JPH0552192B2 - - Google Patents
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- JPH0552192B2 JPH0552192B2 JP60249851A JP24985185A JPH0552192B2 JP H0552192 B2 JPH0552192 B2 JP H0552192B2 JP 60249851 A JP60249851 A JP 60249851A JP 24985185 A JP24985185 A JP 24985185A JP H0552192 B2 JPH0552192 B2 JP H0552192B2
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- Japan
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- human
- cells
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- stem cell
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
〔産業上の利用性〕
本発明は、新規なヒト顆粒球−単球系幹細胞増
殖因子の製造法に関し、詳しくは、本発明は顆粒
球−単球系造血障害の治療に有用な新規な造血因
子を、自発増殖性を賦与したヒトリンパ球細胞の
培養によつて製造する方法に関する。 〔技術の背景及び先行技術〕 人間の血液構成細胞は、骨髄に存在する血球幹
細胞が様々な特異的造血因子の作用を受けて増
殖、分化し、血液中へ生産、放出されることによ
つて維持されている。幹細胞が、それ自身の欠陥
又は薬物、放射線等による二次的損傷を受ける
と、幹細胞の増殖が阻害されて、骨髄での細胞産
生能が低下する、いわゆる骨髄低形成状態とな
り、貧血、血小板減少症或いは顆粒球減少症等の
障害が出現することになる。再生不良性貧血、骨
髄性白血病或いは抗癌剤等の薬剤投与後等にみら
れる顆粒球減少症は、顆粒球系幹細胞の増殖障害
に起因するものと考えられている。 近年、顆粒球減少症の治療に、顆粒球−単球系
幹細胞の特異的な造血因子であるコロニー形成刺
激因子〔コロニー・ステイミユレーテイング・フ
アクター（colony−stimulating factor）。以下
CSFと略記する〕の適用が試みられ、その有用性
が証明されて来ている。このような特異的造血因
子を造血障害及びそれに起因する各種の疾患の治
療へ応用することは、幹細胞の輸血に相当する骨
髄移植と相まつて画期的な治癌法であると期待さ
れている。 顆粒球−単球系幹細胞に対する特異的造血因子
であるCSFは、その作用から顆粒球を産生させる
Ｇ−CSF、顆粒球及び単球を産生させるGM−
CSF、単球−マクロフアージを産生させるＭ−
CSF、更に顆粒球、単球、赤芽球及び巨核球を産
生させるMulti−CSFに分類されている。これま
でヒトCSFとしては、人尿CSF及びある種の腫瘍
細胞が産生するCSF、単球−マクロフアージが産
生するCSF、抗原刺激リンパ球が産生するCSF等
いくつかが知られている。 従来、正常なヒトＴ−リンパ球にCSFを産生さ
せる方法としては、正常なヒトＴ−リンパ球を各
種レクチンで刺激する方法、及び細菌菌体等の抗
原で刺激する方法（特開昭59−78122号公報）が
知られている。しかし、正常なヒトＴ−リンパ球
細胞による細胞増殖及びCSF（主としてGM−
CSF）産生のためにレクチン又は抗原による刺激
が必要であり、CSFの大量生産法としては欠点が
あつた。 本発明者らは、新たなヒトCSF材料の検索にお
いて、正常なヒトリンパ球細胞を成人Ｔ−リンパ
球白血病ウイルス（以下、ATLVと略記するこ
とがある）と混合培養すると、形質を転換し、多
量のヒト顆粒球−単球系幹細胞の特異的な造血因
子のコロニー形成刺激因子（CSF）の活性を産生
すること、およびこのCSF活性の産生した培養液
の加熱をヒト血清アルブミン、牛血清アルブミ
ン、ヒト血清または牛血清などの存在下に行なう
と、産生したCSF活性を保持しうることを見出
し、これらの知見に基づいて本発明に到達した。 〔発明の目的および発明の要約〕 本発明の目的は、ヒト顆粒球−単球系幹細胞増
殖因子を大量に生産しうる方法を提供することに
ある。 本発明のもう１つの目的は、GM−CSF活性を
も有するヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子を提
供することにある。 本発明は、自発増殖性を賦与したヒトリンパ球
細胞を細胞培養用培地において培養して、ヒト顆
粒球−単球系幹細胞の増殖を促進する作用を有す
る物質を生産すること、この培地を加熱処理する
こと、およびヒト顆粒球−単球系幹細胞の増殖を
促進する作用を有する有効成分を回収することか
らなる新規なヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子
の製造法である。 自発増殖性を賦与したヒトリンパ球細胞は、正
常なヒトリンパ球細胞を成人Ｔ−リンパ球白血病
ウイルス感染細胞と混合培養することによつて得
ることができ、加熱処理は、ヒト血清アルブミ
ン、牛血清アルブミン、ヒト血清、牛血清または
これらの混合物の存在下において行なうことがで
き、またこの加熱処理はPH６〜８および60±２℃
において10〜15時間行なうことができ、さらにこ
れらの加熱処理は、１〜５％（ｗ／ｖ）のアルブ
ミンの存在下または５〜20％（ｖ／ｖ）の血清の
存在下において行なうことができる。 〔発明の具体的な説明〕 (1) 自発増殖性を賦与した正常なヒトリンパ球細
胞の樹立 正常人の末梢血管の血液より正常なリンパ球を
採取し、予め15000RのＸ線照射を行なつた
ATLV形質転換細胞のMT−２細胞〔三好勇夫
ら：ネイチアー（Nature）：第294巻 第770〜
771頁（1981年）〕およびこの正常なリンパ球を
各々５×105個／mlの割合で10％（ｖ／ｖ）牛胎
児血清を含むRPMI−1640培地に加え、96穴マイ
クロプレートに200μ／穴の割合で播種し、５
％（ｖ／ｖ）CO2の通気下の37℃において30日間
培養した。培養後、MT−２細胞により形質転換
され、自発増殖性を獲得して増殖した細胞の中か
ら増殖性の高い細胞を選別し、これを、10％
（ｖ／ｖ）牛胎児血清を添加したRPMI−1640培
地へ移して、さらに前記と同様にして培養した。
培養後、培地上澄中のCSF活性をイーレ（Ihre）
らの方法〔ジエイ・エヌ・イーレら：ザ・ジヤー
ナル・オブ・イミユーノロジー（J.N.Ihre et
al：The Journal of Immunology）第131巻
第282〜287頁（1983年）〕により、マウス骨髄細
胞を用いて測定し、CSF活性の高い細胞株をさら
に選別した。次にこの選別された細胞株をリミテ
イング・ダイリユーシヨン（Limiting Dilution）
法によりクローニングし、CSF産生能の高い形質
転換Ｔ−リンパ球細胞Q1C1−１およびQ1C1−２
を純粋に樹立した。 CSF産生能の高い形質転換Ｔ−リンパ球細胞の
Q1C1−１およびQ1C1−２の樹立は、上記の方法
の他に、チエン（Chen）らの方法〔プロシーデ
イング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proceeding of the
National Academy of Sciences）第80巻 第
7006〜7009頁（1983年）〕の方法により行なうこ
とができ、これによつて前記と同様に、目的とす
る純粋な細胞株を取得することができる。 (2) ヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の製造 前記(1)で得た細胞を１〜５×105個／mlの割合
で、ヒト血清、牛血清または牛胎児血清を1.0〜
10％（ｖ／ｖ）の濃度において含有する細胞培養
用培地〔たとえばRPMI−1640培地、MEM培地、
α−培地またはハム（Ham）培地等〕に接種し、
炭酸ガスの通気下、37℃において２〜７日間培養
する。この細胞は支持体吸着性があり、ガラス、
プラスチツクスまたはキヤリアビーズ等に吸着し
て増殖するが、増殖すると同時に、多量のヒト顆
粒球−単球系幹細胞の増殖を促進する作用を有す
る物質を産生する。培養終了後、培地上澄を回収
し、再度新たな培地を加えて培養する。この培地
交換を少なくとも５回以上行ない、培養液を回収
する。次に回収した培養液を500〜2500Gにおい
て５分間遠心分離し、上澄液を孔径0.45〜3μの濾
過膜で濾過し、濾過した上澄液に対して、ヒト血
清アルブミン、牛血清アルブミンを１〜５％
（ｖ／ｖ）の濃度において加えるか、または分子
量10000以上を排除する限外濾過膜を使用して、
この培地上澄液を濃縮し、最初に培地に加えたヒ
ト血清、牛血清または牛胎児血清の濃度を５〜20
％（ｖ／ｖ）に調整する。次いでPHを６〜８に調
整し、60℃前後において10〜15時間加熱処理す
る。 加熱処理された培養液の上澄は、ATLV感染
の危険性がなく、この培養液上澄を公知のイオン
交換体クロマトグラフイー、ゲル濾過または逆相
クロマトグラフイー等の精製法に付して、新規な
ヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子を高度に精製
することができる。 (3) ヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の生物学
的活性 （３−１） ヒト骨髄細胞に対するコロニー形
成刺激作用（CSF活性） 正常人志願者より骨髄細胞を採取し、実施例１
で得られたヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の
GM−CSF活性およびMulti−CSF活性をアー
ル・シー・アツシユ（R.C.Ash）らの方法〔アー
ル・シー・アツシユら：ブラツド（R.C.Ash et
al：Blood）第58巻 第309〜316頁（1981年）〕
により0.9％メチルセルロース、30％牛胎児血清
を含むイスコブ（Iscove′s）改変培地を使用して
試験した。 その結果を第１表に示す。なお公知のCSFと比
較するために、GM−CSFとしてGCT−細胞培養
液〔以下、GCT−CMと略記することがある、ギ
ブコ（Gibco）社製の市販品〕およびMulti−
CSFとしてフイトヘマグルチニン（Phyto
hemagglutinin）刺激白血球培養液（以下PHA
−LCMと略記する）〔エー・ワーンシヤフら：エ
クスペリメンタル・ヘマトロジー（A.
Wahnschaffe et al：Experimental
Hematology）第12巻 第655〜659頁（1984年）〕
を使用した。
殖因子の製造法に関し、詳しくは、本発明は顆粒
球−単球系造血障害の治療に有用な新規な造血因
子を、自発増殖性を賦与したヒトリンパ球細胞の
培養によつて製造する方法に関する。 〔技術の背景及び先行技術〕 人間の血液構成細胞は、骨髄に存在する血球幹
細胞が様々な特異的造血因子の作用を受けて増
殖、分化し、血液中へ生産、放出されることによ
つて維持されている。幹細胞が、それ自身の欠陥
又は薬物、放射線等による二次的損傷を受ける
と、幹細胞の増殖が阻害されて、骨髄での細胞産
生能が低下する、いわゆる骨髄低形成状態とな
り、貧血、血小板減少症或いは顆粒球減少症等の
障害が出現することになる。再生不良性貧血、骨
髄性白血病或いは抗癌剤等の薬剤投与後等にみら
れる顆粒球減少症は、顆粒球系幹細胞の増殖障害
に起因するものと考えられている。 近年、顆粒球減少症の治療に、顆粒球−単球系
幹細胞の特異的な造血因子であるコロニー形成刺
激因子〔コロニー・ステイミユレーテイング・フ
アクター（colony−stimulating factor）。以下
CSFと略記する〕の適用が試みられ、その有用性
が証明されて来ている。このような特異的造血因
子を造血障害及びそれに起因する各種の疾患の治
療へ応用することは、幹細胞の輸血に相当する骨
髄移植と相まつて画期的な治癌法であると期待さ
れている。 顆粒球−単球系幹細胞に対する特異的造血因子
であるCSFは、その作用から顆粒球を産生させる
Ｇ−CSF、顆粒球及び単球を産生させるGM−
CSF、単球−マクロフアージを産生させるＭ−
CSF、更に顆粒球、単球、赤芽球及び巨核球を産
生させるMulti−CSFに分類されている。これま
でヒトCSFとしては、人尿CSF及びある種の腫瘍
細胞が産生するCSF、単球−マクロフアージが産
生するCSF、抗原刺激リンパ球が産生するCSF等
いくつかが知られている。 従来、正常なヒトＴ−リンパ球にCSFを産生さ
せる方法としては、正常なヒトＴ−リンパ球を各
種レクチンで刺激する方法、及び細菌菌体等の抗
原で刺激する方法（特開昭59−78122号公報）が
知られている。しかし、正常なヒトＴ−リンパ球
細胞による細胞増殖及びCSF（主としてGM−
CSF）産生のためにレクチン又は抗原による刺激
が必要であり、CSFの大量生産法としては欠点が
あつた。 本発明者らは、新たなヒトCSF材料の検索にお
いて、正常なヒトリンパ球細胞を成人Ｔ−リンパ
球白血病ウイルス（以下、ATLVと略記するこ
とがある）と混合培養すると、形質を転換し、多
量のヒト顆粒球−単球系幹細胞の特異的な造血因
子のコロニー形成刺激因子（CSF）の活性を産生
すること、およびこのCSF活性の産生した培養液
の加熱をヒト血清アルブミン、牛血清アルブミ
ン、ヒト血清または牛血清などの存在下に行なう
と、産生したCSF活性を保持しうることを見出
し、これらの知見に基づいて本発明に到達した。 〔発明の目的および発明の要約〕 本発明の目的は、ヒト顆粒球−単球系幹細胞増
殖因子を大量に生産しうる方法を提供することに
ある。 本発明のもう１つの目的は、GM−CSF活性を
も有するヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子を提
供することにある。 本発明は、自発増殖性を賦与したヒトリンパ球
細胞を細胞培養用培地において培養して、ヒト顆
粒球−単球系幹細胞の増殖を促進する作用を有す
る物質を生産すること、この培地を加熱処理する
こと、およびヒト顆粒球−単球系幹細胞の増殖を
促進する作用を有する有効成分を回収することか
らなる新規なヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子
の製造法である。 自発増殖性を賦与したヒトリンパ球細胞は、正
常なヒトリンパ球細胞を成人Ｔ−リンパ球白血病
ウイルス感染細胞と混合培養することによつて得
ることができ、加熱処理は、ヒト血清アルブミ
ン、牛血清アルブミン、ヒト血清、牛血清または
これらの混合物の存在下において行なうことがで
き、またこの加熱処理はPH６〜８および60±２℃
において10〜15時間行なうことができ、さらにこ
れらの加熱処理は、１〜５％（ｗ／ｖ）のアルブ
ミンの存在下または５〜20％（ｖ／ｖ）の血清の
存在下において行なうことができる。 〔発明の具体的な説明〕 (1) 自発増殖性を賦与した正常なヒトリンパ球細
胞の樹立 正常人の末梢血管の血液より正常なリンパ球を
採取し、予め15000RのＸ線照射を行なつた
ATLV形質転換細胞のMT−２細胞〔三好勇夫
ら：ネイチアー（Nature）：第294巻 第770〜
771頁（1981年）〕およびこの正常なリンパ球を
各々５×105個／mlの割合で10％（ｖ／ｖ）牛胎
児血清を含むRPMI−1640培地に加え、96穴マイ
クロプレートに200μ／穴の割合で播種し、５
％（ｖ／ｖ）CO2の通気下の37℃において30日間
培養した。培養後、MT−２細胞により形質転換
され、自発増殖性を獲得して増殖した細胞の中か
ら増殖性の高い細胞を選別し、これを、10％
（ｖ／ｖ）牛胎児血清を添加したRPMI−1640培
地へ移して、さらに前記と同様にして培養した。
培養後、培地上澄中のCSF活性をイーレ（Ihre）
らの方法〔ジエイ・エヌ・イーレら：ザ・ジヤー
ナル・オブ・イミユーノロジー（J.N.Ihre et
al：The Journal of Immunology）第131巻
第282〜287頁（1983年）〕により、マウス骨髄細
胞を用いて測定し、CSF活性の高い細胞株をさら
に選別した。次にこの選別された細胞株をリミテ
イング・ダイリユーシヨン（Limiting Dilution）
法によりクローニングし、CSF産生能の高い形質
転換Ｔ−リンパ球細胞Q1C1−１およびQ1C1−２
を純粋に樹立した。 CSF産生能の高い形質転換Ｔ−リンパ球細胞の
Q1C1−１およびQ1C1−２の樹立は、上記の方法
の他に、チエン（Chen）らの方法〔プロシーデ
イング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proceeding of the
National Academy of Sciences）第80巻 第
7006〜7009頁（1983年）〕の方法により行なうこ
とができ、これによつて前記と同様に、目的とす
る純粋な細胞株を取得することができる。 (2) ヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の製造 前記(1)で得た細胞を１〜５×105個／mlの割合
で、ヒト血清、牛血清または牛胎児血清を1.0〜
10％（ｖ／ｖ）の濃度において含有する細胞培養
用培地〔たとえばRPMI−1640培地、MEM培地、
α−培地またはハム（Ham）培地等〕に接種し、
炭酸ガスの通気下、37℃において２〜７日間培養
する。この細胞は支持体吸着性があり、ガラス、
プラスチツクスまたはキヤリアビーズ等に吸着し
て増殖するが、増殖すると同時に、多量のヒト顆
粒球−単球系幹細胞の増殖を促進する作用を有す
る物質を産生する。培養終了後、培地上澄を回収
し、再度新たな培地を加えて培養する。この培地
交換を少なくとも５回以上行ない、培養液を回収
する。次に回収した培養液を500〜2500Gにおい
て５分間遠心分離し、上澄液を孔径0.45〜3μの濾
過膜で濾過し、濾過した上澄液に対して、ヒト血
清アルブミン、牛血清アルブミンを１〜５％
（ｖ／ｖ）の濃度において加えるか、または分子
量10000以上を排除する限外濾過膜を使用して、
この培地上澄液を濃縮し、最初に培地に加えたヒ
ト血清、牛血清または牛胎児血清の濃度を５〜20
％（ｖ／ｖ）に調整する。次いでPHを６〜８に調
整し、60℃前後において10〜15時間加熱処理す
る。 加熱処理された培養液の上澄は、ATLV感染
の危険性がなく、この培養液上澄を公知のイオン
交換体クロマトグラフイー、ゲル濾過または逆相
クロマトグラフイー等の精製法に付して、新規な
ヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子を高度に精製
することができる。 (3) ヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の生物学
的活性 （３−１） ヒト骨髄細胞に対するコロニー形
成刺激作用（CSF活性） 正常人志願者より骨髄細胞を採取し、実施例１
で得られたヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の
GM−CSF活性およびMulti−CSF活性をアー
ル・シー・アツシユ（R.C.Ash）らの方法〔アー
ル・シー・アツシユら：ブラツド（R.C.Ash et
al：Blood）第58巻 第309〜316頁（1981年）〕
により0.9％メチルセルロース、30％牛胎児血清
を含むイスコブ（Iscove′s）改変培地を使用して
試験した。 その結果を第１表に示す。なお公知のCSFと比
較するために、GM−CSFとしてGCT−細胞培養
液〔以下、GCT−CMと略記することがある、ギ
ブコ（Gibco）社製の市販品〕およびMulti−
CSFとしてフイトヘマグルチニン（Phyto
hemagglutinin）刺激白血球培養液（以下PHA
−LCMと略記する）〔エー・ワーンシヤフら：エ
クスペリメンタル・ヘマトロジー（A.
Wahnschaffe et al：Experimental
Hematology）第12巻 第655〜659頁（1984年）〕
を使用した。
【表】
この結果によると、実施例一の増殖因子は、ヒ
ト骨髄細胞に対してGM−CSF活性を示すが、
Multi−CSF活性を示さなかつた。 （３−２） ヒト顆粒球−単球系幹細胞に対す
る増殖促進作用 ヒト骨髄細胞中の顆粒球−単球系幹細胞（以
下、CFU−GMと略記することがある）数の及ぼ
す作用について、公知のGM−CSFと比較するた
めに次の試験を行なつた。 正常人の志願者の骨髄細胞を前記のアール・シ
ー・アツシユ等の方法で非吸着骨髄細胞として、
実施例１の増殖因子およびGCT−細胞培養液を
それぞれ1000単位／ml（後述のマウス骨髄細胞で
定量）ならびに因子非添加（対照）の20％（ｖ／
ｖ）牛胎児血清を含むイスコブ（Iscove′s）改変
ダルベコ（Dulbecco′s）MEM培地（以下IMDM
培養と略記することがある）に１×106個／mlの
割合で播種し、7.5％CO2の通気下、37℃におい
て培養した。培養開始から０、24、48および72時
間後に、それぞれの骨髄細胞を遠心洗浄し、細胞
懸濁液を得た。ヒト顆粒球−単球系幹細胞
（CFU−GM）刺激因子として、フイトヘマグル
チニン刺激白血球培養液（PHA−LCM）1000単
位（後述のマウス骨髄細胞で定量）、20％牛胎児
血清および0.3％（ｗ／ｖ）の寒天を含むIMDM
培地に、前記の細胞懸濁液を10％（ｖ／ｖ）の濃
度にいおて混和し、7.5％CO2の通気下、37℃に
おいて14日間培養した。培養後、50個以上の細胞
からなる集塊をCFU−GMとして、骨髄細胞１×
105個当りに含まれるCFU−GM数を計測した。 その結果は第２表に示すとおりであつた。
ト骨髄細胞に対してGM−CSF活性を示すが、
Multi−CSF活性を示さなかつた。 （３−２） ヒト顆粒球−単球系幹細胞に対す
る増殖促進作用 ヒト骨髄細胞中の顆粒球−単球系幹細胞（以
下、CFU−GMと略記することがある）数の及ぼ
す作用について、公知のGM−CSFと比較するた
めに次の試験を行なつた。 正常人の志願者の骨髄細胞を前記のアール・シ
ー・アツシユ等の方法で非吸着骨髄細胞として、
実施例１の増殖因子およびGCT−細胞培養液を
それぞれ1000単位／ml（後述のマウス骨髄細胞で
定量）ならびに因子非添加（対照）の20％（ｖ／
ｖ）牛胎児血清を含むイスコブ（Iscove′s）改変
ダルベコ（Dulbecco′s）MEM培地（以下IMDM
培養と略記することがある）に１×106個／mlの
割合で播種し、7.5％CO2の通気下、37℃におい
て培養した。培養開始から０、24、48および72時
間後に、それぞれの骨髄細胞を遠心洗浄し、細胞
懸濁液を得た。ヒト顆粒球−単球系幹細胞
（CFU−GM）刺激因子として、フイトヘマグル
チニン刺激白血球培養液（PHA−LCM）1000単
位（後述のマウス骨髄細胞で定量）、20％牛胎児
血清および0.3％（ｗ／ｖ）の寒天を含むIMDM
培地に、前記の細胞懸濁液を10％（ｖ／ｖ）の濃
度にいおて混和し、7.5％CO2の通気下、37℃に
おいて14日間培養した。培養後、50個以上の細胞
からなる集塊をCFU−GMとして、骨髄細胞１×
105個当りに含まれるCFU−GM数を計測した。 その結果は第２表に示すとおりであつた。
【表】
この結果によると、GM−CSFであるGCT−
CMおよび対照では、CFU−GM数の増加はみら
れなかつたが、実施例１の増殖因子はCFU−GM
数を増加する作用を有することがわかつた。 （３−３） マウス骨髄細胞に対するコロニー
形成刺激作用（CSF活性） マウス骨髄細胞に対するGM−CSFおよび
Multi−CSF活性をC57BL／6Nマウス骨髄細胞
を用いたこと以外は前記のイーレらの方法により
試験した。 また本発明の試験で使用した各種刺激因子の生
物学的力価を統一するために、各因子の力価をマ
ウス骨髄細胞に対するCSF力価として表わした。
すなわち、C57BL／6Nマウス骨髄細胞１×105
個／mlを含む20％（ｖ／ｖ）牛胎児血清および
0.3％寒天添加マツコイ（McCoy′s）5A培地に、
各因子を混和し、7.5％CO2通気下の37℃におい
て７日間培養し、形成された50個以上の細胞集塊
をコロニーとして計測し、１コロニーを１単位と
してCSFの力価として表示した。 マウス骨髄細胞に対するGM−CSFとしては
GCT−CM、Multi−CSFとしては、WEHI−３
細胞培養液上澄〔以下WEHI−３−CMと略記す
ることもある、ジエイ・エヌ・イーレら：ザ・ジ
ヤーナル・オブ、イミユーノロジー（J.N.Ihre
et al：The Journal of Immunology）第129巻
第2431 〜2436頁（1982年）を使用した。 本発明の増殖因子のマウス骨髄細胞に対する
CSF活性は第３表に示すとおりであつた。
CMおよび対照では、CFU−GM数の増加はみら
れなかつたが、実施例１の増殖因子はCFU−GM
数を増加する作用を有することがわかつた。 （３−３） マウス骨髄細胞に対するコロニー
形成刺激作用（CSF活性） マウス骨髄細胞に対するGM−CSFおよび
Multi−CSF活性をC57BL／6Nマウス骨髄細胞
を用いたこと以外は前記のイーレらの方法により
試験した。 また本発明の試験で使用した各種刺激因子の生
物学的力価を統一するために、各因子の力価をマ
ウス骨髄細胞に対するCSF力価として表わした。
すなわち、C57BL／6Nマウス骨髄細胞１×105
個／mlを含む20％（ｖ／ｖ）牛胎児血清および
0.3％寒天添加マツコイ（McCoy′s）5A培地に、
各因子を混和し、7.5％CO2通気下の37℃におい
て７日間培養し、形成された50個以上の細胞集塊
をコロニーとして計測し、１コロニーを１単位と
してCSFの力価として表示した。 マウス骨髄細胞に対するGM−CSFとしては
GCT−CM、Multi−CSFとしては、WEHI−３
細胞培養液上澄〔以下WEHI−３−CMと略記す
ることもある、ジエイ・エヌ・イーレら：ザ・ジ
ヤーナル・オブ、イミユーノロジー（J.N.Ihre
et al：The Journal of Immunology）第129巻
第2431 〜2436頁（1982年）を使用した。 本発明の増殖因子のマウス骨髄細胞に対する
CSF活性は第３表に示すとおりであつた。
【表】
※ 第１表に同じ。
（３−４） マウスインターロイキン３依存性
細胞に対する増殖促進作用 マウスインターロイキン３（以下IL−３と略記
することがある）依存性細胞であるFDC−P2細
胞を用いて、イーレらの方法〔ジエイ・イーレ
ら：ザ・ジヤーナル・オブ・イミユーノロジー
（J.Ihre et al：The Journal of Immunology）
第129巻 第2431〜2436頁（1982年）〕により、放
射能標識チミジン（3H−Thymidine）取込み量
を測定し、実施例１のヒト顆粒球−単球系幹細胞
増殖因子のマウスインターロイキン３の活性を試
験した。 その結果は第１図に示すとおりであつた。 第１図において、タテ軸は3H−チミジン取込
み量を示し、横軸は希釈倍数を対数で示し、（−
●−）は対照を、（−△−）はGCT−CM、（−□
−）は実施例１の増殖因子を、そして（−○−）
はWEHI−３−CMをそれぞれ示す。 実施例１の増殖因子はマウスインターロイキン
３標品であるWEHI−３−CMとほぼ同様のIL−
３活性を示し、FDC−P2細胞の増殖を促進した。
一方、GM−CSFであるGCT−CMはIL−３活性
を全く示さなかつた。 (4) ヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の理化学
的性質および熱安定性 （４−１） 陰イオン交換体クロマトグラム 実施例１の方法により得られた加熱処理培養上
澄液を0.02Mリン酸緩衝液（PH：7.0）に平衡化
させて、陰イオン交換体であるDEAE−セフアロ
ースカラムクロマトグラフイーにかけ、CSF活性
をマウス骨髄細胞でIL−３活性をFDC−P2細胞
を用いて、それぞれ前記の方法により測定した。 その結果は第２図に示すとおりであつた。 第２図において左タテ軸は吸光度（−○−で表
わす）を示し、右タテ軸はCSF活性（−▲−で表
わす）およびIL−３活性（−●−）を示し、横
軸はフラクシヨン番号を示す。 第２図によると、実施例１のヒト顆粒球−単球
系幹細胞増殖因子はDEAE−セフアロースに非吸
着の分画として溶出され、CSF活性およびIL−
３活性が完全に一致していた。 （４−２） ゲル濾過クロマトグラム 前記のDEAE−セフアロース非吸着の分画とし
て溶出された実施例１のヒト顆粒球−単球系幹細
胞増殖因子を限外濾過膜濃縮装置（アミコン社
製、PM−10）で濃縮して、TSK3000SW（東洋
ソーダ社製）高速液体ゲル濾過クロマトグラフイ
ーにかけ、その分子量を測定した。 その結果は第３図に示すとおりであつた。 第３図において、左タテ軸のは吸光度を示し、
右タテ軸はCSF活性（−○−で表わす）および
IL−３活性（−×−で表わす）を示し、そして
横軸はフラクシヨン番号を示す。 第３図によると、実施例１のヒト顆粒球−単球
系幹細胞増殖因子は分子量25000〜40000の範囲溶
出された。 （４−３） コンカナバリンＡ−セフアロース
クロマトグラム 前記のゲル濾過クロマトグラフイーによつて得
た分子量25000〜40000の分画を限外濾過膜（旭化
成社製、ミニモジユールNM−３）により濃縮
し、0.5M NaCl添加0.02Mリン酸緩衝液（PH：
7.2）と平衡させ、これをコンカナバリンＡ−セ
フアロースカラムクロマトグラフイーにかけた。 その結果は第４図に示すとおりであつた。 第４図において、左タテ軸は吸光度（−●−で
表わす）を示し、右タテ軸はCSF活性（−○−で
表わす）を示し、横軸はフラクシヨン番号を示
す。 第４図によると、実施例１の増殖因子はコンカ
ナバリンＡ−セフアロースに吸着し、0.15Mのα
−メチルマンノシド溶液で溶出された。 （４−４） 熱安定性試験 実施例１の方法によつて得られた培養上澄液を
0.45μの濾過膜で濾過した後、該培養液上澄を60
±２℃において10時間加熱し、熱安定性および安
定化剤の効果について試験した。増殖因子の安定
性は、前記と同様に、マウス骨髄細胞に対する
CSF活性およびFDC−P2細胞に対するIL−３活
性により測定した。 第４表はヒト血清アルブミンまたは牛血清アル
ブミンの添加による熱安定化効果を、非加熱の対
照を100とした場合の各試料の回収率で表わした
試験の結果である。
（３−４） マウスインターロイキン３依存性
細胞に対する増殖促進作用 マウスインターロイキン３（以下IL−３と略記
することがある）依存性細胞であるFDC−P2細
胞を用いて、イーレらの方法〔ジエイ・イーレ
ら：ザ・ジヤーナル・オブ・イミユーノロジー
（J.Ihre et al：The Journal of Immunology）
第129巻 第2431〜2436頁（1982年）〕により、放
射能標識チミジン（3H−Thymidine）取込み量
を測定し、実施例１のヒト顆粒球−単球系幹細胞
増殖因子のマウスインターロイキン３の活性を試
験した。 その結果は第１図に示すとおりであつた。 第１図において、タテ軸は3H−チミジン取込
み量を示し、横軸は希釈倍数を対数で示し、（−
●−）は対照を、（−△−）はGCT−CM、（−□
−）は実施例１の増殖因子を、そして（−○−）
はWEHI−３−CMをそれぞれ示す。 実施例１の増殖因子はマウスインターロイキン
３標品であるWEHI−３−CMとほぼ同様のIL−
３活性を示し、FDC−P2細胞の増殖を促進した。
一方、GM−CSFであるGCT−CMはIL−３活性
を全く示さなかつた。 (4) ヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の理化学
的性質および熱安定性 （４−１） 陰イオン交換体クロマトグラム 実施例１の方法により得られた加熱処理培養上
澄液を0.02Mリン酸緩衝液（PH：7.0）に平衡化
させて、陰イオン交換体であるDEAE−セフアロ
ースカラムクロマトグラフイーにかけ、CSF活性
をマウス骨髄細胞でIL−３活性をFDC−P2細胞
を用いて、それぞれ前記の方法により測定した。 その結果は第２図に示すとおりであつた。 第２図において左タテ軸は吸光度（−○−で表
わす）を示し、右タテ軸はCSF活性（−▲−で表
わす）およびIL−３活性（−●−）を示し、横
軸はフラクシヨン番号を示す。 第２図によると、実施例１のヒト顆粒球−単球
系幹細胞増殖因子はDEAE−セフアロースに非吸
着の分画として溶出され、CSF活性およびIL−
３活性が完全に一致していた。 （４−２） ゲル濾過クロマトグラム 前記のDEAE−セフアロース非吸着の分画とし
て溶出された実施例１のヒト顆粒球−単球系幹細
胞増殖因子を限外濾過膜濃縮装置（アミコン社
製、PM−10）で濃縮して、TSK3000SW（東洋
ソーダ社製）高速液体ゲル濾過クロマトグラフイ
ーにかけ、その分子量を測定した。 その結果は第３図に示すとおりであつた。 第３図において、左タテ軸のは吸光度を示し、
右タテ軸はCSF活性（−○−で表わす）および
IL−３活性（−×−で表わす）を示し、そして
横軸はフラクシヨン番号を示す。 第３図によると、実施例１のヒト顆粒球−単球
系幹細胞増殖因子は分子量25000〜40000の範囲溶
出された。 （４−３） コンカナバリンＡ−セフアロース
クロマトグラム 前記のゲル濾過クロマトグラフイーによつて得
た分子量25000〜40000の分画を限外濾過膜（旭化
成社製、ミニモジユールNM−３）により濃縮
し、0.5M NaCl添加0.02Mリン酸緩衝液（PH：
7.2）と平衡させ、これをコンカナバリンＡ−セ
フアロースカラムクロマトグラフイーにかけた。 その結果は第４図に示すとおりであつた。 第４図において、左タテ軸は吸光度（−●−で
表わす）を示し、右タテ軸はCSF活性（−○−で
表わす）を示し、横軸はフラクシヨン番号を示
す。 第４図によると、実施例１の増殖因子はコンカ
ナバリンＡ−セフアロースに吸着し、0.15Mのα
−メチルマンノシド溶液で溶出された。 （４−４） 熱安定性試験 実施例１の方法によつて得られた培養上澄液を
0.45μの濾過膜で濾過した後、該培養液上澄を60
±２℃において10時間加熱し、熱安定性および安
定化剤の効果について試験した。増殖因子の安定
性は、前記と同様に、マウス骨髄細胞に対する
CSF活性およびFDC−P2細胞に対するIL−３活
性により測定した。 第４表はヒト血清アルブミンまたは牛血清アル
ブミンの添加による熱安定化効果を、非加熱の対
照を100とした場合の各試料の回収率で表わした
試験の結果である。
【表】
第４表によると、培養液上澄（牛胎児血清１
％、PH：7.1）をそのまま60℃において10時間加
熱処理すると、増殖因子の生物活性は約50％減少
するのに対して、ヒト血清アルブミンまたは牛血
清アルブミンを1.0〜5.0％（ｗ／ｖ）において添
加すると、培地のPHは6.4〜7.0に変化するが、加
熱安定性が増大し、この添加量ではほぼ70％以上
の回収率を得ることができた。 第５表はヒト血清または牛血清の添加による熱
安定化効果を前記と同様にして表わした結果であ
る。
％、PH：7.1）をそのまま60℃において10時間加
熱処理すると、増殖因子の生物活性は約50％減少
するのに対して、ヒト血清アルブミンまたは牛血
清アルブミンを1.0〜5.0％（ｗ／ｖ）において添
加すると、培地のPHは6.4〜7.0に変化するが、加
熱安定性が増大し、この添加量ではほぼ70％以上
の回収率を得ることができた。 第５表はヒト血清または牛血清の添加による熱
安定化効果を前記と同様にして表わした結果であ
る。
(1) ヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子を大量に
生産することができる。 (2) 本発明により生産される物質は、ヒトのGM
−CSF活性および顆粒球−単球系幹細胞そのも
のの増殖を促進する作用を有する。 (3) 本発明により生産される物質は、マウスの骨
髄細胞に対してGM−CSF活性、Multi−CSF
活性およびマウスインターロイキン３活性を有
する。
生産することができる。 (2) 本発明により生産される物質は、ヒトのGM
−CSF活性および顆粒球−単球系幹細胞そのも
のの増殖を促進する作用を有する。 (3) 本発明により生産される物質は、マウスの骨
髄細胞に対してGM−CSF活性、Multi−CSF
活性およびマウスインターロイキン３活性を有
する。
第１図は、実施例１のヒト顆粒球−単球系幹細
胞増殖因子のマウスインターロイキン３依存性細
胞に対する増殖促進作用を示す図表、第２図は、
実施例１の加熱処理培養上澄液のDEAE−セフア
ロースカラムクロマトグラフイーによる分離の結
果を示す図表、第３図は、実施例１のヒト顆粒球
−単球系幹細胞増殖因子の高速液体ゲル濾過クロ
マトグラフイーによる分子量測定の結果を示す図
表、および第４図は、実施例１のヒト顆粒球−単
球系幹細胞増殖因子のコンカナバリンＡ−セフア
ロースクロマトグラフイーの結果を示す図表であ
る。
胞増殖因子のマウスインターロイキン３依存性細
胞に対する増殖促進作用を示す図表、第２図は、
実施例１の加熱処理培養上澄液のDEAE−セフア
ロースカラムクロマトグラフイーによる分離の結
果を示す図表、第３図は、実施例１のヒト顆粒球
−単球系幹細胞増殖因子の高速液体ゲル濾過クロ
マトグラフイーによる分子量測定の結果を示す図
表、および第４図は、実施例１のヒト顆粒球−単
球系幹細胞増殖因子のコンカナバリンＡ−セフア
ロースクロマトグラフイーの結果を示す図表であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 自発増殖性を賦与したヒトリンパ球細胞を細
胞培養用培地において培養して、ヒト顆粒球−単
球系幹細胞の増殖を促進する作用を有する物質を
生産すること、この培地を加熱処理すること、お
よびヒト顆粒球−単球系幹細胞の増殖を促進する
作用を有する有効成分を回収することを特徴とす
る新規なヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の製
造法。 ２ 自発増殖性を賦与したヒトリンパ球細胞が、
正常なヒトリンパ球細胞を成人Ｔ−リンパ球白血
病ウイルス感染細胞と混合培養することにより得
られたものであることを特徴とする特許請求の範
囲第１項に記載の新規なヒト顆粒球−単球系幹細
胞増殖因子の製造法。 ３ 加熱処理が、ヒト血清アルブミン、牛血清ア
ルブミン、ヒト血清、牛血清およびこれらの混合
物からなる群より選択される物質の存在下のPH６
〜８および60±２℃において10〜15時間行なわれ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項または
第２項に記載の新規なヒト顆粒球−単球系幹細胞
増殖因子の製造法。 ４ 加熱処理が、１〜５％（ｗ／ｖ）のアルブミ
ンの存在下において行なわれることを特徴とする
特許請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに
記載の新規なヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子
の製造法。 ５ 加熱処理が、５〜20％（ｖ／ｖ）の血清の存
在下において行なわれることを特徴とする特許請
求の範囲第１項ないし第４項のいずれかに記載の
新規なヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60249851A JPS62107796A (ja) | 1985-11-07 | 1985-11-07 | 新規なヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60249851A JPS62107796A (ja) | 1985-11-07 | 1985-11-07 | 新規なヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62107796A JPS62107796A (ja) | 1987-05-19 |
| JPH0552192B2 true JPH0552192B2 (ja) | 1993-08-04 |
Family
ID=17199128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60249851A Granted JPS62107796A (ja) | 1985-11-07 | 1985-11-07 | 新規なヒト顆粒球−単球系幹細胞増殖因子の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62107796A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6852313B1 (en) | 1989-10-16 | 2005-02-08 | Amgen Inc. | Method of stimulating growth of melanocyte cells by administering stem cell factor |
| US7144731B2 (en) | 1989-10-16 | 2006-12-05 | Amgen Inc. | SCF antibody compositions and methods of using the same |
| AU2001261984A1 (en) * | 2000-05-25 | 2001-12-03 | Novaneuron Inc. | Production of neurons from stem cells |
-
1985
- 1985-11-07 JP JP60249851A patent/JPS62107796A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62107796A (ja) | 1987-05-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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