JPS62298A - 乾式多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は液体試料中の加水分解酵素の活性全測定するた
めの一体型多層分析要素に関するものである。更に詳し
くは本発明は生体液例えば血液、尿、唾液、膵液、腸液
、髄液中に含まれる加水分解酵素例えばプロテアーゼ、
アミラーゼ、す・り−ゼ、各種キナーゼ等の活性を簡易
かつ高精度にｆｆ１１１’定するのに適した一体型多層
分析要素に関するものである。

〔発明の背景〕

生体液中の成分の分析には多種多様な方法が提案されて
いる。その内でも、試料溶液中において、分析しようと
する被検物質（アナライト）のｉｔに比例し交着色物質
の生成反応を進行させ、その色濃度を測定する方法は良
く知られ友分析原理であり、溶液分析法（湿式法）とし
てのみでなく、乾式分析法にも利用されている。即ち、
濾紙等の吸収性単体に、アナライトとの接触により呈色
する試薬を含浸させた、いわゆるｐＨ試験紙類似の形状
をした乾式の分析用シートがその例である。

ま友さらに、乾式操作を利用しながらも精度の高いアナ
ライトの定量分析を可能とする一層若しくは多層構造か
らなるシート状若しくはフィルム状の分析要素も知られ
ている。

このうち多層分析要素は、各種のものが知られており、
例えば特公昭弘ター３３１００号、特開昭ｐｙ−ｊ３ｒ
ｅｒ号、特開昭３０−１３７１９２号、特開昭！ｌ−≠
Ｏ７り７号、特開昭ｊコー３≠ｒｒ号、特開昭６３−ｒ
り７りぶ号、特開昭１３−１３１０１２号などの各公報
には、支持体上に非繊維質多孔性展開層が積層された構
成からなる多層分析要素が開示されている。

これらの多層分析要素においては、その展開層にアナラ
イトラ含有する水性液体試料を点着すると水性液体試料
は、単位面積当九り均一なｆを維持しながら試薬層中に
侵入し、発色反応を起こす。

そして、一定時間後にその色濃度を測定することによシ
、水性液体試料中のアナライトの濃度を知ることができ
る。

上記多層分析要素を利用する分析のアナライトの代表的
な例としては、生体液、例えば血液、尿、唾液、膵液、
腸液、髄液などの中に含有されている各種の加水分解酵
素を挙げることができる。

上記加水分解酵素としては各種各様のものが知られてい
るが、多層分析要素は、その内でも高分子量の化合物を
基質とし、加水分解反応によって拡散性の低分子量化合
物を生成する酵素の分析に特に有用である。これらの加
水分解酵素の定量的分析は、臨床検査項目として重要で
あシ、簡便かつ精度の高い分析方法の開発の要求が高い
。これらの加水分解酵素の例としては、プロテアーゼ、
アミラーゼ、リパーゼ、（例、トリジシン、キモトリプ
シン、イブシンなど）、はクチナーゼ及び各種キナーゼ
が挙げられる。

例えば、血液中に存在するアミラーゼの量の測定は、膵
機能の検査手段として臨床上極めて重要である。アミラ
ーゼは、デンプンなどのアミロース結合部分を加水分解
し、低分子量の多ａｔ類、少糖類または単糖類を生成す
る性質を有する酵素である。通常その性質、即ち酵素活
性を測定する方法により、存在量、試料液中の濃度の相
対値を算出する方法が一般的である。

従来公知のアミラーゼ活性の測定は、アミラーゼの基質
、例えばデンプン等の基質を含有する試料液を添加し、
一定条件下に一定時間反応させ次のち、残有：する未反
応基質或いは加水分解によって生成した低分子量の反応
生成物と、予め加えられていた高分子量基質との量比か
ら、酵素活性を算出する方法によるものが通例である。

前記の特開昭６３−１３１０１２号公報には著しく簡単
な操作によｐアミラーゼ活性が測定できる乾式の多層分
析材料（分析要素）が記載されている。この多層分析要
素は、アミラーゼの基質、例えば、デンプンに染料のよ
うな予め検出可能な発色団を結合させた非拡散基質金倉
む試薬層と、アナライト即ちアミラーゼの加水分解作用
によって拡散性となった反応生成物を受容する念めのレ
ジストレイジョン層と金含む積１−型の多層分析要素で
ある。この多層分析要素を用いてアミラーゼ活性を分析
する方法では、まず、予め検出可能な発色団（染料など
）が結合され交渉拡散性基質が、試料液の酵素の作用に
より加水分解され、これによシ発色団を有する拡散性の
低分子量化合物が生成する。この低分子量化合物は層中
金拡散し、ついにはレジストレイジョン層に受容され固
定されるので、レジストレイジョン層中に受容された発
色団を有する拡散性の低分子量化合物の量に対応する色
濃度を測光定量する操作により反応生成物の量を測定す
ることができる。

前記特開昭ｊ／−≠０／り７号公報は、上記特開昭１３
−／Ｊ１０１ｒり号公報に開示の分析要素に類似の層構
成を有する分析要素が開示されている。前者は、検出層
で検知される手段では本来検知できない化学ａを反応試
薬層に用意し、これをアナライトの作用により、反応試
薬層において、拡散性でかつ検知可能な化学種に変換し
、これを検出層で検出する過程を含むのに対し、後者に
おいては、反応試薬層中に予め検知可能な化学種を含有
させておくという相違がある。

これらの技術にあっては、検出層あるいはレジストレイ
ジョン層は拡散性化学種の単なる受容をその目的として
おり、その層内における発色反応などは想定されていな
い。従って、反応試薬層中に残存或いは生成した検知可
能な化学種と、検出層或いはレジストレインヨン層中に
捕捉或いは受容された化学種とを明確に識別し、定量性
のある１１１１Ｊ定結果を得るためには、両層の間に色
遮蔽を目的とした光散乱性の放射ブロッキングＩｆ５に
設けることが必須であった。

特開昭！７−グｏｔｅり号公報には、上記の欠点を改善
した多層分析要素が記載されている。この多層分析要素
にあっては、そこに用意された基質層に含有されている
基質とアナライトの反応により生成する拡散性化合物は
実質的に無色であり、そして、この拡散性化合物が、分
析要素内に予め含有されていた色原体と反応し、これに
より初めて色素が形成される。この色原体は通常、基質
層に積層されて設けられている呈色層に含有された状、
櫟で多層分析要素に予め導入されている。従って、アナ
ライトの作用を受ける前と後における基質と生成物を光
学的に識別することは極めて容易であるという特徴を有
するものである。ところが、上記開示技術において、拡
散性化合物との反応により色素を形成する色原体化合物
としてジアゾニウム化合物を使用し次場合には、ジアゾ
ニウム化合物の安定性が悪く、また分解反応や望ましく
ない種々の副反応を起こすことがある次め、これにより
分析の定量性が低下する傾向があることが判明した。

〔発明の要旨〕

本発明者は生体試料中の加水分解酵素を分析する友めの
一体型多層分析要素における上記諸問題の解決を図シ、
本発明に到達し次。

本発明の目的は経時安定性が高く、分析の定量性にすぐ
れ次加水分解酵素分析用の一体を多層分析要素を提供す
ることである。

本発明は光透過性・木下透過性支持体の上に呈色層と基
質層が積層されてなる多層分析要素において゛、ａ）ア
ナライトの作用により蛋白質と特異的に反応して色素或
いは螢光物質を形成しうる拡散性化合物を生成しうる非
拡散性基質を含んでなる基質層、及び、ｂ）前記アナラ
イトの作用により生成した拡散性化合物と特異的に反応
して色素或いは螢光物質を形成せしめる蛋白質を含んで
なる呈色層よりなることｆ！：特徴とする加水分解酵素
分析用の一体型乾式多層分析要素を提供するものである
。

〔発明の効果〕 本発明の多層分析要素は乾式であるため測定操作が極め
て簡便であり、測定経験の少ない人でも極めて高い精度
で測定できる。

本発明の多層分析要素はジアゾニウム塩を含有していな
いため、経時保存にすぐれておシ、長期間にわたって再
現性の良い測定結果が得られる。

〔発明の詳細な説明〕

本発明の多層分析要素は光透過性・木下透過性支持体の
上に呈色層と基質層とを順に積層してなる基本構成含有
するものである。

光透過性・木下透過性支持体（以下、支持体と略す）の
具体例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフ
ェノールＡのポリカーボネート、ホリスチレ／、セルロ
ースエステル（例、ｔはセルロースジアセテート、セル
ローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオ
ネート等）等のポリマーからなる厚さ約１０μｍから約
／ｖｍ、好ましくは約１０μｍから約３００μｍの範囲
の透明。

で水を実質的に透過させない支持体を挙げることができ
る。

支持体表面には必要により下塗層を設けて支持体の上に
設けられる基質層と支持体との接着全強固なものにする
ことができる。また、下塗層の代わりに、支持体の表面
を物理的あるいは化学的な活性化処理を施して接着力の
向上を図ってもよい。

支持体の上には（場合によっては下塗層等の他の層を介
して）呈色層が設けられる。

本発明の一体型乾式多層分析要素を構成する呈色層は検
体中のアナライトの作用により基質層中の基質が加水分
解され、その分解生成物が該呈色層に浸透し、該層中で
特異的に反応して色素或いは螢光物質を生せしめる蛋白
質を含有してなる層である。

呈色層に用いられるポリマーとしては水を吸収して膨潤
する性質を有する親水性ポリマーであることが好ましい
。親水性ポリマーの例としては、ゼラチン（酸処理ゼラ
チン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（フタル
化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン
等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリア
クリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルビク
リトン等を挙げることができる。

呈色層の乾燥膜厚は約２〜７００μｍの範囲、好ましく
は約ｔ〜３０μｍの範囲である。また呈色層は実質的に
透明であることが好ましい。

本発明の分析要素は呈色層がアナライトの作用により生
成した拡散性化合物と特異的に反応して色素或いは螢光
物質を生成しうる蛋白質、即ち酵素を含有することを特
徴としている。用いる酵素はこの作用により生成する色
素或いは螢光物質に結合している基質によって定められ
る。

本発明の呈色層に用いられる酵素の具体的例として、 （１１非還元末端α又はβ−Ｄ−／、４Ｃ−グルコシド
結合を加水分解して色素或いは螢光物質を生成する酵素 α−Ｄ−グルＦシダーゼ （ＥＣｊ、、２．／、Ｊ（７） β−Ｄ−グルコシダーゼ （ＥＣ３，、ｚ、１．、ｚｚ） １２）α又はβ−Ｄ−ガラクトシドを加水分解して色素
或いは螢光物質を生成する酵素α−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ （’Ｂｃ３．２．ｔ、２コ） β−Ｄ−ガラクトシダーゼ （ＥＣ３，２，ｉ、２ｓ） （３）α又はβ−Ｄ−マンノシドを加水分解して色素或
いは螢光物質全生成する酵素 α−Ｄ−マンノシダーゼ （ＥＣｊ、コ、／、λ≠） β−Ｄ−マンノシダーゼ （ＥＣ３，、ｚ、１．、ｚｔ） （４）β−Ｄ−フルクト７ラノシド結合を加水分解して
色素或いは螢光物質を生成する酵素β−Ｄ−フルクトフ
ラノシド （ＥＣＪ、コ、１．コロ） （５）β−Ｄ−グルクロニド結合を加水分解して色素或
いは螢光物質を生成する酵素 β−Ｄ−グルクロニダーゼ （ＥＣ３，、ｚ、１．３）） （６）β−Ｄ−フフピラノシド結会を加水分解して色素
或いは螢光物質を生成する酵素β−Ｄ−７コシダーゼ （ＥＣＪ、２．／、Ｊｒ） （カ　アリールリン酸を加水分解して色素或いは螢光物
質を生成する酵素 アルカリフォスファターゼ （ＥＣ３，１，ｚ、ｔ） が挙げられる。

呈色層中の酵素量は用いる酵素とその活性に応じて変わ
るものであるが、ｏ　、　ｏ　ｊ−／　ｏ　ｙ／ｍ２の
範囲で用いられる。

生成する色素がｐ−ニトロフェノールの場合、バインダ
ー中にα−シクロデキストリンを加えることができる。

呈色層の酵素が基質層に拡散移動すると非拡散性基質に
結合している色素形成物質と特異的に反応して色素或い
は螢光物質を生成する。これはアナライトの作用によら
ない呈色、即ち「かぶり」を生ずることを意味し、分析
性能を低下せしめるので、酵素の呈色層からの拡散を確
実に防止しなければならない。

酵素の呈色層からの拡散を防止する方法として、（１）
酵素を水不溶性の粒子に結合同定する１２）酵素の如き
比較的高分子量の物質が拡散移動しにくい親水性バイン
ダー例えばゼラチンに分散して用いる （３）呈色層と基質層の間に拡散防止層を設ける一基質
層からの拡散性生成物は透過し、酵素の拡散を抑制する
。これにはゼラチン、アガロース、ポリビニルアルコー
ル等の親水性ポリマーを用いるのが適肖である。

酵素を非拡散性にするために固定化する粒子として、セ
ファロース、アガロース、セファデックス、アビセル或
いはラテックス、ガラスピーズ等が挙げられる。

粒子と酵素とは二官能性の架橋試薬を用いて直接或いは
へキサメチレンジアミン等のスペーサーを介して結合さ
れる。二官能性架橋試薬としてグルタルアルデヒド、ヘ
キサメチレンジインシアネート、Ｎ、Ｎ’−１ｆレンビ
スマレイミト、水溶性カルボジイミド等が挙けられる。

呈色層には酵素、親水性バインダーの他、保存性などの
諸性能の向上金目的として界面活性剤、ｐＨｖＭＪ節用
試薬、酸化防止剤、その他の有機物或いは無機物からな
る４！ｒ檀添加剤を加えることができる。

呈色層の上に積層される基質層は、実質的に無色で呈色
層中に含有する酵素との特異的反応による加水分解作用
によって色素或いは螢光物質を生成する物質（以下色素
前駆体と称する）′ｆｒ：有し、アナライトの作用によ
り水の存在下に拡散しうる拡散性化分物を生成すること
ができる非拡散性色素前駆体を親水性バインダー中に分
散し次層である。

本発明の材料に用いられる非拡散性基質とは分析の目的
となるアナライトの作用により、分子の大きさ、形状、
解離度などの物性が著しく変化し、結果として、多層型
分析要素の親水性バインダ一層中での拡散性が著しく増
大する物質上いう。非拡散性基質の具体例は生体液中に
含まれる各種酵素の基質が挙げられる。これらのうち本
発明の多層分析要素が特に有効に適用できるのは、加水
分解酵素であって、その具体例としては、プロテアーゼ
、アミラーゼ、リノ髪−ゼ及びペクチナーゼが挙げられ
る。これらの加水分解酵素をアナライトとする場合、本
発明に用いられる非拡散性基質としてはそれぞれの加水
分解酵素の基質、即ち蛋白質、アミロース、グリセリド
またはペクチンに実質的に無色のｐＨ変色薬を結合させ
たものが用いられる。

酵素の加水分解作用により生成する色素或いは螢光物質
の例として ニトロフェノールおよびその誘導体、 ランベリフェロ／およびその誘導体、 ナフトールおよびその誘導体 が挙げられる。

色素前駆体の例として、 （１）　　ニトロフェノールを生成するものｐ−ニトロ
フェニル−α−マルトシド、ｐ−ニトロフェニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド、 ｐ−ニトロフェニル−α−］）　−／　ル：ｙ　ヒラノ
シド、 ｐ−ニトロフェニルリン酸 １２）　　ウンベリフェロンを生成するものグーメチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、 ３−カルボキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、 μｍメチルウンベリフェリル−α−Ｄ−マンノピラノシ
ド、 弘−メチルウンベリフェリル−リン酸 （３）ナフトールを生成するもの ６−ブロモーーーナフチルーα−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、 ６−プロモー２−ナフチル−α−Ｄ−グルコピラノシド が挙げられる。

目的に応じて選択された色素前駆体基質を非拡散性基質
に結合させる方法は、染料業界で広く用いられている「
反応性染料」の技術が用いられる。

ここで用いる色素前駆体を非拡散性基質に結合するには
、色素分子形成側の官能基を活性化するか、或いは呈色
層中の酵素の作用により加水分解される色素に結合して
いる糖の部分を活性化するかの何れかの方法にニジなさ
れる。

染料業界では各種天然繊維に染料化合物を物理的に吸着
させるか、或いは化学結合を形成させてより好ましい染
料状態を得ている。この時用いられる染料が反応性染料
であり、Ｋ、ヴエンカタラ−ｒ　７　（Ｋ　、　Ｖｅｎ
ｋａ　ｔ　ａ　ｒ　ａｍａｎ　）編［合成化学（Ｔｈｅ
　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　５ｙｎｔｈｅｔｉ
ｃ　　Ｄｙｅｓ）　Ｊ第■巻にューヨーク、アカデミツ
クプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、／２７
２年発行）にこの反応性染料が詳しく述べられている。

特に天然高分子である多棟類のセルロースや蛋白質繊維
である羊毛、絹等の分子と染料分子を結合する「連結基
」については詳しく記載されておシ、本発明に用いる非
拡散性基質を製造するためにこれらの技術を用いること
ができる。即ち、この連結基金利用して色素前駆体と非
拡散性基質とを結会し、本発明に有益な化合物を得るこ
とができる。色素前駆体の基質への結什量は少ないと加
水分解酵素の加水分解作用によシ遊離生成する色素前駆
体のｔが少なく検出の鋭敏性が損なわれる。結合量が多
い程検出の鋭敏性は高くなるが、余シ多くなると基質と
しての特性が損なわれる。色素前駆体をデンプンに結合
する場合、デンプンのグルコースＪ−−７００単位当た
り７個の割合で色素前駆体が結合していること、よｐ好
ましくは１０−≠Ｏ単位当之シ／個の範囲である。

基質）＃全塗布により形成する場合には、基質を／［又
は２種以上のポリマーからなるバインダー溶液中に溶解
又は分散し友液を塗布、乾燥して用いる。しかしながら
、本発明の基質は基質自身高分子量であるのでバインダ
ーを用いずに塗布或いは含浸などの方法によっても形成
することができる。例えば、濾紙、不織布、織物生地、
編物生地、ガラス繊維濾紙、メンブランフィルタ−など
に基質を含浸させるなどの前処理の後、呈色層上にラミ
ネート等の手段によって積層することも可能である。

この基質層に用いうる親水性バインダーのポリマーとし
ては各種の親水性バインダーがある。これらのうち本発
明に用いることができるものとして、ゼラチン、アガロ
ース、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロ
ース、メチルセルロースなどの天然親水性高分子、ポリ
アクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピ
ロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリヒドロキシ
エチルメタクリレート、アクリル酸を含むコポリマー、
マレイン酸を含むコポリマーなどの親水性合成高分子な
どがある。

これらのうちから、アナライトの特性、塗布特性などを
考慮して適当なバインダーを選択する。

例えば、プロテアーゼの分析材料用バインダーとしては
ゼラチンは不適当であり、主としてアガロースが用いら
れる。また、アナライトの分子量が大きい場合（例えば
、アミラーゼなど）には、アナライトの基質層への拡散
を実効あらしめるため、膨潤率の大きいバインダー、例
えば、ポリアクリルアミドを使用する。親水性バインダ
ーポリマーのうちで本発明の基質層のバインダーとして
特に適しているのはアガロース、ポリアクリルアミド、
ポリアクリル酸ナトリウム、アクリルｌ’ｌ！？含むコ
ポリマーである。

基質層には非拡散性色素前駆体、親水性バインダーの他
、保存性などの諸性能の向上を目的として、界面活性剤
、ｐＨ調節用試薬、酸化防ＩＬ剤、その他有機物或いは
、無機物からなる各種添加剤を加えることができる。

基質層の膜厚は塗布層として設けるためにはλ〜！Ｏμ
ｍ程度、好ましくは、４ｔ〜３０μｍの範囲が適当であ
る。ラミネートによる積層など塗布以外の方法による場
合の膜厚は、数十〜数百μｍの範囲で大きく変化し得る
。

本発明の多層分析要素は、更に必要に応じて拡散防止、
試料の均一展開、光遮蔽、接着など金目的としたその他
の機能層を積層してなることができる。

拡散防止層の機能は、呈色層中の酵素の他層への拡散並
びに、アナライトによる作用を受ける前の非拡散性基質
の他層への拡散をそれぞれ完全に防止し、かつ拡散性と
かった反応生成物（拡散性化合物）の拡散を妨げないこ
とにある。拡散防止層に用いられる材料は基質層に用い
られるものと同様の親水性ポリマー類である。これらの
うち特に適当なポリマーは、ゼラチン、アガロース、ポ
リビニルアルコールであって、これらは非拡散性基質と
生成物（拡散性化合物）の間の拡散性の差を明確にする
のに適した特性を有している。拡散防止層中にも基質層
に関して述べ次と同様各種の添加物を加えることができ
る。

拡散防止層はその機能から理解されるように、基質層と
呈色層との間に設けられ、通常約０．ｊ〜ｊμｎｌの厚
さを有する。

本発明の多層分析要素は、基質層の上に展開層を設ける
ことができる。

本発明の展開層としては濾紙、不織布、織物生地、編物
生地、ガラス繊維濾紙、プラッシュポリマーにより形成
されるメンブランフィルタ−あるいはポリマーミクロビ
ーズ等からなる連続空隙含有多孔性層等を用いることが
好ましい。

展開層に用いることができる織物生地（織布）としては
、特開昭ｊｔＪ−／を弘３ｊ６号および特開昭７７−ｔ
ｔＪｊｔり号の各公報に開示の広範囲の種類の織物生地
が挙げられる。

織物生地のうちでは平織物が好ましく、絹布生地、金巾
生地、ブロード生地、ボブリン生地等が好ましい。糸の
太さは−２（１）　１．）〜／Ｊ−（７Ｓ、好ましくは
≠Ｏ８〜・／コク８相当の範囲である。織物生地の厚さ
は１００〜ｓｏｏμｍ１好ましくは１２Ｏ〜ＪＩＯμｍ
の範囲である。

編物生地としてはメリヤスが好ましく、−重アトラス編
生地、トリコット編生地、ダブルトリコツ、ト編生地、
ラッシェル編生地等を用いることができる。編物生地の
糸の太さは参〇Ｓ〜１ｚｏｓ、好ましくはｔＯＳ〜／コ
Ｏ８相当の範囲である。

編物生地の厚さは１ｏｏ−ｔｏｏμｍ、好ましくは／！
ＯＳ−≠００μｍの範囲である。

織物生地、編物生地を作る原糸としては綿、絹、羊毛等
の天然繊維の糸、ビスコースレーヨン、キュプラ等の再
生セルロース、セルロースジアセテート、セルロースト
リアセテート等の半合成有機ポリマー、ポリアミド（ナ
イロン類）、アセタール化ホリビニルアルコール（ビニ
ロン等）、ｄｅｌＪアクリロニトリル、ポリエチレンテ
レフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウ
レタン等の合成有機ポリマーの細繊維からなる糸または
単繊維からなる糸、天然繊維と再生セルロース、半合成
ま念は合成有機ポリマー繊維との混合繊維からなる糸が
挙げられる。

多孔性展開層に用いられる織物または編物生地は特開昭
Ｊ’７−６ｌ、３１２号公報に開示の物理的活性化処理
（好ましくはグロー放電処理又はコロナ放電処理等）を
生地の少なくとも片面に施すか、或いは特開昭６１−／
Ａ≠Ｊｅｔ号、特開昭よ７−６ｔ３ｊり号公報等に開示
の親水性ポリマー含浸等の親水化処理、又はこれらの処
理工程を逐次実施することにより織物生地又は編物生地
全親水化し、下側（支持体に近い側）の層との接着力を
強化することができる。

織物又は編物生地からなる展開層を基質層又は接着層に
接着・積層するには特開昭１１−／１４ｃＪｅｔ号およ
び特開昭！７−≦１．３ｊり号公報等に開示の方法に従
って作製することができる。即ち、基質層又は接着層の
塗布後床乾燥のうちに、または乾燥後の層に水（または
界面活性剤を少量含む水）を実質的に均一に供給して層
を膨潤させ、つ込で織物または編物生地を湿潤または膨
潤している層の上に実質的に均一に軽く圧力をかけなが
ら接着・積層して一体化する。

展開層がプラッシュポリマーまたはメンブランフィルタ
−からなる場合には特公昭ｊ３−λ１６７７号公報等、
ポリマーミクロビーズからなる三次元格子状構造物層で
ある場合には特開昭Ｊ′！−タｏｒｒり号公報等、濾紙
または不織布からなる場合には特開昭１７−１１１１２
１０号公報等にそれぞれ記載の方法に従って設けること
ができる。

本発明の多層分析材料には基質層と呈色層の間に色遮蔽
層″１次は光反射層を設けることができる。

さらに展開層と色遮蔽層ま友は光反射層との間に展開層
を強固に接着する目的で液体試料透過性の接着層を設け
ることができる。

色遮蔽層ま友は光反射層としては、Ｔ　ｉ　Ｏ２微粉末
またはＢａＳＯ４微粉末等の白色微粉末を親水性バイン
ダーポリマーに分散してなる厚さ約λ〜コＯＡｍの範囲
の層を設けることができる。

接着層としては、基質層、色遮蔽層または光反射層など
にバインダーとして用いられている液体試料透過性の親
水性ポリマーと同洩のポリマーからなる厚さ約０．２〜
！μｍの範囲の層を設けることができる。親水性ポリマ
ー水溶液を基質層、色遮蔽層または光反射層の上に塗布
し、その後半乾きのときに、または乾燥後に接着層の表
面を水または界面活性剤を含む水で湿潤させておいて、
その表面に多孔質材料を接触させ、適当な圧力をかけて
接着層に一様に積層することができる。また接着層の上
に多孔質層を形成しうる溶液または分散液を塗布するこ
とによっても展開層が強固に接着した多層分析要素をう
ろことができる。

本発明の要素を更に具体的、詳細に説明する為にアミラ
ーゼ活性測定用の多層分析要素を具体例として以下に詳
述する。本発明による多層分析要素の一実施態様として
のアミラーゼ分析用多層分析要素は、アミラーゼの基質
であるアミロース結合を含む化合物、例えばデンゾ／に
色素前駆体基質を結合させ友非拡散性基質と親水性バイ
ンダーとからなる基Ｉａ層、基質に結合した色素前駆体
基質を加水分解作用によって色素或いは螢光物質を生成
せしめる酵素を含有する呈色層とを透明なプラスチック
フィルム上に積層塗布し九構成をしている。

デンプン分子は本来非常に大きく非拡散性であって１反
応前には呈色層の中へ拡散することはないので、色素前
駆体と呈色層に固定化された酵素とは隔離され次状態に
保持されており、多層分析要素は実質的に無色である。

アナライ）７するアミラーゼを含む試料水溶液が基質層
に付着するとアミラーゼが水媒体と共に基質層に拡散、
浸透する。

ついでアミラーゼの加水分解作用が進行し、デンプン分
子が切断され、低分子化されるに従い、層中の拡散性が
増加し、色素前駆体が結合した少糖類（拡散性化合物）
が呈色層中に拡散して行き、呈色層中に固定され次酵素
の作用により加水分解され、色素或いは螢光物質を生成
する。アミラーゼの活性はデンプンの加水分解速度に比
例し、一方、色素形成速度は呈色層中に拡散し次色素前
駆体が結合した少糖類の量に比例する。従って、一定時
間内に形成された色素の量を測光或いは螢光を測定する
ことによって、アミラーゼ活性を知ることができる。以
上の如く、本発明の多層分析要素においては、色素形成
反応速度を測定し、これと予め既知量のアミラーゼを用
いて作成した検量線とから、被検液中のアミラーゼ活性
を測定する。

この方法においては、被検液の適用前ではほぼ無色であ
り、反応後に測光によって得られる光学濃度値或いは螢
光強度値は、酵素反応の結果形成され友色素量そのもの
に比例する。

合成例 （１１Ｆ−二トロフェノール前駆体修飾デンプンの合成 １００ｍ１の反応容器に塩化シアヌル≠、０２、蒸留水
ｊｍ１．アセトン３０ｍｔｆ加え、−１０°Ｃまで冷却
して攪拌する。次に、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドｔ、ｏｔ、蒸留水２０ｍ１及び水酸化
ナトリウム１．Ｏｆからなる溶液を加え、−／（７０Ｃ
で３０分、更に室温で２時間攪拌する。次に、塩酸でｐ
Ｈ７とし、アセトンλｊＯｍｌｆ加えて沈澱せしめ、生
成物を乾燥する。反応性色素前駆体の収量１．７ｔ０可
溶性デンプン！ｔ％コークロロエチルアミン塩酸塩コ、
！？、水酸化ナトリウム≠ｆｔ蒸留水／４ＡＯＩＬｌに
溶解し、室温で３時間攪拌する。塩酸でｐＨ７とし、過
剰のアセトンを加えて沈澱せしめ、生成物を乾燥し次。

収１１≠、ｒｆ０アミノエテル化デンプンμ、ｒｒ、水
酸化ナトリウムμｆｔ１−蒸留水７≠Ｏａｔで溶解し、
反応性色素前駆体！、７ｔｆ加え、室温で１０時間攪拌
する。最後に塩酸でｐＨ７とし、過剰のアセトンを加え
て沈澱せしめ、生成物を乾燥した。収量≠。

ｔ０ 反応率を測定する念めに得られたデンプン誘導体のＪ／
７ｎｍにおける紫外吸収を測定した組法、グルコース２
７ユニツト当たｐｉ分子の色素前駆体が導入され次こと
を確認し友。

１２）　　ウンベリフェロン前駆体修飾デンプンの合成 ｊｏｏｍｌの反応容器に３−カルボキシウンベリフェリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド３．！？、蒸留水ｊＯ
ｍｌｆ加え、０．／Ｎ　　Ｈ（ＪＴｐＨ３４゜ｒに調製
し、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩／、Ｏｆｆ加え、室温で１時間攪
拌し、次いでエチレンヂアミン／　、ｔｆ１に加え、室
温で７時間攪拌する。次に塩酸でｐＨ７とし、アセトン
を過剰に加えて沈澱せしめ、生成物を乾燥する。アミノ
化したウンヘリフエロン前駆体の収量コ、コ１゜ 可溶性デンプン１ｆｔ−合成例（１）と同様にしてアミ
ノエチル化する。アミノエチル化デンプン≠、ｌｔ、ア
ミノ化ウンベリフェロン前駆体λ、２２を蒸留水２００
ｒｎｌで溶解し、グルタルアルデヒド（３％水溶液）２
０ｍｌを加え、室温で３時間攪拌する。最後に塩酸でｐ
Ｈ７とし、過剰のアセトンを加えて沈澱せしめ、生成物
を乾燥し友。収を弘２２゜ 反応率を測定するために得られたデンプン誘導体の３２
乙ｎｍにおける紫外吸収を測定し次結果、グルコース３
２ユニツト当たり１分子の色素前駆体が導入され次こと
？確認した。

（実施例／） ｆｉ＋　　アミラーゼ活性測定用乾式多層分析フィルム
の炸裂 ゼラチン下塗りした無色透明ポリエチレンテレフタレー
ト（ＰＥＴ）フィルム（厚さｔｒＯａｍ）の上に呈色層
（乾燥膜厚／２μｍ）、拡散防止層（乾燥膜厚コμｍ）
および基質層（乾燥膜厚／２μｍ）全順次塗布、乾燥に
より形成し次。さらに上記三層を塗布した面をｐ−ノニ
ルフェノキシグリセリンＯ，コチ水溶液で湿潤させた後
、グロー放電により親水化処理したポリエステルと綿の
混紡布＜ｉｏｏ香手の平織布；混紡比：ポリエチレンテ
レフタレート／綿＝７！／２１）’ｆ＜圧着・乾燥して
展開層を形成させ、アミラーゼ測定用一体型乾式多層分
析要素を作成した。

以下に呈色層、拡散防止層、基質層の調製法を示す。

呈色層 精製水　　　　　　　　　　　　／７ｊ　　ｍｌ脱イオ
ンゼラチ：ｙ　　　　　　　　　／ｊ　　ｆＨＥＰＥＳ
（Ｎ−２−ヒドロキシ エテル−ピペラジン−Ｎ’− λ−エタンスルホン酸）Ｊ、ｔｆ β−Ｄガラクトシターゼ　　　　ｏ、ｒ　　ｔｐ−ノニ
ルフェノキシクリセリン （！チ水溶液）！？ ゼラチンを加熱溶解し、溶液のｐＨを水酸化ナトリウム
で７．θに調整し次。

拡散防止層 精製水　　　　　　　　　　　　　！ＯゴＴ　ｉ　０２
微粉末　　　　　　　　　ｔｏ　　ｔｐ−ノニルフェノ
キシグリセリン １２！チ水溶液）　　　　　　ｏ、ｒｙ上記混合物を完
全にボールミル型粉砕機で粉砕し、次いでゼラチン１０
チ水溶液１００？’にこれに添加しホモジナイザーで均
一分散した。

基質層 ｐ−ニトロフェノール前駆体修飾デフフッ合成法ｆｉ＋
参照）　　　　　　　　弘　　２ＨＥＰＥＳ　　　　　
　　　　／、ｊ　　ｒ精製水　　　　　　　　　　　　
≠コ　　ゴポリアクリルアミド （！チ水溶液）　　　　　　３コ　ｔ ｐ−ノニルフェノキシグリセリン （ｊチ水溶液）　　　　　　　、≠　１上記混合液を溶
解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１ｆｔニア、７と
じた。

１２）アミラーゼ活性の測定 ヒト膵アミラーゼｆｔ７％ヒトアルブミン生理食塩水で
段階的に希釈し、ブルースターチ法で測定したアミラー
ゼ活性が次の値のアミラーゼ標準液を作製した。

Ａ　　　タコ ソモジ（Ｓｏｍｏｇｙｉ）　Ｕ／ｒｎ９Ｂ　　３り／　
　Ｉ ＣＩｏｒａｓ フィルムにアミラーゼ標準液７ｊ１０μｉｆ点着し、３
７°Ｃｊ分間インクベートし、マクベス濃度計を用いて
弘□ｊｎｍの光で反射光学濃度を測定し、次に示す結果
を得危。

反射光学濃度値 上記結果から、本発明のアミラーゼ活性測定用フィルム
は、アミラーゼの活性に応じた発色性能を有する。

（実施例λ） （１）アミラーゼ活性測定用乾式多層分析フィルムの作
製 実施例１において修飾デンプンを合成例１２）のウンベ
リフェロン前駆体修飾デンプンに変更した他は、実施例
／と同様にしてアミラーゼ活性測定用一体を乾式多層分
析フィルム金作製した。

１２）アミラーゼ活性の測定 実施例１と同様にアミラーゼ標準液１０μｌを点着し、
３７°ＣＡ分間インクベート後、日立螢光分光光度計ｔ
ｒｏ型で反射螢光を測定し″（°励起光３ぶｊｎｍ、螢
光≠４’Ｊ’ｎｍ）、次に示す結果を得几。

相対螢光強度 上記結果から、本発明のアミラーゼ活性測定用フィルム
は、アミラーゼの活性に応じた螢光発光性能を有するこ
とが判った。

特許出願人　富士写真フィルム株式会社手続補正書（方
側 １、事件の表示　　　　昭和ｔＯ年特願第１ＪＩ７７’
７号２、発明の名称　　乾式多層分析要素 ３、補正をする者 事件との関係　　　　　　　特許出願人任　所　　神奈
川県南足柄市中沼２１０番地表　補正命令の日付　　昭
和ｔｏ年り月２≠日（発送日） ５、補正の対象　　明細書 ６、補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし）を提出します。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）光透過性・木下透過性支持体の上に呈色層と基質
   層がこの順に積層されてなる乾式多層分析要素において
   、 ａ）被検物質の作用により、実質的に無色で後記する蛋
   白質と特異的に反応して色素或いは螢光物質を形成しう
   る物質を有する拡散性化合物を生成しうる非拡散性基質
   を含んでなる基質層、および ｂ）前記被検物質の作用により生成した拡散性化合物と
   特異的に反応して色素或いは螢光物質を形成せしめる蛋
   白質を含んでなる呈色層、であることを特徴とする多層
   分析要素。 １２）前記非拡散性基質がデンプンであり、アナライト
   がアミラーゼである特許請求の範囲第１項に記載の乾式
   多層分析要素。