JPH0559046A - 免疫調節剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式 【化１】 で表される１８員環マクロライドを含有する免疫調節
剤。但し、式中のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は同
一又は異なっていて、それぞれ水素原子、低級アルキル
基、アシル基、アセチル基、アリル基又はアラルキル基
を表し、Ｒ⁷は低級アルキル基、アリル基又はアラルキ
ル基を表し、Ｒ⁸は水酸基、置換基を有しても良い糖残
基又は 【化２】 で表される有機基を表す。 【効果】 本発明の免疫調節剤は副作用が少なく、臓器
移植の際の拒絶反応の予防及びリウマチ等の自己免疫疾
患とアレルギー性疾患の治療に有用な免疫調節剤の提供
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は主要組織適合抗原（ＨＬ
Ａ）のクラスＩＩの発現を抑制することにより、臓器移
植時の拒絶反応の予防、並びに自己免疫疾患、アレルギ
ー性疾患などの炎症性疾患の治療に用いられる免疫調節
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近、日本に於いても臓器移植が行われ
るようになってきたが、臓器移植には拒絶反応が付きま
とい、これを如何に対処するかが大きな問題となってい
る。臓器移植における拒絶反応は、Ｔリンパ球が移植片
を異物として認識することから始まる。また慢性関節リ
ウマチ、全身性エリテマトーデス、インシュリン依存型
糖尿病などの自己免疫疾患の患者の炎症局所では、Ｔリ
ンパ球が自己の細胞と慢性的に反応し、炎症部位へ好中
球、マクロファージ、リンパ球を集束させ局所の組織破
壊を導いていることが知られている。このような臓器移
植及び自己免疫疾患の炎症局所でのＴ細胞の活性化は、
Ｔ細胞レセプターがＨＬＡに提示されている抗原を認識
することから始まり、その後に種々のサイトカインの産
生及びサイトカインレセプターの発現を惹起させること
が知られている。

【０００３】さて、現在臓器移植によく使用されている
薬剤としてサイクロスポリンＡとアザチオプリンがあ
る。サイクロスポリンＡの作用機序は、peptidy1-proly
1 cis-trans isomerase活性を阻害しＤＮＡ結合蛋白の
機能を低下させることにより１Ｌ−２等のサイトカイン
遺伝子の発現を抑制することが知られている。アザチオ
プリンは６ーメルカプトプリン（６ＭＰ）誘導体で生体
内で６ＭＰに分解された後、主としてヌクレオタイドの
チオイノシン酸となり、プリン代謝の過程においてイノ
シン酸と括抗して核酸合成を抑制し、免疫抑制作用を表
す。サイクロスポリンＡは臓器移植の他にべーチェット
病、ぶどう膜炎、慢性関節リウマチ、１型糖尿病、重症
筋無力症、クローン病等自己免疫疾患に対する有効性も
確認されている。自己免疫疾患に対する効果の発現は、
サイクロスポリンＡの投与量によるが２〜１２週間目に
みられ、サイクロスポリンＡの中止後再燃する。またサ
イクロスポリンＡを長期にわたり投与することは腎、
肝、神経、消化器に副作用があり、特に腎障害は臨床上
最も重要な問題となっている。その他の自己免疫疾患の
治療薬として、現在ペニシラミン、ロベンザリット、ブ
シラミンが用いられており、ロベンザリットはＮＺＢ／
ＷＦＩマウス延命効果とＭＲＬ／ｌマウスのLyt-5の出
現を抑制し、ブシラミンはサプレッサー細胞の増加とイ
ンターフェロンを増量することが報告されているが、そ
れらの薬理機序については不明な点が多い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は新規作用機作を有し副作用の少ない臓器移植又はリウ
マチ等の自己免疫疾患に優れた効果を有する免疫調節剤
の提供である。

【０００５】

【課題を解決する為の手段】移植臓器の拒絶及び自己免
疫反応の抑制には移植片及び自己抗原を認識するＴ細胞
の不活性化が重要なポイントである。そこでＴ細胞の活
性化に重要な機能を果たしているＨＬＡ クラスＩＩの
発現を抑える生理活性物質を探策し、そのなかで自己免
疫疾患のモデル動物に有効性を示す物質を見いだすこと
により本発明を完成することに至らしめた。即ち、本発
明は一般式

【０００６】

【化５】

【０００７】で表される１８員環マクロライドを含有す
る免疫調節剤である。但し、式中のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、
Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は同一又は異なっていて、それぞれ水
素基、低級アルキル基、アシル基、アセチル基、アリル
基又はアラルキル基を表し、Ｒ⁷は低級アルキル基、ア
リル基又はアラルキル基を表し、Ｒ⁸は水酸基、置換基
を有しても良い糖残基又は

【０００８】

【化６】

【０００９】で表される有機基を表すものである。

【００１０】以下に、本発明を具体的に説明する。ＨＬ
Ａ クラスＩＩ分子はＩＦＮーγやＩＬ４等のサイトカ
インでその発現が誘導されることが知られており、慢性
炎症局所では特にその発現が顕著である。本発明者らは
タンパクの合成を阻害しない生理活性物質の中で、サイ
トカインの産生及びクラスＩやＩＣＡＭ−１の発現を抑
えず、クラスＩＩの発現を特異的に抑える物質を広く微
生物の培養物について探索した結果、ストレプトミセス
属に属する放線菌が生産する一般式、

【００１１】

【化７】

【００１２】で表される１８員環マクロライドが上記作
用を有することを見いだしたわけである。尚 化７に於
いて、式中Ｒ⁷がＣＨ₃基の場合Ｒ⁹はＣＯＮＨ₂基を表
し、Ｒ⁷がＣＨ₂ＣＨ₃基の場合Ｒ⁹が水素原子又はＣＯＮ
Ｈ₂基を表すものとする。本発明に於いては化７中のＲ⁷
がＣＨ₂ＣＨ₃基であり、Ｒ⁹がＣＯＮＨ₂基である１８員
環マクロライドをＡ２２２０−１、化７中のＲ⁷がＣＨ₃
であり、Ｒ⁹がＣＯＮＨ₂基である１８員環マクロライド
をＡ２２２０−２、化７中のＲ⁷がＣＨ₂ＣＨ₃基であ
り、Ｒ⁹が水素原子である１８員環マクロライドをＡ２
２２０−３と称する。

【００１３】

【化８】

【００１４】で示されるようにＡ２２２０−１、Ａ２２
２０−２、Ａ２２２０−３のＲ⁸を水酸基にすると、い
ずれもクラスＩＩの発現抑制に対する活性が向上した。

【００１５】尚、本発明に於いてはＨＬＡ クラスＩＩ
の発現を特異的に抑える活性を有する限りＡ２２２０−
１、Ａ２２２０−２及びＡ２２２０−３以外の構造を有
する１８員環マクロライドも用いることができる。換言
すれば、化５で表される一般式を有する１８員環マクロ
ライド（ 式中のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は同
一又は異なっていて、それぞれ水素基、低級アルキル
基、アシル基、アセチル基、アリル基又はアラルキル基
を表し、Ｒ⁷は低級アルキル基、アリル基又はアラルキ
ル基を表し、Ｒ⁸は水酸基、置換基を有しても良い糖残
基又は化６で表される有機基を表す）であり、かつ上記
活性を有する限り本発明の免疫調節剤として用いられ
る。

【００１６】さて、Ａ２２２０−１、Ａ２２２０−２、
Ａ２２２０−３がＨＬＡ クラスＩＩの発現を抑制する
作用をもつ物質である。即ち、ＩＦＮ−γの刺激と同時
にＡ２２２０−１、Ａ２２２０−２、Ａ２２２０−３を
細胞に添加または、細胞をＡ２２２０−１、Ａ２２２０
−２、Ａ２２２０−３で１時間前処理すると、ＩＦＮ−
γで誘導されるＨＬＡ クラスＩ及びＩＣＡＭ−１の発
現は抑制されずＨＬＡクラスＩＩが特異的に抑制され
る。これらの物質は水に難溶性の為、エタノールで５mg
/mlに溶解してアラビアゴムまたはカルボキシメチルセ
ルロースで目的の濃度になるように懸濁し、in vivo の
評価系に用いた。結核菌で作成した自己免疫疾患動物で
あるアジュバンド関節炎ラットにＡ２２２０−１、Ａ２
２２０−２、Ａ２２２０−３を腹腔内に結核菌の注射後
１０日目より連日投与し関節炎の発症を調べたところＡ
２２２０−１、Ａ２２２０−２、Ａ２２２０−３を投与
すると関節炎の発症が抑えられた。また自然発症自己免
疫疾患マウスのＭＲＬ／ｌの延命に対しても効果が認め
られた。

【００１７】さて、次に本発明に係るＡ２２２０−１、
Ａ２２２０−２、Ａ２２２０−３の生産、分離方法につ
いて記載する。Ａ２２２０−１、Ａ２２２０−２、Ａ２
２２０−３の生産に用いられる微生物はストレプトミセ
ス・エス・ピーＡＪ９４６７（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３０
０）である。かかる微生物の培養に用いられる培地は、
炭素源、窒素源及び無機塩類、更に必要に応じて有機微
量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が用いられる。
炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、マ
ルトース、シュークロース、スターチ、デキストリン、
澱粉加水分解物、廃糖蜜等の炭水化物、クエン酸、コハ
ク酸、フマール酸、酢酸等の有機酸類及びグリセリン等
のアルコール類が用いられる。窒素源としては例えば硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の硝酸塩、尿
素、アンモニア水、アンモニアガス、アミノ酸類、更に
ペプトン、大豆ホエー、大豆フレーク及びそれらの加水
分解物等のタンパク質、米糖等が用いられる。そのほか
無機塩としては例えばマンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、マグ
ネシウム塩、リン酸塩が適宜用いられ、また有機微量栄
養素としてはアミノ酸、ビタミン及びこれらを含有する
ペプトン、酵母エキスなどが適宜用いられる。培養条件
は、培地組成その他により異なるが、例えば通常PH４.
０〜９.０温度１５〜４０℃で振とう培養、通気攪拌培
養等好気的条件下に培養が行われる。本発明の本物質は
このようにして培養して得られる培養産物中に存在し、
培養産物より本物質を分離・採取する方法はブタノー
ル、メタノール、アセトニトリルなどの有機溶媒抽出
法、順相及び逆相シリカゲル、セルロースなどの吸着剤
を用いる吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過法、各種溶
媒に対する溶解度の差を利用する方法などの公知の分離
・精製法を適宜組み合わせて行なえば良い。

【００１８】本発明のＡ２２２０−１、Ａ２２２０−
２、Ａ２２２０−３等の１８員環マクロライドは難水溶
性のため、静注用製剤は、POLYOXYETHYLATED HYDROGENA
TEDCASTER OIL (HCO-60)とアルコールで可溶化して調製
される。この時の濃度は通常 ０.１ー５０mg/ml 好まし
くは０.１ー２０mg/mlである。その後１ー１０重量％の
ブドウ糖溶液で希釈して、０.００１ー１０mg/mlに調製
して静注される。勿論、マンニトール等の賦形剤、安定
化剤を添加しても良い。経口投与の場合は該免疫調節剤
中、Ａ２２０１−１、Ａ２２２０−２、Ａ２２２０−３
等の１８員環マクロライドを散剤でカプセルに包入して
投与する。この時の１８員環マクロライドの含量は０.
０１ー１００好ましくは０.１ー５０重量％にすれば良
い。又 静注用製剤の場合と同様マンニトール等の賦形
剤、安定化剤を添加しても良い。

【００１９】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて説明する。

【００２０】実施例１ 活性物質の産生、単離精製 表１に示した培地１００ml（PH７.４）を分注した５０
０ml容フラスコを１２０℃で２０分間殺菌して、これに
ストレプトミセス・エス・ピーＡＪ９４６７（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２３００）の培養液１mlを接種し２７℃で４日
間培養した。

【００２１】

【表１】

【００２２】一方３０リットル（Ｌ）溶のステンレス・
ジャーファーメンターの中に前記の培地を２０Ｌ入れ殺
菌したものに上記の種母０.２Ｌを接種し攪拌（３００r
pｍ）通気（１／４vvm）し２７℃で４日間培養し、培養
液を遠心分離して菌体２.４kg（湿重量）を得た。菌体
２.４kgに４Ｌのメタノールを加え活性物質を抽出し
た。抽出液を遠心分離又はろ過して菌体を除去後エバポ
レーターでメタノールを除去し１Ｌの蒸留水に抽出物を
懸濁した。塩酸で最終濃度０.０５Ｎの酸性にし等量の
酢酸エチルで２回抽出し、等量の５％炭酸水素ナトリウ
ムで中性画分を分画後、酢酸エチルで活性物質を中性画
分より抽出した。酢酸エチルをエバポレーターで除去
し、酢酸エチル／ヘキサン（１：１）の有機溶媒に懸濁
後、サンプルをシリカゲルカラム（２００ml）にアプラ
イし、１Ｌの酢酸エチル／ヘキサン（１：１）で不純物
質を溶出後１Ｌの酢酸エチルで活性物質を溶出させた。
活性物質の最終精製は、逆相の液体クロマトグラフィー
（YMC-Pack D-ODS-5）でアセトニトリル／水の系で６０
％アセトニトリルから１００％アセトニトリルで３０分
のグラジエントの条件で活性物質Ａ２２２０−１、Ａ２
２２０−２及びＡ２２２０−３をそれぞれ分離した。

【００２３】実施例２ 活性物質の構造 本物質のＦＡＢ−ＭＡＳスペクトル、ＵＶスペクトル、
ＩＲスペクトル、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル，¹³Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトルを測定した結果Ａ２２２０−１、Ａ２２２
０−２、Ａ２２２０−３はそれぞれ公知のコンカナマイ
シンＡ、コンカナマイシンＢ、コンカナマイシンＣと同
様なスペクトルを示す物質であった(J. Antibiotics 3
7: 1333-1343,1984)。

【００２４】実施例３ ＨＬＡ クラスＩＩの発現抑制 大腸癌由来アデノカルシノーマＣＯＬＯ ２０５細胞を
ヒトＩＦＮ−γ（ゼンザイム社製）５００u/mlで刺激す
る際に生理活性物質Ａ２２２０ー１を同時に添加し、１
２時間培養後ＨＬＡ クラスＩ、ＨＬＡ クラスＩＩ、Ｉ
ＣＡＭ−１の発現を蛍光抗体染色法で測定した。染色は
まず細胞をＡ溶液（２％ＦＣＳ、０.１％ＮａＮ₃／ＲＰ
ＭＩ）に懸濁後マウス抗ＨＬＡ クラスＩ抗体（B9.12.
1）、マウス抗ＨＬＡ クラスＩＩ抗体（10T2a）、マウ
スＩＣＡＭ−１抗体（84H10）で３０分間４℃で反応さ
せた後、Ａ溶液で細胞を２回洗浄し、蛍光標識したヤギ
抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社製）で３０分間４℃で
反応させた。次にＢ溶液（０.１％ＢＳＡ、０.１％Ｎａ
Ｎ₃／ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄しＣ溶液（０.１％Ｎａ
Ｎ₃／ＰＢＳ）で細胞を１回洗浄し、propidium iodide
( 2 mg/ml)で死細胞を染色後ＦＡＣＳｃａｎ（BECTON D
ICKINSON）で測定した。図１に示すようにＡ２２２０−
１はＩＦＮ−γによるクラスＩ、ＩＣＡＭ−１の発現誘
導に対しては影響がなかったが、クラスＩＩの発現誘導
を抑制した。Ａ２２２０ー１と同様の効果がＡ２２２０
−２及びＡ２２２０ー３でも得られ、５０％の抑制値を
示すＩＣ₅₀値はＡ２２２０−１の場合５μg/mlでＡ２２
２０−２とＡ２２２０−３でも同様な値であった。

【００２５】実施例４ Ａ２２２０−１のラットアジュ
バント関節炎における投与効果 ８週齢雄Lewisラットの後肢足裏（footpad）の内皮にＤ
ＩＦＣＯのFreund'scomplete adjuvantの結核菌の乾燥
菌体を５mg/mlに調製し、０.１ml注射すると注射側の足
は注射後２４時間で急速に発赤腫脹をし、その後７日頃
までは一定の腫脹のままである（一次炎症）。時間が経
過すると、この一時期腫脹は治まるが注射後２週目から
更に関節に腫脹が生じる（二次炎症）。Ａ２２２０−１
の投与は、結核菌を注射して１０日目より行った。具体
的にはそれぞれ０μg/kg、５μg/kg及び２５μg/kgの濃
度になるようにカルボキシメチルセルロースで懸濁した
ものを連日腹腔内に投与し、footpadの腫脹をＵＮＩＣ
ＯＭ社の後肢足せき浮腫容積測定装置で測定した。図２
に示すようにＡ２２２０−１は２５μg/kg慢性炎症に対
応する二次炎症を顕著に抑制した。Ａ２２２０−１と同
様の効果はＡ２２２０−２及びＡ２２２０−３でも得ら
れた。

【００２６】実施例５ Ａ２２２０−１の自己免疫疾患
マウスＭＲＬ／１に対する延命効果 ＭＲＬ／１マウスは関節炎、血管炎、リンパ腫の病変を
自然発症し、全身性エリテマトーデスと類似の自己免疫
疾患マウスである。寿命は雌で約２０週齢、雄で約２２
週齢である。さてＡ２２２０−１を生後８週目より連日
腹腔内に投与しＭＲＬ／１雌マウス延命に対する影響を
調べた。図３に示すように、Ａ２２２０ー１を投与した
マウスでは顕著な延命効果が観察され、Ａ２２２０ー２
及びＡ２２２０ー３でも同様な効果が得られた。

【００２７】実施例６ 脱中性糖体の作製と活性の向上
化 Ａ２２２０ー１とＡ２２２０ー２に５０％酢酸水（２０
倍量）を加え、４０℃にて１５時間攪拌した。その後反
応液を減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー（ベンゼン：酢酸エチル＝１：１）にて精製し、白色
個体の脱中性糖体の化４を得た。それらを用いてＩＦＮ
−γによるクラスＩＩの発現誘導に対する影響を調べ
た。表２に示すようにＣＯＬＯ ２０５細胞において脱
中性糖体でクラスＩＩの発現抑制活性が約１０倍向上し
た。尚、表２に於て＋はクラスＩＩ発現抑制活性がある
場合でーはない場合を示す。

【００２８】

【表２】

【００２９】

【発明の効果】本発明の免疫調節剤は、臓器移植時の拒
絶反応の予防、アレルギー性疾患や自己免疫疾患等の炎
症性疾患の治療薬として有用なものとして期待できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ａ２２２０−１のＩＦＮーγによるＨＬＡ ク
ラスＩＩ（ＤＲ）の発現抑制を示したのもである。縦軸
に細胞の数を横軸に蛍光強度（ＨＬＡクラスＩＩの発現
量）を示す。

【図２】Ａ２２２０−１投与によるラットアジュバント
関節炎の抑制を示したものである。

【図３】Ａ２２２０−１投与による自己免疫疾患マウス
ＭＲＬ／１に対する延命効果を示したものである。

【符号の説明】

図２に於て黒丸、黒四角、白四角は、Ａ２２２０−１を
それぞれ０、５、２５μg/kg投与したものである。また
図３に於て、黒四角、黒丸はそれぞれ０、及び５０μg/
kg投与したものである。

フロントページの続き (72)発明者 福地 直之 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 宮野 博 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 鈴木 栄一郎 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 間宮 直子 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 古屋 真美 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 明石 知子 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 戸嶋 一敦 神奈川県川崎市中原区井田777−15 シル クハウス201 (72)発明者 竜田 邦明 東京都杉並区松ノ木２−26−７

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 で表される１８員環マクロライドを含有する免疫調節
   剤。但し、式中のＲ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵及びＲ⁶は同
   一又は異なっていて、それぞれ水素原子、低級アルキル
   基、アシル基、アセチル基、アリル基又はアラルキル基
   を表し、Ｒ⁷は低級アルキル基、アリル基又はアラルキ
   ル基を表し、Ｒ⁸は水酸基、置換基を有しても良い糖残
   基又は 【化２】 で表される有機基を表す。
2. 【請求項２】 【化３】 で表される１８員環マクロライドを含有する請求項１記
   載の免疫調節剤。但し、式中Ｒ⁷がＣＨ₃基の場合Ｒ⁹は
   ＣＯＮＨ₂基を表し、Ｒ⁷がＣＨ₂ＣＨ₃基の場合Ｒ⁹が水
   素原子又はＣＯＮＨ₂基を表す。
3. 【請求項３】 【化４】 で表される１８員環マクロライドを含有する請求項１記
   載の免疫調節剤。但し、式中Ｒ⁷がＣＨ₃基またはＣＨ₂
   ＣＨ₃基を表す。