JPH0558709B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0558709B2 JPH0558709B2 JP59241457A JP24145784A JPH0558709B2 JP H0558709 B2 JPH0558709 B2 JP H0558709B2 JP 59241457 A JP59241457 A JP 59241457A JP 24145784 A JP24145784 A JP 24145784A JP H0558709 B2 JPH0558709 B2 JP H0558709B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- precursor
- cells
- medium
- acid
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、プラスミノーゲンアクチベーター前
駆体（以下、前駆体という）の産生増強方法に関
する。更に詳しくは、本発明は、前駆体の産生細
胞を培養して前駆体を生産するに際して、培地に
中性アミノ酸及び有機酸もしくはその塩を含むこ
とを特徴とする前駆体の産生増強方法に関する。 〔従来の技術〕 本発明の前駆体は、先に本発明者が見出したも
のであり、その詳細は特願昭58−170354号に記載
されている。すなわち、本前駆体はそのままでは
不活性であるが、プラスミン処理することにより
酵素活性を発現する、いわゆるチモゲンの一種で
ある。この前駆体はヒト腎細胞に無血清培地中に
て生成できることが最近判明した。本前駆体はア
ミノ酸411個の鎖状構造を有しており、分子量５
万、フイブリンに特異的な親和性を示し、従来の
ウロキナーゼとは全く異なる性質を有する。ま
た、合成基質法では活性が認められず、平板法で
活性を示す。その産生条件については、特願昭58
−170354号で詳細に述べられているが、必ずし
も、その産生効率が充分であるとは言えない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従つて、本発明の目的は前駆体の産生増強方法
を提供することである。 〔問題点を解決するための手段〕 そこで本発明者らは、上記目的を解決するため
に、前駆体の産生増強について鋭意検討した結
果、前駆体産生性細胞培養培地中に、中性アミノ
酸並びに有機酸またはその塩をそれぞれ高濃度含
ませることにより、前駆体の産生を向上できるこ
とを見いだし、本発明を完成した。 即ち、本発明はプラスミノーゲンアクチベータ
ー前駆体の産生細胞を培養して、プラスミノーゲ
ンアクチベーター前駆体を生産するに際して、培
地に中性アミノ酸を0.16〜3.06w／ｖ％、並びに
有機酸またはその塩を0.10〜3.00w／ｖ％含むこ
とを特徴とするプラスミノーゲンアクチベーター
前駆体の産生増強方法に関する。 (1) 前駆体産生細胞の調製 前駆体産生細胞の原料としては、ヒト腎細胞が
好適に用いられる。たとえば、ヒト腎細胞より得
たprimary cultureまたはdipioid cellsを継代培
養して得られる前駆体を産生する細胞が用いられ
る。この種細胞を20万〜30万cells／ml植え込み、
培地（たとえば、waymouth培地あるいは
Dulbecco´s modified MEM培地に熱不活化牛胎
児血清２〜5w／ｖ％を添加したもの）を用いて
２〜３日間培養を続けた後、必要ならば培地を新
しく交換して継代培養し、細胞数を100万〜200万
cells／mlに調整する。 (2) 培養条件 基本培地としては、たとえばwaymouth培地あ
るいはDulbecco´s modified MEM培地に0.05〜
0.2w／ｖ％ヒト血清アルブミンを添加した無血
清培地が用いられる。 これに本発明の特徴である、中性アミノ酸並び
に有機酸またはその塩が添加される。中性アミノ
酸としてはグリシン、アラニン、ロイシン、イソ
ロイシン、フエニルアラニン等の脂肪族アミノ酸
などが例示されるが、好適にはグリシンが用いら
れる。添加量としては0.1〜3w／ｖ％が例示され
る。添加量が、0.1％以下では産生能が十分上が
らず、また、３％以上では、毒性が上がつて産生
能向上にはマイナスとなるためである。また、中
性アミノ酸と有機酸又はその塩の割合としては、
１：10〜10：１（重量比）程度が望ましい。有機
酸としては炭素数３〜18のものであれば特に限定
されない。通常は、カルボン酸、特に飽和または
不飽和脂肪族カルボン酸（就中、モノカルボン酸
またはジカルボン酸）が好適に使用される。当該
有機酸は置換基として、たとえば水酸基等を有し
ていてもよい。かかる有機酸としては、フマル
酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、ステアリン
酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、リ
ノレン酸、ミリスチン酸などが例示される。特に
好適には、コハク酸などの脂肪族ジカルボン酸が
使用される。上記有機酸の塩としては、生理的に
受け入れられる塩、たとえばアルカリ金属塩（ナ
トリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金
属塩（カルシウム塩など）などを用いることがで
きる。これらの有機酸もしくはその塩の添加量と
しては0.1〜3w／ｖ％が例示される。 また他に添加物として公知であるラクトアルブ
ミン水解物、トランスフエリン、インシユリン等
のホルモンなどを添加してよい。 培養は、例えば前駆体産生細胞50万〜200万
cells／mlを一定に維持しながら、上記培地中で
行つて、前駆体を産生させ、２〜３日毎に培養培
地を新しく交換する。そしてこの交換した培地中
に存在する前駆体を回収する。 培地からの前駆体の回収は公知の手段を用いて
行えばよく、例えば当該培地を遠心分離、減圧濃
縮、塩析分画、ゲル濾過、濃縮、イオン交換クロ
マトグラフイー、アフイニテイクロマトグラフイ
ーを、便宜組み合わせることによつて行われる。 〔発明の効果〕 本発明の方法により、本前駆体の産生は従来の
方法に比べて活性比で約1.3〜３倍程度増強する
ことができる。 実験例 １ 本発明による前駆体産生増強効果を見るため
に、前駆体の産生量の比較実験を行つた。第１表
に示したようにグリシン及びコハク酸の添加量は
０〜5.0w／ｖ％の範囲で設定した。それ以外の
条件は実施例１に準じて各群とも同様に行つた。
産生量の指標として活性を測定した。 活性量の測定は、ｐ−MCA法により以下のよ
うに行つた。即ち、検体0.1mlとプラスミン溶液
（0.2cu／ml、ゼラチン緩衝液〔PH8.6〕で調製し
たもの）0.1mlを混合後、37℃で10分間インキユ
ベーシヨンし、ｐ−MCA溶液（0.1ｍMGlu−
Gly−Arg−MCA）１mlを加え、さらに37℃で20
分間インキユベーシヨンし、18v／ｖ％酢酸を加
えて反応を止めた後、Ex（励起波長）370nｍ、
Em（螢光波長）460nｍにて螢光強度を測定した。
その結果は、第１表に示す通りである。 なお単位はＵ／mlを用いた。Ｕはウロキナーゼ
国際単位であり、1U／mlは検体１mlにつきプラ
スミン処理によつて発現する線維素溶解活性が
1Uに相当することを意味する。 実験例 ２ 実験例１と同様にして第２表に記載の添加物に
ついて、併用効果を検討し、その結果を第２表に
示した。 実施例 １ ヒト腎臓細胞より得たprimary−cultureを培
養し、本発明前駆体を産生する細胞だけを分離後
再培養し、その20×104cells／mlの濃度で熱不活
化ウシ胎児血清5w／ｖ％含有Waymouth培地に
埋え込み、３日間培養後、細胞数が100×
104cells／mlとなつた時点で、さらに、0.1w／ｖ
％ヒト血清アルブミン、0.5w／ｖ％グリシン、
0.5w／ｖ％コハク酸ナトリウム含有Waymouth
培地（無血清培地）に上記前駆体産生細胞100×
104cells／mlを植え直し、この濃度を維持しつつ
３日間培養した。培養液を遠心分離し、沈澱には
新しい培地を添加して培養を続けた。上清中には
前駆体（活性は１ml当たり300Uに相当）が含ま
れていた。 本発明により得られた前駆体は、特開昭58−
170354で開示した「繊維素溶解酵素前駆体」と全
く同一の性質を有していた。 実施例 ２ 実施例１により得られた前駆体を含む培養上清
をPH5.5に調整した後、CM−Sephade×Ｃ−50に
接触した。0.16Mリン酸緩衝液（PH8.5）で吸着
していた前駆体を溶出させた。 一方、前駆体で予め免疫しておいたマウス
BALB／ｃの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞
をポリエチレングリコールにより融合させたハイ
ブリドーマのうち、前駆体に体する抗体産生の高
いクローンを選択した。この融合細胞の培養液か
ら、前駆体モノクローナル抗体を回収した。この
モノクローナル抗体をCNBr活性化Sepharose
4B（Pharmacia社）に固定した。 このモノクローナル抗体カラムを0.4M NaCl
含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化し、こ
れに前記の前駆体を含有する溶出液を接触した。
0.4M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）でカ
ラムを洗浄した後、吸着していた当該前駆体を
0.5M NaCl含有0.2Mグリシン−HCl水溶液（PH
2.5）で溶出させた。溶出液を除菌濾過した後、
凍結乾燥し比活性が少なくとも80000U／mgの高
度精製前駆体を得た。 なお、この精製品はSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法より分子量５万の１本の帯を示し
た。
駆体（以下、前駆体という）の産生増強方法に関
する。更に詳しくは、本発明は、前駆体の産生細
胞を培養して前駆体を生産するに際して、培地に
中性アミノ酸及び有機酸もしくはその塩を含むこ
とを特徴とする前駆体の産生増強方法に関する。 〔従来の技術〕 本発明の前駆体は、先に本発明者が見出したも
のであり、その詳細は特願昭58−170354号に記載
されている。すなわち、本前駆体はそのままでは
不活性であるが、プラスミン処理することにより
酵素活性を発現する、いわゆるチモゲンの一種で
ある。この前駆体はヒト腎細胞に無血清培地中に
て生成できることが最近判明した。本前駆体はア
ミノ酸411個の鎖状構造を有しており、分子量５
万、フイブリンに特異的な親和性を示し、従来の
ウロキナーゼとは全く異なる性質を有する。ま
た、合成基質法では活性が認められず、平板法で
活性を示す。その産生条件については、特願昭58
−170354号で詳細に述べられているが、必ずし
も、その産生効率が充分であるとは言えない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従つて、本発明の目的は前駆体の産生増強方法
を提供することである。 〔問題点を解決するための手段〕 そこで本発明者らは、上記目的を解決するため
に、前駆体の産生増強について鋭意検討した結
果、前駆体産生性細胞培養培地中に、中性アミノ
酸並びに有機酸またはその塩をそれぞれ高濃度含
ませることにより、前駆体の産生を向上できるこ
とを見いだし、本発明を完成した。 即ち、本発明はプラスミノーゲンアクチベータ
ー前駆体の産生細胞を培養して、プラスミノーゲ
ンアクチベーター前駆体を生産するに際して、培
地に中性アミノ酸を0.16〜3.06w／ｖ％、並びに
有機酸またはその塩を0.10〜3.00w／ｖ％含むこ
とを特徴とするプラスミノーゲンアクチベーター
前駆体の産生増強方法に関する。 (1) 前駆体産生細胞の調製 前駆体産生細胞の原料としては、ヒト腎細胞が
好適に用いられる。たとえば、ヒト腎細胞より得
たprimary cultureまたはdipioid cellsを継代培
養して得られる前駆体を産生する細胞が用いられ
る。この種細胞を20万〜30万cells／ml植え込み、
培地（たとえば、waymouth培地あるいは
Dulbecco´s modified MEM培地に熱不活化牛胎
児血清２〜5w／ｖ％を添加したもの）を用いて
２〜３日間培養を続けた後、必要ならば培地を新
しく交換して継代培養し、細胞数を100万〜200万
cells／mlに調整する。 (2) 培養条件 基本培地としては、たとえばwaymouth培地あ
るいはDulbecco´s modified MEM培地に0.05〜
0.2w／ｖ％ヒト血清アルブミンを添加した無血
清培地が用いられる。 これに本発明の特徴である、中性アミノ酸並び
に有機酸またはその塩が添加される。中性アミノ
酸としてはグリシン、アラニン、ロイシン、イソ
ロイシン、フエニルアラニン等の脂肪族アミノ酸
などが例示されるが、好適にはグリシンが用いら
れる。添加量としては0.1〜3w／ｖ％が例示され
る。添加量が、0.1％以下では産生能が十分上が
らず、また、３％以上では、毒性が上がつて産生
能向上にはマイナスとなるためである。また、中
性アミノ酸と有機酸又はその塩の割合としては、
１：10〜10：１（重量比）程度が望ましい。有機
酸としては炭素数３〜18のものであれば特に限定
されない。通常は、カルボン酸、特に飽和または
不飽和脂肪族カルボン酸（就中、モノカルボン酸
またはジカルボン酸）が好適に使用される。当該
有機酸は置換基として、たとえば水酸基等を有し
ていてもよい。かかる有機酸としては、フマル
酸、コハク酸、リンゴ酸、クエン酸、ステアリン
酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、リ
ノレン酸、ミリスチン酸などが例示される。特に
好適には、コハク酸などの脂肪族ジカルボン酸が
使用される。上記有機酸の塩としては、生理的に
受け入れられる塩、たとえばアルカリ金属塩（ナ
トリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金
属塩（カルシウム塩など）などを用いることがで
きる。これらの有機酸もしくはその塩の添加量と
しては0.1〜3w／ｖ％が例示される。 また他に添加物として公知であるラクトアルブ
ミン水解物、トランスフエリン、インシユリン等
のホルモンなどを添加してよい。 培養は、例えば前駆体産生細胞50万〜200万
cells／mlを一定に維持しながら、上記培地中で
行つて、前駆体を産生させ、２〜３日毎に培養培
地を新しく交換する。そしてこの交換した培地中
に存在する前駆体を回収する。 培地からの前駆体の回収は公知の手段を用いて
行えばよく、例えば当該培地を遠心分離、減圧濃
縮、塩析分画、ゲル濾過、濃縮、イオン交換クロ
マトグラフイー、アフイニテイクロマトグラフイ
ーを、便宜組み合わせることによつて行われる。 〔発明の効果〕 本発明の方法により、本前駆体の産生は従来の
方法に比べて活性比で約1.3〜３倍程度増強する
ことができる。 実験例 １ 本発明による前駆体産生増強効果を見るため
に、前駆体の産生量の比較実験を行つた。第１表
に示したようにグリシン及びコハク酸の添加量は
０〜5.0w／ｖ％の範囲で設定した。それ以外の
条件は実施例１に準じて各群とも同様に行つた。
産生量の指標として活性を測定した。 活性量の測定は、ｐ−MCA法により以下のよ
うに行つた。即ち、検体0.1mlとプラスミン溶液
（0.2cu／ml、ゼラチン緩衝液〔PH8.6〕で調製し
たもの）0.1mlを混合後、37℃で10分間インキユ
ベーシヨンし、ｐ−MCA溶液（0.1ｍMGlu−
Gly−Arg−MCA）１mlを加え、さらに37℃で20
分間インキユベーシヨンし、18v／ｖ％酢酸を加
えて反応を止めた後、Ex（励起波長）370nｍ、
Em（螢光波長）460nｍにて螢光強度を測定した。
その結果は、第１表に示す通りである。 なお単位はＵ／mlを用いた。Ｕはウロキナーゼ
国際単位であり、1U／mlは検体１mlにつきプラ
スミン処理によつて発現する線維素溶解活性が
1Uに相当することを意味する。 実験例 ２ 実験例１と同様にして第２表に記載の添加物に
ついて、併用効果を検討し、その結果を第２表に
示した。 実施例 １ ヒト腎臓細胞より得たprimary−cultureを培
養し、本発明前駆体を産生する細胞だけを分離後
再培養し、その20×104cells／mlの濃度で熱不活
化ウシ胎児血清5w／ｖ％含有Waymouth培地に
埋え込み、３日間培養後、細胞数が100×
104cells／mlとなつた時点で、さらに、0.1w／ｖ
％ヒト血清アルブミン、0.5w／ｖ％グリシン、
0.5w／ｖ％コハク酸ナトリウム含有Waymouth
培地（無血清培地）に上記前駆体産生細胞100×
104cells／mlを植え直し、この濃度を維持しつつ
３日間培養した。培養液を遠心分離し、沈澱には
新しい培地を添加して培養を続けた。上清中には
前駆体（活性は１ml当たり300Uに相当）が含ま
れていた。 本発明により得られた前駆体は、特開昭58−
170354で開示した「繊維素溶解酵素前駆体」と全
く同一の性質を有していた。 実施例 ２ 実施例１により得られた前駆体を含む培養上清
をPH5.5に調整した後、CM−Sephade×Ｃ−50に
接触した。0.16Mリン酸緩衝液（PH8.5）で吸着
していた前駆体を溶出させた。 一方、前駆体で予め免疫しておいたマウス
BALB／ｃの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞
をポリエチレングリコールにより融合させたハイ
ブリドーマのうち、前駆体に体する抗体産生の高
いクローンを選択した。この融合細胞の培養液か
ら、前駆体モノクローナル抗体を回収した。この
モノクローナル抗体をCNBr活性化Sepharose
4B（Pharmacia社）に固定した。 このモノクローナル抗体カラムを0.4M NaCl
含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で平衡化し、こ
れに前記の前駆体を含有する溶出液を接触した。
0.4M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）でカ
ラムを洗浄した後、吸着していた当該前駆体を
0.5M NaCl含有0.2Mグリシン−HCl水溶液（PH
2.5）で溶出させた。溶出液を除菌濾過した後、
凍結乾燥し比活性が少なくとも80000U／mgの高
度精製前駆体を得た。 なお、この精製品はSDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法より分子量５万の１本の帯を示し
た。
【表】
【表】
Claims (1)
- １ プラスミノーゲンアクチベーター前駆体の産
生細胞を培養して、プラスミノーゲンアクチベー
ター前駆体を生産するに際して、培地に中性アミ
ノ酸を0.16〜3.06w／ｖ％、並びに有機酸または
その塩を0.10〜3.00w／ｖ％含むことを特徴とす
るプラスミノーゲンアクチベーター前駆体の産生
増強方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59241457A JPS61119189A (ja) | 1984-11-15 | 1984-11-15 | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59241457A JPS61119189A (ja) | 1984-11-15 | 1984-11-15 | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61119189A JPS61119189A (ja) | 1986-06-06 |
| JPH0558709B2 true JPH0558709B2 (ja) | 1993-08-27 |
Family
ID=17074595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59241457A Granted JPS61119189A (ja) | 1984-11-15 | 1984-11-15 | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61119189A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6384490A (ja) * | 1986-09-29 | 1988-04-15 | Green Cross Corp:The | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 |
| US7547529B1 (en) | 2000-05-10 | 2009-06-16 | Asubio Pharma Co., Ltd. | Methods for reducing the formation of by-products in the production of recombinant polypeptides |
-
1984
- 1984-11-15 JP JP59241457A patent/JPS61119189A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61119189A (ja) | 1986-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4317882A (en) | Production of plasminogen activator | |
| EP0100982B2 (en) | Novel purified plasminogen activator, process for its production and thrombolytic composition containing it | |
| JPS59139324A (ja) | 血清非依存性セルラインの確立方法 | |
| JPS62289182A (ja) | 新規なプラズミノゲン活性化物 | |
| WO1989008702A1 (en) | Improved methods for recovery of tissue plasminogen activator using chaotropic agents | |
| JPS5928492A (ja) | 細胞培養系よりの血しよう蛋白質の分離 | |
| JP2824430B2 (ja) | 血液凝固第▲ｖｉｉ▼因子または活性型血液凝固第▲ｖｉｉ▼因子の調製方法 | |
| US5075230A (en) | Stabilized plasminogen activator precursor and method of producing the same | |
| CA1336585C (en) | Method of stabilizing urokinase precursor and dry preparation containing said precursor | |
| CA1258242A (en) | Urokinase zymogen and composition containing the same | |
| JPS61119189A (ja) | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の産生増強方法 | |
| JPH03219880A (ja) | 細菌コラゲナーゼ遺伝子 | |
| JPH05506354A (ja) | 端が切り取られた軽鎖を有する活性プロテインｃ | |
| EP0151996A2 (en) | Process for the Preparation of a double-chain plasminogen activator | |
| Tamura et al. | Purification of human plasma kallikrein and urokinase by affinity chromatography | |
| Maciag et al. | [53] Urokinase | |
| JPH0736755B2 (ja) | プラスミノーゲン・アクチベーター前駆体含有組成物 | |
| JPH01144996A (ja) | カルニチンヒドロリアーゼの分離方法およびｌ（−）−カルニチン合成への利用 | |
| JPS62205784A (ja) | 新しい型のプラスミノ−ゲン活性化因子の製造方法 | |
| JPH01500563A (ja) | 精製方法 | |
| JPH0336513B2 (ja) | ||
| JPH0462302B2 (ja) | ||
| JP2714817B2 (ja) | ウロキナーゼ前駆体の製造方法 | |
| JPS61132183A (ja) | サイクロデキストリン グルカノトランスフエラ−ゼの製造法 | |
| JPS61246131A (ja) | 新しいタイプのプラスミノ−ゲン活性化因子及びその調製方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |