ ー目ｂ／ＩＩ［ａに対する高い親和性と、フィブロネクチンレセプターおよびビ トロネクチンレセプターに対する低い親和性を有する。このようなペプチドは、 血栓症の治療上の処置のために、生理学的に受容可能なキャリアに入れられて投 与される。

図面の簡単な説明 図１は、左回旋冠状動脈への電磁流プローブ（ｅｌｅｃｔｒｏｗａｇｎｅｔｉｃ 　ｆｌｏｗ　ｐｒｏｂｅ）　、冠状動脈内電極、およびスクリューオクルダーの 装着（上図）、および重篤な狭窄の調節の前後の冠状動脈内血流（下図）を示し ている。

図２は、実施例■において注射されたペプチドの相対抗凝集潜在能の投与量−反 応分析を示している。

図３は冠状動脈血栓誘引後の時間の各ペプチド投与に対する血小板凝集の数値を 示している。

図４は、実施例■において注射されたペプチドの冠状動脈内血流および血栓症に 及ぼす効果を示している。

図５は、実施例■において注射されたペプチドの血行力学的反応に及ぼす効果を 示している。

図６は、実施例■のペプチドを注射された動物１における、Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ移 植片による血小板およびフィブリノーゲンの取り込みを示している。

図７は、実施例■のペプチドを注射された動物ｌにおけるＧｏｒｅ−Ｔｅｘ移植 片による血小板取り込み速度を示している。

図８は、対照処５ｉ！（シャント１）と実施例■のペプチドによる処置（シャン ト２）とに対する動物ｌにおける血液学パラメータを示している。

図９は、実施例■のペプチドを注射された動物２における、Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ移 植片による血小板およびフィブリノーゲンの取す込みを示している。

図１０は、実施例■のペプチドを注射された動物２におけるＧｏｒｅ−Ｔｅｘ移 植片による血小板取り込み速度を示している。

図１１は、対照処置（シャント１）と実施例■のペプチドによる処置（シャント ２）とに対する動物２における血液学パラメータを示している。

図１２は、ウサギモデルにおける、種々の疎水性を高められたペプチドの、イン ビボおよびエックスビボにおける効能を示している。

発明の詳細な説明 本発明は、出血時間の延長を引き起こすことなく血小板凝集を抑制する、環状ペ プチドを提供する。１つの実施態様においては、さらに、環状であってモしてＸ ａが正に荷電したアミノ酸、ｘｂが疎水性部分、そして＊が正に荷電した部分で ある配列ＸａＧＤＸｂ’を含むペプチドが提供される。これらのペプチドは、血 小板凝集を抑制するのに有効で、それゆえ不適当な血管平滑筋細胞の成長、およ び動脈移植片閉塞のみならず、血餅を溶かすために用いられ得る。意外にも、こ のような治療は、他の抗凝集剤の有用性を限定してきた、並行して起こる重篤な 長引く出血を引き起こさない。それゆえこのようなペプチドの使用は、他のＲＧ Ｄ含有ペプチドを利用するこのような治療を含めて、慣習的治療を大いに進歩さ せるものである。

本明細書に用いられているように、ｒ　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチド」 あるいはｒ　ＲＧＤペプチド」は、ｒ　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐレセプターファ ミリー」、すなわちＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を区議し結合するレセプターで あるが、このレセプターに対する結合部位として機能するようなＡｒｇ−Ｇｌｙ −Ａｓｐ配列を１個あるいはそれ以上有するペプチドを意味している。Ｌｙｓ− Ｇｌｙ−Ａｓｐ　（ＫＧＤ）あるいはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　トリペプチド配 列に機能的に類似の他のアミノ酸からなる化学構造物もこの定義の内に含まれる 。結合活性を維持するために、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列およびその機能同等 物は、不変であることが必要であるが、該ペプチドと結合して存在する残りのペ プチドおよび他の化学部分（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｏｉｅｔｙ）　ｉｔ、必ずし も結合部位の活性に影響を与えることなく変化し得る。

特定の化学構成物、あるいはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を越える配列が存在す るところで、結合部位の機能を破壊しない種々の改変が、ペプチドの定義からは ずれることなく意図される。

本明細書に用いられているように、用語「架橋」は、２種のアミノ酸、アミノ酸 誘導体、あるいは他の化学部分間の、該ペプチドの骨格が形成されるアミド結合 以外の、ただしそれがラクタムを形成するためにペプチドを環状化するアミド結 合でない場合の、化学結合を意味する。

本明細書で用いられているように、用語「ペプチド結合」あるいは「ペプチド連 鎖」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のα−アミノ基との間 のアミド結合を意味する。

本明細書で用いられているように、用語「ペプチド」は、ペプチド結合により直 線的に連結されたアミノ酸を含む分子を包含することを意図する。このようなペ プチドは、付加的にアミノ酸誘導体あるいはアミノ酸でない部分を含む。該アミ ノ酸は、ペプチドの結合機能が維持される限り、Ｌ体あるいは０体のいずれでも あり得る。該ペプチドは種々の長さでありに好ましくは、約７個から３５個のア ミノ酸であり、最も好ましくは、約１９個のアミノ酸である。用語アミノ酸は、 天然のアミノ酸と、Ｔｙ　ｒＭｅおよびＰｈｅＣｌのようなそれらの誘導体、お よびカルボキシル基とアミノ基との両方の存在により特徴づけられる他の部分を 意味している。該ペプチドに包含されるアミノ酸でない部分には、例えば、アミ ンのような窒素含冑部分、アシル基、あるいはアミノ酸類似構造物が含まれる。

類似構造物とは、アミノ酸と実質的に同じ機能性の基の空間的配置を示すが、ア ミノ酸の特徴であるα−アミ７基およびα−カルボキシル基の両方は有さない構 造である。

本明細書で用いられているように、「環状ペプチド」とは、ペプチド内の２個の 隣接していないアミノ酸間の分子内結合を有するペプチドを意味している。該分 子内結合は、骨格−骨格間の結合に限定されるものではなく、側鎖−骨格間、お よび側鎖−側鎖間での環状化も包含する。例えば、Ｐｅｎ５　Ｆ’＋ｓｐおよび ＰｍｐアナログおよびＰｉｅおよびＰ＋ｓｃアナログを含む種々のアミノ酸誘導 体および化学部分がこのような結合に関与し得る。

本明細書で用いられているように、「出血時間を長引かせない」あるいは「実質 的に出血時間を長引かせない」という表現は、処置されていない動物から得られ る出血時間と実質的に同じ出血時間を意味している。従って、出血時間を長引か せないペプチドとは、動物に投与されたときに、後に述べる実施例■の６で提供 されるような、アブセイにより測定される２より多い因子によって、出血時間を 引き延ばさないペプチドである。

ここで泪いられるアミノ酸および他の化学部分に対する１文字あるいは３文字の 省略形は、以下のように与えられる。

Ａ　Ａｌａ　アラニン α−ＡＢＡ　α−アミノインブチリル酸Ｄ　Ａｓｐ　アスパラギン酸 Ｃｈａ　シクロヘキシル−アラニン Ｅ　ＧＩＬＩ　グルタミン酸 ０−ｎ−７’　ｆルーＴｙｒ　０−ｎ−ブチル−チロ７ンｏ−ｎ−へキシル−Ｔ ｙｒ　０−ｎ−へキシル−チロシンＯｒｎ　オルニチン Ｐ−アミノ−Ｐｈｅ　パラ−アミノ−フェニルアラニンＰａｓ　６．６−シクロ ベンタメチレンー２−７ミノスベリフク酸アナログ Ｐｅｎ　ベンジラミン Ｆ　Ｐｈｅ　フェニルアラニン ＰｈｅＣ１パラ−クロロ−フェニルアラニンＰｈｇ　フェニルグリシン Ｐ−ト）−Ｐｈｅ　パラ−ヨード−フェニルアラニンＰ＋＊ｃ　アミノ−β！、 β−ペンタメチレンーβ−メルカプトプロピオン酸 ＰＩＩｐ　βτ、β−ペンタメチレンーβ−メルカプトプロピオン酸アナログ Ｐ−二トローＰｈｅ　パラ−ニトロ−フェニルアラ５ｕｃｃＡｌａ　スクシニル −アラニンＴｙｒＭｅ　Ｏ−メチル−チロシン Ｖ　Ｖａｌ　バリン ２−Ｎａ１　（２−ナフチル）アラニン本明細書で用いられているように、用語 「疎水性」は、非極性のアミノ酸、アミノ酸誘導体、アミノ酸類似物および化学 部分を包含することを意図している。疎水性アミノ酸には、Ｐｈｅ、　Ｖａｌ、 　Ｔｒｐ、　ｌｌｅおよびＬｅｕが含まれる。本発明に有用な池の疎水性の部分 には、ＴｙｒＭｅ、　ＰｈｅＣｌおよびＣｈＡ　０−ｎ−ヘキシル−Ｔｙ　ｒ。

３．５−シ゛ヨード’−ＴｙｒＳ　Ｈｐａ、２−Ｎａ１．　０−ｎ−７゛チル− Ｔｙｒ、ｐ−ニド０−Ｐｈｅ、Ｐｈｇ、　ｐ−コート’−ＰｈｅＳＰ−アミ／− ＰｈｅおよびＣｉｔが含まれる。

本明細書で用いられているように、「正に荷電した部分」とは、正に荷電したア ミノ酸、アミノ酸誘導体、アミノ酸類似物、および化学部分を意味する。正に荷 電したアミノ酸には、例えば、Ｌｙｓ、　Ａｒｇ、　ＨｉｓおよびＯｒｎが含ま れる。

本発明は、ＲＧＤレセプター結合ペプチドについて述べるが、当業者に既知の機 能同等物が本発明の精神からはずれることなく、ＲＧＤ配列に代わり得る。当業 者は、このような機能同等物を用いて、ここに記載の本発明を実施し得る。

今日、該アミノ酸配列ＲＧＤは、例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、 および■型コラーゲンを含む多数のタンパク質の中で、細胞結合部位であること が十分に確認されている。譲ＲＧＤ結合部位は、インテグゾンと称される細胞表 面レセプターのファミリーによって認識される。血小板は、広範な［？ＧＤ−細 胞表面レセプし−レバートワーを有し、個々のレセプターは、種々の生理学的機 能を果たすために、１個あるいはそれ以上のＲＧＤ含有リガンドを認識する。Ｇ ＰＩＩｂ／ｌ１ｌａは血小板中に見いだされるこのようなインテグリンレセブタ ーの一種である。このようなレセプターによって認識されるリガンドは、フィブ リノーゲンおよび他の血清タンパク質を含む。ＧｐＨｂ／１ｌｌａは、凝集物を 形成するため他の血小板と相互作用し、また損傷した血管の内皮表面とも相互作 用して、主として冠状動脈血栓症の発達の原因になる。ＲＧＤペプチドは、溶解 性の形態であれば、他の［？Ｇｆ）含有リガンドと競合して細胞付着あるいは血 小板凝集を抑制し得る。例として、ここに参考として援用されている米国特許Ｎ ｏ、　４．５７８．０７９．４．５１７．６８６．４．７９２．５２５および４ ．６８３．２９１を参照のこと。

出血時間の延長は、血栓症治療の望ましくない副作用で有り得るので、本発明の この副作用を有さないペプチドは、きわめて有用である。ペプチドの出血時間に 対する影響は、例えば、実施例■の６．血行力学的反応において記載されている プロトフールを用いて、当業者には容易に測定される。

意外にも、１ｉＧＤ結合部位の「＋４位」、すなわち配列ＲＧＤＸのＸ位の残基 に隣接する位置の正に荷電した部分の存在が、血小板凝集抑制ペプチドに対し、 出血時間を延長しないという特徴を付与する。このようなペプチドの例としては 、Ａｃ−ＣＮＰＲＧＤ　（ＹＯＭｅ）　ＲＣＮＨ２じ８Ｘ）が挙げられる。該正 の荷電は、＋４位に、例えば、Ａｒｇあるいはｌｙｓホモ−Ａｒｇあるいはオル ニチンのような正に荷電したアミノ酸が存在する結果生ずる。あるいは、＋４位 の正に荷電したアミノ酸誘導体、あるいはアミノ酸類似物も望ましい効果を生ず る。さらに、実質的にこのような部位を占有するために、空間的に列を成した正 に荷電した化学部分もまた、該特徴を付与する。このような部分は、前記グアニ ジノ側鎖８ｘにより占有されたのと実質的に同じ空間的部位を占有する限りは、 ＋４位に直線的に列を成す必要はない。

本発明のペプチドは、化学合成法も含む、当業者に既知の適当な方法の何れによ っても合成し得る。好ましくは、直線配列は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅ＋＊ｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡにより製造されるも ののような、市販の自動ペプチド合成機を用いて合成される。そのようにして合 成された該物質は、沈澱し、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） によってさらに精製し得る。合成ペプチドは９５％より高い純度が好ましいが、 より低い純度も許容し得る。

動物に投与されたとき、長引く出血を引き起こすことなく血小板凝集を抑制する 高い可能性を有する、本発明の能力を高めたペプチドの一種を得るために、該合 成ペプチドを、当業者に既知の方法によって環状化する。環状化は２つのイオウ を含有するアミノ酸、あるいは他の部分でジスルフィド結合により行われる。有 用なイオウ含有部分の例としては、Ｃｙｓ。

ＰｅｎおよびＰ＋ｉｐが挙げられる。あるいは、環状化はペプチド結合、または 例えばＰａｓを用いたアルキル架橋構造の形成によっても達成される。残基がス ルフヒドリルを含有する場合、ジスルフィド架橋は、Ｋ３　［Ｆｅ（ＣＮ）ａｌ による該ペプチドの希水溶液の酸化により行われる。化学部分ＰｕｐおよびＰａ ｓのような他の残基は、Ｐ＋ｓｐとＣｙｓ（あるいは類似構造）の間のジスルフ ィド結合による架橋構造を形成する。他の環状化方法も、当業者には既知であり 、使用し得る。

本発明の環状ペプチドは、隣接していないアミノ酸残基の間のペプチド結合形成 によっても調製され得る。このようなペプチド結合を形成するための方法は、こ こに参考として援用される５ｃｈｉｌｌｅｒらのＩｎｔ、Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ 　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、２５：１７１　（１９８５）の中で提供される。要 約すれば、環状ペプチドは、Ｎ”−Ｆｍｏｃ−アミノ酸、Ｂｏａおよびｔ−ブチ ルタンパク質を用いて、ペプチド鎖を集め、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂上で合成 し得る。

側鎖−側鎖環状化は、上記の方法あるいは、ここに参考として援用されている、 Ｆｅ１ｉｘらのＩｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＰｒｏｇｅｉｎＲｅｓ、　３ １：２３１　（１９８ｇ）に記載されているように、Ｎｄ−Ｂｏｃ−アミノ酸を 、ＯＦ＋＊／Ｆｓｏｃとともに用いて、ＡｓｐおよびＬｙｓ残基に対する側鎖保 護により行われる。あるいは、側鎖−骨格環状化は、この方法あるいは前の段落 で述べられた方法との組み合わせによって行われる。

環状ペプチドを作製する代替方法が、例えば、１９９１年２月７日に公開のＮｏ 　９１１０１３３１の中に「小環状ペプチド凝集抑制物」というタイトルで開示 されている。ここで記載されているように、例えば、ブロモアセチル−Ｇｌｙ− Ａｒｇ　（ｇ−２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−β−スルフォニル ）　−Ｇｌｙ−Ａｓｌ）　（β−ｔ−ブチル）　−Ｃｙｓ　（Ｓ−トリフェニル メチル）−０−（ポリマー樹脂）は、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂上 のフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保護基の化学的性質を利泪する 標準的な固相ペプチド合成法を用いて調製し得る。樹脂に結合したペプチドをジ クロルメタン中の１％トリフルオロ酢酸溶液で繰り返し処理すると、溶液の明る い黄色で明らかなようにｓ−トリフェニルメチル基の分離が起こる。処理は黄色 が消失するまで続ける。（１グラムの樹脂結合ペプチドにつきおよそ１．５Ｌの 分離液が必要である。）ｓ−トリフェニルメチル基の完全な分離の後、樹脂結合 ペプチドはＮ、Ｎ−ジメチルアセタミド中の５％Ｎ−メチルモルフォリン溶液で 数回洗浄し、環状化を完全にするために、１２時間純粋なＮ、Ｎ−ジメチルアセ タミド中で振盪する。環状化した樹脂結合ペプチドを、１容量％のフェノール、 １容量％のアニソール、１容量％のエタンジチオールを含むトリフルオロ酢酸で 処理することは、同時に、残存する保護基の分離、および樹脂からの所望の物質 の分離に効果的であり、所望の産物を、例えば、１０ミクロンの孔径３００オン グストロームであるＣ−１８充填剤を詰めた、４．６＋＊＋ｓＸ　２５０ｍ＋ｍ のカラムを用いら４０％までのアセトニトリル０．１％トリフルオロ酢酸溶液で のグラジェント溶出を行う。

本発明に包含されるペプチドは、１ｉＧＤ配列のカルボキシ末端に隣接する疎水 性部分を含有し得る。該疎水性部分は、構造上の型および疎水性に幅を有し得る 。適当な疎水性部分には、例えば、Ｐｈｅ、　Ｔｒｐ、　Ｖａｌ、ｌｉｅ、　Ｌ ｅｕ、　ＰｈｅＣｌ、ＴｙｒＭｅ、およびＣｈＡ　０−ｎ−ヘキシル−Ｔｙｒ、 　３．５−ｄｉｉｏｄｏ−Ｔｙｒ、■ｐａ、　２−Ｎａ１．および０−ｎ−ブチ ル−Ｔｙｒなどが含まれる。このようなペプチドはＸ、Ｘ２Ｘ３ＸａＧＤＸ５Ｘ ６Ｘｒノように表され得、ここｒＸｓは疎水性部分、ｘ２およびｘ８はジスルフ ィド架橋、アルキル架橋、およびペプチド結合のような架橋を形成する能力を有 する部分である。このような部分の代表として、Ｃｙｓｓ　Ｐｅｎ１Ｐａｐ、　 ＰｍｃおよびＰａｓが挙げられる。ｘｌおよびｘ７は０から２０個のアミノ酸で ある。ｘｌの残基の数が１である時、ｘｌは好ましくはＧｌｙであり、残基の数 が１より多い時、カルボキシ末端の残基は好ましくはＧｌｙである。ｘ３は１か ら１０個のアミノ酸であり、好ましくはカルボキシ末端残基としてＨｉｓあるい はＰｒｏを有し、ＡｒｇまたはＬｙｓのような正に荷電したアミノ酸を有するも のである。このような性質を有する特異的ペプチドには、Ｒｈ匝鳳」五ｌ１％Ｇ ヒバ１は匹ＲＣＡ、　ＲＰｎＧＨＲＧＤＷＲＣＲ，ＲＰｅｎＧＨＲＧＤ　ＣＡ　 ＲＣＲ，ｈ四１団ル践Ａ、　ＯＲａｍ−ＰＩＩＧＨＧＤＬ　ＣＲ，Ｒｔ−ｂｕｔ −ａｍ−Ｐｍ　Ｇ　ＲＧ　ＲＣＲ，Ａｃ−儲」瓜旦り皿紅銭Ｎ　Ｈ２、Ａｅ−Ｃ ＮＰＫＧＤ　Ｙ−ＯＭｅ　ＲＣ−ＮＨ２、Ａｃ−用…鉦剋ゴｊ旦ム工坦肛−ＮＨ ２が挙げられる。

あるいは、該ペプチドは、環状化ペプチドを含む、−Ｘ、ＧＤＸ−一結合部位を 含有する物質の組成物として表され得る。ここでｘ６　は正に荷電したアミノ酸 であり、Ｘ、は血小板凝集を抑制するための１以上のアミノ酸または他の部分で あり、そして、中は動物への投与に際し非処置動物の出血時間に対し実質的に出 血時間が増大しないように、該結合部位に隣接する、構造上適切な位置にある、 正に荷電した部分である。

ここで特異的に同定された配列以外の配列を有するペプチドも、必要な機能上の 分類基準を示すのであれば、本発明に包含される。高い抗血栓活性を宵し、出血 時間を長引かせないペプチドは、ここに記載されている教示を用いて合成され、 または試験され得る。一旦合成されたこのようなペプチドは、例えば、実施例Ｖ に記載されている血小板凝集アッセイを用いて、抗血栓活性を試験され得る。こ のペプチドの種々のインテグリンレセブターに対する相対親和性は、例えば、実 施例■のリポソーム結合アッセイあるいは実施例■のＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイを 用いて試験され得る。血小板凝集抑制に対し高い能力を示し、また、ＧＰＩｌｂ ｌｌｌｓに対する高い親和性とフィブロネクチンおよびビトロネクチンに対する 低い親和性とを示すペプチドは、その出血時間に対する影響を測定することで選 択し得る。実施例■および■に記載されているヒヒのモデルあるいはウサギのモ デルのような動物モデルを出血時間の評価に使用し得る。ペプチド投与後、その 効果は、動物を刃物で傷つけ、吸収性のタオルあるいはティ／ニーに出血させて モニターし得る。出血が止まるまでの時間の長さを、ペプチド投与のない動物の 出血時間と比較する。ここで記載された教示の範囲内に当てはまるペプチドは、 処置をしていない対照の出血時間より約２倍より多く増加させるものではない。

従って、当業者は、本発明の教示を、ここに記載された一般式を有する多種多様 なペプチドを生産し、また試験するために使用し得る。

本発明の他の目的は、ペプチドがレセプター１１ｂ／Ｉ［ｌａに対する比較的高 い親和性と、フィブロネクチンおよびビトロネクチンレセプターに対する低い親 和性を有して提供されることである。このようなＩｌｂ／ｌ１ｌａ親和性は、例 えば、実施例■および■に記載のリポソーム結合アッセイ、あるいは実施例Ｖに 記載の血小板凝集アッセイによって測定し得る。Ｉｌｂ／ＩＩＩａに対する高い 親和性を特徴とするペプチドは、実施例■および■で与えられたアッセイの条件 下で測定されるように、約１０μｍより小さい、好ましくは約１μｍ１　さらに 好ましくは０．１μｍより小さい１ｃｓａを有する。あるいは、実施例■におい て特徴づけられたようにＩｌｂ／ｌ１ｌａに対する親和性は、約１０μｍより小 さい、好ましくは約Ｌμｍ、さらに好ましくは約０．１８厘より小さいＩＣｓθ を有する。フィブロネクチンレセプター親和性およびビトロネクチンレセプター 親和性は、例えば、実施例■および■、ならびに■および■において詳述する方 法によって測定し得る。記載の条件下、これらのアッセイにより、フィブロネク チンレセプターに対する低い親和性を有するペプチドは、約０．１μｍより大き い、好ましくは約１μｍより大きい、さらに好ましくは約１０μｍより大きい１ ｃｓｅを有し、ビトロネクチンレセプターに対する低い親和性は、約１μｍより 大きく、好ましくは約ＩＯμ閤より大きく、さらに好ましくは約１００μｍより 大きい。従って、種々のペプチドを、その抑制濃度、および抑制のための結合親 和性を測定し、またＩｌｂ／１ｌｌａに対する高い親和性とフィブロネクチンお よびビトロネクチンレセプターに対する低い親和性を有するペプチドを選択する ためにスクリーニングすることが可能である。

本発明はまた、特異的にＧＰＩＩｂ／１ｌｌａに対する種々のリガンドの結合を 抑制し、出血時間の延長を引き起こさないペプチドを提供する。例えば、ここで ８ｘと称されるペプチドは、フイブリノーゲンのＧＰＩＩｂ／ｌ１ｌａへの結合 を、同じインテグリンへのフォンビルプラント因子の結合を抑制するより強く抑 制する。

本発明のペプチドは、血栓症である哺乳動物に、治療上有効な量のペプチドを、 適切な生理学的に受容可能な牛ヤゾアに入れて投与することにより、効果的に血 栓状態を除去するために使用し得る。効果的な量とは、■から５０　ｍｇ／ｋｇ 体重／ｈｒであり、好ましくは、１からｓ　ｍｇ／ｋｇ体重である。適切な有効 量は、当業者によって容易に決定され得る。このペプチドは種々の方法、例えば 注入あるいは注射によって投与し得る。

処置の長さは効果をモニターすることによって決定され得る。

特許請求の範囲の物質は、ＲＧＤ配列のカルボキン末端に隣接する疎水性部分を 有する環状のＲＧＤを宵するペプチドを含有する組成物を包含する。１つの実施 響様においては、組成物は配列ＸｌＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＤＸ５Ｘ６Ｘ７を有する環状 のペプチドを含有する物質の組成物である。ここてｘ２およびｘ６は、架橋を形 成し得る部分を含有し、Ｘ３は１個以上のアミノ酸であり、ＸｌおよびＸ７は０ から２０個のアミノ酸であり、そしてＸ５は疎水性部分を含み、ｘ４は正に？Ｒ ｉｆ　Ｉ、たアミノ酸である。他の実施態様においては、組成物は、実質的に出 血時間を長引かせることのない血小板凝集抑制活性を有する、ＲＧＤ結合部位含 有の環状ペプチドを含有する物質の組成物である。さらに他の実施態様において 、組成物は、−ＸａＧＤＸｉｌ＊−結合部位含有の環状ペプチドを含有する物質 の組成物である。ここでＸ、は正に荷電したアミノ酸であり、Ｘｂは１個以上の アミノ酸あるいは血小板凝集抑制活性を与える他の部分であり、本は動物への投 与に際し非処置動物の出血時間に対して実質的に出血時間が増大しないように、 該結合部位に隣接して、構造上適切な位置にある、正に荷電した部分である。他 のペプチドは以下の群より選択されるペプチドを含有する：　ＲＰｅｎＧＲＧＤ ＷＰＣＲ，ＧＰｅｎＧＨＲＧＤＬＲＣＡ、　ＲＰｅｎＧ）ＩＲＧＤＷＲＣＲＳＲ ｊ−ｂｕｔ−ａｍ−Ｐｍ　Ｇ）ｌＲＧＤＬｌ？ｃＲ，Ａｃ−ＣＮＰＲＧＤ　Ｙ− ＯＭｅ　ＲＣＮＨ２、Ａｃ−ＣＮＰＫＧＤ　Ｙ−ＯＭｅ　ＲＣ−Ｎ）＋２、Ａｃ −ＣＮＰＲＧＤ（０−Ｎ−Ｂｕｔ　１−ＹＯＲＣ−ＮＨ２゜これらの化合物は、 生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせられ、血栓症および血管移植片閉塞 の治療に使用され得る。

以下の実施例は、例証することを意図しているが、本発明を限定するものではな い。

Ｋ皿星上 ペプチド合成 ペプチドは、自動ペプチド合成機（Ｍｏｄｅｌ　４３０Ａ、　ＡｐｐｌｉｅｄＢ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ４ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｕ ＳＡ）によって、製造者が推奨されているように、ＰＡＭ樹脂樹脂量適化された ｎ−メチルピロリドンの化学的性質を用いて合成した。樹脂からのペプチドの分 離は、１００％フッ化水素で行った。ペプチドは、ＶＹＤＡＣ逆相Ｃ１１ｌカラ ムを用いて、０から６０％までのアセトニトリルのグラジェント溶出を行い、Ｈ ＰＬＣによってさらに精製した。

ペプチドは９８％以上の純度である場合のみ使用した。

Ｐｅｎの環状化のために、上記のように合成されたペプチド６エエＩ１ｇを、予 め沸騰させ冷やしておいた水４す／トルに溶解した。

ペプチドを加える直前に、４５分間水中に窒素を吹き込んだ。

ペプチドを溶解した後、０．１℃ｇ／ｍｌのフェリシアン化カリウムに３［Ｆｅ （ＣＮ）ａ］水溶液を、攪拌されているペプチド溶液に滴下し、黄色が５分間持 続するまで加えた（おおよそ５ｍ１）。この処理の間中、ＮＨ４ＯＨを加えるこ とによって溶液のｐＨを７．０に保った。

溶液は２０時間、低減圧下に放置し、それから凍結乾燥した。

余剰のに３　［Ｆｅ（ＣＮ）ｅｌは環状化した物質をセファデックスＧ−１５カ ラム＜１．８　ｘ　１２０ｃｍ）に通すことにより取り除いた。ペプチドは、Ｗ ａｔｅｒｓ　Ｂｏｎｄａｐａｋ”　Ｃｐｓカラム（３ｘ　３０ｃｍ：１０μｍ充 填剤）（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ、、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡ）を用いた逆 相ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドは、緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸アンモニウ ム、ｐＨ７，５）によりカラムに負荷し、６０％のアセトニトリルと４０％の緩 衝液Ａよりなる緩衝液Ｂのグラジェント溶出を行った。溶出した画分のレセプタ ー結合抑制能力を試験した。

Ｃ＋ｓカラムから得られた主要ピークは、回収ペプチドの９０％で構成され、そ して、単量体環状ペプチドであると推定された。なぜなら、その配列が予測され る時間の間カラムに保持されていたし、また非環状物質および多量体形態のもの は主要ピークから十分に分離されていたからである。

寒二星ユ レセプターおよびリガンドの精製 レセプターはここに参考として援用されているＰｙｔｅｌａらの方法（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１４４：４７５　（１９８７））により精製した。

要約すると、ビトロネクチンレセプター（Ｖｎ−Ｒ）は、ヒト胎盤から抽出した （１０（ｌａＭ）オクチルグルコノド（ＯＧ）から、ＲＧＤペプチドアフィニテ ィークロマトグラフィーによって精製した。

抽出後、懸濁液をセファロース６Ｂカラムで濾過し、それからＧＲＧＤＳＰＫカ ラムに供した。開始時を除いて、すべての処置は４℃で行った。ペプチドカラム を、ｌａＭ　Ｃａ”および２５＋ｎＭ　ＯＧを含む３倍容量のトリス緩衝化生理 食塩水（ＴＢＳ）を用いて、次にＬｍＭ　Ｃａ２“および２５ｍＭオクチルチオ グルコシド（ＯＴＧ）を含むＴＢＳを用いて、室温で洗浄した。結合したレセプ ターの溶出は、２０ＭＭ　ＥＤＴＡおよび２５　ｎ＋Ｍ　ＯＴＯを含むＴＢＳを 用いて、室温で実施した。

最後に、最終濃度が１ｍＭになるようにＣａ”およびＭｇ２°を溶出分画に加え た。

フィブロネクチンレセプター（Ｆｎ−Ｒ）も同様に、ヒト胎盤から抽出した（Ｉ ＱＯｍＭ）オクチルグルコノドから、最初のセファロースクロマトグラフィー処 理も含めた、Ｖｎ−Ｒ精製と同じ方法によってＩ製した。セファロース６Ｂカラ ムの流出では２ｎＭ　ＭｎＯ２を得て、得られた溶液を１１０　ｋｄのフィブロ ネクチンフラグメントのアフィニティーカラムに通した。洗浄および溶出工程は ビトロネクチンレセプター精製に用いたものと同様であった。

血小板糖タンパク質１１ｂ／１ｌｌａは古くなったヒト血小板から精製した。要 約すると、血小板を１０ｍＭトｌ、Ｊス塩酸、１５０ｍＭ　ＮａＣ１（ＴＢＳ） 、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５を用いて洗浄し、そして、２０００Ｘｇで遠 心して細胞をベレットにした。細胞を、ペレットの５倍容ｆｉ＋７）ＴＢＳ、１ ％トリドアＸ−１００，１ｍＭ　Ｃａ２Ｃｌ２ｉ：溶解し、その後３０，０００ 　Ｘ　ｇで遠心した。上澄み画分を回収して、その上澄みを、予めＴＢＳ、１ｍ Ｍ　Ｃａ２Ｃ１２，０，１％　トリトン、Ｏ，ＯＳ％ＮａＮ３で平衡化したフン カナバリン−Ａカラムに負荷し、０．２Ｍα−メチルマン／ンドで溶出した。画 分をプールし、ヘパリン−アガロースカラムに負荷した。流出分を集め、Ａｍ１ ｃｏｎ　ＹＭ　３０フイルターで約５から１０ｍ１に濃縮した。次に濃縮液をＳ −３００カラム（５００ｍｌ）に供して、６ｍ１画分を収集した。ＧＰＩＩｂｌ ｌｌ、含有画分を収集腰　プールして一８０°Ｃで保存した。

フィブリノ−ケンの精製は、本質的には上述のＬｉｐｉｎｓｋａらの方法（Ｊ、 　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、　５０７　（１９７４ン）で行う。要約する と、ヒトフィブリノ−ケン（Ｋａｂｉ　３５３０２）の０．３Ｗ／Ｖ％溶液を１ ５０ｍＭ　ＮａＣ１に溶解する。飽和（ＮＨａ）２ｓＯ４をかき混ぜながら、約 １６％の飽和度になるように、フィブリノ−ケン溶液に滴下した。沈澱を適切な 大きさの瓶の中で２０００　ｘ　ｇで遠心する。上澄みをデカンテーションによ り除いて沈澱を１５Ｏｎ＋Ｍ　ＮａＣ１に再懸濁した（もとの容量の約５０％） 。１６％の飽和度になるようにＮ）Ｉ４ＳＯ４を再度滴下しいた。懸濁液を遠心 し、沈澱を最小容量（もとの容量の約５％）のトリス−生理食塩水に再懸濁する 。

残存するあらゆる不溶物を２００Ｏｒ四で５ｏｒｖａｌタイプ遠心機で遠心し、 フィブリノーゲン上清をデカンテーションにより取り出し、４℃で一晩、トリス −生理食塩に対して遇析する。フィブリノーゲンの特徴づけは、ブラッドフォー ド（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質アッセイ、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、および／また は既知の標準的な方法を用いたウェスタンブロッティングによる。

支血五旦 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬ［５Ａ）１、ヒトビトロ不りチンービ ト口不りチンレセブター（α、β３）　ＥＬＩＳＡアッセイ ヒトビトロネクチン（Ｖｎ）はヒト血漿から単離し、Ｙａｔｏｈｇｏらの方法（ Ｃｅｌｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　１３：２８１−２ ９２　（１９８８））により、アフィニティークロマトグラフィーによって精製 する。

各レセプターの純度は、還元および非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。各 レセプターを液体窒素中でフラノシニ凍結し、使用時まで凍結保存する。

２、フィブロネクチンレセプター（Ｆｎ−Ｒ）　ＥＬＩＳＡアッセイ精製された Ｆｎ−Ｒへのペプチドの結合は、競合的酵素結合イムノソルベント７ノセイ（Ｅ ＬＩＳＡ）を用いて測定した。この方法では、フィブロネクチンは固定され、種 々の濃度のペプチドアナログの存在下での、溶解Ｆｎ−Ｈの結合および溶解ＦＮ −Ｈの結合が、ポリクローナル抗Ｆｎ−Ｒ抗体と、その後の櫟識抗つサギＩｇＧ 複合体で検出される。

マイクロタイタープレートを、ＴＢＳ中（２μｇ／ｍ　１濃度）の１１０μｍの ヒトフィブロネクチンでコートした。プレートを０，０５％Ｔｖｅｅｎ　２０を 含むＴＢＳで３回洗浄した。２０ｍＭオクチルグルコシドおよび２ｍＭ　Ｎ１１ Ｃ１２を含むＴＢＳ中の５０μｌのペプチドを各ウェルに加えた。次に、同じ緩 衝液中の５０μｍのペプチドを正確に１０倍に希釈して加えた。プレートを室温 で３時間インキュベートし、２００μｌの上記ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で洗浄 した。１００μｌのアフィニティー精製したウサギ抗ヒトフィブロネクチンレセ プター抗体をウェルに加え、プレートをさらに２時間インキュベートし、ＴＢＳ −Ｔｖｅｅｎおよび精製水で洗浄した。アフィニティー精製したヤギ抗つサギ＋ ｇＧホースラデイノンユパーオ牛シダーゼ（１００μｌ）複合体を各ウェルに加 えた。結合反応を室温で１６時間インキュベートして行った。翌日、プレートを ＴＢＳ−Ｔｖｅｅｎで２回洗浄し、次に精製水で洗浄した。１００μＩの基質混 合物（２５ＩＩｌｌＯ，１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液中のｌｏｍｇ　Ｏ−フェニ レンジアミン、ｐＨ５，０に３０％８２０２６μｌを加えたもの）をプレートに 加え、発色させた。発色の工程を、５０μｍの４Ｎ硫酸を各ウェルに加えて停止 させた。

３、フィブリノ−ケンー〇Ｐ１１ｂｌｌｌａレセプターＥＬＩＳＡ（Ｆｇ／ｌ１ ｂｌ！！ａ） マイクロタイタープレートの９６個のウェル（Ｔｙｐｅ　Ｎｕｎｅ　Ｉ　Ｍａｘ ｉｓｐｏｒ”″）を１０μｇ／ｌｌ１ｌの精製フイブリノーゲ７でコートしく１ ００μｍ／ウェル）、４°Ｃで一晩放置した。プレートをＰＢＳ　Ｔｗｅｅｎ、 　０．１３７　Ｍ　ＮａＣ１，０，００３Ｍ　ＫＣＩ、０．００８　Ｍ　Ｎａ２ ＨＰＯ４室温でｐＨ７，４，０，０５％Ｔｖｅｅｎ−２０を用いて３回洗浄し、 １から２時間室温で、２００μｌ／ウエルのＴＮＣＮＴ　（０，５％ＢＳＡ、２ ０＋ｉＭ　ｌ−リス、室温でｐＨ７，５，１２０ｍＭ　ＮａＣ１，０，２％Ｎａ Ｎ３．２ｍＭ　ＣａＣｌ２．０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０［Ｃａｌｂｉｏｃｈ ｅｍ　ＲＩＡ級あるいはそれ以上］）を用いて、プレートシェーカー上でブロッ クした。プレートを再度ＰＢＳ／Ｔｖｅｅｎを用いて３回洗浄し、ＴＮＣＮＴ中 の５０μｌの試料を加えた。混合物を室温で、１５分間、プレートンニーカー上 でインキュベートした。ヒト血小板からの精ＨＧ　Ｐ　ｌ　ｌ　ｂ　Ｉ　Ｉ　Ｉ 　ｓレセプターのストック溶液（０，１％トリトンＸ−１００中の０．４−１． ０　ｍｇ／ｍｌ　ＧＰＩＩｂｌｌｌ、、１μＭＣａＣ１２，２０１Ｍトリス、１ ５０＋ｗＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，５０，３ＭＮ−アセチルグルコサミン中の０． ０５％ＮａＮ３、−７０℃保存）をＴＮＣＮＴ中に再度いれた。次に、この希釈 ＧＰＩＩ＋ＩＩＩａ　５０μｌを各ウェルに加え、室温でプレートシェーカー上 でインキュベートした。１時間後、プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎを用いて４回 洗浄し、ＡＰ３　（ｌ　ｕ　ｇ／＋Ｈ１）のような、ＧＰＩＩ＋、に対して特異 的なポリクローナルあるいはモノクローナル抗体（例えば、Ｎｅｖｍａｎら、Ｂ ｌｏｏｄ、６５：２２７−２３２　（１９８５）を参照）１００μｍ、およびＥ ＬＩＳＡ緩衝液（ＰＢＳ、　０．５８ＳＡＳ０．０５％Ｔｖｅｅｎ　２０．０． ０１％Ｔｈｉｍｅｒａｓｏｌ）を加えた。プレートシェーカー上、室温での１時 間のインキュベーンランの後、試料をＰＢＳ／Ｔｖｅｅｎを用いて４回洗浄する 。次に、予め１：１０，０００に希釈したＧＡＭＨＲＰ　（ヤギ抗マウスＩｇＧ （Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚｅ　Ｃａｔ、　７１５３０５−１）のホースラディノンユ パーオキシダーゼ複合体をＥＬＩＳＡ緩衝液に溶解したもの）１００μＩを加え 、プレートンニーカー上、室温で１時間インキュベートした。続いて試料をＰＢ Ｓ／Ｔｗｅｅｎを用いて４回洗浄し、１００ｍ１のＯＰＤ／Ｈ２Ｏ２基質を加え た（ＯＰＤ／Ｈ２Ｏ２基質：　１０ｍｇのＯ−フェニレンジアミンをリン酸／ク エン酸緩ｆｆｉｉｆｆ１１５ｍｌに溶解し、ホイルでおおった５０ｍ１　Ｆａｌ ｃｏｎ”チューブ中で室温に維持し、使用の直前に６．２５μｍの３０％Ｈ２Ｏ ２を加えて、０．０１２５％Ｈ２Ｏ２中０．６７ｍｇ　ＯＰＤ／ｍｌの最終溶液 を得た。）（リン酸／クエン酸緩衝液は、１６ｍＭクエン酸、５０ｍＭ　Ｎａ２ ＨＰ○４よりなりｐ）１５．０である）。３から２０分以内に発色し、１００μ ｍのＬＭ　Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させた。４０５ｎｍを対照に４９２ｎ ｍでの光学的濃度を記録し、１ｃｓｓ値を決定した。

４、ビトロ不りチンービトロ不りチンレセブターＥＬ　ＩＳＡ　（Ｖｎ／ＶｎＲ ） ヒトＧｐＨｌａに対して特異的な抗ＧＰＩＩｂｌｌｌｉモノクローナル抗体をＮ ｅｗｍａｎらの方法（Ｂｌｏｏｄ、　６５：　２２７−２３２　（１９８５）） 、あるいは類似の方法により調製した。このマウスＭａｂは、ビトロネクチンレ セプターのβ３サブユニツトに特異的である。ウサギＦａｂ２抗マウスＦｃフラ グメノトホースラデイノンユノザーオキシダーゼ複合体（抗ＭｕＦｃ　ＨＲＰ） をＰｅ１Ｆｒｅｅｚｅ（Ｃａｔ、　Ｎｏ、　７１５３０５−１）から入手した。

マキンソーブ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）マイクロタイタープレートを２μｇ／ｌｏ　 ｌヒトビトロネクチンでコートし、ＰＢＳで溶解しく　５０ｍ１／ウエル）４℃ で一晩保存した。プレートをＰＢＳ−０，０５％Ｔｖｅｅｎ−２０（洗浄緩衝液 ）を用いて２回洗浄し、約１５０μｍ／つｚ）しのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ　 ｌ−リス塩酸、１００ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ＣａＣ１２、Ｍｎ Ｃｌ２、ｐＨ７，４中１％、ＢＳＡ　（ＲＩＡグレードもしくはそれ以上）を用 いて６０分間インキュベートすることでブロックした。標準希釈物を調製し、予 測される抑制物質（表２）をアツセイ緩衝液に溶解した。ブロックしたプレート を空にし、２０μｌ／ウエルの抑制物質あるいは［４物質の溶液を各ウェル（こ 加えた。

精製α９β３のアッセイ緩衝液に溶解した３０μｇ／ｍ　１溶液２５μｌをコー トしたプレートにピペットで加えた。アッセイウェルのレセプターの最終濃度は 約１５μｇ／ｍｌであった。プレートを７エーカー上で６０分間インキュベート した。しばらくして、各マイクロタイトプレートに対し、β３に特異的なマウス モノクローナル抗体１５μｇ／ｍ　ｌを含有する６ｍｌの緩衝液を調製する。

この溶液に２次抗体を加えた。この２次抗体は抗マウス−Ｆｃ−ＨＲＰ抗体複合 体である。例えば、あるプレートに、６ｍｌの１．５μｇ／ｍｌマウスＭａｂ溶 液を調製し、ｌμｌの抗マウス−Ｆｃ−ＨＲＰ抗体抗体スタフ加えた（これは、 ｌ：６０００希釈の抗体−ＨＲＰ複合体ζこ相当する）。この混合物をレセプタ ー−抑制物質インキュベーンランの間、インキュベートした。アッセイプレート をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて４回洗浄し、次に６０分間のインキュベーンラン の間に、５０μｌ／ウエルの抗体慢合体をプレート（こピペットで加えた。プレ ートを４回洗浄し、５０μｌの００１２％Ｈ２Ｏ２を含もＰＢＳ中の０．６７ｎ ＋ｇ／ｍｌオルトフェニレンジアミン溶液を用（Ａで発色反応を進めた。あるい は、１６＋ａＭクエン酸、５０ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４、ｐＨ５，０を基貫緩衝液と して使用し得る。５０μｌ／ウエルのＩ　Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止さ せる。プレートを４９２−４０５ｒ＋ｎ＋で測定し、データをフォーパラメータ フィツトで分析した。

５、フォンビルプラント因子−〇ＰＩＩｂｌｌｌａレセプターＥＬＩＳＡ（ｖＷ ｆ／ｌ１ｂｌｌｌｉ） マイクロタイタープレートを、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄらの方法（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５１：１６９−１７７　（１９８５））によって調製した １、　Ｏｊｔ　ｇ／ｍｌ　ＧＰＩ［ｂｌｌｌ、でコートし、コート緩衝液中で一 晩インキユベートした。次にプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中Ｏ０５％Ｔｖｅｅ ｎ２０）を用いて３回、５ｔ［し、１５０μｌのアッセイ緩衝液を加え、プレー トシェーカー上で、１から２時間室温でインキユベートした。プレートを３回洗 浄し、５０μｌのアッセイ緩衝液（アッセイ緩衝液＝０５％Ｂ５Ａ１５０　ｍＭ 　Ｔｒｉｘ、　１．０Ｏｎ＋Ｍ　ＮａＣｌ５１．０１１℃ＭＣａＣ１２、Ｌ、Ｏ ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１．０　ＩＩＩＭ　ＭｎＣｌ２；　：Ｉ−ト緩衝液も同じで あるがＢＳＡが含まれない）中２ｘ抑制物質を加えた。次に、アッセイ緩衝液に 溶解した５０μｍの４．０μｇ／ｍｌ　ｖＷＦ　（Ｌｅｄｆｏｒｄら、Ｔｈｒｏ ｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　６４（４）：５６９−５７５ 　（１９９０）のＳ己載Ｉこ従って調製）を加え、プレートンニーカー上、室温 で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、アッセイ緩衝Ｍ中の抗体 混合物（１，５０００マウス抗ｖＷＦおよび１　：　５０００ウサギ抗マウス− Ｆｃ−ＨＲＰ、いずれも市販されている）を加え、プレートシェーカー上、室温 で１時間インキュベートした。プレートを再度３回洗浄し、１００μｌの基ｗ緩 衝液（１０ｍｇ　ＯＰＤ、６．　ｊμｌ　Ｈ２Ｏ２，１５ｍ１　リン酸クエン酸 緩衝液）を加え、室温でインキュベートした。ＯＰＤ／Ｈ２Ｏ２の色調の変化は 、フィルターフォトメーターで４０５ｎｍを対照波長に４９２ｒｖで測定した。

大ｆｆ ビトロネクチンレセプター（Ｖｎ−Ｒ）のためのリポソーム結合アッセイ このアッセイは、ＰｙｔｅｌａらのＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１４４ ：４７５　（１９８７）に示されている方法に従って、少し修正を加えて実行し た。この文献は本明細書に参考のため援用した。簡単に述べると、ホスファチジ ルコリン（ＰＣ）　リポソームの標識されたものとされていないものを１．４の 割合で混合したものを、窒素下で溶解し、等量の（実施例ＴＩで述べたように精 製した）精製レセプターで希釈して、予め決定しておいたレセプター−リポソー ムの濃度比にした。次に、この混合物を、１　ｍＭのＣａ”を含有するリン酸緩 衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にて−夜４℃で透析を行った。透析された試料の１部 分をカウントして、放射能含有量を調べるために測定した。次に、レセプター− リポソーム混合物を希釈して単位容量当りの放射能を一定の値とした。

マイクロタイタープレートを１０μｇのビトロネクチンでコード口た。非特異的 部位を、５　ｍｇ／ｍｌのＢＳＡならびにＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２を各１　 ｍＭ金含有るＰＢＳ中にて３７℃で２時間、ブロックした。次に、プレートを１ 　ｍＭのＣａ“２およびＭ　ｇ＋　２を含有するＰＢＳで２度洗浄し、各ウェル に１００μｍのリポソーム−レセプター混合物を添加した。必要であれば、この 工程の前にペプチドを１−１０％の希釈で添加した。次に、プレートを４℃で２ ４時間インキュベートした。次の日、各ウェルの液を吸引し、プレートを１　ｍ ＭのＣａ“２およびＭ　ｇ　”　２を含有するＰＢＳで２度洗浄した。最後に、 ２％のＳＤＳを１００μｌ添加して、プレートを１０〜１５分間振盪し、上清を 回収してこれを攪拌し、液体ンンチレーションカウンティングにかけた。この処 置では、典型的にはウェルあたり全体では約１０００、および非特異的部位では １００のカウントになった。

実Ｊ１を竺 疎水性を増したＲＧＤペプチドの 血小板凝集および潜在能 ＢｏｒｎのＮａｔｕｒｅ　１９４：９２７−９２９　（１９６２）に示されてい る方法を使用して、血小板の凝集を調べた。この文献は本明細書にて参考のため 援用した。闇単に述べると、血小板凝集計（Ｍｏｄｅ１４００　ＶＳ、　Ｃｈｒ ｏｎｏ−Ｌｏｇ、　）Ｉａｖｅｒｔｏｗｎ、　ＰＡ、　ＵＳＡ）にて、血小板の 懸濁液を攪拌して、光透過性の変化を測定した。ＡＤＰを用いる研究を多血小板 血漿（ＰＰＰ）により行った。ＰＲＰは、最終濃度１１ｍＭで）クエン酸三ナト リウム中に採血されたばかりの全血を低速遠心分離（２００ｘ　ｇで１０分間） することにより得た。トロンビンを使用する研究では、ＰＰＰを２％のＢＳＡを 含有する二価イオンを除いたタイロード溶液中のセファロース２Ｂ　（Ｓｅｐｈ ａｒｏｓｅ　２Ｂ）でゲル濾過した。すべての研究で、参照標準は貧血小板血漿 であり、これは１０００　ｘ　ｇで５分間、ＰＲＰを遠心分離す一〇 ることにより得た。

凝集に関するすべての研究は、３　ｘ　１０”個／ｍｌの血小板の懸濁液を絶え ず攪拌しなから３７°Ｃで行った。（血小板のカウントは血球計により測定した 。）これらの！！ｉ４濁液にペプチドおよび刺激薬の１％の希釈液を添加した。

ＰＲＰおよびゲル濾過した血小板は血液採取の時点から３時間以内に使用した。

ペプチドの抗凝集潜在能を、生理学的投与量のＡＤＰ（１０μｍ１）およびトロ ンビン（２Ｕ／ｍｌ）により刺激される最大凝集反応の抑制に対する投与量−反 応曲線により測定した。各ペプチドの５０％抑制濃度（ＩＣｓｓ）をこれら曲線 の回帰分析により測定した。

別の研究においては、少し修正を加えた凝集アッセイを使用した。この修正され た方法は以下の通りであり、その結果を表１１に示す。ヒト多血小板血漿（ＰＲ Ｐ）にて血小板凝集アッセイを行った。５０ミリリツターのヒト全血（９ノイー ト）を、少くとも２週間の間、アスピリンまたは類似の薬物を服用していないド ナーから、３６％のクエン酸ナトリウム（１／ｆ−））中に採血した。この血液 を２２°Ｃで１０分間、１６０　ｘ　ｇで遠心分離し、５分間放置した後、ＰＲ Ｐをデカンテーシヨンにより取り出した。

２５分間、２０００　ｘ　ｇで遠心分離した後、残留血液から貧血小板血漿（Ｐ ＰＰ）を単離した。ＰＲＰの血小板カウントは、マイクロリッター当り血小板約 ３００．０００になるように、ＰＰＰを用いて希ＰＲＰの２２５μｌに、試験抑 制試料の希釈液またはコントロール（ＰＢＳ）のいずれかを２５μｍ加えて、こ れを３７℃でＣｂｒｏｎｏ−１ｏｇ全血血小板凝集計にて５分間インキュベート した。凝集剤（コラーゲン、Ｌ　ｕ　ｇ／Ｉｌｌ　；　Ｕ４６６１９．１００　 ｎｇ／ｌｌ１ｌ　；　またはＡＤＰ。

１７μＭ）を添加し、透過性を記録した。

疎水性を増したＲＧＤペプチドを、系統的に比較するために４つの区別できるク ラスに分類した。これらは、（１）トリペプチドＲＧＤのＡｓｐ残基の直後の部 位に位置する部分のサイズおよび疎水性を変化させた環状ＲＧＤペプチド（表Ｉ に示す第１部位および最後の部位はＡｒｇでの置換により変わり得る）、（２） 環状化のための架橋構造のサイズおよび疎水性を変化させた環状ＲＧＤペプチド 、（３）架橋構造、およびトリペプチドＲＧＤのＡｓｐ残基の直後の残基の両方 のサイズおよび疎水性を変化させた環状ＲＧＤペプチド、ならびに（４）上記３ つのクラスの１つに該当し、また疎水性部分に隣接した残基の荷電を変化させた 環状ＲＧＤペプチドである。表１は直鎖状および環状の両方の他のＲＧＤペプチ ドを比較のために示している。下線は、下線を引いた部分に含まれる竿１残基と 最後の残基との間の架橋を示す。

表Ｉに示すように、各クラスの環状の疎水性を増したＲＧＤペプチドのアナログ は、トロンビンまたはＡＤＰにより刺激された血小板に抑制効果を示した。８個 のアナログはトロンビンにより刺激された血小板凝集に対して１０μｍより少な いまたはこれにほぼ等しい抑制潜在能（ｌｃｓａ）を有し、一方、２２個がＡＤ Ｐに刺激された反応に対してこの範囲で、抑制潜在能を示した。例えば、テンプ レート構造、ＧＰｅｎＧＲＧＤ−Ｘ−ＰＣＡおよびＧＰｅｎＧ［（ＲＧＤ−Ｘ− ＲＣＡのｒＸＪ部位に疎水性残基フェニルアラニン（Ｆ）およびトリプトファン ＜Ｗ＞を含むことにより、ＧＰｅｎＧＲＧＤΔＡおよびＧＰｅｎＧ）ＩＲＧＤＬ ＲＣＡに比較して抗凝集抑制潜在能が向上した。この効果は、バラ−クロロ−フ ェニルアラニン（ＰｈｅＣｌ）、およびバラ−メチル−チロシン（ＴｙｒＭｅ） 　、０−ｎ−ヘキシルーチロシン、３．５−ノヨードーチロシン、０−ｎ−フチ ルーチロシン、ｐ−ニトロ−フェニルアラニンなどの、他の非天然の疎水性構造 によりさらに増強された。また、ＸＰｅｎ−ＧＲＧＤＳＰＣＡまたはＸＰｅｎ− ＧＦＩＲＧＤＬＲＣＡのｒＸＪ部位にアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｌ）など の正に荷電した部分を含むことによっても、抗凝集潜在能が増大した。さらに、 環状構造の外側に正に荷電した部分を含むことによっても、潜在能の高いペプチ ドが生成された。

テンプレート構造Ｇ−Ｘ−ＧＨＲＧＤＬＲＣＡのｒＸＪ部位のペニシラミンおよ びＰＩｌｐを有機化学的類似架橋構造に置換した。置換がｔ−ブチル−Ｐａ＋ｐ およびアミノ−Ｐａｐのみの場合は、ペプチドの抗凝集潜在能が減少した。一方 、血小板凝集アッセイにおいて、これらの部分およびＮ−末端Ｒを含有するペプ チド誘導体は、前述の環状ＲＧ、Ｄ構造、ＧＰｅｎＧＨＲＧＤＬＲＣＡおよびＰ 　吐旺匹匹践Ａより著しく優れた性能を示した。最後に、Ｇ（１−Ｐｅｎ）ＧＨ ＲＧＤＬＲＣＡにおける１−Ｐｅｎをペニシラミンのｄ形態により置換すると、 抗凝集潜在能が２倍低下した。

上述の改変により抑制潜在能が、原型のＧＲＧＤＳＰ直鎖ペプチドより１０から ２５０倍、および最初のコンフオメーシゴンを制限された環式ペプチドＧＰｅｎ ＧＲＧＤＳＰＣＡより２から５倍向上した。表＋＋に示す別の研究により得られ た結果（こより、これらの結を自はさらに確証される。

（以下余白） 実１ヱ［Ｌ上 ペプチドレセプターの選択力 血小板凝集実験（実施りＩＶに記載）と平行した研究において、ペプチドのＧＰ 　ｌｌｂ／１ｌｌａ、フィブロネクチンレセプター、およびビトロネクチンレセ プターに対する見かけの親和性を測定した。ペプチドの、レセプターのレセプタ ー特異的リガンドへの結合を置換する能力を調べるために、精製されたレセプタ ーを用いたレセプター結合アッセイ（実施例ＩＩＩおよびＩＶに記載）を使用し た。

表１に、血小板抑制潜在能との比較のために、提示したレセプターに対する各ペ プチドの相対親和性を示す。

結合データは、この場合も各ペプチドの５０％抑制濃度（ＩＣｓｌＩＳ）として 提示されており、これらは血小板凝集抑制に対する投与量−反応曲線により実施 例Ｖで述べたように測定された。

ＦｎＲに対するＩＣ５９をＥＬＩＳＡ　（実施例１１１）により測定した。Ｉ／ ｎＲおよびＧＰ　Ｉｌｂ／ｌ１ｌａに対しては、ＥＬ　Ｉ　ＳＡまたはリポソー ム結合アッセイ　（実施例ＩＶ）により測定した。ＧＲＧＤＳＰの原型ペプチド は、各々のペプチドに対するアッセイの比較を行うときの参照として使用される 。

表１１は、レセプター結合データを表に示す血小板抑制潜在能と比較して示す。

このデータはまた、各ペプチドの５０％抑制濃度としても示される。すべてのレ セプターアッセイの値を、実施例ＩＩ＋で述へたようにＥＬＩＳＡにより測定し た。表Ｉ＋に示す結果は、表１から引き出される結果をさらに確証する、すなゎ ち、抗凝集潜在能はＩ　Ｉｂ／　Ｉ　ｌ　［ａレセプターに対する相対親和性と 平行する。

え引駐ユ 電気的に誘導されたイヌの冠状動脈血栓症に対する効力１、手術の準備および器 具 体重１４から２０ｋｇの雄の雑種犬を、アラキドン酸、コラーゲン、およびアゾ ／ノンニリン酸（ＡＤＰ）に反応して血小板が適切に凝集するかどうか、および 体重および血行力学特性が類似しているかどうかに基づいて選択した。

手術前、動物にベントパルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ。

静脈注射）により麻酔をかけ、次に挿管して、容１１３０　ｍｉ／ｋｇおよび呼 吸数１２回／分で人工呼吸器（ｔｌａｒｖａｒｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ、　Ｓ、 　Ｎａｔｉｃｋ、　ＭＡ）を使用して、圧力をかけて室内空気を通気した。手術 は無ｍ環境下で行われ、先ずカニ二−レを左頚動脈および頚静脈に配置して、動 脈血圧のモニター（５ｔａｔｈａ＋ｓ　Ｐ２３　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｔｒａｎｓ ｄｕｃｅｒ、　Ｇｏｕｌｄ、Ｉｎｃ、、　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐｒ 。

ｄｕｃｔｓ、　０ｘｎａｒｄ、　ＣＡ）および静脈流の管理を行った。

第５肋間の間隙で左開胸を行うことにより心臓を露出した。

左回旋冠状動脈（ＬＣＣＡ）の２ｃｍの部位を大針（ｂｌｕｎｔ）切開により周 囲の組織から離した。この動脈に、近位から遠位に向かって、電磁流プローブ（ Ｍｏｄｅｌ　５０１．　Ｃａｒｏｌｉｎａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｉｃｓ、Ｉｎｃ、Ｋｉｎｇ、　ＮＣ）　、冠状動脈内電極、およびスクリューオ クルダー（図１参照〉を配置した。冠状動脈内電極は、２５ゲージの皮下注射針 の先端を３０ゲージのテフロンにより絶縁された銀被膜銅線に接着させることに より作製した。

機械的なオクルダーは、先端にテフロン製スクリュー（直径２　ｍｍ）を宵する Ｃ字状のステンレススチールにより作製した。

これを、血管の環境を制御し、１０秒間の（完全な）閉塞によって反応性充血流 動を、基底冠状動脈血流に影響を与えずに５０−７０％低下させるように調整し たく図１〉。単極心外膜電極を、心室表面のＬ　ＣＣＡの分布領域に縫い合わせ 、心電図（ＥＣＧ）で虚血の変化をモニターした。左心房にポリエチレン管を挿 入してペプチドを投与した。血圧、リム誘導（ｌｉｍｂ　１ｅａｄ）　ＩＩＥＣ Ｇ、心外膜電位図、ならびに平均および位相性ＬＣＣＡ血流の連続記録をモデル ７ポリグラフ（Ｇｒａｓｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、、　Ｑｕｉｎｃｙ、 　ＭＡ）上に得た。

２冠状動脈血栓症の誘発 手術完了１時間後、９ホルトのニッケルーカドミウム電池から配電されるｌＯＯ マイクロアンペアの連続した陽極直流を、ＬＣＣＡの脈管内膜表面に流した。電 池の陽極は２５（１，０００オームの電位差計および冠状動脈内電極と直列連結 した。この電気回路は皮下部位に陰極を配置することにより完成した。電気刺激 を３時間加えた。各実験の終わりには、心臓は電気的に細動し、直ちに除去され た。また、ＬＣＣＡを、移植した陽極電極の位置を確認するために可能な限り遠 くまで自由に切開した。

すべてのエノクスビポにおける研究（図３参照）の対照の凝集値を、ＰＲＰおよ びＰＰＰ試料において観測された光透過性のパーセンテージ（各々０％および１ ００％）に対して標準化した。

３、ペプチドの投与 動物を、賦形剤対照（すなわち通常の生理食塩水）または様々なａ度のＲＧＤペ プチドの２つの治療群に任意に割り当てた。

ペプチドをポーラスおよび連続注射の両方で動脈内に投与した。各ポーラス注射 は０５から１０　ｍｇ／ｋｇよりなり、電流を流す１５分前に投与した。次に、 同じペプチドの連続注入をこの最初の注射後すぐに開始した。動物は２５μｇ／ ｋｇ／分から２００μｇ／ｋｇ／分の注入を受けた。ペプチドの抗血栓症効果を 、永続性閉塞性血栓の発現後３０分間、または電気刺激の開始後５時間（何れか 最初に終了する方）にわたって監視した。電流を流した後４時間以内に閉塞性血 栓が発現しなかった場合は、ペプチドの注入を中止した。

４、血小板の研究 血小板カウントおよびエノクスビボにおける凝集研究を、陽極直流を流す１時間 前、および１．３、および５時間後に行った。動脈血液の試料を、３８％のクエ ン酸三ナトリウム（最終的に１−１０の希釈になる）を含宵するプラスチック製 ンリンジに採血して、実施例Ｖで述べたように血小板凝集を測定した。

総称的アナログＧＲＧＤＳＰと同様に、ペプチドアナログ２Ｇ（ＧＰｅｎＧＨＲ ＧＤＬＲＣＡ）、４Ｑ　（ＲＰｅｎＧＨＲＧＤＷＲＣＲ）、および４Ｒ（ＲＰｅ ｎ（ＪＧＤＷＰＣＲ）の抑制潜在能を、１０μｍのＡＤＰ、　０．６５　ｍＭの アラキドン酸（ＡＡ）、または９．６マイクログラム／ｌｌ１ｌのコラーゲンに より最大限に刺激されたイヌの血小板凝集に対して測定した。アラキドン酸によ る刺激を行う前に血小板を活性化するために、エピネフリン（５５０ｎＭ）を使 用した。ペプチドの１％の希釈液をＰＲＰ溶液に加えた。注射されたペプチドす べておよび総称的アナログＧＲＧＤＳＰの相対的抗凝集潜在能を、投与量−反応 分析（図２参照）により、電流を流す１時間前に測定した。最大活性の５０％抑 制（ＩＣｓｓｓ）を引き起こすペプチド濃度は、これら投与量−反応曲線の直線 回帰から得られた。これら抑制潜在能を計算する際、対照の値（すなわちペプチ ドが含まれない場合）を最大値の１００％とみなした。

図示するように、アナログ４Ｑおよび４Ｒは、１，５〜５μｍで５０％凝集を抑 制するという優れた潜在能を示した。アナログ２Ｇは、１ｃｓｓが１５〜３０μ ｍで潜在能は僅かに劣り、ＧＲＧＤＳＰは３つの反応すべてを約１３０マイクロ モルで５０％抑制した。注目すべきことに、潜在能の順序（４Ｑ　＝　４Ｒ＞　 ２０　＞　ＧＲＧＤＳＰ）およびこれらの反応に対するこれらペプチドのＩＣ５ ８は、ＡＤＰ、コラーゲン、およびアラキドン酸に各々刺激されたヒトの血小板 凝集の抑制に対して見られるものと同じであった。

また、血小板凝集をエノクスビボで、４４Ｉ７ｔを流ス１．３、および５時間後 にエックスビボにより測定した。これらの研究では、血小板を刺激するためにア ラキドン酸またはコラーゲンを再び使用した。

図３に、これらの研究において測定された、すべてのペプチド処置に対する平均 凝集値を示す。（これらのヒストグラムにおいては、０％および１００％の凝集 は、各々、刺激薬添加前のＰＲＰおよびＰＰＰの光透過性の程度を示す。）３つ の時点すべてにおいて、１ｏ　ｍｇ／ｋｇで注射すると、アナログ２ＧはＡＤＰ により刺激された凝集を実質的に抑制したが、ＡＡおよびコラーゲンにより刺激 された反応は部分的に抑制しただけであった（対照レベルに対して各々４３〜７ ０％および１２〜５０％）（図３ａ）。

図３ｂおよび３Ｃに示すように、アナログ４Ｑおよび４Ｒのエックスビボにおけ る抗凝集効果ははるかに優れていた。アナログ４Ｑを５　ｍｇ／ｋｇ注射するこ とにより、血小板は３つの時点すべてにおいてＡＤＰおよびＡＡによる刺激に完 全に無反応となり、コラーゲンによるこれらの活性化は、はぼ最大限に抑制され た。

（ここで、バーの記載のないものは対応する反応がなかったことを示す）図３ｂ に示すように、同じ注射時のこの同じペプチドの効果は、血小板カウントが低い 、すなわち、通常の約３分の１　（１０４，０００／ｍｌ対３６１．０００／＋ １）のとき、より顕著であった。注射の濃度がもつと高いとき（１０＋ｍｇ／ｋ ｇ）、アナログ４Ｑは１および３時間経過時点で３つの刺激すべてによる血小板 凝集を抑制した。５時間経過時点では、血小板反応性は僅かに向上した。これら の研究における対照の反応は最大値の７０〜８０％であった。図３０に示すよう に、アナログ４Ｒは３ｍｇ／ｋｇで血小板の反応性に明白な時間依存効果を示し た。つまり、凝集は、対照レベルに対して、１時間では２０〜５８％減少しただ けであるが、３および５時間では７５〜１００％減少した。最後に、このアナロ グをｉｏ　ｍｇ／ｋｇ注射することにより、血小板はすべての時点においてすべ ての刺激方法に対して非反応となった。このときコントールの反応は最大値の５ ５〜８０％であった。

５冠状動脈血流および血栓症に対するペプチドの効果冠状動脈血栓症を完全閉塞 へ至る時間として定量化した。

冠状動脈血栓症に対する様々なペプチドによる治療の効果を図４に示す。対照条 件（生理食塩水注射）では、２時間を僅かに越えた時点で完全閉塞が見られた。

アナログ２Ｇは１０　ｍｇ／ｋｇであってもこの度数に著しい影響は与えなかっ た。アナログ４Ｑは５　ｍｇ／ｋｇでは閉塞にいたる時間を著しく延長し、１０ 　ｍｇ／ｋｇで５時間に及ぶ実験期間の間、完全に閉塞を妨げた。さらに、少な い投与量では（５ｍｇ／ｋｇ）アナログ４Ｑは循環している血小板レベルが通常 の３分の１である動物においては血栓の形成を防ぎ得た。アナログ４Ｒは１０　 ｍｇ／ｋｇでは実験期間を通して閉塞を妨げたが、３　ｍｇ／ｋｇでは効果はな かった。

これらの研究において、抗血栓症効果の程度は、上述の抗凝集潜在能と一致する ように見えた。例えば、アナログ４Ｑおよび４Ｒはインビトロにおける凝集の優 れた抑制物質であるが、また同じ注射濃度のアナログ２Ｇよりインビトロにおい て極めて大きい防御効果を示した。さらに、これらのペプチドは、これらが（１ ０ｍｇ／ｋｇで）作動薬のすべてによる血小板への刺激を完全に抑制するときだ け完全閉塞を防ぐことができた。

しかし、アナログ４Ｑ　（５ｍｇ／ｋｇ）は完全にまたはほぼ最大限にすべての 凝集反応を抑制したか、冠状動脈閉塞を単に延期し得ただけであった。さらに、 アナログ４Ｒは３１７ｋｇで３および５時間の時点で７２〜１００％、凝集反応 を抑制したが、これらの時点では、閉塞性血栓は十分に発現していた。最後に、 これらのペプチドは、インビトロにおける凝集に対する、これらの１ｃｓａの２ ０から５０倍に等しい注射濃度においてのみこのモデルにおける閉塞を完全に防 ぐことができた。

６、血行力学的反応 ペプチド投与の１時間前、および１．３、および５時間後における出血時間を定 量化した。これは、舌に小さな（長さ５　ｍｍおよび深さ１．５　ｍｍ）切開部 を形成し、出血が止まるまで１枚のワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）フィルター紙 により１５秒ごとにこの部位ににじみ出た血液を連続して吸収することにより行 った。血小板のカウントはＨａｅｍａ　Ｃｏｕｎｔ　ＭＫ−４／）Ｉｃ血血小板 ラウントンステムより測定した。

このように明らかにペプチド濃度が高すぎても、テンプレート出血時間、血小板 カウント、または主要な血行力学ノｆラメータ（心拍数および血圧）に有意な影 響を与えないことに注目するのは重要である。これらは実験期間（図５）を通し て本質的には変化はなく、また基準値近くに維持された。ペプチド処理が閉塞を 防止しない場合には、閉塞性血栓形成により回旋冠状動脈血流が停止した３０分 後に実験を終了したため、測定時間によってはこれらのパラメータは測定されな かった（表ＩＩのＮＤ）。

（以下余白） 叉１」υ上は プロテーゼ動脈移植片中の、疎水性が向上したＲＧｄペプチドの抗血栓特性 これらの研究において、成体の雄のヒヒ（体重１６から２５　ｋｇ）を用いた。

これらを、ケタミン塩酸塩（Ｚｏｏがら２５０　ｌｌ１ｇを筋肉的注射）で鎮静 し、ソジウムベントバルビタール（必要ニ応じて５０から７５１１１ｇを筋肉内 投与）で麻酔状態に維持した。

エノクスビボンヤントを確立する２４時間前に、試験動物からの血液５００　ｍ ｌから血小板を分離し、インジウム−１１１オキシン（Ｍｅｄｉ＋Ｐｈｙｓｆｃ ｓ、　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、　ＣＡ）約５ａｏ−ｖイクロ牛ユリ−で標識した 。インジウム−１１１オキシンは、５０％の効率で、不可逆に、且つ、特異的に 血小板に結合する。その後、標識の直後に、これらの血小板を動物に注射して戻 し、２４時間循環させた。動物から分離してヨード−１３１で標識していたフィ ブリノーゲン（ＤｕＰｏｎｔ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）もま た、研究の開始直前に、動物に注射して戻した。また、この時、凝固およびテン プレート出血時間の基線決定も行い、血液学研究のために血液試料を採血した。

エノクスビボ／ヤントを確立するために、大腿動脈および静脈に、導入器を用い てカテーテル（ＫＭＡ　Ｉｎｃ−、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ。

ＭＡ＞を経皮カニユーレ挿入した。その後、医療用に使用可能なレベルの、ヘパ リンコートしたサイラスティック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）管（内径２．５９　ｍｍ 、　（Ｅｘｔｒａｃｏｒｐｏｒｅａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｐｅｃｉａｌｔｉｅ ｓ。

Ｉｎｃ６．　Ｋｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｕｓｓｉａ、　ＰＡ）に、カテーテルを連結 した。その後、電磁流プローブを、プローブに対して遠位の、部分的に閉塞する スクリュークランプによって与えられた抵抗を変化させることによって、管に挿 入した。最後に、　（内径）４ＩＩＩＴ１で長さ５　ｃ＋＊の、血管移植片の試 験セグメントを、回路の頂端に挿入した。これらの研究で用いた移植片は、Ｇｏ ｒｅ−ｔｅｘ　（展伸したポリテトラフルオロエチレン（Ｗ、Ｌ、　Ｇｏｒｅ　 ａｎｄ　Ａｓ５ｏｃｉａｔａｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｆｌａｇｓｔａｆｆ、　Ａｚ） ）であった。その後、電磁流プローブを管の回路に挿入することにより、血流量 を測定し、プローブに対して遠位の、部分的に閉塞するスクリュークランプによ って与えられた抵抗を変化させることによって、血流量を１００　ｍｌ／分に維 持した。最後に、　（内径）４ｍｍで長さ５ｃｍの、血管移植片の試験セグメン トを、回路の頂端に挿入した。これらの研究で用いた移植片は、Ｇｏｒｅ−ｔｅ ｘ　（！伸したポリテトラフルオロエチレン、Ｗ、Ｌ、　Ｇｏｒｅ　ａｎｄ　Ａ ｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｆｌａｇｓｔａｆｆ、　ＡＺ）であった。

移植片への血小板の沈着を、ガンマカメラ（Ｓｊｇ＋Ｉｌａ　４００．０ｂｔｏ 　Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｉｎｃ、、　５ｏｈｏｎ、　ＯＨ）を用いた動的スキャンに よってモニターすることにより、１″インジウム標識した血小板によって発射さ れるガンマ線放射を検出した。回路が載置されると、このカメラの下に動物を置 き、血流を開始した。その後、２時間に亘って２分毎に１フレームの速度でスキ ャンを撮った。これらのスキャンから得られたデータを、専用のディジタルＭＤ Ａコンピュータ（Ｍａｙｎａｒｄ、　ＭＡ）に収集した。移植片のサイズ、同位 体の量および崩壊、循環血小板活性およびバ、タグラウンド、そして移植片の表 面積に応じて、スキャンを修正した。

１時間および２時間を経た時点で、テンプレート出血時間を測定し、血液学凝集 研究を評価するために、血液試料を採血した。血小板凝集研究は、実施例■に記 載したように、刺激薬としてＡＤＰを用いて行った。

第２の、同一の／ヤントを動物に取り付けた後、静脈（１’／）注射として抗血 小板ペプチドＧＰｅｎＧＨＲＧＤＬＲＣＡを投与した。その後、第２のスキャン 群を得ることにより、移植片の血小板取り込みパターンに対するペプチドの効果 を確認した。

各々の研究の完了後、各々のシャントを、乳酸加リンガー液で洗浄し、その後、 各々の移植片をはずした。これらの移植片の複数のセクションを液体ンンチレー ション測定にかけることにより、これらの移植片の、残存１３１ヨード−フィブ リノーゲンおよび２目インジウム−血小板の含有量を判定した。

その後、大腿動脈および静脈中のカテーテルを除去し、圧縮によって止血した。

最後に、実験後の血液試料を採血し、テンプレート出血時間および凝固時開の判 定もまた行った。

動物による相違を説明するために、３匹の異なる動物を用いた。移植片物質上で １ｌｌＩｎ標識した血小板をガンマカメラで捕らえた画像から判定したところ、 ３匹の試験動物のうち２匹は、正常な血小板取り込みパターンを示した。これら ２匹の動物に対する処置を以下に述べる。

これらの動物のうちｊｌ？７７の動物において、２回のポーラス１ｖ注射として １０　ｍｇ／ｋＨのペプチド（−回の注射につき１６０１１１ｇ）を投与した。

第２のシャントが確立する１５分前に一回巨の注射を行い、それから１時間後ｊ こ２回目の注射を行った。図６に示すように、これらの注射は、ロ’Ｉｎ−血小 板と１３１１−フィブリ／−ゲンの両方の取り込みにおいて大幅な減少（各々９ ０％および７９％）を引き起こした。この抑制効果は、この研究の全期間に亘る 、ペプチド処置した、および未処置、の移植片における血小板取り込み速度のプ ロットからも明かである（図７）。ここで、＋１１１ｎ標識した血小板の蓄積は 、移植片中で観察された測定値から、スキャンを実施した各時点での管のバック グラウンド部で見られた測定値を引いた数を表す。

図８に示すように、ペプチド処置は、テンプレート８血時間および凝固時間を減 少させなかった。しかし、第２のシャントの完了直後に採取した血液試料におい て、白血球および血小板力クントが、各々３７％および１４％減少した。他のパ ラメータは、影響を受けなかった。

第２の動物について、第２のシャントの開始１５分前に、１０ｍｇ／ｋｇのペプ チドを再びポーラス（２５０ｍｇ）ＩＶ投与した。この直後に、１０　ｍｇ／ｋ ｇ／時を連続注入して、これを少なくともシャント（全５００　ｍｇ）を行った 全２時間中続けた。図９に示すように、この処置は、標識した血小板および標識 したフィブリノーゲンの取り込みを大幅に減少させた（各々８４％および７８％ ）。ペプチドの存在下および不在下で、再び血小板の取り込み速度をプロ、トシ た（図１０）。

さらに、第２の動物から得たＰＢＦ上で血小板凝集の研究を実施した。対照およ び実験的シャントの両方の、３つの時点（０，１および２時間後）において、全 血液を取り出した。ＡＤＰの、最大限に効果的な濃度（１０μ請）において、血 小板は、ペプチド処置に全く無反応であった。ペプチド処置はまた、テンプレー ト出血時間にも、凝固時間にも、またいかなる血液細胞のカウントにも効果をも たらさなかった。

Ｋ１匹旦 出血時間および工７クスビボ血小板凝集ウサギモデル１、動物のＲ１！および血 液試料 麻酔をかけていない雄のニューシーラント白ウサギ（２，５−３、ｓｋｇ）を標 準的なウサギレストレーナ−に入れた。耳の毛を剃り、流量スイッチ（Ｖｉｇｇ ｏ）を備えた２０Ｇテフロンカテーテルを内側動脈に入れ、生理食塩水で洗浄し 、ヘパリン化生理食塩水（１０ｍ／ｍｌＨｌｌ１ｌでロックした。注射キ（ｐ　 ｙプ（Ｍｅｄｅｘ）を備えた２２Ｇカテーテル（Ａｂｂｏｔｔ＞を、同じ耳の辺 縁静脈に入れた。

ｌから３　ｍｇ／ｍｌの濃度で、生理食塩水またはＧＰ　Ｉｌｂｌｌ１ｍレセプ ター拮抗薬を、静脈中のカテーテルを介して注入した。０時において、２分間に 亘ってポーラスとして、注入量の４１％を与えた。その後６０分間に亘って、残 りを連続的に注入した。

−１０、−５，１０，４５、および６０分の時点において、動脈中のカテーテル を介して、針のない注射器に血液試料（３，２ｍ１）を収集した。最初の０．５ ｍｌを廃棄し、続＜２．７ｍｌを、３．８％クエン酸ナトリウム０．３ｍｌを含 有する注射器に直接収集した。試料を、１．５　＋ｍｌづつの部分に分割し、室 温で５秒間、１２．０ＯＯＧで遠心分離した。得られた、多血小板血漿（ＰＲＰ ）を、エノクスビボ血小板凝集（ＸＰＡ）を測定するために用いる。−１０およ び６０分の時点において、別の試料１．５ｍｌを、自動血液測定（Ｂａｋｅｒ　 Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のために取り出す。各試料毎に、カテーテルを洗浄し 、ロックする。

２、エックスビボ血小板凝集 ＰＲＰ　３００　ｍｌを、撹拌棒を備えた使い捨てのガラスキュベツトに入れた 。キュベツトを、光透過型血小板凝集計（Ｃｈｒｏｎｏ−１ｏｇ）の、温度規制 した光路上に載置し、３７°Ｃに平衡した。基線の透過率を３０秒間記録し、そ の後、ＡＤＰ（１ｉＭ）　１０　ｍｌを添加して、透過率の変化を記録した。基 線（ｄＴ）からの最大変化量を、各々の試料について記録した。抑制物質によっ てもたらされたＸＰＡの抑制程度を、以下のように、各々の動物に対して計算し た：注入前および注入後の平均のｄＴを計算し、その後、抑制率を、（１−ｄｔ （注入後）／ｄｄｔ（注入前））Ｘ１００で計算した。

３、皮膚出血時間（ＣＲＴ） −１０、−５，１０、および４５分の時点において、自動切開装置（Ｓｕｒｇｉ ｃｕｔｔＲ，ＩＴＤ）を用いて、反対側の耳で、ＣＢＴを測定した。

耳の背側表面の、主要な血管が到達しない部位に、切開部（５ｍｍ　ｘ深さＩＩ ＩＩＩｌｌ）を設けた。切開部位近傍に載置した吸収性の紙で、２から１５秒毎 に最高１５分間に亘って、血液を吸い取った。切開部位で１５秒間出血がない時 を、出血の停止と定義した。４０匹の正常なウサギにおける同型のＣＲＴの範囲 は、０．８８から３．３８分であった。

４、末梢血流（ＰＢＦ） 表Ｉに要約されている実験のために、注入前および注入中に、ウサギの耳の血管 の状態を観察することにより、ＰＢＦをモニターした。耳がピンク色から赤色を 呈し、主要な血管の狭搾が見られない状態を、正常流と定義した。抑制物質の注 入開始後、最高４０分間、血管を狭搾し、その結果、血流を減少して耳を冷たく 青白くした。

別の一連の実験において（表２）、レーザードプラー流プローブ（Ｐｅｒｉｍｅ ｄ）を用いて、ＰＢＦを定置的に測定した。一方の耳の血管床上にプローブをし っかりと位置づけ、血流を連続的にモニターした。反対側の耳に、各々の抑制物 質を注入し、ＣＢＴを測定した。血液試料採取のために動脈カテーテルを入れた すせず、その結果、これらの動物体内でＸＰＡを測定した。しかし、使用した量 は上記の実験で示したもので、これにより、効果的にＸＰＡを抑制した。

５、結果 図１２にＣ１３ＴＳＸＰＡ、およびし察したＰＢＦを要約した。各々の動物に関 して、処置後（および注入中）の試料２個の平均値を、処置前の試料の平均値で 割ることにより、処置前のＣＢＴに対する処置後のＣＢＴの割合を計算した。生 理食塩水の対照の２匹のウサギにおいては、処置前のＣＢＴの平均値に対する処 置後のＣＢＴ（ｎ＝ｌｏ）の、平均値士標準偏差は１．．１２±０１９であった 。

レーザードプラープローブによってＰＢＦを測定する実験を、表Ｉｌ＋に要約す る。正の対照として、エピネフリンをａ　ｏ　分間り脈注入（２分間に１　ｍｇ ）　Ｌ、た。その結果生じた血管狭搾は５分間以内に血流を、はとんどＯ流単位 にした。

図１２および表ＩＩ＋に挙げた量は、ポーラス部分のみを示す。

測定した血液指数のいづれもに大きな変化はなかった。

表ＩＩ＋ １組　ＩＦ、’Ｉ−山ムユ　に−Ｌ辷二　ＥＪＩＬｊ社」ユＲＰ釦二医Σ五ＲＯ ２，８２８２ ３，７５ｍｇ／ｋｇ　１０　１．５　９４５　．１ｉｌｔＬ７．、ｒ；、　５ｔ ｌ’ｌｉｊしｚ＝ｒ７：　。

Ｒ−ＲＯ２，９３９２ １，５ｍｇ／ｋｇ　１０　０．１１　５４５　１．５　３６０ Ｒ−０ｅＲＯ１１３１ １５ｍｇ／ｋｇ　１０　３．８　０ ＡｃＮＲ−ＯＭ　ＮＨ２０１，８２６コ４．５　ｍｇ／ｋｇ　１０　２．２　３ １７４５　コ＋０　２９３ （工・奸余白ン 叉上目１瓦 その他の結果 血小板凝集のエノクスビボ抑制を測定するために実施例■で説明した方法を用い 、且つ、出血を測定するために実施例Ｖｌ＋で説明した方法を用いて、別の４個 のペプチドを試験した。

これらのペプチドには、ＩＩＪ、　ＩＩＱ、１１に１　およびＬＩＶが含まれて いた。結果を表１ｖに示す。４個のペプチド全てが、示した量においてエノクス ビボ血小板凝集を抑制したが、ペプチド１１Ｊ、　ＩＩＫ、およびＩＩＶは出血 時間を大幅に延長し、逆にＩＩＱは、出血時間に影響を与えなかった。これらの 結果は、ペプチドを抑制する血小板＃集土で、出血時間を延長しないという特徴 を与えるのは、ＩＩＱが有するような、＋４位における正の苛電の存在であると いうことを確認した。

〈以下余白） 表Ｖ Ｆ工ＧｔＪＲＥ　ｌ Ｆ’！ＧｔＪＲＥ　２ Ｌｏｇ　［へ＝７°す）’Ｌ　ｌ−ＬＭｒＩＧｔＪＲＥ　３ａ （ｇ＋閘） 口５団ｔ４ 釆り状ｉｐ＃＆ｈνＦ全痕＋−１１するへ°７°テト“ｎ号〆冬Ｃｏｎｔｒｏｌ 　１３６　ｔ　Ｉｓ　（１３）アｔｐ７・・　２Ｇ　１２７±４１　（３）ｌＯ ■／に９ アｉｏ７”４Ｑ Ｓ　ｍｇ／ｋｇ　１６５　ｔ　１０　（２）’５■／に９　＞３００　（２） （イ匹加−小隷１ウント　） １０　ｍｇ／ｋｇ　＞　３００　（１）ｃアアヮ７・・４Ｒ ３ｍｇ／ｋｇ　、９５　（１） １０　ｍｑ／に９　＞　３００　（１）’”　ｎｌコｒＱ　ｔｓ７１（４’ｌ− ”１ｌｒＸ宇１ｔ　９＞ｑｉ；ｒ：５ｅｈｔ１ｈｂ。

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このようなペプチドは、血栓症を治療するために、適当な、生理学的に受容可能 なキャリア中において、投与し得る。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ＲＧＤ配列のカルボキシ末端に隣接する疎水性部分を有するペプチドを含む 、環状ＲＧＤを含有する物質の組成物。
2. ２．配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＤＸ５Ｘ６Ｘ７を有する環状ペプチドを含有する物 質の組成物であって、Ｘ２およびＸ６が、架橋を形成し得る部分を含有し、Ｘ３ が、１個またはそれ以上のアミノ酸であり、そしてＸ１およびＸ７が、ゼロから ２０個のアミノ酸であり、そしてＸ５が、疎水性部分を含有し、そしてＸ４が、 正に荷電したアミノ酸である、組成物。
3. ３．Ｘ２およびＸ６が、Ｃｙｓ、Ｐｅｎ、Ｐｍｐ、Ｐｍｃ、およびＰａｓから成 る群から選択される、請求項２に記載の物質の組成物。
4. ４．Ｘ３が、カルボキシ末端残基としてＰｒｏまたはＨｉｓを有する、請求項２ に記載の組成物。
5. ５．Ｘ１が、カルボキシ末端残基としてＧｌｙを有する、請求項２に記載の組成 物。
6. ６．Ｘ５が、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＰｈｅＣｌ、ＣｈＡ、ＴｙＭｅ、０−ｎ−ヘキシ ル−Ｔｙｒ、３，５−ジヨード−Ｔｙｒ、Ｈｐａ、２−Ｎａｌ、０−ｎ−ブチル −Ｔｙｒ、ｐ−ニトロ−Ｐｈｅ、Ｐｈｇ、Ｐ−ヨード−Ｐｈｅ、Ｐ−アミノ−Ｐ ｈｅ、およびＣｉｔから成る群から選択される、請求項２に記載の物質の組成物 。
7. ７．Ｘ４が、ＡｒｇおよびＬｙｓから成る群から選択される、請求項２に記載の 物質の組成物。
8. ８．Ｘ５が、さらに、正に荷電した部分を含有する、請求項２に記載の組成物。
9. ９．実質的に出血時間を長引かせることなく、活性を抑制する血小板凝集をなす 環状ペプチドを含む、ＲＧＤ結合部位を含有する物質の組成物。
10. １０．さらに、ＲＧＤ配列のカルボキシ末端に隣接する疎水性部分を含有する、 請求項９に記載の組成物。
11. １１．さらに、前記結合部位のカルボキシ末端に位置づけられた、正に荷電した 部分を含有する、請求項９に記載の組成物。
12. １２．環状ペプチドを含む−ＸａＧＤＸｂ＊−結合部位を含有する物質の組成物 であって、Ｘａが、正に荷電したアミノ酸であり、Ｘｂが、活性を抑制する血小 板凝集を与えるための、１個またはそれ以上のアミノ酸、または、他の部分であ り、＊が、該組成物を動物に投与した時に、出血時間が、未処置の動物よりも実 質的に増加しないように、該結合部位に対して適当な空間的に近い位置に位置づ けられた、正に荷電した部分である、組成物。
13. １３．さらに、Ｘａのアミノ末端に隣接するプロリンを含有する、請求項２に記 載の組成物。
14. １４．前記環状ペプチドが、約５０個よりも少ないアミノ酸残基を含む、請求項 ２に記載の組成物。
15. １５．前記環状ペプチドが、約２５個よりも少ないアミノ酸残基を含む、請求項 ２に記載の組成物。
16. １６．前記環状ペプチドが、フォンビルプラント因子の、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ への結合よりも、フィブリノーゲンの、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合を抑制す る、請求項１または２に記載の組成物。
17. １７．ＲＰｅｎＧＲＧＤＷＰＣＲ ＧＰｅｎＧＨＲＧＤＬＲＣＡ ＲＰｅｎＧＨＲＧＤＷＲＣＲ ＲＰｅｎＧＨＲＧＤ（ＣｈＡ）ＲＣＲ ＰｍｐＧＨＲＧＤＬＲＣＡ Ｇ（ｄＰｅｎ）ＧＨＲＧＤＬＲＣＡ Ｒａ（ａｍ−Ｐｍｐ）ＧＨＲＧＤＷＲＣＲＲ（ａｍ−Ｐｍｐ）ＧＨＲＧＤ（Ｔｙ ｒＭｅ）ＲＣＲＲ（ａｍ−Ｐｍ）ＧＨＲＧＤ（ＰｈｅＣ）ＲＣＲＲ（ａｍ−Ｐｍ ｐ）ＧＨＲＧＤＬＲＣＲＲ（ａｍ−Ｐｍｐ）ＧＨＲＧＤＬＲＣＲＲ（ｔ−ｂｕｔ −ａｍ−Ｐｍｐ）ＧＨＲＧＤＬＲＣＲＡｃ−ＣＮＰＲＧＤ（Ｙ−ＯＭｅ）ＲＣＮ Ｈ２Ａｃ−ＣＮＰＫＧＤ（Ｙ−ＯＭｅ）ＲＣ−ＮＨ２ＡｃＣＮＰＲＧＤ（Ｏ−Ｎ −ブチル−ＹＯＲＣ−ＮＨ２から成る群から選択される、ペプチド。
18. １８．生理学的に受容可能なキャリア中における、請求項１、２、９、または１ ７に記載の物質の組成物。
19. １９．血栓症を治療または予防する方法であって、ＩＩｂ／ＩＩＩａに対しては 高い親和性、そしてフィブロネクチンおよびビトロネクチンレセブクーに対して は低い親和性を有する、環状ＲＧＤ含有ペプチドを、治療上効果的な重で投与す ることを包含する、方法。
20. ２０．血栓症を治療または予防する方法であって、生理学的に受容可能なキャリ ア中における、請求項１、２、９、または１７に記載の組成物を、治療上効果的 な量で投与することを包含する、方法。
21. ２１．血管移植片閉塞を治療または予防する方法であって、ＩＩｂ／ＩＩＩａに 対しては高い親和性、そしてフィブロネクチンおよびビトロネクチンレセプター に対しては低い親和性を有する、環状ＲＧＤ含有ペプチドを、治療上効果的な量 で投与することを包含する、方法。
22. ２２．血管移植片閉塞を治療または予防する方法であって、生理学的に受容可能 なキャリア中における、請求項１、２、９、または１７に記載の組成物を、治療 上効果的な量で投与することを包含する、方法。
23. ２３．望ましくない血小板凝集を特徴とする病気（ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）を治療 または予防する方法であって、生理学的に受容可能なキャリア中において、請求 項１、２、９、または１７に記載の組成物を、治療上効果的な量で投与すること を包含する、方法。
24. ２４．望ましくない血小板凝集を特徴とする前記病気が、発作である、請求項２ ３に記載の方法。