JPH0558713B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は新規微生物およびそれを用いる２−チ
オフエン酢酸の製造方法に関する。さらに詳しく
は、シユードモナス属に属し、２−ｎ−アルキル
チオフエンを２−チオフエン酢酸に変換する能力
を有する微生物を２−ｎ−アルキルチオフエンに
作用させることによつて、ペニシリンやセフアロ
スポリンの化学修飾剤として有用である２−チオ
フエン酢酸〔R.R.Chauvetteら、J.Am.Chem.
Soc.、843401（1962）〕を高収率、高選択率で容易
に製造する方法に関する。 〔従来の技術、発明が解決しようとする課題〕 一般に２−チオフエン酢酸を製造する方法とし
ては有機合成法によつて(1)チオフエンをクロルメ
チル化し、シアン化アルカリと反応させて２−シ
アノメチルチオフエンとし、これを加水分解する
方法（米国特許第2533084号公報）、(2)チオフエン
をアセチル化し、ホルムアルデヒドジメチルカプ
タール−ｓ−オキシドを用いて１−メチルスルフ
イニル−１−メチルチオ−２−チエニルエチレン
を経由する方法（特開平１−86458号公報）、(3)チ
オフエンを直接ハロゲン化酢酸で光化学反応によ
り縮合する方法（特開昭53−46962号公報）等が
あるが、いずれもシアノ化合物などの有害な試薬
やＳ−オキサイドのような高価な薬品を使用する
か、または高温、高圧を利用する方法である。 また、これらの方法で得られた２−チオフエン
酢酸は副反応等によつて生ずる不純物のために着
色しており、精製方法（特開昭56−23429号公報
および特開昭61−76482号公報）が提案されてい
る。 上記の如く、有機合成法による２−チオフエン
酢酸の製造には問題点があることに鑑み、本発明
者らは微生物を用いて２−チオフエン酢酸を製造
すべく検討を重ねた。 その結果、ストレプトマイセス属に属する微生
物を用い、２−アルキルチオフエンを酸化して２
−チオフエン酢酸を製造する方法を完成した。 さらに、本発明者らは２−チオフエン酢酸の収
率の向上と大量生産を図るべく検討を重ねた結
果、シユードモナス属に属する微生物がこの目的
に適合することを見出し、本発明を完成したので
ある。 〔課題を解決するための手段〕 すなわち、本発明はシユードモナス属に属し、
２−ｎ−アルキルチオフエンを２−チオフエン酢
酸に変換する能力を有する微生物を２−ｎ−アル
キルチオフエンに作用させることを特徴とする２
−チオフエン酢酸の製造方法並びにシユードモナ
ス属に属し、２−ｎ−アルキルチオフエンを２−
チオフエン酢酸に変換する能力を有するシユード
モナス・エスピーEK−9891菌（FERM Ｐ−
11097）に関する。 本発明に係る上記微生物シユードモナス・エス
ピー EK−9891菌（以下、EK−9891菌と略記す
る。）は神奈川県内の土壌から無機培地等の培地
を用いて分離されたものであり、本菌は以下に示
す菌学的性質を有している。 Ａ 形態 桿菌 Ｂ 芽胞 − Ｃ 運動性 ＋ Ｄ グラム反応 − Ｅ カタラーゼ反応 ＋ Ｆ ブドウ糖の分解（OF試験） 酸化 Ｇ 色素の産生 (1) ピオシアニン − (2) ピオベルデイン − (3) フロレツセイン ＋ (4) カロチノイド系 − Ｈ 41℃での発育 − Ｉ ４℃での発育 − Ｊ アルギニンの加水分解 ＋ Ｋ ゲラチンの加水分解 ＋ Ｌ 澱粉の加水分解 − Ｍ 尿素の加水分解 ＋ Ｎ 白糖からレバンの産生 − Ｏ インドールの産生 − Ｐ 硫化水素の産生 − Ｑ 硝酸の還元 − Ｒ オキシダーゼ反応 ＋ Ｓ レシチナーゼ反応 − Ｔ リパーゼ反応（Tween80分解） ＋ Ｕ VP反応 − Ｖ IPA反応 − Ｗ ONPG − Ｘ 炭素源の利用 酢酸塩 ＋ コハク酸塩 ＋ Ｌ−マレイン酸塩 ＋ クエン酸塩 ＋ オキザロ酸塩 − ギ酸塩 − マロン酸塩 ＋ Ｌ−アラビノース − マルトース − セロビオース − ラクトース − Ｄ−キシロース ＋ Ｌ−ラムノース − グルコース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−ガラクトース − Ｄ−フラクトース ＋ シユークロース ＋ トレハロース − ソルビトール − ｍ−イノシトール − アドニトール − レブロース ＋ メリビオース − ズルシトール − サリシン − ラフイノース − デキストリン − Ｙ 窒素源の利用 Ｌ−リジン − Ｌ−オルニチン − Ｌ−アルギニン ＋ Ｚ 糖から酸の産生 マルトース − Ｌ−ラムノース − グルコース ＋ シユークロース − ソルビトール − イノシトール − アドニトール − Ｌ−アラビノース − マンニトール − Ａ 脱炭酸能 Ｌ−リジン − Ｌ−オルニチン − Ｌ−アルギニン ＋ 以上の諸性質をBergey′s Manual of
Systematic Bacterologyに基ずいて検索したと
ころ、本菌はシユードモナス・フルオレツセンス
ビオバーＶであると認めた。本菌は工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されており、その受
託番号はFERMP−11097である。本発明におい
ては、本菌を自然にもしくは人工的手段によつて
変異させて得られる変異株であつても上記能力を
有するものはすべて包含される。 次に、本発明による２−チオフエン酢酸の製造
方法について述べる。 本発明に用いる２−ｎ−アルキルチオフエンと
しては通常、下記の式で表わされるものが好適で
ある。 （式中、ｍは２〜12の整数である。） 無機塩と窒素源を含む水溶液を滅菌し、２−ｎ
−アルキルチオフエンとEK−9891菌を加えPH調
整を行ない振盪する。鉱酸で酸性にし遠心分離不
溶解物を除去したのち溶媒、例えばエチルエーテ
ルで抽出する。残査を水より再結晶して目的とす
る２−チオフエン酢酸を得ることができる。この
製造方法における反応温度は、使用する微生物の
生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲
に設定する。この設定も基質、培地の組成、PHそ
の他の条件によつて異なるので一様に規定できな
いが、例えば15〜35℃、好ましくは25〜30℃が適
当である。反応系のPHは通常6.0〜8.0、好ましく
は6.8〜7.3の範囲に設定すればよい。培養は、通
常好気的条件がよく、例えば振盪培養法または通
気撹拌培養法などが利用できる。ただし、２−ｎ
−アルキルチオフエンは揮発し易いので、クロー
ズドシステム、例えば密封方法が望ましい。 培養時間は２−チオフエン酢酸が十分に蓄積す
るまで行なえばよく、通常は４日間以上、好まし
くは７〜10日間である。無機塩として添加する物
質はリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、
鉄塩、その他必要に応じて微量金属塩が用いられ
る。窒素源として添加する物質は使用菌が資化し
うるものであればよく、例えば尿素、硫酸アンモ
ニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、
リン酸アンモニウムならびに各種アミノ酸を包含
する。これらの窒素源は１種で用いてもよく、ま
た２種以上組み合わせて用いてもよい。さらに、
使用菌の成長を促進するための栄養源としてビタ
ミン、酵母エキス、麦芽エキスなどの適量を添加
してもよい。 本発明においては、上述のように使用菌を培地
に直接接種して培養を行なう場合の他に、使用菌
を、それが資化しうる炭素源、例えばグルコー
ス、フラクトース、サツカロース、マルトース、
廃糖蜜、でんぷん等の１種もしくは２種以上を含
む培養液で予め培養して得られる菌体を上述した
培地と同様な組成の物質を含む液に添加し、反応
を行なう場合も包含する。 〔実施例〕 以下、実施例を示して本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ ハートインフユージヨンV4培地100mlを坂口フ
ラスコに入れ、120℃で20分間加熱殺菌したのち、
シユードモナス・エスピーEK−9891（FERM Ｐ
−11097）の２白金耳を接種し、30℃で48時間往
復振盪（100回／分）培養した（前培養）。次に、
尿素0.25ｇ、KH₂PO₄0.2ｇ、NaH₂PO₄0.3ｇ、
MgSO₄・7H₂00.08ｇを含む培地100mlを200mlの
坂口フラスコに入れ、120℃で20分間加熱殺菌し
たのちNaClでPHを7.0に調整した。これに原料の
２−ｎ−アルキルチオフエンとして２−ｎ−デシ
ルチオフエン〔式(1)、ｍ＝10〕0.36ｇを加えたの
ち、前培養菌液200μを接種し、30℃で７日間
回転振盪（100回／分）培養した。 得られた培養液を遠心分離し、上澄液を塩酸で
酸性にした。ジエチルエーテルを用いて３回
（各々50ml）エーテル抽出を行なつた。エーテル
溶液からエーテル留去した残留物の一部を採取
し、メタノール溶液として約5μｍのODS（オクタ
デシル シラン）を充填した内径4.6mm、長さ250
mmのカラムおよびUV検出器を備えた島津R6A型
液体クロマトグラフで流量1.0ml／minのメタノ
ールを溶離液として分析した。２−チオフエン酢
酸の保持時間は3.16分であり、原料の２−ｎ−デ
シルチオフエンの保持時間7.81分よりもかなり短
く、ピークがよく分離したため、分析は容易であ
つた。分析の結果98％の収率で２−チオフエン酢
酸が得られていることがわかつた。また、赤外吸
収スペクトルおよび核磁気共鳴スペクトル、LC
−MSを測定した結果、次のようなデータが得ら
れ、市販の２−チオフエン酢酸のデータと一致し
た。 IR（KBr、cm^-1） 3050（υ_=C-H） 2900〜2540（−COOH） 1700（υ_=C=O） 1398（−CH₂−） 1240（−COO−） 1190、1040、850、688（チオフエン環） NMR（δ、CDCl₃） 3.88（ｔ、2H、−CH₂−） 6.96（ｄ、2H、H₃およびH₄） 7.22（ｍ、1H、
H₅） LC−MS RT 6.00 分子量142（NH₄(18)が結合して160で検出される。） 実施例 ２ 実施例１における原料の２−ｎ−アルキルチオ
フエンとして、２−ｎ−デシルチオフエンに代え
て、２−ｎ−エチルチオフエン（式(1)、ｍ＝２）
とヘキサデカン0.2ｇを用い、２−ｎ−エチルチ
オフエンが培養中に揮発しないように装置を施し
たこと以外は実施例１に記載されている方法で反
応を行ない、実施例１と同様にして分析した結
果、45％の収率で２−チオフエン酢酸が得られ
た。 実施例 ３〜６ 実施例１における原料の２−ｎ−アルキルチオ
フエンとして、それぞれ次のような化合物を用い
たこと以外は実施例１に記載されている方法で反
応を行ない、実施例１と同様にして分析した結
果、表に示したような収率で２−チオフエン酢酸
が得られた。 （２−ｎ−オクチルチオフエン） （２−ｎ−ヘキシルチオフエン） （２−ｎ−ブチルチオフエン）

〔発明の効果〕

本発明は微生物を利用して２−ｎ−アルキルチ
オフエンより２−チオフエン酢酸を製造するもの
であり、微生物としてシユードモナス属細菌を使
用することにより２−チオフエン酢酸の収率の向
上を図り、しかも大量生産が可能である。さら
に、水より再結晶するだけで非常に純度の高い物
質を得ることができる。 本発明により製造された２−チオフエン酢酸は
ペニシリンやセフアロスポリンの化学修飾剤とし
て使用することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ シユードモナス属に属し、２−ｎ−アルキル
   チオフエンを２−チオフエン酢酸に変換する能力
   を有する微生物を２−ｎ−アルキルチオフエンに
   作用させることを特徴とする２−チオフエン酢酸
   の製造方法。 ２ シユードモナス属に属し、２−ｎ−アルキル
   チオフエンを２−チオフエン酢酸に変換する能力
   を有するシユードモナス・エスピーEK−9891菌
   （FERM Ｐ−11097）。