JPS613064A - 酵素を利用したポリヌクレオチドの測定方法 - Google Patents
酵素を利用したポリヌクレオチドの測定方法Info
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- JPS613064A JPS613064A JP59123758A JP12375884A JPS613064A JP S613064 A JPS613064 A JP S613064A JP 59123758 A JP59123758 A JP 59123758A JP 12375884 A JP12375884 A JP 12375884A JP S613064 A JPS613064 A JP S613064A
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- enzyme
- polynucleotide
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- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
特定の構造を有するデオキ／リボ核酸（ＤＮＡ ）及び
リボ核酸（ＲＮＡ ）の測定は生化学分野において重要
であり、例えば人血清中のＤＮＡを測定すること罠よっ
てウィルス感染の検査あるいは遺伝性疾患の発見などを
行なうことができる。本発明はこのようなりＮＡ及びＲ
ＮＡの特定のものを簡便かつ正確に測定しうる方法を提
供するものである。
リボ核酸（ＲＮＡ ）の測定は生化学分野において重要
であり、例えば人血清中のＤＮＡを測定すること罠よっ
てウィルス感染の検査あるいは遺伝性疾患の発見などを
行なうことができる。本発明はこのようなりＮＡ及びＲ
ＮＡの特定のものを簡便かつ正確に測定しうる方法を提
供するものである。
（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）
従来、このＤＮＡ及びＲＮＡの測定方法としては、試料
を変性処理して得だ一本鎖ＤＮＡ（Ｓ−ＤＮＡ）又は−
木調ＲＮＡ（Ｓ −ＲＮＡ ）を固相に結合させ、との
固相にラノオアイノトーデを標識した５−ＤＮＡ又は５
−ＲＮＡを作用させて固相の５−ＤＮＡ又は５−ＲＮＡ
と・・イブリ。
を変性処理して得だ一本鎖ＤＮＡ（Ｓ−ＤＮＡ）又は−
木調ＲＮＡ（Ｓ −ＲＮＡ ）を固相に結合させ、との
固相にラノオアイノトーデを標識した５−ＤＮＡ又は５
−ＲＮＡを作用させて固相の５−ＤＮＡ又は５−ＲＮＡ
と・・イブリ。
ドを形成させてから未反応の標識Ｓ −ＤＮＡ又は５−
ＦｔＮＡを除去し、固相の放射線を測定する方法が行な
われていた。この方法は測定の際に固定化、洗浄等数多
くの工程を必要とし、特に試料の固定化に長時間を要す
るところから操作の労力及び時間の両方に問題があった
。
ＦｔＮＡを除去し、固相の放射線を測定する方法が行な
われていた。この方法は測定の際に固定化、洗浄等数多
くの工程を必要とし、特に試料の固定化に長時間を要す
るところから操作の労力及び時間の両方に問題があった
。
本発明者らはこのような問題のない方法を開発すべく種
々検討の結果、予め標識された一本鎖ポリスクレオチド
を固相に結合させておき、この固相に試料を変性処理さ
せて得た一本鎖ポリヌクレオチドを作用させてハイブリ
ッドを形成させ、ハイブリッドしたポリヌクレオチドを
制限酵素で切断する方法を案出し、その内容を既に特許
出願（特願昭５８−１９９７０２号）した。しかしなが
ら、この方法もまだ固相の分離が必要であり、特に大量
の検体を一度に処理する臨床分析等にあってはこの分離
操作が煩雑であった。
々検討の結果、予め標識された一本鎖ポリスクレオチド
を固相に結合させておき、この固相に試料を変性処理さ
せて得た一本鎖ポリヌクレオチドを作用させてハイブリ
ッドを形成させ、ハイブリッドしたポリヌクレオチドを
制限酵素で切断する方法を案出し、その内容を既に特許
出願（特願昭５８−１９９７０２号）した。しかしなが
ら、この方法もまだ固相の分離が必要であり、特に大量
の検体を一度に処理する臨床分析等にあってはこの分離
操作が煩雑であった。
（問題点を解決するだめの手段）
本発明はこのような問題点を解決するものであり、測定
対象の一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリ、ドする一本
鎖？リヌクレオヂドに−の酵素及びこの酵素の作用によ
る生成物質を基質とする他の−の酵素を結合させ又けし
うるようにし、この二種の酵素による連続反応がこのポ
リヌクレオチドの切断によって変化することを利用して
いる。
対象の一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリ、ドする一本
鎖？リヌクレオヂドに−の酵素及びこの酵素の作用によ
る生成物質を基質とする他の−の酵素を結合させ又けし
うるようにし、この二種の酵素による連続反応がこのポ
リヌクレオチドの切断によって変化することを利用して
いる。
すなわち、本発明は測定対象である一本鎖ポリヌクレオ
チドを、酵素１又けこの酵素１を直接もしくは間接的に
結合しうる物質】と、酵素１の作用により生ずる物質を
基質とする酵素２又はこの酵素２を直接もしくは間接的
に結合しうる物質２とが結合されかつ該測定対象二本鎖
ポリスクレオチドと二本鎖ポリスクレオチ１“を形成し
うる一本鎖ホリヌクレＡチドと接触させて二本鎖ポリス
クレオチドを形成させ、該二本鎖ポリヌクレオチドに一
本鎖ポリヌクレオチド制限酵素を作用させてこの一本鎖
ポリヌクレオチドを切断し、その後この、１０ リヌク
レオチｌ゛に結合されている酵素２の反応を測定するこ
とを特徴とするポリヌクレオチドの測定方法に関するも
のである。
チドを、酵素１又けこの酵素１を直接もしくは間接的に
結合しうる物質】と、酵素１の作用により生ずる物質を
基質とする酵素２又はこの酵素２を直接もしくは間接的
に結合しうる物質２とが結合されかつ該測定対象二本鎖
ポリスクレオチドと二本鎖ポリスクレオチ１“を形成し
うる一本鎖ホリヌクレＡチドと接触させて二本鎖ポリス
クレオチドを形成させ、該二本鎖ポリヌクレオチドに一
本鎖ポリヌクレオチド制限酵素を作用させてこの一本鎖
ポリヌクレオチドを切断し、その後この、１０ リヌク
レオチｌ゛に結合されている酵素２の反応を測定するこ
とを特徴とするポリヌクレオチドの測定方法に関するも
のである。
測定対象は一本鎖ポリヌクレオチド（以下、測定対象ポ
リヌクレオチドという。）である。測定対象ポリヌクレ
オチドにはＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
リヌクレオチドという。）である。測定対象ポリヌクレ
オチドにはＤＮＡ及びＲＮＡを含む。
試料中に含まれるポリスクレオチドが二本鎖である場合
には水酸化ナトリウム溶液の添加などのアルカリ処理あ
るいは熱処理などにより一本鎖にしておく必要がある。
には水酸化ナトリウム溶液の添加などのアルカリ処理あ
るいは熱処理などにより一本鎖にしておく必要がある。
試料の種類は問わないが、例えば人血清、尿、組織抽出
物などである。人血清などのようにポリヌクレオチドが
蛋白と結合しているおそれがある場合には試料をプロテ
アーゼ等で処理して蛋白を分離しておくのがよい。
物などである。人血清などのようにポリヌクレオチドが
蛋白と結合しているおそれがある場合には試料をプロテ
アーゼ等で処理して蛋白を分離しておくのがよい。
この測定対象ポリヌクレオチドと接触させる一本鎖ポリ
ヌクレオチド（以下、標識ポリヌクレオチドという。）
は、酵素ｌ又はこの酵素Ｊを直接もしくは間接的に結合
しうる物質１と、酵素１の作用により生ずる物質を基質
とする酵素２又はこの酵素２を直接もしくは間接的に結
合しうる物質２とが結合されかつ該測定対象二本鎖ポリ
スクレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうるも
のである。従って、この標識ポリヌクレオチドは測定対
象ポリスクレオチドに対するグローブである。この標識
ポリスクレオチドは測定対象ポリヌクレオチドを含む二
本鎖ポリヌクレオチドをアルカリ処理、熱処理などで変
性させて用いればよい。
ヌクレオチド（以下、標識ポリヌクレオチドという。）
は、酵素ｌ又はこの酵素Ｊを直接もしくは間接的に結合
しうる物質１と、酵素１の作用により生ずる物質を基質
とする酵素２又はこの酵素２を直接もしくは間接的に結
合しうる物質２とが結合されかつ該測定対象二本鎖ポリ
スクレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうるも
のである。従って、この標識ポリヌクレオチドは測定対
象ポリスクレオチドに対するグローブである。この標識
ポリスクレオチドは測定対象ポリヌクレオチドを含む二
本鎖ポリヌクレオチドをアルカリ処理、熱処理などで変
性させて用いればよい。
その場合、相補性がある相手方の一本鎖、４１Ｊヌクレ
オチドは極力除去する必要があり、そのため、電気泳動
やイオン交換クロマトグラフィーアルイはアフィニティ
ークロマトグラフィーなどを利用して精製を行なうのが
よい。１だ、最近測定対象ポリヌクレオチド、ＤＮａｓ
ｅ ｌ及びＤＮＡ ｙ！？リメラーゼ１の存在下で各種
ヌクレオチドを次々と結合させる二、クトランスレー／
ヨン法や大腸菌を用いるＣＤＮＡ作製法等の直接一本領
ポリヌクレオチドを合成する方法が開発されており、こ
れらの方法によって合成することも可能である。さらに
検出プローブのみを溶液中でアニーリングさせ、これに
二本鎖ポリヌクレオチド制限酵素を作用させた後ケ。
オチドは極力除去する必要があり、そのため、電気泳動
やイオン交換クロマトグラフィーアルイはアフィニティ
ークロマトグラフィーなどを利用して精製を行なうのが
よい。１だ、最近測定対象ポリヌクレオチド、ＤＮａｓ
ｅ ｌ及びＤＮＡ ｙ！？リメラーゼ１の存在下で各種
ヌクレオチドを次々と結合させる二、クトランスレー／
ヨン法や大腸菌を用いるＣＤＮＡ作製法等の直接一本領
ポリヌクレオチドを合成する方法が開発されており、こ
れらの方法によって合成することも可能である。さらに
検出プローブのみを溶液中でアニーリングさせ、これに
二本鎖ポリヌクレオチド制限酵素を作用させた後ケ。
ル沖過して混入している相補性プリヌクレオチドを除去
してもよい。
してもよい。
酵素】及び酵素２は、酵素】の作用により生ずる物質を
酵素２が基質とする関係にあればよい。
酵素２が基質とする関係にあればよい。
このような酵素の組合せの例を次に示す。
酵素１ 酵素２
ヘキソキナーゼ − グルコース−６−ホスフ
エードプヒドロケ８ナーゼ アルカリホスファターゼ − α−Ｄ−ヘキシトールデ
ヒドロケゞす一ゼ ビルベートキナーゼ − ラクデートデヒドロケゝ
ナーゼダルコ−スオギンダーゼ − パーオキンダーゼ
ウリカーゼ − パーオキ７ダーゼフマラ
ーゼ − マレートｒヒドロデナーゼこ
れらは一例であり、酵素・・ンドブ、りあるいは生化学
・・ンドブ、りに記載されている各種酵素のなかから適
当な組合せを選択して使用することができる。酵素には
作用至適ＰＨが中性のほか酸性あるいはアルカリ性のも
のがあり、また、耐熱性を有するものなど種々のものが
あるから、測定条件などに応じ適当なものを選択する。
エードプヒドロケ８ナーゼ アルカリホスファターゼ − α−Ｄ−ヘキシトールデ
ヒドロケゞす一ゼ ビルベートキナーゼ − ラクデートデヒドロケゝ
ナーゼダルコ−スオギンダーゼ − パーオキンダーゼ
ウリカーゼ − パーオキ７ダーゼフマラ
ーゼ − マレートｒヒドロデナーゼこ
れらは一例であり、酵素・・ンドブ、りあるいは生化学
・・ンドブ、りに記載されている各種酵素のなかから適
当な組合せを選択して使用することができる。酵素には
作用至適ＰＨが中性のほか酸性あるいはアルカリ性のも
のがあり、また、耐熱性を有するものなど種々のものが
あるから、測定条件などに応じ適当なものを選択する。
使用される酵素は通常は２種類であるが、必要に応じ連
続反応する関係にある３種以上の酵素を使用することも
できる。
続反応する関係にある３種以上の酵素を使用することも
できる。
酵素１を直接もしくは間接的に結合しうる物質】（以下
、親和性物質１という。）及び酵素２を直接もしくは間
接的に結合しうる物質２（以下、親和性物質２という。
、親和性物質１という。）及び酵素２を直接もしくは間
接的に結合しうる物質２（以下、親和性物質２という。
）とは、水溶液中で親和力等により自動的に結合する物
質である。直接結合しうる親和性物質１又は親和性物質
２としては、例えば酵素１又は酵素２に対する抗体がこ
れに相当し、間接的に結合しうる親和性物質１又は親和
性物質２としては、例えば酵素１又は酵素２にビオチン
又はアビノンを結合させた場合のアビツノ又はビオチン
がこれに相当する。親和性物質】及び親和性物質２はビ
オチン及びアビノンに限られるものではなく、これらの
誘導体、そのほか・・ブテンをポリヌクレオチドに結合
し、一方、・・ブテンの抗体に酵素を結合させても゛よ
い。
質である。直接結合しうる親和性物質１又は親和性物質
２としては、例えば酵素１又は酵素２に対する抗体がこ
れに相当し、間接的に結合しうる親和性物質１又は親和
性物質２としては、例えば酵素１又は酵素２にビオチン
又はアビノンを結合させた場合のアビツノ又はビオチン
がこれに相当する。親和性物質】及び親和性物質２はビ
オチン及びアビノンに限られるものではなく、これらの
誘導体、そのほか・・ブテンをポリヌクレオチドに結合
し、一方、・・ブテンの抗体に酵素を結合させても゛よ
い。
酵素１、酵素２又は親和性物質１、親和性物質２を標識
ポリヌクレオチドとなる一重鎖ポリヌクレオチドに結合
させる方法は公知の方法に準じて行なえばよい。これら
は直接ポリヌクレオチドに結合させてもよく、ス被−サ
ー等を介して結合させてもよい。酵素１又は親和性物質
１と酵素２又は親和性物質２とをポリヌクレオチドに結
合させる間隔は１０〜１０００２程度が適当であり、そ
こでこのような間隔で結合されるようにこれらの添加量
あるいは反応条件などを調節するのがよい。
ポリヌクレオチドとなる一重鎖ポリヌクレオチドに結合
させる方法は公知の方法に準じて行なえばよい。これら
は直接ポリヌクレオチドに結合させてもよく、ス被−サ
ー等を介して結合させてもよい。酵素１又は親和性物質
１と酵素２又は親和性物質２とをポリヌクレオチドに結
合させる間隔は１０〜１０００２程度が適当であり、そ
こでこのような間隔で結合されるようにこれらの添加量
あるいは反応条件などを調節するのがよい。
このような標識ポリヌクレオチドを測定対象ポリヌクレ
オチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ
る。接触時間は通常は測定対象ポリヌクレオチドが標識
ポリヌクレオチドと充分に反応して・・イブリッドを形
成しうる程度であるが、例えば０５〜４０時間程度が適
当である。温度は２０〜７０℃程度、ＰＨは５〜９程度
がよい。
オチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ
る。接触時間は通常は測定対象ポリヌクレオチドが標識
ポリヌクレオチドと充分に反応して・・イブリッドを形
成しうる程度であるが、例えば０５〜４０時間程度が適
当である。温度は２０〜７０℃程度、ＰＨは５〜９程度
がよい。
二本鎖ポリヌクレオチドを形成させたのちはこれに二本
鎖、Ｉｆ ＩＪヌクレオチド制限酵素（以下、単に制限
酵素という。）を作用させる。この制限酵素ハ二木調ポ
リヌクレオチドにのみ特異的に作用するものがよく、１
だ、認識ポリヌクレオチド鎖のあまり長くないもののほ
うが好ましい。制限酵素は１種のみでなく、２種以上を
併用してもよい。
鎖、Ｉｆ ＩＪヌクレオチド制限酵素（以下、単に制限
酵素という。）を作用させる。この制限酵素ハ二木調ポ
リヌクレオチドにのみ特異的に作用するものがよく、１
だ、認識ポリヌクレオチド鎖のあまり長くないもののほ
うが好ましい。制限酵素は１種のみでなく、２種以上を
併用してもよい。
制限酵素を作用させる時期は通常は測定対象ポリヌクレ
オチドと標識ポリヌクレオチドとの反応終了後であるが
、測定対象ポリヌクレオチドと同時あるいはその前罠反
応系に添加しておいてよい場合もある標識ポリヌクレオ
チドに親和性物質１あるいは親和性物質２を結合させた
場合にはこれらに結合させる酵素は測定対象ポリヌクレ
オチドと接触させる前からこの制限酵素を作用させるに
至る任意の段階で添加すればよい。
オチドと標識ポリヌクレオチドとの反応終了後であるが
、測定対象ポリヌクレオチドと同時あるいはその前罠反
応系に添加しておいてよい場合もある標識ポリヌクレオ
チドに親和性物質１あるいは親和性物質２を結合させた
場合にはこれらに結合させる酵素は測定対象ポリヌクレ
オチドと接触させる前からこの制限酵素を作用させるに
至る任意の段階で添加すればよい。
制限酵素を作用させたのちは一すヌクレオチドに結合さ
れている酵素２の反応を測定する。この反応は公知の活
性側一定方法により測定すればよく、これらの共役酵素
や化学物質を利用して比色定量あるいは螢光、発光等を
定量する々どすればよい。
れている酵素２の反応を測定する。この反応は公知の活
性側一定方法により測定すればよく、これらの共役酵素
や化学物質を利用して比色定量あるいは螢光、発光等を
定量する々どすればよい。
（作用）
標識ポリヌクレオチドは測定対象ポリヌクレオチドとハ
イフリ、ドを形成する。ノ・イブリフ′を形成すること
によって制限酵素が働いてこの二本鎖ポリヌクレオチド
を切断する。その結果、標識ポリヌクレオチドに結合さ
れている酵素１と酵素２との距離が離れて連続反応が起
こりにくくなる。
イフリ、ドを形成する。ノ・イブリフ′を形成すること
によって制限酵素が働いてこの二本鎖ポリヌクレオチド
を切断する。その結果、標識ポリヌクレオチドに結合さ
れている酵素１と酵素２との距離が離れて連続反応が起
こりにくくなる。
そこで酵素２による反応速度が低下する。
（発明の効果）
本発明の方法は、従来の方法と異なり、測定対象ポリヌ
クレオチドを固相に固定するという煩雑な操作がなく、
先願の方法に比しても固液分離及びそれに付随する洗浄
操作が不要な点でさらに簡便にされている。
クレオチドを固相に固定するという煩雑な操作がなく、
先願の方法に比しても固液分離及びそれに付随する洗浄
操作が不要な点でさらに簡便にされている。
（実施例）
■ ＨＢＶ −ＤＮＡ ７°ローブの調製５００ｍＪの
慢性Ｂ型肝炎患者のプール血清を９００ Ｏｒｐｍで１
５分間遠心し、得られた上清を４℃１ｏ００００ｘ夕で
５時間超遠心してＨＢＶ粒子を被し、トとして集めた。
慢性Ｂ型肝炎患者のプール血清を９００ Ｏｒｐｍで１
５分間遠心し、得られた上清を４℃１ｏ００００ｘ夕で
５時間超遠心してＨＢＶ粒子を被し、トとして集めた。
このぜし、トをＯ，］ Ｍ ＮａＣ４゜１ ｍＭＥＤＴ
Ａ、 ０．１１２−メルカプトエタノール及び０１％Ｂ
ＳＡを含む０．０１Ｍト！Ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）１０ｍ／！に溶かし、このウィルス溶液のうち５
ｍｌを保存し、残５＃Ｉ／をｌｏｏｏｏＱｘｇで再度５
時間超遠心してベレットを得た。
Ａ、 ０．１１２−メルカプトエタノール及び０１％Ｂ
ＳＡを含む０．０１Ｍト！Ｊスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，
５）１０ｍ／！に溶かし、このウィルス溶液のうち５
ｍｌを保存し、残５＃Ｉ／をｌｏｏｏｏＱｘｇで再度５
時間超遠心してベレットを得た。
この硬レットを０５％ＮＰ−４０を含む１０ｍＭトリス
−塩酸、０．１ Ｍ ＮａＣ４ｐ８７．５溶液２００
ｐｌ！で処理し、ＤＮＡポリメラーゼを活性化した。こ
の溶液に１ ｍＭ ｄＡＴＰ 、 １ ｍＭ ｄＴ’ｒ
ｐ、２．５ ｔｔＭ ３２ＰｄＧＴＰ、２５μＭ ３２
ＰｄＣＴＰを含む０．０８ Ｍ ＭｇＣｌ２０．２ Ｍ
ｉリス緩衝液（ＰＨ７，５）５０μｔを加えて３時間
加温した。この溶液を３０チシユークロース溶液の入っ
た遠尼・チューブに重層し、５Ｗ６５０−ター（イ。
−塩酸、０．１ Ｍ ＮａＣ４ｐ８７．５溶液２００
ｐｌ！で処理し、ＤＮＡポリメラーゼを活性化した。こ
の溶液に１ ｍＭ ｄＡＴＰ 、 １ ｍＭ ｄＴ’ｒ
ｐ、２．５ ｔｔＭ ３２ＰｄＧＴＰ、２５μＭ ３２
ＰｄＣＴＰを含む０．０８ Ｍ ＭｇＣｌ２０．２ Ｍ
ｉリス緩衝液（ＰＨ７，５）５０μｔを加えて３時間
加温した。この溶液を３０チシユークロース溶液の入っ
た遠尼・チューブに重層し、５Ｗ６５０−ター（イ。
クマン社製）を用い５００００ｒｐｍで３時間遠心して
被し、トを得た。このにし、トをプロナーゼで処理し、
得られた溶液をフェノールで２回抽出処理した。抽出液
を５〜２０係ンー−クロースグラノエントで５０００Ｏ
ｒｐｍにて３時間遠心して１５Ｓ ”ＰＤＮＡ分画を集
めこれをプールした。この分画から１５ Ｓ ５２ＰＤ
ＮＡをエタノールを用いて沈澱させ、乾燥して目的のＨ
ＢＶ −ＤＮＡを得た。
被し、トを得た。このにし、トをプロナーゼで処理し、
得られた溶液をフェノールで２回抽出処理した。抽出液
を５〜２０係ンー−クロースグラノエントで５０００Ｏ
ｒｐｍにて３時間遠心して１５Ｓ ”ＰＤＮＡ分画を集
めこれをプールした。この分画から１５ Ｓ ５２ＰＤ
ＮＡをエタノールを用いて沈澱させ、乾燥して目的のＨ
ＢＶ −ＤＮＡを得た。
■ −重鎖ＨＢＶ −ＤＮＡの調製
次に、５ ｍＭ ＭｇＣｌ２．１０ ｒｎＭ ２−メル
カプトエタノール、５μＭｄＴＴＰ、５μＭ ｄＧＴＰ
、 ５μＭｄＣＴＰ。
カプトエタノール、５μＭｄＴＴＰ、５μＭ ｄＧＴＰ
、 ５μＭｄＣＴＰ。
５μＭｄＡＴ’ｐ、１ｏμＭアミノヘキシルｄＡＴＰ及
び１０μＭアミノヘキシルｄＣＴＰを含む５０ｍＭトリ
ス−ＨＣ１緩衝液（ｐｌ（７，５） ］ ０Ｏｔｔｌ
ＫヤはりＨＢＶ −ＤＮＡ １４ 、 ＤＮａｓｅ
ｌ １００ ｐｌ及びＤＮＡ 、ｆｆリメラーセＩ １
００ ｐ＆ ヲ加えて１５℃で９０分間インキュベート
した。この溶液をやはりフェノールで抽出し、５ｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−５０カラムで精製して修飾型ＨＢＶ−Ｄ
ＮＡを得た。この二本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡ １ ｍ９（ｌ
ｍｌ ）とＨＢＶ−ＤＮＡを導した一本鎖Ｍ１３−７
アノＤＮＡ ５ ｍ９（２ｍ／）にホルムアミド８ ｍ
ｌを加え、５分間この混合液を沸とうさせた。次に、こ
れに２ ｍｌの緩衝液（００７モル／ｌ）リス−ＨＣ４
２モル／ ｌ ＮａＣ１、］ ５ ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ７，５）を加え、５０℃で４時間そしてさらに６０℃
で１時間加温した。
び１０μＭアミノヘキシルｄＣＴＰを含む５０ｍＭトリ
ス−ＨＣ１緩衝液（ｐｌ（７，５） ］ ０Ｏｔｔｌ
ＫヤはりＨＢＶ −ＤＮＡ １４ 、 ＤＮａｓｅ
ｌ １００ ｐｌ及びＤＮＡ 、ｆｆリメラーセＩ １
００ ｐ＆ ヲ加えて１５℃で９０分間インキュベート
した。この溶液をやはりフェノールで抽出し、５ｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−５０カラムで精製して修飾型ＨＢＶ−Ｄ
ＮＡを得た。この二本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡ １ ｍ９（ｌ
ｍｌ ）とＨＢＶ−ＤＮＡを導した一本鎖Ｍ１３−７
アノＤＮＡ ５ ｍ９（２ｍ／）にホルムアミド８ ｍ
ｌを加え、５分間この混合液を沸とうさせた。次に、こ
れに２ ｍｌの緩衝液（００７モル／ｌ）リス−ＨＣ４
２モル／ ｌ ＮａＣ１、］ ５ ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ
Ｈ７，５）を加え、５０℃で４時間そしてさらに６０℃
で１時間加温した。
この反応液をＢｌｏ−Ｇｅ１ Ａ ５０ ｍでケゞル濾
過し、・・イブリッドしたＤＮＡと未反応のＤＮＡを分
離した。
過し、・・イブリッドしたＤＮＡと未反応のＤＮＡを分
離した。
ボイド分画の近くに溶出される最初のピークを分画し、
これにＮａＣ１が０．１Ｍになるように粉末を加えて溶
かした。そして、さらに１００％エタノールを溶液１
ｍｌに対し２倍の比率（２ｍ／）で加え、−７０℃で２
時間放置した。次に、＋７０００Ｘ、ｊ９で１０分間遠
心し、エタノール沈殿物を５０＃Ｉｌのｏ、 １． Ｎ
ＮａＯＨ１０，２５ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．００
１％フェノールレ、ドで溶解した。ただちにこれをＢｌ
ｏ−Ｇｅ１ Ａｓ２でケ９ル濾過し、目的の一本鎖Ｈ３
Ｖ−ＤＮＡを得た。
これにＮａＣ１が０．１Ｍになるように粉末を加えて溶
かした。そして、さらに１００％エタノールを溶液１
ｍｌに対し２倍の比率（２ｍ／）で加え、−７０℃で２
時間放置した。次に、＋７０００Ｘ、ｊ９で１０分間遠
心し、エタノール沈殿物を５０＃Ｉｌのｏ、 １． Ｎ
ＮａＯＨ１０，２５ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ０．００
１％フェノールレ、ドで溶解した。ただちにこれをＢｌ
ｏ−Ｇｅ１ Ａｓ２でケ９ル濾過し、目的の一本鎖Ｈ３
Ｖ−ＤＮＡを得た。
■
■で調製した一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡ １００μｇにビオ
チンのサタンンイミドエステル１μソをｐＨ８，０の炭
酸緩衝液中で３７℃で２時間反応させた。これをセフア
ゾ、リスＧ−２５でケ３ル濾過し、ボイド分画を６０℃
で一夜放置した。この溶液にｄ−ＤＮＡ制限酵素溶液（
Ｈａｅ ＩＩ、Ｈａｅｌｌｌ、Ｒａｐ口、Ｂｇｌ ＩＩ
、Ａｖａｌ 各 Ｉ Ｕ／ｍｌ １ １０ ｒｎＭ
ト リ ス − ＨＣＺ １ ７ ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２．７ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、Ｐ’
７．５ ） １ ｍｌを加え、３７℃で１時間反応さ
せた。この反応物をセフアゾ、リスＧ−１００でｒルｐ
過し、ビイ］・分画をプールしてこれに除蛋白処理を行
なった。
チンのサタンンイミドエステル１μソをｐＨ８，０の炭
酸緩衝液中で３７℃で２時間反応させた。これをセフア
ゾ、リスＧ−２５でケ３ル濾過し、ボイド分画を６０℃
で一夜放置した。この溶液にｄ−ＤＮＡ制限酵素溶液（
Ｈａｅ ＩＩ、Ｈａｅｌｌｌ、Ｒａｐ口、Ｂｇｌ ＩＩ
、Ａｖａｌ 各 Ｉ Ｕ／ｍｌ １ １０ ｒｎＭ
ト リ ス − ＨＣＺ １ ７ ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ２．７ ｍＭ ２−メルカプトエタノール、Ｐ’
７．５ ） １ ｍｌを加え、３７℃で１時間反応さ
せた。この反応物をセフアゾ、リスＧ−１００でｒルｐ
過し、ビイ］・分画をプールしてこれに除蛋白処理を行
なった。
■ ３ Ｈ化アビノンの調製
アビノン２ＩＩ＋９を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，５
に溶かした溶液１ ｍｌに５ＰＤＰ ２００ ノ１ｇを
含むＤＭＦ溶液１００μｌを加え、室温で３０分間反応
させた。これを１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０． ］、
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０で平衡化したセフアゾ、リ
スＧ−２５のカラムに入れ同じ液で展開してケゝル濾過
を行なった。はイド分画をプールし、これに２−メルヵ
ゾトエチルアミン２００μｇを加えて３７℃で３時間攪
拌した。
に溶かした溶液１ ｍｌに５ＰＤＰ ２００ ノ１ｇを
含むＤＭＦ溶液１００μｌを加え、室温で３０分間反応
させた。これを１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０． ］、
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０で平衡化したセフアゾ、リ
スＧ−２５のカラムに入れ同じ液で展開してケゝル濾過
を行なった。はイド分画をプールし、これに２−メルヵ
ゾトエチルアミン２００μｇを加えて３７℃で３時間攪
拌した。
続いて上記のセフアゾ、クスＧ−２５のカラムを用いて
同様にケ８ル濾過し、ｓＨ化アビソン２ ｍ９を得た。
同様にケ８ル濾過し、ｓＨ化アビソン２ ｍ９を得た。
■ ＣＨＭ化へキノキナーゼ
ヘキソキナーゼ１ ｍｇを含む０．１ Ｍ ＩＪ ／酸
緩衝液ｐ＋（７，０１ｍｌにシクロへキンルー４−マレ
イミドメチルンクロヘキサン−１−カルはン酸すク／ン
イミドｘ スｆ ル（Ｃ１−ＩＭＳ ） ２００４を含
ムＤＭＦ″溶液１００μｌを加え、室温で１時間放置し
た。これを前項と同じセフアゾ、クスＧ−２５のカラム
でケ８ル濾過し、ボイド分画をプールした。
緩衝液ｐ＋（７，０１ｍｌにシクロへキンルー４−マレ
イミドメチルンクロヘキサン−１−カルはン酸すク／ン
イミドｘ スｆ ル（Ｃ１−ＩＭＳ ） ２００４を含
ムＤＭＦ″溶液１００μｌを加え、室温で１時間放置し
た。これを前項と同じセフアゾ、クスＧ−２５のカラム
でケ８ル濾過し、ボイド分画をプールした。
■ アビノン結合へキノキナーゼの調製■で調製したＳ
Ｈ化アビノン１〜に■ＴＸ＆またＣＨＭ化へキノキナー
ゼｌ ｍ９を加え、３７℃で９０分間反応させた。次に
、これをＡＣＡ ３４カラムでグルＦａＪし、アビノン
とへキノキナーゼの１１の結合物を分取した。
Ｈ化アビノン１〜に■ＴＸ＆またＣＨＭ化へキノキナー
ゼｌ ｍ９を加え、３７℃で９０分間反応させた。次に
、これをＡＣＡ ３４カラムでグルＦａＪし、アビノン
とへキノキナーゼの１１の結合物を分取した。
■ アビノン結合グルコースー６−リン酸デヒドロケ９
す一ゼの調製 ■と同様の方法で調製しｆｃＣＨＭ化グルコース−６−
リン酸デヒドロケ８ナーゼＪ ｍ９を含む溶ｆｉ ｌ
ｍｌに■のＳＨ化アビノン５００μ９を含む溶液１ ｍ
ｌを加え、３７℃で９０分間反応させた。反応物をＡＣ
Ａ ３４カラムでケ“ル濾過し、アビノンとグルコース
−６−リン酸デヒドロダナーゼの１：１の結合物を分取
した。
す一ゼの調製 ■と同様の方法で調製しｆｃＣＨＭ化グルコース−６−
リン酸デヒドロケ８ナーゼＪ ｍ９を含む溶ｆｉ ｌ
ｍｌに■のＳＨ化アビノン５００μ９を含む溶液１ ｍ
ｌを加え、３７℃で９０分間反応させた。反応物をＡＣ
Ａ ３４カラムでケ“ル濾過し、アビノンとグルコース
−６−リン酸デヒドロダナーゼの１：１の結合物を分取
した。
■ ＤＮＡの測定
ＨＢウィルス性肝炎患者血清１００／ｌｌに０．５ Ｎ
ＮａＯＨ１００Ｉｉｌを加えて室温で１０分間攪拌し
た。次に、Ｑ、 ５ ＮＨＣｔ １００μｌを加えさら
に２００μｇＡＩｌの！ロテイナーゼに溶液２００μｌ
を加えて７０℃で１時間反応させた。これに０項で調製
した修飾ＤＮＡ ２００μｌを加え、３７℃で一夜装置
した。ｄ−ＤＮＡ制限酵素溶液（Ｂｇ見■、 Ａｖａ
Ｕ、 Ｈａｅ ＩＩＸ Ｈａｅ ＩＩＩ、 Ｈ
ａｐｆＪ 、Ｈｉｎｃ ■ 各 Ｉ Ｕｌｎｌ、
１ ０ ｒｒ？／Ｉ ト リ ス − ＨＣｌ
、 ７ｍＭＭｇＣ１２，７０ｍＭ ＮａＣ１，７ｍ
Ｍ ２−メルカグトエタノール、ＰＨ７，ｓ ）を１．
０ｍ／加えて３７℃で１時間反応させた。反応後、アビ
ノン結合へキノキナーゼ及びアビ、ノン結合グルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼを各々１．０μＩ含む溶
液１００μｌを加え、さらに基質液（０，１Ｍグリンル
グリ／ン、２０ ｍＭ ＭｇＣｌ２グルコース５０ ｍ
１７／ｒｎｌ、υ５ ｍＭ ＡＴＰ、０、５ ｍＭ Ｎ
ＡＤＰ−’、Ｐ’ ８．０ ） ３ ｍｌを加え、ＮＡ
ＤＰＨの増加を３４０ ｎｍの吸光度を測定することに
よりレートアッセイした。
ＮａＯＨ１００Ｉｉｌを加えて室温で１０分間攪拌し
た。次に、Ｑ、 ５ ＮＨＣｔ １００μｌを加えさら
に２００μｇＡＩｌの！ロテイナーゼに溶液２００μｌ
を加えて７０℃で１時間反応させた。これに０項で調製
した修飾ＤＮＡ ２００μｌを加え、３７℃で一夜装置
した。ｄ−ＤＮＡ制限酵素溶液（Ｂｇ見■、 Ａｖａ
Ｕ、 Ｈａｅ ＩＩＸ Ｈａｅ ＩＩＩ、 Ｈ
ａｐｆＪ 、Ｈｉｎｃ ■ 各 Ｉ Ｕｌｎｌ、
１ ０ ｒｒ？／Ｉ ト リ ス − ＨＣｌ
、 ７ｍＭＭｇＣ１２，７０ｍＭ ＮａＣ１，７ｍ
Ｍ ２−メルカグトエタノール、ＰＨ７，ｓ ）を１．
０ｍ／加えて３７℃で１時間反応させた。反応後、アビ
ノン結合へキノキナーゼ及びアビ、ノン結合グルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼを各々１．０μＩ含む溶
液１００μｌを加え、さらに基質液（０，１Ｍグリンル
グリ／ン、２０ ｍＭ ＭｇＣｌ２グルコース５０ ｍ
１７／ｒｎｌ、υ５ ｍＭ ＡＴＰ、０、５ ｍＭ Ｎ
ＡＤＰ−’、Ｐ’ ８．０ ） ３ ｍｌを加え、ＮＡ
ＤＰＨの増加を３４０ ｎｍの吸光度を測定することに
よりレートアッセイした。
図面は得られた結果を示すものであり、縦軸は吸光度を
そして横軸は血清の希釈度をそれぞれ表わしている。
そして横軸は血清の希釈度をそれぞれ表わしている。
図面は、本発明の方法で測定して得られた、血清の希釈
度と吸光度との関係を示すものである。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人 弁理士 １） 中 政 浩何 １千オ
尺キ
度と吸光度との関係を示すものである。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人 弁理士 １） 中 政 浩何 １千オ
尺キ
Claims (1)
- 測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドを、酵素１又は
この酵素１を直接もしくは間接的に結合しうる物質１と
、酵素１の作用により生ずる物質を基質とする酵素２又
はこの酵素２を直接もしくは間接的に結合しうる物質２
とが結合されかつ該測定対象一本鎖ポリヌクレオチドと
二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうる一本鎖ポリヌクレ
オチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ
、該二本鎖ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチド
制限酵素を作用させてこの二本鎖ポリヌクレオチドを切
断し、その後このポリヌクレオチドに結合されている酵
素２の反応を測定することを特徴とするポリヌクレオチ
ドの測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59123758A JPS613064A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 酵素を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59123758A JPS613064A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 酵素を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS613064A true JPS613064A (ja) | 1986-01-09 |
| JPH0552199B2 JPH0552199B2 (ja) | 1993-08-04 |
Family
ID=14868563
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59123758A Granted JPS613064A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 酵素を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS613064A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2636970A1 (fr) * | 1988-09-26 | 1990-03-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de detection et de dosage d'une sequence specifique d'adn ou d'arn, reactif et necessaire pour sa mise en oeuvre |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07259461A (ja) * | 1994-03-23 | 1995-10-09 | Nomura Kensetsu Kk | 脚 立 |
-
1984
- 1984-06-18 JP JP59123758A patent/JPS613064A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2636970A1 (fr) * | 1988-09-26 | 1990-03-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de detection et de dosage d'une sequence specifique d'adn ou d'arn, reactif et necessaire pour sa mise en oeuvre |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0552199B2 (ja) | 1993-08-04 |
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