JPH0552196B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学分析の対象となる生体液中の
加水分解酵素を定量するための乾式分析要素に関
する。 〔従来の技術〕 加水分解酵素、例えばアミラーゼ、リパーゼ、
ホスフアターゼ、グルコシターゼ、ガラクトシダ
ーゼの、定量分析には加水分解生成物をさらに化
学的反応または酵素化学的共役反応を利用して、
呈色生成物に導き、光学濃度を測定する方法が数
多く知られている。（例えばH.U.ベルグマイヤー
H.U.Bergmeyer著メソツズ・オブ・エンザイマ
チツク・アナリシス） しかし該加水分解生成物自体が有色であれば検
出が一層効率的に行なわれる。例えば加水分解酵
素の一つであるアルカリホスフアターゼの分析の
目的に、酵素反応の結果ｐ−ニトロフエノールを
生成するｐ−ニトロフエノールホスフエートを基
質とした方法が利用される。酵素反応系の至適PH
であるPH9.5付近でｐ−ニトロフエノールは大部
分が解離状態になり、400nmに吸収極大を有する
黄色を呈する。 しかしｐ−ニトロフエノールは極大吸収波長が
410nm付近（溶液では400nm）であり、血液性生
体液（例えば全血、血漿、血清）試料中に共存す
る可能性のあるヘモグロビン（極大吸収波長
414nm）やビリルビン（極大吸収波長430および
450nm）の分光吸収領域と重複しているため、こ
れらの干渉を受ける。特に疾病によりヘモグロビ
ンの変質等に基づく吸収スペクトルの変化がある
場合、あるいは血液試料から血清を調製する過程
で溶血が起こつた場合に、ヘモグロビンの干渉が
現れ、定量分析に誤差を生ずる欠点を有してい
る。 〔発明の目的〕 本発明の目的は、溶血などによるヘモグロビン
等の生体色素の光学的干渉を排除した、かつ分析
感度の高い、酵素活性測定用乾式分析要素の提供
にある。 特に、染料を解離する自己顕色性基質を水保持
性担体中に含み、該基質に対して活性を有する酵
素の活性を測定するための乾式分析要素におい
て、溶血などによるヘモグロビン等の生体色素の
光学的干渉を排除し、かつ高い分析感度を実現す
ることにある。 〔発明の要旨〕 上記目的は、染料を解離する自己顕色性基質を
水保持性担体中に含み、該基質に対して活性を有
する酵素の活性を測定するための乾式分析要素で
あつて、解離状態で500nm以上に吸収極大を有す
るヒドロキシジアリールアゾ染料をエーテル結合
またはエステル結合で分子中に有する自己顕色性
基質およびカチオン性ポリマーをそれぞれ水保持
性を有する担体の少なくとも一つに含有する乾式
分析要素によつて達成された（該基質と該ポリマ
ーは同じ担体中に含まれてもよく、互いに液体が
流通しうる関係にある異なる担体中に含まれても
よい）。 さらに本発明の前記目的は、染料を解離する自
己顕色性基質を水保持性担体中に含み、該基質に
対して活性を有する酵素の活性を測定するための
乾式分析要素において、乾式分析要素が水不浸透
性支持体と液体計量作用を有する多孔性液体展開
層を少なくとも有し、前記自己顕色性基質を該液
体展開層に含み、かつカチオン性ポリマーを該液
体展開層に含み、かつカチオン性ポリマーを該液
体展開層と液体接触関係にある他の水浸透性の層
に含む乾式分析要素によつて、より好ましく達成
された。 本発明により分析するに好適な酵素の代表例
を、それぞれの酵素に対して用いられる自己顕色
性基質に対応させて、第１表に示した。酵素は一
つでもよく、組み合わせてもよい（例えば、アミ
ラーゼとグルコシダーゼ）。

【表】

【表】 解離状態で500nm以上に吸収極大を有するヒド
ロキシジアリールアゾ染料をエーテル結合または
エステル結合で分子中に有する自己顕色性基質の
好ましいものは、下記一般式で示される。 Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ−Ｎ 式中Ａは、フエニル基、ナフチル基または、チ
エニル基を表し、置換基のハメツト定数の和が
0.5以上である。 Ｂは、ｐ−フエニレン基またはｐ−ナフチレン
基を表す。これらの芳香族基は、置換されていて
もよい。 Ｘは

【式】

【式】 （Ｒは炭素数９ないし17のアルキル基を表す） または共役糖残基を表す。 共役糖として好ましいものは、例えばマルトー
ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マ
ルトヘキサオース、Ｄ−ガラクトピラノース、グ
ルクロニドである。 本発明に用いられる自己顕色性基質の具体例を
以下に示す。 (1) ４−（2′−メチルスルフオニル−4′−ニトロ
フエニルアゾ）−２−クロロフエニルホスフエ
ート ＝ナトリウム (2) ４−（2′−メチルスルフオニル−4′−ニトロ
フエニルアゾ）フエニルホスフエート ＝ナト
リウム (3) ４−（4′−ニトロフエニルアゾ）フエニルホ
スフエート ＝ナトリウム (4) ４−（2′−メチルスルフオニル−4′−ニトロ
フエニルアゾ）−５−（3′−アミノスルフオニル
フエニルスルフオニルアミノ）ナフチルホスフ
エート ＝ナトリウム (5) ３−〔5′−ウンデカノイルオキシ−8′−（2″−
メチルスルフオニル−4″−ニトロフエニルア
ゾ）ナフチルアミノスルフオニル〕ベンゼンス
ルフオン酸ナトリウム (6) ４−（2′−メチルスルフオニル−4′−ニトロ
フエニルアゾ）フエニルガラクトピラノシド 具体的例の構造式 (1) 520nm (2) 520nm (3) 500nm (4) 644nm (5) 644nm (6) 520nm 本発明に用いることのできるカチオン性ポリマ
ーとは、二級及び三級アミノ基を含むパリマー、
含窒素複素環部分をもつポリマー、これらの４級
カチオン基を含むポリマーなどで分子量が5000〜
200000、特に10000〜50000のものである。 例えば 米国特許2548564号、同2484430号、同3148061
号、同3756814号、特開昭52−136626号、明細書
等に開示されているビニルピリジニウムカチオン
ポリマー； 米国特許3625694号、同3859096号、同4128538
号、英国特許1277453号明細書等に開示されてい
るゼラチン等と架橋可能なポリマー； 米国特許3958995号、同2721852号、同2798063
号、特開昭54−115228号、同54−145529号、同54
−126027号明細書等に開示されている水性ゾル型
カチオン性ポリマー； 米国特許3898088号や特開昭55−33172号明細書
に開示されている水不溶性カチオン性ポリマー； 米国特許4168976号（特開昭54−137333号）明
細書等に開示の染料と共有結合を行うことのでき
る反応性媒染剤； 更に米国特許3709690号、同3788855号、同第
3642482号、同第3488706号、同第3557066号、同
第3271147号、同第3271148号、特開昭50−71332
号、同53−30328号、同52−155528号、同53−125
号、同53−1024号明細書に開示してあるカチオン
性ポリマーを挙げることが出来る。 その他、米国特許2675316号、同2882156号明細
書に記載のカチオン性ポリマーも挙げることがで
きる。 これらの内、親水性コロイド層から他の層に移
動しにくいものが好ましく、例えば、ゼラチン等
の親水性コロイドと架橋反応するもの、水不溶性
カチオン性ポリマー、及び水性ゾル（又はラテツ
クス分散物）を好ましく用いることが出来る。 特に好ましいカチオン性ポリマーを以下に示
す。 (1) ４級アンモニウム基をもち、かつゼラチンと
共有結合できる基（例えばアルデヒド基、クロ
ロロアルカノイル基、クロロアルキル基、ビニ
ルスルホニル基、ピリジニウムプロピオニル
基、ビニルカルボニル基、アルキルスルホノキ
シ基など）を有するポリマー 例えば (2) 下記一般式（）で表わされるモノマーの繰
り返し単位と他のエチレン性不飽和モノマーの
繰り返し単位とからなるコポリマーと、架橋剤
（例えばビスアルカンスルホネート、ビスアレ
ンスルホネート）との反応生成物。 一般式（）

〔実施例 １〕

セルロースアセテートで成るメンブランフイル
ター（富士写真フイルム(株)製FM300）に次の水
溶液を含浸して乾燥した。 化合物具体例５ １ｇ ラウリン硫酸ナトリウム／リン酸PH8.0緩衝液
100ml コール酸ソーダ 0.5ｇ ポリーコー（スチレン−Ｎ−メチルモルホリニ
ウム−α−メチルスチレン−ジビニルベンゼン
（55：43：２）ラテツクスポリマー含量 50％ 20ml 次いでこの含浸済みフイルターを10mm角に切
り、両面粘着テープでプラスチツク片に固定し、
リパーゼ検出用乾式分析要素を作つた。 これに酵素活性の異なる血清を10μl点着する
と、やがて青色に着色し、目視により標準色片と
の比較で、または測定波長640nmの反射濃度計に
より検量線を用いて、リパーゼ活性を定量した。
検量線は次のようにして作成した。 10種の酵素活性既知の血清10μlを点着し、37で
５分間保応させる。各の血清について、この間２
分後および５分後の反射濃度を測定し、その差
ΔODと酵素活性の値の関係として検量線を作成
した。 〔実施例 ２〕 ゼラチン下塗りされている厚さ180μmのポリエ
チレンテレフタレート無色透明平滑フイルム上に
下記の組成(a)の水溶液を乾燥後の厚さが10μmに
なるように塗布し、乾燥した。 (a) ゼラチン 300ｇ 水 2150ｇ 界面活性剤 ５ｇ （オリン社製Surfactant10G）ポリコ（スチレ
ン−Ｎ−メチルモルホリニウムメチルスチレン
−ジビニルベンゼン） 重合比 55：43：２ 15％ラテツクス溶液 280ｇ （希NaOH溶液でPHを7.0に調整する） 次に上記ゼラチン層の上に約30ｇ／m²の割合で
水を全面に均一に供給して湿潤させた後、その上
にトリコツト編み物（ポリエステル製 40ゲー
ジ）を軽く圧力をかけてラミネートし、乾燥させ
る。 次にこの布に下記の組成(b)の水溶液を200c.c.／
m²の割合でほぼ均一に塗布し乾燥させ、リパーゼ
測定用一体型多層分析要素を作製した。 (b) 化合物具体例５ ６ｇ コール酸ナトリウム １ｇ 水 170ｇ ラウリン硫酸ナトリウム／リン酸PH8.0緩衝液
（0.5M） 50ml 比較のために、上記組成(a)の溶液の代わりに下
記組成（a′）の溶液を用い、その他は上記と同様
にしてリパーゼ活性測定用分析要素を作製した。 （a′） ゼラチン 340ｇ 水 2150ｇ 界面活性剤 ５ｇ （オリン社製Surfactant 10G） （希NaOH溶液でPH7.0に調整する） 本発明の実施例２および比較用の分析要素に、
第１表に示すごとくリパーゼ活性値の異なるコン
トロール血清（市販コントロール血清またはそれ
に必要に応じてリパーゼを添加したもの）を10μl
点着し、37℃に保つた際の、３分後から６分後の
間の１分あたりの反射濃度変化を波長640nmで測
定した。その結果を第２表に示す。 第２表 リパーゼ活性 本発明 比較用 150 0.020 0.013 450 0.044 0.027 920 0.077 0.047 1200 0.093 0.056 〔実施例 ３〕 ゼラチン下塗りされている厚さ180μmのポリエ
チレンテレフタレート無色透明平滑フイルム上に
下記の組成(a)の水溶液を乾燥後の厚さが10μmに
なるように塗布し、乾燥する。 (a) 脱イオンゼラチン 80ｇ 水 1285ｇ 界面活性剤 ９ｇ （ノニルフエノキシポリグリシドール） ポリーコ（スチレン−Ｎ−メチルモルホリニウ
ム−α−メチルスチレン−ジビニルベンゼン） 重合比 55：43：２ 15％ラテツクス溶液 500ｇ １，２−ビス（ビニルスルフオニルアセトアミ
ド）エタン ２ｇ （希NaOH溶液でPHを7.0に調整する） 次に上記ゼラチン層上に下記の組成(b)の水溶液
を乾燥後の厚さが5μmになるように塗布し乾燥し
た（接着層）。 (b) ゼラチン 80ｇ 水 1869ｇ 界面活性剤 8.6ｇ （ノニルフエノキシポリグリシドール） （希NaOH溶液でPHを7.0に調整する） 次に上記ゼラチン層の上に30ｇ／m²の割合で
0.4％ノニルフエノキシポリグリシドール水溶液
を均一に塗布して湿潤させた後、その上にトリコ
ツト編み物（ポリエステル製 36ゲイジ）を軽く
圧力をかけてラミネートし、乾燥させた。 次にこの布に下記の組成(d)の分散液を150c.c.／
m²の割合でほぼ均一に塗布し乾燥させ、アルカリ
ホスフアターゼ測定用一体型多層分析要素を作製
した。 (d) 化合物具体例２ ジシクロヘキシルアミン塩 30mmol ポリビニルピロリドン ５ｇ （平均分子量 10万） エタノール 20ｇ アセトン 25ｇ 本発明の実施例３の分析要素に第３表に示すご
とくアルカリホスフアターゼ活性値の異なるコン
トロール血清（市販コントロール血清またはそれ
に必要に応じて酵素を添加したもの）を10μl点着
し、37℃に保つた際の２分後から５分後の間の反
射濃度変化（ΔOD）を波長540nmで測定した。 第３表 アルカリホス ΔOD フアターゼ活性 300IU／ｌ 0.120 605 0.240 1200 0.375

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 染料を解離する自己顕色性基質を水保持性担
   体中に含み、該基質に対して活性を有する酵素の
   活性を測定するための乾式分析要素であつて、解
   離状態で500nm以上に吸収極大を有するヒドロキ
   シジアリールアゾ染料をエーテル結合またはエス
   テル結合で分子中に有する自己顕色性基質および
   カチオン性ポリマーをそれぞれ水保持性を有する
   担体の少なくとも一つに含有する乾式分析要素
   （該基質と該ポリマーは同じ担体中に含まれても
   よく、互いに接触関係にある異なる担体中に含ま
   れてもよい）。 ２ 少なくとも水不浸透性支持体と液体計量作用
   を有する多孔性液体展開層を有し、前記自己顕色
   性基質を該液体展開層に含み、かつカチオン性ポ
   リマーを該液体展開層と液体接触関係にある他の
   水浸透性の層に含む特許請求の範囲１の乾式分析
   要素。