JPH0338528A - 血栓症および血栓寒栓併発症を処置および予防するための調整物 - Google Patents
血栓症および血栓寒栓併発症を処置および予防するための調整物Info
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- JPH0338528A JPH0338528A JP2166528A JP16652890A JPH0338528A JP H0338528 A JPH0338528 A JP H0338528A JP 2166528 A JP2166528 A JP 2166528A JP 16652890 A JP16652890 A JP 16652890A JP H0338528 A JPH0338528 A JP H0338528A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、抗血栓活性を有するプロティンＳ含有医薬調
製物、および抗血栓活性を有する調製物を調製すること
における精製プロティンＳの用途に関する。
製物、および抗血栓活性を有する調製物を調製すること
における精製プロティンＳの用途に関する。
現在人手可能な抗血栓性の物質は、副作用として出血を
引き起こす危険性を（Ｐう。したがって、危険性が増大
した臨床状態においてそれらを血栓症に適用すれば、重
大な副作用を招来することになる。
引き起こす危険性を（Ｐう。したがって、危険性が増大
した臨床状態においてそれらを血栓症に適用すれば、重
大な副作用を招来することになる。
プロティンＳは、血餅の形成を阻害すると同時に、プロ
フィプリン溶解性を示す生理学的に存在している抗血栓
性物質である。天然の血漿はＩＲＱ当たりプロティンＳ
を２５μｇから３０μｇａ有している。プロティンＳは
、活性プロティンＣの抗凝集性およびプロフィプリン溶
解性のための非−Ｍ素的共同因子である。活性プロティ
ンＣは、活性化第■因子および活性化第■因子の不活化
速度を速める。
フィプリン溶解性を示す生理学的に存在している抗血栓
性物質である。天然の血漿はＩＲＱ当たりプロティンＳ
を２５μｇから３０μｇａ有している。プロティンＳは
、活性プロティンＣの抗凝集性およびプロフィプリン溶
解性のための非−Ｍ素的共同因子である。活性プロティ
ンＣは、活性化第■因子および活性化第■因子の不活化
速度を速める。
さらに、プロティンＳは肝臓、内皮細胞、巨核球におい
て合成される、ビタミンに依存性タンパク質であること
が、Ｂｆｏｏｄ、 ６４巻、６号（１２月、 １９８４
）。
て合成される、ビタミンに依存性タンパク質であること
が、Ｂｆｏｏｄ、 ６４巻、６号（１２月、 １９８４
）。
＋２９７−１３００頁、およびＰｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ
Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、 １５巻、 ｌ５ＢＮ Ｏｏ
−８０８９−１８６１−３（１９？）から知られている
。
Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、 １５巻、 ｌ５ＢＮ Ｏｏ
−８０８９−１８６１−３（１９？）から知られている
。
その構造によれば、プロティンＳは分子量約７０゜ＯＯ
Ｏの１本鎖糖タンパク質である。それは６３５個のアミ
ノ酸からなる。プロティンＳは、血漿中では、種々の形
態で、すなわち少量は、遊離の活性型として、および大
部分（約６０％）は、Ｃ４ｂ結合タンパク質との非共有
？１体くこの複合体は不活外である）として存在する。
Ｏの１本鎖糖タンパク質である。それは６３５個のアミ
ノ酸からなる。プロティンＳは、血漿中では、種々の形
態で、すなわち少量は、遊離の活性型として、および大
部分（約６０％）は、Ｃ４ｂ結合タンパク質との非共有
？１体くこの複合体は不活外である）として存在する。
活性プロティンＣは、血漿の血餅形成時間を用量依ｒｒ
的に増大させる。プロティンＳ−免疫劣化血漿中では、
活性プロティンＣはその機能を発揮することができない
。活性プロティンＣは、精製プロティンＳを用いてプロ
ティンＳ欠損血漿を再構築した後でしか、再度完全には
有効とならないであろう。その状態生理学的な役割は、
先天性のプロティンＳ欠損症および欠損症発生傾向（栓
友病）に見舞われた患者の記録から明らかになっている
。先天性のプロティンＳ欠損症は、常染色体支配的に遺
伝され、若年間における静脈および動脈の血栓塞栓症の
発現か特徴的である。
的に増大させる。プロティンＳ−免疫劣化血漿中では、
活性プロティンＣはその機能を発揮することができない
。活性プロティンＣは、精製プロティンＳを用いてプロ
ティンＳ欠損血漿を再構築した後でしか、再度完全には
有効とならないであろう。その状態生理学的な役割は、
先天性のプロティンＳ欠損症および欠損症発生傾向（栓
友病）に見舞われた患者の記録から明らかになっている
。先天性のプロティンＳ欠損症は、常染色体支配的に遺
伝され、若年間における静脈および動脈の血栓塞栓症の
発現か特徴的である。
本発明は、治療学的に有用であるプロティンＳ含有調製
物であって、特定の精製方広故に、それが天然血漿のプ
ロティンＳ濃度より焼焙も高い濃度であり、かつその作
用を減退させる成分を含まない調製物を提供することを
目的とするものである。
物であって、特定の精製方広故に、それが天然血漿のプ
ロティンＳ濃度より焼焙も高い濃度であり、かつその作
用を減退させる成分を含まない調製物を提供することを
目的とするものである。
この目的を達成するため、本発明は、天然血漿の少なく
とも５０倍の濃度であるプロティン３ｉ量を有し、かつ
Ｃ４ｂ−結合タンパク質を含まず、要すれば所定量の活
性プロティンＣを含有することもできる、血栓症および
血栓塞栓併発症を処置および予防するための調製物を提
供するものである。
とも５０倍の濃度であるプロティン３ｉ量を有し、かつ
Ｃ４ｂ−結合タンパク質を含まず、要すれば所定量の活
性プロティンＣを含有することもできる、血栓症および
血栓塞栓併発症を処置および予防するための調製物を提
供するものである。
特定の精製法および濃縮法により、本発明にしたがって
精製し、高度に濃縮したプロティンＳｌ農縮物は、種々
の治療用組成物を製造するために使用するのに有益であ
る。
精製し、高度に濃縮したプロティンＳｌ農縮物は、種々
の治療用組成物を製造するために使用するのに有益であ
る。
本発明を利用するための１つの教示として、ポリクロー
ナル・アフィニティークロマトグラフィーまたはモノク
ローナル抗−プロテインＳアフィニティークロマトグラ
フィーによって精製したプロティンＳを、先天性または
１麦天性プロテインＳ欠１１】症に罹患した患者におけ
る血栓塞栓併発症を予防するための治療学的調製物の調
製に（重用することか挙げられる。
ナル・アフィニティークロマトグラフィーまたはモノク
ローナル抗−プロテインＳアフィニティークロマトグラ
フィーによって精製したプロティンＳを、先天性または
１麦天性プロテインＳ欠１１】症に罹患した患者におけ
る血栓塞栓併発症を予防するための治療学的調製物の調
製に（重用することか挙げられる。
さらに、本発明を利用するための１つの教示として、Ｃ
４ｂ−結合タンパク質の増大したレベルに関連した症状
に見舞われた患者を処置するための治療学的調製物の調
製に、ポリクローナル・アフィニティークロマトグラフ
ィーまりこはモノクローナル抗−プロテインＳアフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製したプロティン
Ｓを使用することか挙げられる。
４ｂ−結合タンパク質の増大したレベルに関連した症状
に見舞われた患者を処置するための治療学的調製物の調
製に、ポリクローナル・アフィニティークロマトグラフ
ィーまりこはモノクローナル抗−プロテインＳアフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製したプロティン
Ｓを使用することか挙げられる。
さらに、本発明を利用するための教示として、人工血背
の表面に固定化させて血栓の形成を予防することのでき
る調製物を調製するために、ポリクローナル・アフィニ
ティークロマトグラフィーまたはモノクローナル抗−プ
ロテインＳアフィニティークロマトグラフィーによって
精製したプロティンＳを、要すれば活性プロティンＣと
組み合わせて使用すること、を峰ましいものとして挙げ
ることができる。
の表面に固定化させて血栓の形成を予防することのでき
る調製物を調製するために、ポリクローナル・アフィニ
ティークロマトグラフィーまたはモノクローナル抗−プ
ロテインＳアフィニティークロマトグラフィーによって
精製したプロティンＳを、要すれば活性プロティンＣと
組み合わせて使用すること、を峰ましいものとして挙げ
ることができる。
本発明の調製物の調製、精製および評価を以下の実施例
によってより詳細に説明する。
によってより詳細に説明する。
実施例１
プロトロンビン−庚合体濃縮物からのプロティンＳの精
製 ＱＡＥ−セフアゾ、クスおよびブルー・セファロースＣ
Ｌ−６Ｂクロマトグラフィー（ファルマンア）を使用し
、第１Ｘ因子濃縮物（プｏＦｏンビン′ｆ夏合体Ｓ Ｔ
ｆ Ｍ−３１ＭＭＵＮＯＡＧウィーン）からヒトプロ
ティンＳを以下のように調製した：その凍結乾燥濃縮物
（１００ｇ）を滅菌したイオン不含水２００．ｖ９に溶
解し、０．０１ｍｏｌ／Ｃ２（Ｎ−モルホリンエタンス
ルホン酸）ｐＩ（８，０゜０、 ｌ ８ｍｏｌ＃ Ｎａ
Ｃ（１，１０ＩＩＩＩＩｌｏｌ／ｆ２ Ｅ ＤＴＡ、
２ｍｍｏｌ＃ ヘンズアミジンーＨＣＩ２および０．０
２％ＮａＮ３からなる緩衝液（出発緩衝液）に対して透
析した。次いて、得られた透析物質をＱＡＥ−セフアゾ
、クス力ラム（８Ｘ１９ＣＪりに適用し、そのＨＷｉ腹
で平衡化した。洗浄溶液として、緩衝液（出発ｌＪ街ｉ
Ｕ １ 、５リノトルを使用した。
製 ＱＡＥ−セフアゾ、クスおよびブルー・セファロースＣ
Ｌ−６Ｂクロマトグラフィー（ファルマンア）を使用し
、第１Ｘ因子濃縮物（プｏＦｏンビン′ｆ夏合体Ｓ Ｔ
ｆ Ｍ−３１ＭＭＵＮＯＡＧウィーン）からヒトプロ
ティンＳを以下のように調製した：その凍結乾燥濃縮物
（１００ｇ）を滅菌したイオン不含水２００．ｖ９に溶
解し、０．０１ｍｏｌ／Ｃ２（Ｎ−モルホリンエタンス
ルホン酸）ｐＩ（８，０゜０、 ｌ ８ｍｏｌ＃ Ｎａ
Ｃ（１，１０ＩＩＩＩＩｌｏｌ／ｆ２ Ｅ ＤＴＡ、
２ｍｍｏｌ＃ ヘンズアミジンーＨＣＩ２および０．０
２％ＮａＮ３からなる緩衝液（出発緩衝液）に対して透
析した。次いて、得られた透析物質をＱＡＥ−セフアゾ
、クス力ラム（８Ｘ１９ＣＪりに適用し、そのＨＷｉ腹
で平衡化した。洗浄溶液として、緩衝液（出発ｌＪ街ｉ
Ｕ １ 、５リノトルを使用した。
出発緩衝層１．２リソトル、および０ 、５ ｍｏｌ／
ｆｆＮａＣＱを添加したことによ、り上記最初の緩衝液
とはＲなる別の緩衝液１．２リツトルからなる線形Ｎａ
ＣＱグラジェントによって１１０．ｗＭ時でプロティン
Ｓを溶出させた。Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｓ ＤＳ Ｐ
ａｇｅ（ファルマ／ア）および抗原決定法［ローレル（
Ｌａｕｒｅｌｌ）］によって、プロティンＳフラクショ
ンをプロティンＳについて試験し、プロティンＳを含有
するフラクションをまとめ、最後に緩衝液に対して透析
した。この緩衝液は、５０ｍｍｏｌ＃ ト’Ｊス１−（
Ｃ（ｌ ｐ Ｈ７，４、ｌ ５０ｍｍｏ１１０．ＮａＣ
ｆｆ、 ２ｍｌｌ１ｏｌ／１ＥＤＴＡ、ｌ ｍｍｏｌ／
（！ベンズアミジンー）ＩＣ＆および０．０２％Ｎ５Ｎ
Ｊを含有するものであった。
ｆｆＮａＣＱを添加したことによ、り上記最初の緩衝液
とはＲなる別の緩衝液１．２リツトルからなる線形Ｎａ
ＣＱグラジェントによって１１０．ｗＭ時でプロティン
Ｓを溶出させた。Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｓ ＤＳ Ｐ
ａｇｅ（ファルマ／ア）および抗原決定法［ローレル（
Ｌａｕｒｅｌｌ）］によって、プロティンＳフラクショ
ンをプロティンＳについて試験し、プロティンＳを含有
するフラクションをまとめ、最後に緩衝液に対して透析
した。この緩衝液は、５０ｍｍｏｌ＃ ト’Ｊス１−（
Ｃ（ｌ ｐ Ｈ７，４、ｌ ５０ｍｍｏ１１０．ＮａＣ
ｆｆ、 ２ｍｌｌ１ｏｌ／１ＥＤＴＡ、ｌ ｍｍｏｌ／
（！ベンズアミジンー）ＩＣ＆および０．０２％Ｎ５Ｎ
Ｊを含有するものであった。
透析した後、まとめたプロティンＳをブルー・セフｙＯ
−スカラムＣＬ−６Ｂ（２，５ｃｘｘ １０．５ｃｍ）
に適用し、出発緩衝液で平衡化させた。
−スカラムＣＬ−６Ｂ（２，５ｃｘｘ １０．５ｃｍ）
に適用し、出発緩衝液で平衡化させた。
この出発緩衝６５００ｘ（ｌを用いて速度１５朴／時で
洗浄を行った。このようにすれば、フロティンＳは「ボ
イドボリューム（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）−ｔとして
溶出され、プロトロンビンはカラムに吸冴されたようで
ある。再び、ＳＤＳ−Ｐａｇｅファーストフローシステ
ム（ファルマシアおよびローレル）によって、プロティ
ンＳが豊富なフラクションを決定した［５ｃａｎｄ、
Ｊ、 ＣＩ ｉｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、 （浦）２９（１
９７７）２１（浦１２４）］。
洗浄を行った。このようにすれば、フロティンＳは「ボ
イドボリューム（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）−ｔとして
溶出され、プロトロンビンはカラムに吸冴されたようで
ある。再び、ＳＤＳ−Ｐａｇｅファーストフローシステ
ム（ファルマシアおよびローレル）によって、プロティ
ンＳが豊富なフラクションを決定した［５ｃａｎｄ、
Ｊ、 ＣＩ ｉｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、 （浦）２９（１
９７７）２１（浦１２４）］。
このようにして調製したプロティンＳは、還元ＳＤＳ−
Ｐａｇｅにおいて形慝的な特徴、すなわら分子１約８６
，０００および７６．０００のそれぞれ２つの近接した
バンド（二重線）を示した。タンパク質ｌ農度は、ヒト
プロティンＳについて、吸光係数０．１．２８ＯｎＩ！
＋において分光光学的に測定し、ローリ−ら［Ｌｏｗｒ
ｙ Ｏ，、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ Ｎ、、Ｆａｒｒ Ａ
、Ｌ、Ｉ？ａｎｄａｌｌ Ｒ，のＪ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃ
ｈｅｍ、 １９３（１９５１）２６５における１−フォ
リン・フエ／−ル試薬を用いたタンパク實１則定（Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ ｍｅａｓｕｒｅ＋＋＋ｅｎｔ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ Ｆｏｌｉｎ ｐｈｅｎｏｌ ｒｃａｇｅｎ
ｔ）］、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 １９３（１
９５１）２６５］の方法によって確認した。
Ｐａｇｅにおいて形慝的な特徴、すなわら分子１約８６
，０００および７６．０００のそれぞれ２つの近接した
バンド（二重線）を示した。タンパク質ｌ農度は、ヒト
プロティンＳについて、吸光係数０．１．２８ＯｎＩ！
＋において分光光学的に測定し、ローリ−ら［Ｌｏｗｒ
ｙ Ｏ，、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ Ｎ、、Ｆａｒｒ Ａ
、Ｌ、Ｉ？ａｎｄａｌｌ Ｒ，のＪ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃ
ｈｅｍ、 １９３（１９５１）２６５における１−フォ
リン・フエ／−ル試薬を用いたタンパク實１則定（Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ ｍｅａｓｕｒｅ＋＋＋ｅｎｔ ｗｉｔｈ
ｔｈｅ Ｆｏｌｉｎ ｐｈｅｎｏｌ ｒｃａｇｅｎ
ｔ）］、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 １９３（１
９５１）２６５］の方法によって確認した。
実施例２
プロティンＳによるヒツジの免疫
実施例１にしたがって調製した精製前プロティンＳをプ
ロティンＳに対するヒツジ−抗血清の調製に使用するに
当たり、最初の２回はフロイントのアジユバントを含有
するプロティン５１００μｇを皮下注ｆＡＪ Ｌ、以後
、不完全アジユバントを含有させて増強投与（ブースタ
ー）する、という４つの免疫用注射を行った。その以後
の増強投与を行った後、二重免疫拡散によって抗血ｌｎ
を試験した。
ロティンＳに対するヒツジ−抗血清の調製に使用するに
当たり、最初の２回はフロイントのアジユバントを含有
するプロティン５１００μｇを皮下注ｆＡＪ Ｌ、以後
、不完全アジユバントを含有させて増強投与（ブースタ
ー）する、という４つの免疫用注射を行った。その以後
の増強投与を行った後、二重免疫拡散によって抗血ｌｎ
を試験した。
それにより、精製プロティンＳとの沈降および正常血清
との沈降が各々認められた。
との沈降が各々認められた。
実施例３
抗血清４５０＋ＣからＩｇＧフラクションをアルコール
沈澱、およびその後のトリス−ＨＣｌ２ｐＨ６，８緩衝
液中、セファデックスΔ５０への眼前によって得た。抗
血清４５０ｍ１２から、抗−プロテインＳ ＩｇＧ１
．］、４ｇを含有する上清が得られた。セファロースＣ
Ｌ−４Ｂ（セファロースＩＩＩＱ当たりタンパク質５，
７ｘｇを使用した）４５０ｍ＆をそのＩｇＧフラクショ
ンとカップリングさせた。
沈澱、およびその後のトリス−ＨＣｌ２ｐＨ６，８緩衝
液中、セファデックスΔ５０への眼前によって得た。抗
血清４５０ｍ１２から、抗−プロテインＳ ＩｇＧ１
．］、４ｇを含有する上清が得られた。セファロースＣ
Ｌ−４Ｂ（セファロースＩＩＩＱ当たりタンパク質５，
７ｘｇを使用した）４５０ｍ＆をそのＩｇＧフラクショ
ンとカップリングさせた。
カップリング効率は７６％であった。抗−プロテインＳ
カラムをグリシン−Ｈ（Ｊ！ｐＨ３および吸収緩衝液ｐ
Ｈ７，５で平衡化した。
カラムをグリシン−Ｈ（Ｊ！ｐＨ３および吸収緩衝液ｐ
Ｈ７，５で平衡化した。
吸収緩衝液には、２０ｍ１ｏｌトリス、２ｍｍｏｌＥＤ
ＴＡ、０．２５ｍｏｌＮａＣ１２，２ｍｍｏｌベンズア
ミジン、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、および０．０２％
Ｎ ａ Ｎ ３ ＋ｐＨ７，４を含有させた。洗浄緩衝
溶液は、以下の成分を含有していた： ２０ｍｍｏｌ
トリス、２ｍｍｏｌＥＤＴＡ、１．ＯｍｏｌＮａＣ＆、
０．５ｍｉ＋ｏｌベンズアミジン、０．０１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０．および０．０２％ＮａＮａ、１）Ｈ７，４゜ 溶出緩衝液は洗浄緩衝溶液と同じ組成を有するが、改変
点として０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用し、およびＮ
ａ５ＣＮ２４３．３ｇ、ｐＨ７，４（３ｍｏｌロダン溶
液）をさらに使用した。
ＴＡ、０．２５ｍｏｌＮａＣ１２，２ｍｍｏｌベンズア
ミジン、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、および０．０２％
Ｎ ａ Ｎ ３ ＋ｐＨ７，４を含有させた。洗浄緩衝
溶液は、以下の成分を含有していた： ２０ｍｍｏｌ
トリス、２ｍｍｏｌＥＤＴＡ、１．ＯｍｏｌＮａＣ＆、
０．５ｍｉ＋ｏｌベンズアミジン、０．０１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０．および０．０２％ＮａＮａ、１）Ｈ７，４゜ 溶出緩衝液は洗浄緩衝溶液と同じ組成を有するが、改変
点として０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を使用し、およびＮ
ａ５ＣＮ２４３．３ｇ、ｐＨ７，４（３ｍｏｌロダン溶
液）をさらに使用した。
透析緩衝溶液には、２０開ｏｆ）リス、０．１５ｍｍｏ
ｌグリンン、１ｍｍｏｌ ＥＤＴＡ、 ２ｍｍｏｌベン
ズアミンン、ｐＨ８，３を含有させた。
ｌグリンン、１ｍｍｏｌ ＥＤＴＡ、 ２ｍｍｏｌベン
ズアミンン、ｐＨ８，３を含有させた。
本発明にしたがってさらに精製するため、実施例１のよ
うにしてプロトロンビン複合体濃縮物から調製したプロ
ティンＳワラクシ３フ１００吸収緩衝液１リノトルに溶
解し、吸収緩衝溶液に対して一晩透析した。試料を適用
した後、洗浄緩衝ｉｔｌ約５リノトルを使用してカラム
からタンパク質を洗いだし、次いで溶出緩衝溶液中Ｂｉ
ｏｌのＮａ５ＣＮによって溶出した。その直後に、ｌ容
出１夜を透析し、ＳＣＮを検出限界値以下とした（その
溶出ｉｆ＆ハ５ ０ ０μｇ ／ｘＱプロティンＳ濃度
を有していた）。それはＣ４ｂ−結合タンパク質を含ん
でいなかった。
うにしてプロトロンビン複合体濃縮物から調製したプロ
ティンＳワラクシ３フ１００吸収緩衝液１リノトルに溶
解し、吸収緩衝溶液に対して一晩透析した。試料を適用
した後、洗浄緩衝ｉｔｌ約５リノトルを使用してカラム
からタンパク質を洗いだし、次いで溶出緩衝溶液中Ｂｉ
ｏｌのＮａ５ＣＮによって溶出した。その直後に、ｌ容
出１夜を透析し、ＳＣＮを検出限界値以下とした（その
溶出ｉｆ＆ハ５ ０ ０μｇ ／ｘＱプロティンＳ濃度
を有していた）。それはＣ４ｂ−結合タンパク質を含ん
でいなかった。
実施例４
一クロマトグラフィーによるプロティンＳの精製モノク
ローナル抗ープロチインＳ抗体を以下のように調製した
： 実施例１にしたがって調製したプロティン５１００μｇ
を２週間隔てＢ ａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与するこ
とによって、Ｂａ１ｂ／ｃマウスを免疫した。
ローナル抗ープロチインＳ抗体を以下のように調製した
： 実施例１にしたがって調製したプロティン５１００μｇ
を２週間隔てＢ ａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与するこ
とによって、Ｂａ１ｂ／ｃマウスを免疫した。
６週後、ヒトプロティン３５０μｇを再度１回注射し、
その３日後に融合を行った。骨髄腫セルライン（Ｐ３−
Ｘ−６３−ＡＣ３−６５３、１．５Ｘ１０７細胞）をそ
のマウスの肝臓細胞１．７ＸＩＯ８個と混合し、ケーラ
ー（Ｋ６ｈ １ｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ）の改変方法にしたがってＰＥＧ１５００を使用する
ことによりそれらを融合した［Ｋ６ｈｌｅｒ Ｇ． 、
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．のＮａｔｕｒｅ ２５６（
＋９７５）４９５−４９７コ。
その３日後に融合を行った。骨髄腫セルライン（Ｐ３−
Ｘ−６３−ＡＣ３−６５３、１．５Ｘ１０７細胞）をそ
のマウスの肝臓細胞１．７ＸＩＯ８個と混合し、ケーラ
ー（Ｋ６ｈ １ｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ）の改変方法にしたがってＰＥＧ１５００を使用する
ことによりそれらを融合した［Ｋ６ｈｌｅｒ Ｇ． 、
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．のＮａｔｕｒｅ ２５６（
＋９７５）４９５−４９７コ。
ＥＬＩＳＡによって試験した陽性クローンを２回サブク
ローンした。ブリスタン処置後２週間経過したＢａ１ｂ
／ｃマウス当たり、５ＸＩＯ”個のハイブリドーマ細胞
を注射することによって腹水を産生させた。
ローンした。ブリスタン処置後２週間経過したＢａ１ｂ
／ｃマウス当たり、５ＸＩＯ”個のハイブリドーマ細胞
を注射することによって腹水を産生させた。
硫安沈澱により腹水から免疫グロブリンを回収し、ＱＡ
ｒＥセファデノクスによるクロマトグラフ、次にセフア
ゾ、ラスＧ２００によるクロマトグラフィーによって連
続的に事前製した。
ｒＥセファデノクスによるクロマトグラフ、次にセフア
ゾ、ラスＧ２００によるクロマトグラフィーによって連
続的に事前製した。
腹水から回収し、プロティンＡセファロースから前精製
した［ｇＧフラクションをセファロースＣＬ−４Ｂとカ
ップリングさせた。実施例１に記載のようにプロティン
Ｓがプロトロンビン複合体濃縮物から回収されるアフィ
ニティークロマトグラフィーによって、ポリクローナル
プロティンＳ抗体について実施例３に記載した条件下で
プロティンＳを精製した。得られたｌ容出液のプロティ
ンｓ４度は６００μｇ７Ｊであった。これはＣ４ｂ結合
タンパク質を含有していなかった。
した［ｇＧフラクションをセファロースＣＬ−４Ｂとカ
ップリングさせた。実施例１に記載のようにプロティン
Ｓがプロトロンビン複合体濃縮物から回収されるアフィ
ニティークロマトグラフィーによって、ポリクローナル
プロティンＳ抗体について実施例３に記載した条件下で
プロティンＳを精製した。得られたｌ容出液のプロティ
ンｓ４度は６００μｇ７Ｊであった。これはＣ４ｂ結合
タンパク質を含有していなかった。
ポリクローナルまたはモノクローナルアフィニティーク
ロマトグラフィー法によって高度に精製されたプロティ
ンＳ調製物をＳＤＳ Ｐａｇｅ（グラジェントゲル８
から１２％）にかけると、コオマッシー（Ｃｏｏｍａｓ
ｓ ｉｅ）染色法［ラエミリ（ＬａｅｍＩＩＩｌ ｉ
Ｕ、 Ｋ、 ）のＮａｔｕｒｅ ２２７（１９７０）６
８０におけるバクテリオファージＴ４のヘッドの組み立
て時における構造タンイ バク質の開裂］によれば、９５％以上の純度であると認
められた。
ロマトグラフィー法によって高度に精製されたプロティ
ンＳ調製物をＳＤＳ Ｐａｇｅ（グラジェントゲル８
から１２％）にかけると、コオマッシー（Ｃｏｏｍａｓ
ｓ ｉｅ）染色法［ラエミリ（ＬａｅｍＩＩＩｌ ｉ
Ｕ、 Ｋ、 ）のＮａｔｕｒｅ ２２７（１９７０）６
８０におけるバクテリオファージＴ４のヘッドの組み立
て時における構造タンイ バク質の開裂］によれば、９５％以上の純度であると認
められた。
実施例５
実施例３または４によって調製したプロティンＳ溶出液
を以下に記載の方法に供し、製薬的に許容され得る調製
物を得た。
を以下に記載の方法に供し、製薬的に許容され得る調製
物を得た。
まず、その溶出液を限外濾過、および透析（ｄｉａｆｉ
ｌｔｅｒａＬｉｏｎ）工程に供した。この透析には、１
リツトル当たり１５０ｍｍｏｌＮａＣ（！および１５ｍ
ｍｏｌクエン酸三ナトリウム・２水和物を含有するｐ
Ｈ７４の緩衝液を使用した。得られた濾液を凍結乾燥し
、８０’Ｃ±５°Ｃ１かつ１３７５±３５ミリバールに
おいて、１時間蒸気処理することにより、ウィルス不活
化処理した［ポリクローナルまたはモノクローナル抗体
に存在し得るウィルス性夾雑物を排除する］。
ｌｔｅｒａＬｉｏｎ）工程に供した。この透析には、１
リツトル当たり１５０ｍｍｏｌＮａＣ（！および１５ｍ
ｍｏｌクエン酸三ナトリウム・２水和物を含有するｐ
Ｈ７４の緩衝液を使用した。得られた濾液を凍結乾燥し
、８０’Ｃ±５°Ｃ１かつ１３７５±３５ミリバールに
おいて、１時間蒸気処理することにより、ウィルス不活
化処理した［ポリクローナルまたはモノクローナル抗体
に存在し得るウィルス性夾雑物を排除する］。
次いで、凍結乾燥したウィルス不活化物質を滅菌等優性
ＮａＣＱ溶液に溶解し、存在し得る抗体または血清アミ
ロイドＰをＱ−セファロースのイオン交換クロマトグラ
フィーによって除去した。精製した溶液をさらに限外濾
過および透析（ｄｉａｆｉｌｔｅｒａｔ １ｏｎ）工程
により濃縮した。次いで、得られた溶液１リノトル当た
りアルブミンＪｏｇＳ １５０ｍｆｆ１ｏｌＮａｃ（お
よび１５ｍｍｏｌクエン酸三ナトリウムを加えた。得ら
れた溶液のｐＨは７５であ−）た。
ＮａＣＱ溶液に溶解し、存在し得る抗体または血清アミ
ロイドＰをＱ−セファロースのイオン交換クロマトグラ
フィーによって除去した。精製した溶液をさらに限外濾
過および透析（ｄｉａｆｉｌｔｅｒａｔ １ｏｎ）工程
により濃縮した。次いで、得られた溶液１リノトル当た
りアルブミンＪｏｇＳ １５０ｍｆｆ１ｏｌＮａｃ（お
よび１５ｍｍｏｌクエン酸三ナトリウムを加えた。得ら
れた溶液のｐＨは７５であ−）た。
それはプロティンＳを３０００μｇ ／３！１２で含有
していた。このプロティンＳ含量は血漿と比較すると５
００倍豊富な値に相当していた。マウスの免疫グロブリ
ンならびに第■因子、第■因子、第１Ｘ因子および第Ｘ
因子は検出されなかった。次いで、その溶液を滅菌濾過
し、容器に入れ、凍結乾燥した。
していた。このプロティンＳ含量は血漿と比較すると５
００倍豊富な値に相当していた。マウスの免疫グロブリ
ンならびに第■因子、第■因子、第１Ｘ因子および第Ｘ
因子は検出されなかった。次いで、その溶液を滅菌濾過
し、容器に入れ、凍結乾燥した。
得られた調製物か血栓を予防する効果を以下の血栓症モ
デルで説明する。
デルで説明する。
この試験には、体重２．５から３ｋｇの雄性ニューシー
ラント白ウサギを使用した。それらにウレタンを含有す
る麻酔剤（５０％溶ｒα）を投与ｆｆ１２ｇ／ｋｇ体重
で投与した。
ラント白ウサギを使用した。それらにウレタンを含有す
る麻酔剤（５０％溶ｒα）を投与ｆｆ１２ｇ／ｋｇ体重
で投与した。
麻酔した後、動物を仰向けに固定配置させた。
頚の前面領域の毛を刈り取った後、縦に切開して両側に
約３ｃｘの頚静脈を得た。結紮５Ｃ１′Ｊ）前に、ｌｔ
ｇ当たり２５単位のＦＥＩＢＡ（血栓形成物質、血栓刺
激物質）を対側性の耳静脈に注射した。結紮をそれぞれ
１０分または２０分間維持させた。
約３ｃｘの頚静脈を得た。結紮５Ｃ１′Ｊ）前に、ｌｔ
ｇ当たり２５単位のＦＥＩＢＡ（血栓形成物質、血栓刺
激物質）を対側性の耳静脈に注射した。結紮をそれぞれ
１０分または２０分間維持させた。
次いで、静脈を取り出し、血管を開いた後、形成された
血栓を視覚的にＯから４のスコアーで評ｆｉｌｌｉした
（「Ｏ」は血餅が無い状態を指し、「４」は滲出物の無
い硬い血餅状態を指す）。
血栓を視覚的にＯから４のスコアーで評ｆｉｌｌｉした
（「Ｏ」は血餅が無い状態を指し、「４」は滲出物の無
い硬い血餅状態を指す）。
このモデルは、抗血栓症物質を評価するものとして文献
［血栓およびうっ血におけるセミナー（Ｓｅａ＋１ｎａ
ｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｉｌｅｍ
ｏｓｌａｓｉｓ）１１（１９８５）； Ｊ、 Ａｐｐｌ
、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 １４（１９５９）９４３−９４
６］に記載されている。
［血栓およびうっ血におけるセミナー（Ｓｅａ＋１ｎａ
ｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｉｌｅｍ
ｏｓｌａｓｉｓ）１１（１９８５）； Ｊ、 Ａｐｐｌ
、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 １４（１９５９）９４３−９４
６］に記載されている。
この一連の試験では、ＦＥ Ｉ ＢＡ注射の５分前にプ
ロティンＳを種々の用量で耳静脈を介して適用した。血
餅か＋１またはそれ以下であると評価された場合に、プ
ロティンＳは血栓症の予防に有効であると判定した。
ロティンＳを種々の用量で耳静脈を介して適用した。血
餅か＋１またはそれ以下であると評価された場合に、プ
ロティンＳは血栓症の予防に有効であると判定した。
ＦＥＩＢＡ適用（２５Ｕ／ｋｇ）の５分前に、投与量０
．５から１．２ｘｇ／ｋｇで注射したプロテインＳは、
１１匹の動物において有効であった。２０分の血行停ｕ
二時では、プロティンＳは投与量１５ ｍ ｇ以」二で
有効であ−）た（３匹）。使用したＪＩ乏大１ｆＪ ！
ｎは？＋、７ｉ２であった。７および１０ｍＣで使用し
たプロティンＳ緩衝液からなる対胆は、血栓症の予防効
果を示さなかった。
．５から１．２ｘｇ／ｋｇで注射したプロテインＳは、
１１匹の動物において有効であった。２０分の血行停ｕ
二時では、プロティンＳは投与量１５ ｍ ｇ以」二で
有効であ−）た（３匹）。使用したＪＩ乏大１ｆＪ ！
ｎは？＋、７ｉ２であった。７および１０ｍＣで使用し
たプロティンＳ緩衝液からなる対胆は、血栓症の予防効
果を示さなかった。
既述のように、本発明の好ましい態様は、本発明にした
かって精製したプロティンＳを、活性プロティンＣと組
み合わせて使用することである。
かって精製したプロティンＳを、活性プロティンＣと組
み合わせて使用することである。
笈悶旦旦
活性プロティンＣの調製
プロティンＳについて記載した実施例４の操作法に類似
した方法によって、高度に精製された活性プロティンＣ
を調製するに当たり、始めに、市販のプロトロンビン複
合体濃縮物から粗製のプロティンＣフラクションを調製
した。プロティンＣに対するモノクローナル抗体を、プ
ロティンＳについて実施例４に記載したように、調製し
、さらに精製した。プロティンＣに対するモノクローナ
ル抗体をＣＮＢＲ−セファロース４Ｂ（ファルマシア）
にカップリングさせた。アフィニティークロマトグラフ
ィーによるプロティンＣの精製には以下の緩衝液を使用
した。
した方法によって、高度に精製された活性プロティンＣ
を調製するに当たり、始めに、市販のプロトロンビン複
合体濃縮物から粗製のプロティンＣフラクションを調製
した。プロティンＣに対するモノクローナル抗体を、プ
ロティンＳについて実施例４に記載したように、調製し
、さらに精製した。プロティンＣに対するモノクローナ
ル抗体をＣＮＢＲ−セファロース４Ｂ（ファルマシア）
にカップリングさせた。アフィニティークロマトグラフ
ィーによるプロティンＣの精製には以下の緩衝液を使用
した。
吸収緩衝液＋ ２ Ｏｍｍｏｌ トリス、２ｍｍｏｌ
ＥＤＴＡ、 ０．２５ｍｏｌ Ｎａ（Ｊｊ、および２ｍ
ｍｏｌヘンズアミジン、 洗浄緩衝液： ２ Ｏｍｍｏｌ ）リス、Ｉｍｏｌ Ｎ
ａＣ（！。
ＥＤＴＡ、 ０．２５ｍｏｌ Ｎａ（Ｊｊ、および２ｍ
ｍｏｌヘンズアミジン、 洗浄緩衝液： ２ Ｏｍｍｏｌ ）リス、Ｉｍｏｌ Ｎ
ａＣ（！。
２ｍｍｏｌベンズアミジン、２ｍｍｏｌ ＥＤＴＡ ；
ｐＨ７，４であった、 溶出緩衝液： ３ｍｏｌ Ｎ ａ Ｓ ＣＮ、２０ ｍ
ｍｏｌ トリス、Ｉｍｏｌ ＮａＣＱ！、０．５ｍ１ｏ
ｌベンズアミジン、２ｆｆｌＩｌｌｏｌＥＤＴ八〇 詳細には、プロトロンビン複合体濃縮物を吸収緩衝液に
溶解し、モノクローナル抗体カラム２０籾に対してプロ
トロンビン複合体濃縮物約１０ｇを使用した。次いで、
溶解したプロトロンビン複合体濃縮物を濾過し、２０．
ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心し、０．８μｌフイルタ
ーによって滅菌濾過した。滅菌濾過し、溶解したプロト
ロンビン複合体濃縮物を流速１ｏｉｎ／時でカラムに適
用した。
ｐＨ７，４であった、 溶出緩衝液： ３ｍｏｌ Ｎ ａ Ｓ ＣＮ、２０ ｍ
ｍｏｌ トリス、Ｉｍｏｌ ＮａＣＱ！、０．５ｍ１ｏ
ｌベンズアミジン、２ｆｆｌＩｌｌｏｌＥＤＴ八〇 詳細には、プロトロンビン複合体濃縮物を吸収緩衝液に
溶解し、モノクローナル抗体カラム２０籾に対してプロ
トロンビン複合体濃縮物約１０ｇを使用した。次いで、
溶解したプロトロンビン複合体濃縮物を濾過し、２０．
ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心し、０．８μｌフイルタ
ーによって滅菌濾過した。滅菌濾過し、溶解したプロト
ロンビン複合体濃縮物を流速１ｏｉｎ／時でカラムに適
用した。
次いで、そのカラムを洗浄緩衝液で洗浄してタンパク質
を遊離させ、最後に流速５村／時で、結合したプロティ
ンＣを溶出緩衝液で溶出し、フラクションを採取した。
を遊離させ、最後に流速５村／時で、結合したプロティ
ンＣを溶出緩衝液で溶出し、フラクションを採取した。
溶出されたプロティンＣを緩衝液（０，２＋＋＋ｏｌ／
１２ ｌ−リス、０．１５ｍｏｌグリ／ンおよび１ｍ
ｍｏｌ ＥＤＴＡＳｐＨ８，３）に対して透析した。プ
ロティンＣ量を測定するに当たり、ローレルの方法によ
るその抗原性、およびプロタソク（Ｐｒｏｔａｃ）活性
にしたがったその活性に換算して行った。
１２ ｌ−リス、０．１５ｍｏｌグリ／ンおよび１ｍ
ｍｏｌ ＥＤＴＡＳｐＨ８，３）に対して透析した。プ
ロティンＣ量を測定するに当たり、ローレルの方法によ
るその抗原性、およびプロタソク（Ｐｒｏｔａｃ）活性
にしたがったその活性に換算して行った。
トロンビン（約２０００ Ｎ Ｉ Ｈ単位／タンバク質
７１ｇにｔ目当する５ ００ Ｎ Ｉ Ｉ−（中位／抑
）７０屑ｇヲＣＮ Ｂ Ｒセファロース４Ｂ（ファルマ
シア）トカノブリングさせ、次いでトロンビン１単位に
対してプロティンＣ約６単位の比率でプロティンＣをそ
のトロンビン・ゲルと３７℃で混合し、連続撹拌下に３
時間反応させることにより、精製プロテ・インＣの活性
化を行った。次いで、発色性基質（Ｓ２３６６）を使用
してプロティンＣ活性を測定した。次に、活性プロティ
ンＣを滅菌濾過し、要すれば凍結した。
７１ｇにｔ目当する５ ００ Ｎ Ｉ Ｉ−（中位／抑
）７０屑ｇヲＣＮ Ｂ Ｒセファロース４Ｂ（ファルマ
シア）トカノブリングさせ、次いでトロンビン１単位に
対してプロティンＣ約６単位の比率でプロティンＣをそ
のトロンビン・ゲルと３７℃で混合し、連続撹拌下に３
時間反応させることにより、精製プロテ・インＣの活性
化を行った。次いで、発色性基質（Ｓ２３６６）を使用
してプロティンＣ活性を測定した。次に、活性プロティ
ンＣを滅菌濾過し、要すれば凍結した。
実施例７
高度に精製したプロティンＣはさらに、プロティンＳに
ついて記載している実施例３に記載のように、ヒツジを
免疫し、該ヒツジをプラズマフェレーゼ（血漿瀉血）す
ることによってプロティンＣ抗血清を調製し、ポリクロ
ーナルアフィニティークロマトグラフィーによって：Ａ
製することかできる。
ついて記載している実施例３に記載のように、ヒツジを
免疫し、該ヒツジをプラズマフェレーゼ（血漿瀉血）す
ることによってプロティンＣ抗血清を調製し、ポリクロ
ーナルアフィニティークロマトグラフィーによって：Ａ
製することかできる。
以下に記載の操作法にしたがって、モノクローナル精製
プロティンＣＣ４０ｘをＣＮＢＲセファロース４Ｂ（フ
ァルマシア）にカップリングさせた。
プロティンＣＣ４０ｘをＣＮＢＲセファロース４Ｂ（フ
ァルマシア）にカップリングさせた。
そのヒツジ抗−プロテインＣ１ｇＧフラク／：Ｉン１５
０ｚｆ２を、５０ Ｏｍｍｏｌ ＮａＣＣ，２Ｏｍｍｏ
ｌ トリス、ｌｏｍｍｏｌ ベンズアミジン、Ｉ Ｏ
ｍｍｏｌ ＣａＣＱ、からなる緩１ｉｉ夜中のプロティ
ンＣカラムにｊ歯用した。
０ｚｆ２を、５０ Ｏｍｍｏｌ ＮａＣＣ，２Ｏｍｍｏ
ｌ トリス、ｌｏｍｍｏｌ ベンズアミジン、Ｉ Ｏ
ｍｍｏｌ ＣａＣＱ、からなる緩１ｉｉ夜中のプロティ
ンＣカラムにｊ歯用した。
次いで、そのカラムをその同じ緩衝液で洗浄してタンパ
ク質を洗い流した。１００＋＋＋ｍｏｌ ＮａＣ（２゜
２０ｍｍｏｌトリス、３ｍｍｏｌ ＥＤＴＡからなる緩
衝液で溶出することによって、カル／ラム依存性抗体フ
ラクションを得た。
ク質を洗い流した。１００＋＋＋ｍｏｌ ＮａＣ（２゜
２０ｍｍｏｌトリス、３ｍｍｏｌ ＥＤＴＡからなる緩
衝液で溶出することによって、カル／ラム依存性抗体フ
ラクションを得た。
適用したすべてのヒツジＩｇＧフラクションの約６％を
これらの条件下で溶出した。グアニンン４ｍｏｌを１更
用し、カル７ウム依ｔ＜ｎ性１ｇＧフラク／ヨンをカラ
ムから分離した。次いで、１４られたカル７ウム依（ｆ
性（金属イオン依存性）プロティンＣ抗体フラク／＝Ｉ
ンをＣＮ Ｂ Ｒセファロース４Ｂ（ファルマシア）と
カンプリングさせた。
これらの条件下で溶出した。グアニンン４ｍｏｌを１更
用し、カル７ウム依ｔ＜ｎ性１ｇＧフラク／ヨンをカラ
ムから分離した。次いで、１４られたカル７ウム依（ｆ
性（金属イオン依存性）プロティンＣ抗体フラク／＝Ｉ
ンをＣＮ Ｂ Ｒセファロース４Ｂ（ファルマシア）と
カンプリングさせた。
フロトロンビン複合体濃縮物を５００ｍｍｏｌ ＮａＣ
Ｑ、 ２０ｍｍｏｌ トリス、ｌｏｍｍｏｌベンズ
アミジン、２０ｍｍｏｌ ＣａＣｆＬに溶解し、カルシ
ウム依存性ポリクａ−ナル抗−プロテインＣセファａ−
スに適用し、次いでその同じ緩衝液で洗浄し、１００ｍ
ｍｏｌ ＮａＣ（！、 ２０ｍｍｏｌ トリス、２ｍ
ｍｏｌベンズアミジン、３ｍｍｏｌ Ｅ Ｄ’ＦＡから
なる緩衝液で溶出した。次いで、溶出されたプロティン
Ｃを、実施例６においてモノクローナル精製プロティン
Ｃについて記載した方法と類似した方法によってさらに
処理し、活性化した。
Ｑ、 ２０ｍｍｏｌ トリス、ｌｏｍｍｏｌベンズ
アミジン、２０ｍｍｏｌ ＣａＣｆＬに溶解し、カルシ
ウム依存性ポリクａ−ナル抗−プロテインＣセファａ−
スに適用し、次いでその同じ緩衝液で洗浄し、１００ｍ
ｍｏｌ ＮａＣ（！、 ２０ｍｍｏｌ トリス、２ｍ
ｍｏｌベンズアミジン、３ｍｍｏｌ Ｅ Ｄ’ＦＡから
なる緩衝液で溶出した。次いで、溶出されたプロティン
Ｃを、実施例６においてモノクローナル精製プロティン
Ｃについて記載した方法と類似した方法によってさらに
処理し、活性化した。
実施例６または７に記載しているように調製した、高度
に精製されたプロティンＣの製薬的に投与可能な調製物
の製剤化を、プロティンＳについて実施例５に記載した
方法と同じ方法によって行った。
に精製されたプロティンＣの製薬的に投与可能な調製物
の製剤化を、プロティンＳについて実施例５に記載した
方法と同じ方法によって行った。
実施例８
プロティンＣまたはプロティンＳに対する抗体の熱処理
実施例７にしたがって調製した、プロティンＣに対する
モノクローナル抗体の水溶液２５ ｍ（ｌを、６倍容量
の０．７５％グリシン溶液に対して透析した後、ソルビ
トール０．４５ｇを加えた。次いで、得られた溶液を凍
結し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を７．６％に
まで水分で湿らせ、窒素雰囲気下に８０’Ｃで１０時間
加熱することにより、存在し得る病原体を不活化させた
。
モノクローナル抗体の水溶液２５ ｍ（ｌを、６倍容量
の０．７５％グリシン溶液に対して透析した後、ソルビ
トール０．４５ｇを加えた。次いで、得られた溶液を凍
結し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を７．６％に
まで水分で湿らせ、窒素雰囲気下に８０’Ｃで１０時間
加熱することにより、存在し得る病原体を不活化させた
。
この抗体１００＋ｇをアフィゲル１０ （Ａｆｒｉｇｅ
ｌｌｏ）（バイオ−ラド）２５村に固定化させ、それに
より９９％以上のタンパク質を結合させた。プロティン
Ｃを回収するため、プロトロンビンミニ体濃縮物由来の
プロティンＣを実施１ρ１６に記載のようにして固定化
モノクローナル抗体に結合し、溶出した。収量は、ゲル
１岬当たりプロティンＣ６００μｇであった。
ｌｌｏ）（バイオ−ラド）２５村に固定化させ、それに
より９９％以上のタンパク質を結合させた。プロティン
Ｃを回収するため、プロトロンビンミニ体濃縮物由来の
プロティンＣを実施１ρ１６に記載のようにして固定化
モノクローナル抗体に結合し、溶出した。収量は、ゲル
１岬当たりプロティンＣ６００μｇであった。
同しようにして、プロティンＳに対する抗体（これは固
定化の前に熱処理しておく）を使用することにより、プ
ロティンＳも回収することができよう。
定化の前に熱処理しておく）を使用することにより、プ
ロティンＳも回収することができよう。
実施例９
血餅の評価が＋１またはそれ以下の場合に、活性プロテ
ィンＣか血栓症の予防に有効であると判定した。ＦＥＩ
ＢＡ適用の５分前に５００から１０００μｇ ／ ｋｇ
の用量で活性プロティンＣを注射すると、１８匹の動物
で有効であった。効能無しの型は、このモデルでは血栓
症の予防効果を有さないものであった。
ィンＣか血栓症の予防に有効であると判定した。ＦＥＩ
ＢＡ適用の５分前に５００から１０００μｇ ／ ｋｇ
の用量で活性プロティンＣを注射すると、１８匹の動物
で有効であった。効能無しの型は、このモデルでは血栓
症の予防効果を有さないものであった。
実施例ＩＯ
プロティンＳおよび活性プロティンＣを組み合わせて適
用するに当たり、１ｋｇについて、活性プロティンＣは
２８０μｇおよびプロティンＳは５００μｇ使用した。
用するに当たり、１ｋｇについて、活性プロティンＣは
２８０μｇおよびプロティンＳは５００μｇ使用した。
このような組み合わせは上記血栓症モデルにおいて血栓
症の予防に十分有効である。この組み合わせ適用におい
ては、個々の活性物質が極めて低濃度でも有効である。
症の予防に十分有効である。この組み合わせ適用におい
ては、個々の活性物質が極めて低濃度でも有効である。
したがって、相乗または相加効果があると評価すること
ができる。損傷に基づいた出血の延長は観察されなかっ
た。
ができる。損傷に基づいた出血の延長は観察されなかっ
た。
既述のようにポリクローナルまたはモノクローナル抗−
プロテインＳアフィニティークロマトグラフィーにより
精製するためには、安全性を考慮し、すなわち存在し得
る病原体、具体的にはウィルスを不活化させるに十分な
時間および温度で、ＩｇＧ含有物質を熱処理すればよい
。
プロテインＳアフィニティークロマトグラフィーにより
精製するためには、安全性を考慮し、すなわち存在し得
る病原体、具体的にはウィルスを不活化させるに十分な
時間および温度で、ＩｇＧ含有物質を熱処理すればよい
。
特ｊＨＢＭ人 イムノ・アクチェンゲセルンヤフト・フ
ユール・ヘミンユーメディツィニッ シエ・プロデュクテ
ユール・ヘミンユーメディツィニッ シエ・プロデュクテ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、血栓症および血栓塞栓併発症を処置および予防する
ための調製物であって、天然の血漿に存在する濃度より
も少なくとも５０倍高い濃度でプロテインＳを含有し、
かつＣ４ｂ−結合タンパク質を含まない調製物。 ２、該プロテインＣと共に活性プロテインＣを含有する
請求項１に記載の調製物。 ３、ポリクローナル・アフィニティ−クロマトグラフィ
ーおよびモノクローナル抗−プロテインＳアフィニティ
ークロマトグラフィーのいずれかによって精製され、か
つＣ４ｂ−結合タンパク質を含有していない、天然の血
漿に存在する濃度よりも少なくとも５０倍高い濃度であ
るプロテインＳを、先天性または後天性プロテインＳ欠
損症に罹患した患者の血栓塞栓併発症を予防するための
治療学的調製物の調製に使用する、該プロテインＳの用
途。 ４、ポリクローナル・アフィニティークロマトグラフィ
ーおよびモノクローナル抗−プロテインＳアフィニティ
ークロマトグラフィーのいずれかによって精製され、か
つＣ４ｂ−結合タンパク質を含有していない、天然の血
漿に存在する濃度よりも少なくとも５０倍高い濃度であ
るプロテインＳを、Ｃ４ｂ−結合タンパク質レベルの増
大に関連した症状に見舞われた患者を処置するための治
療学的調製物の調製に使用する、該プロテインＳの用途
。 ５、ポリクローナル・アフィニティークロマトグラフィ
ーおよびモノクローナル抗−プロテインＳアフィニティ
ークロマトグラフィーのいずれかによって精製され、か
つＣ４ｂ−結合タンパク質を含有していない、天然の血
漿に存在する濃度よりも少なくとも５０倍高い濃度であ
るプロテインＳを、人工血管の表面に固定化させて血栓
の形成を予防することのできる調製物を調製するために
使用する、該プロテインＳの用途。 ６、活性プロテインＣと組み合わせて使用する請求項５
に記載のプロテインＳの用途。 ７、起こり得る感染症を予防するため、熱不活化する請
求項３、４、５または６に記載のプロテインＳの用途。 ８、プロトロンビン複合体濃縮物からプロテインＳフラ
クションを調製し、ポリクローナルおよびモノクローナ
ル抗−プロテインＳ抗体のいずれかに基づくポリクロー
ナルおよびモノクローナル抗−プロテインＳアフィニテ
ィークロマトグラフィーのいずれかによって該プロテイ
ンＳフラクションを精製し、溶出によって該プロテイン
Ｓを濃縮する、天然の血漿に存在する濃度よりも少なく
とも５０倍高い濃度でプロテインＳを含有し、かつＣ４
ｂ−結合タンパク質を含まない調製物を調製する方法で
あって、ポリクローナルおよびモノクローナル抗−プロ
テインＳ抗体を固定化する前に、存在し得るウィルスな
どの病原体を不活化するに十分な温度および時間で該抗
体を熱処理することを特徴とする方法。 ９、該調製物が活性プロテインＣを含有する請求項８に
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT1551/89 | 1989-06-26 | ||
| AT0155189A AT402153B (de) | 1989-06-26 | 1989-06-26 | Protein-s-hältige pharmazeutische präparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0338528A true JPH0338528A (ja) | 1991-02-19 |
Family
ID=3515833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2166528A Pending JPH0338528A (ja) | 1989-06-26 | 1990-06-25 | 血栓症および血栓寒栓併発症を処置および予防するための調整物 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5143901A (ja) |
| EP (1) | EP0406216B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0338528A (ja) |
| AT (2) | AT402153B (ja) |
| CA (1) | CA2019745C (ja) |
| DE (1) | DE59003060D1 (ja) |
| DK (1) | DK0406216T3 (ja) |
| ES (1) | ES2061007T3 (ja) |
| FI (1) | FI94927C (ja) |
| NO (1) | NO902823L (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004508280A (ja) * | 2000-02-04 | 2004-03-18 | ザ スクリップス リサーチ インスティテュート | 活性化プロテインｃ（ａｐｃ）の神経保護薬、抗血栓薬および抗炎症薬としての使用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO1989002747A1 (en) * | 1987-10-05 | 1989-04-06 | The American National Red Cross | Therapeutic thrombolytic composition |
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-
1990
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- 1990-06-18 EP EP90890184A patent/EP0406216B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-19 US US07/540,357 patent/US5143901A/en not_active Expired - Fee Related
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- 1990-06-25 JP JP2166528A patent/JPH0338528A/ja active Pending
- 1990-06-25 CA CA002019745A patent/CA2019745C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-06-26 FI FI903197A patent/FI94927C/fi not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63109785A (ja) * | 1986-07-25 | 1988-05-14 | インテグレーテッド・ジェネティックス・インコーポレーテッド | 成熟型ヒトプロテインｓをコ−ドするｄｎａを含むベクタ− |
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|---|---|---|---|---|
| JP2004508280A (ja) * | 2000-02-04 | 2004-03-18 | ザ スクリップス リサーチ インスティテュート | 活性化プロテインｃ（ａｐｃ）の神経保護薬、抗血栓薬および抗炎症薬としての使用 |
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| DE59003060D1 (de) | 1993-11-18 |
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| EP0406216B1 (de) | 1993-10-13 |
| AT402153B (de) | 1997-02-25 |
| EP0406216A2 (de) | 1991-01-02 |
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