JPH0563155B2 - - Google Patents
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- JPH0563155B2 JPH0563155B2 JP2234656A JP23465690A JPH0563155B2 JP H0563155 B2 JPH0563155 B2 JP H0563155B2 JP 2234656 A JP2234656 A JP 2234656A JP 23465690 A JP23465690 A JP 23465690A JP H0563155 B2 JPH0563155 B2 JP H0563155B2
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- chloroacetyl
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
［産業上の利用分野］
本発明は、次のような反応：
を接触する今まで記載されていない酵素に関す
る。 この新規酵素は熱安定性であり、かつ特に良好
な反応（ただしR1＝Ｈ、Ｘ＝CH、R2＝Ｈ；R1＝
Cl、Ｘ＝CH、R2＝Ｈ；R1＝Ｈ、Ｘ−R2＝Ｓ；
R1＝Cl、Ｘ−R2＝Ｓ；R1＝Ｈ、Ｘ＝CH、R2＝
Ｈ、Ｙ＝Ｓ；R1＝Cl、Ｘ＝CH、R2＝Ｈ、Ｙ＝
Ｓ）が生じる。 ［従来の技術］ Biochimica et Biophysica Acta，744
（1983），180−188，Elsevier Biomedicai Press
から既にプソイドモナス株からのプロリンアシ
ラーゼ（Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アミド−ヒ
ドロラーゼ）は公知である。しかしこの文献に記
載された酵素は50℃の温度で既に極めて急速に失
活してしまう。しかし工業的利用のために、高い
安定性を有する酵素が必要である。反応操作のた
めには、高めに温度で作業することが特に有利で
あり、この温度が基質の反応速度および溶解性を
本質的に高める。本発明による酵素は本質的に熱
安定性である。 ［発明の構成］ 本発明による酵素は次の特性により特徴づけら
れる。 １ 反応性： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンのアセチル基を分
割し、その際、最終生成物として酢酸およびＬ−
プロリンが生じ、酢酸およびＬ−プロリンを縮合
し、その際、最終生成物としてＮ−アセチル−Ｌ
−プロリンおよび水が生じる； ２ 基質特異性； Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロロアセ
チル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−プロリ
ン、Ｎ−プロピオニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチ
リル−Ｌ−プロリン、Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリ
ン、Ｎ−カプロイル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−クロロア
セチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、Ｎ
−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−２−カル
ボン酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−ピペコリン
酸、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−
Ｌ−プロリン、グリシル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ア
セチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ
−メチオニンおよびＮ−クロロアセチル−Ｌ−バ
リンを加水分解する； ３ 最適PH値： 最適PH値は6.8±0.5である； ４ PH安定性： 22℃で３週間にわたりPH7.0〜10.0の範囲内で
良好な安定性を示す； ５ 最適温度： 最適温度は、PH値7.5で65℃である； ６ 温度安定性： 70℃で、PH7.5で30分間インキユベートした後
に、活性度損失は検出されない； ７ 阻害剤および活性化剤の影響： 特に１，10−フエナントロリン、２−メルカプ
トエタノール、４−クロロメルクリベンゾエー
ト、４−ヒドロキシメルクリベンゾエート、
Hg2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+，Sn2+，Zn2+，PO4 3+
が阻害作用し、アポ酵素に関してCo2+および
Zn2+が活性化作用する； ８ 分子量： 分子量は380000±40000ダルトンである； ９ サブユニツト： 分子はそれぞれ45000±5000ダルトンを有する
８個の同じ大きさのサブユニツトからなる； 10 KM値： 基質のＮ−アセチル−Ｌ−プロリンに対する
KM値は5mM（30℃、0.1Mトリス−HCl緩衝液、
PH7.0）である。 本発明によるＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシ
ラーゼは、コマモナス テストステロニ菌株
（Comamonasu testosteroni）DSM5416または
アルカリゲネス デニトリフイカンス菌株
（Alkaligens denitrificans）DSM5417を用いて
得ることができる。この双方の菌株は、西ドイツ
国ブラウンシユバイク（Braunschweig）在の
Deutschen Sammlung von Mikloorga nismen
und Zellkulturen GmbH（DSM）に寄託されて
いる。 次の特性は、菌株DSM5416がコマモナス テ
ストステロニ種に属することを示す。 この菌株は、幅0.5〜0.7μm、長さ1.5〜3.0μm
で、グラム陰性で、１本以上の極性の鞭毛により
運動する桿状の形で増殖し、芽胞を形成しない。
この細胞は３％のKOHで溶解する。アミノペプ
チダーゼ（Cerny）反応、オキシダーゼ反応、カ
タラーゼ反応およびフエニルアラニンデアミナー
ゼ反応は陽性であり、レクチナーゼ反応およびウ
レアーゼ反応は陰性である。この増殖は偏性好気
性であり、PH5.6でMac−Conkey寒天および
Simmons−Citrat寒天において陽性であり、37
℃および41℃でSS寒天およびCetrimid寒天では
陰性である。色素形成、ONPG反応、ADH反応
およびVP反応は陰性である。硝酸還元は陽性で
あり、脱窒素作用は陰性である。でんぷん、ゼラ
チン、カゼイン、DNA，Tween80およびエスク
リン（Asculin）を加水分解しない。増殖のため
にビタミンが必要で、チロシン分解は陽性であ
る。次の基質は増殖のために炭素源およびエネル
ギー源として使用した：グルコン酸塩、グルセリ
ン、ピルビン酸塩、Ｌ−乳酸塩、リンゴ酸塩、ア
ジピン酸塩、レブリン酸塩、ムカート、Ｄ−酒石
酸塩、セバシン酸塩、２−ケトグルタル酸塩、酢
酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、Ｎ−アシル−Ｌ
−プロリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−
アスパラギン酸塩、ノルロイシンおよびγ−アミ
ノブチレート。増殖させないためには、アラビノ
ース、グルコース、フルクトース、ラクトース、
マルトース、マンノース、サツカロース、キシロ
ース、マンニツト、２−ケトグルコン酸塩、Ｎ−
アセチルグルコースアミン、カプロン酸塩、クエ
ン酸塩、グルコール酸塩、マロン酸塩、フエニル
アセテート、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、
Ｌ−セリンおよびＬ−トリプトフアンを使用す
る。 次の特性は、菌株DSM5417がアルカリゲネス
デニトリフイカンス種に属することを示す。 この菌株は、幅0.5〜0.6μm、長さ1.0〜2.0μm
で、グラム陰性で、周鞭毛により運動する桿状の
形で増殖し、芽胞を形成しない。この細胞は３％
のKOHで溶解する。アミノペプチダーゼ
（Cerny）反応、オキシダーゼ反応カタラーゼ反
応は陽性であり、フエニルアラニンデアミナーゼ
反応、レクチナーゼ反応およびウレアーゼ反応は
陰性である。この増殖は好気性であり、PH5.6で、
36℃でMac−Conkey寒天、SS寒天および
Simmons−Citrat寒天において陽性であり、41
℃でおよびCetrimid寒天では陰性である。色素
形成、ONPG反応、ADH反応およびVP反応は
陰性である。硝酸還元および脱窒素作用は陽性で
ある。貯蔵物質としてポリ−β−ヒドロキシ酪酸
（PHB）を生成する。でんぷん、ゼラチン、カゼ
イン、DNA，Tween80およびエスクリン
（Asculin）を加水分解しない。チロシン分解は
陽性である。次に基質は増殖のために炭素源およ
びエネルギー源として使用した：酢酸塩、アジピ
ン酸塩、カプロン酸塩、クエン酸塩、Ｌ−乳酸
塩、リンゴ酸塩、プロピオン酸塩、フエニルアセ
テート、アゼライン酸塩、グルコン酸塩、Ｎ−ア
セチルグルコースアミン、Ｎ−アセチル−Ｌ−プ
ロリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン酸塩お
よびＬ−グルタミン酸塩。増殖させないために
は、アラビノース、グルコース、フルクトース、
マンノース、マルトース、キシロース、マンニツ
ト、２−ケトグルコン酸塩、グルコール酸塩、レ
ブリン酸塩、マロン酸塩、シユウ酸塩、メソー酒
石酸塩、イタコン酸塩、ピメリン酸塩、セバシン
酸塩、スベリン酸塩、Ｌ−アラニン、およびＬ−
セリンを使用する。 微生物は、−80℃で凍結することによるかまた
は−196℃で液体窒素中で、凍結乾燥培養として
保存する。 作業培養は、斜面培地小管（Schragagar−
Rohrchen、西ドイツ国、Darmstadt，Merck社
のカゼインペプトン−ダイズ粉末ペプトン−寒
天）で管理した。 本発明によるＮ−アシル−プロリン−アシラー
ゼを得るために、炭素および窒素の供給源、誘導
物質としての鉱物塩およびＮ−アシル−Ｌ−プロ
リンを含有し、コマモナス テストステロニ
DSM5416を使用する場合、付加的に、たとえば
酵母抽出物として複合体の形ビタミン源を含有す
る水性培養基中のコマモナス テストステロニ
DSM5416またはアルカリゲネス デニトリフイ
カンスDSM5417を、出発PH値6.0〜8.0で温度25℃
〜35℃で好気的に培養し、細胞物質を分離し、酵
素を細胞から単離する。 酵素は、たとえばコマモナス テストステロニ
DSM5416またはアルカリゲネス デニトリフイ
カンスDSM5417を公知方法で、所望のサイズの
バイオリアクター中で培養するようにして大量に
得ることができる。 必要な培養にとつて次のことが重要である： 良好な通気（好気性生物）； 培養基の出発PH値6.0〜8.0； 酵素の誘導のため、培養基中のＮ−アセチル−
Ｌ−プロリンの存在（0.06〜0.1重量％）； ビタミンの存在（たとえば酵母抽出物として複
合体の形で）； この酵母は、細胞を溶解した後、酵素精製の公
知方法の組合せにより得ることができる。この酵
素は、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロロ
アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ
−プロリンのからＬ−プロリンを取得すために使
用する。さらに、この酵素はＮ−アセチル−Ｌ−
プロリン、Ｎ−プロピオニル−Ｌ−プロリンおよ
びＮ−ブチリル−Ｌ−プロリンをＬ−プロリンか
ら製造するために使用することができる。 ［実施例］ 本発明を、次に実施例により詳説した。 例 １：Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼ
の製造者の追跡 ３土壌試料および１浄化加工試料を0.9％
（ｗ／ｖ）のNaClと共に懸濁させ、この懸濁液１
mlもしくは希釈していない浄化加工試料１mlを液
体培養基（増菌培養基）50mlに植え込んだ。この
液体培養基は次の組成を有していた： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン ５ｇ 酵母抽出物 0.1ｇ H2HPO4 ２ｇ NaCl １ｇ MgSO4・7H2Ｏ 0.3ｇ CaCl2・2H2Ｏ 0.1ｇ 微量元素溶液 １ml H2Ｏ（脱塩水） 全量1l PH値 5.6もしくは7.4 微量元素溶液は次の組成を有していた： FeCl3・6H2Ｏ 250mg ZnCl2 75mg H3BO3 30mg CuSO4・5H2Ｏ 20mg MnCl2・4H2Ｏ 20mg CoCl2・6H2Ｏ 14mg （NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 10mg 0.01N HCl 全量100ml PH値 〜1.7 増菌培養基50mlを500mlのエルレンマイヤーフ
ラスコ［接合部（Aufsatz）および側部の４個の
差し込み口（Schikane）を備えている］に装入
し、オートクレーブにかけた。微量元素溶液は無
菌濾過し、それぞれのフラスコに冷却後に装入し
た。このフラスコを前記したように植え込み30℃
で好気性にラウンドシエイカーで200rpmで３日
間インキユベートした。厚く覆つた成分を無菌の
0.9％（ｗ／ｖ）のNaCl溶液で通常の方法で希釈
し、寒天プレート（1.2％の寒天を有する増菌培
養基、PH値：5.6）上に平板培養した。寒天プレ
ートを５日間30℃でインキユベートし、良好に発
育したコロニーを個別化し、あわせて４回から５
回同じ培養基上に植え込んだ。 コロニー形態および顕微鏡画像により単一に生
じた系統を、次に液体培養基（接合部および側部
の４個の差し込み口を備えた500mlのエルレンマ
イヤーフラスコ）100ml中で、30℃で円形振盪機
で200rpmで増殖させた。この培養基は次の組成
を有していた： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン ４ｇ （NH4）2SO4 ２ｇ 酵母抽出物 １ｇ K2HPO4 ２ｇ MgSO4・7H2Ｏ 0.3ｇ CaCl2・2H2Ｏ 0.1ｇ NaCl １ｇ 微量元素溶液 １ml H2Ｏ（脱塩水） 全量1l PH値 7.0 24〜48時間後に細胞を含む培養基を遠心分離
（15分、冷却遠心分離機中4500ｇ）し、この細胞
を0.9％（ｗ／ｖ）のNaCl溶液で２回洗浄し、
0.1Mのトリス−HCl緩衝液（PH値7.0）10mlで再
懸濁させた。 この懸濁液の微生物は超音波処理（Sonifier−
Cell Disrupter Ｂ−30 Branson Sonic Power
Co.社、Danbury，Commectict，USA）により
溶かした（２分間パルス処理、相応して１分間の
純粋な音波処理時間）。細胞断片および不溶解の
細胞を冷却遠心分離機で30分間５℃で40000Gで
遠心分離した。澄んだ上澄液（粗製抽出液）を酵
素テストで使用した。酵素の活性度の測定のため
の標準反応成分は次の組成を示す： 0.1MのトリスーHCl−緩衝液中の30mMのＮ
−アセチル−Ｌ−プロリン（PH値：7.0に調節）
1.0ml 0.1MのトリスーHCl−緩衝液（PH値：7.0）
1.95ml 粗製抽出液 0.05ml この反応を粗製抽出液の添加により開始し、反
応バツチを通常30℃で10分間インキユベートし
た。インキユベート時間および粗製抽出液量は、
酵素反応および後続するプロリン検出の直線領域
を越えないように測つた。 反応生成物のＬ−プロリンの検出はニンヒドリ
ン検出により行つた（YaronおよびMlynar，
Biochem.Biophys.Res.Commun.32（４），658−
663（1968））。 酵素テスト物質50μlを100％の酢酸1.25ml中に
ピペツトで取り、それにより酵素反応を停止させ
た。引続き0.1MのトリスーHCl−緩衝液（PH
値：7.0）0.45mlおよびニンヒドリン試薬（ニン
ヒドリン３ｇを加熱しながら100％の酢酸60mlと
6Mリン酸40mlとからなる混合物に溶かした）
1.25mlを添加した。ニンヒドリン試薬を毎日新た
に添加した。 試料ガラス容器を螺嵌蓋でゆるく閉め、100℃
で30分間インキユベートし、引続き氷浴で冷却し
た。 酵素による加水分解により遊離したＬ−プロリ
ンは、ニンヒドリンで100℃で黄色の色素を形成
し、この吸光は分光分析装置で480nmで、１バツ
チに対して粗製抽出物なしで測定した。試料50μl
当りの５〜100nmolの範囲のＬ−プロリンの検量
直線に基づき生じたＬ−プロリンの濃度を測定し
た。酵素活性度は国際単位で表し、その際、１単
位（Ｕ）は、１分当り放出したＬ−プロリン
1μmolの量に相当する。 タンパク質測定は、米国、イリノイ州、Rock
ford在、Pierce Chemical Co社のタンパク質測
定キツトを用いて、Bradford，Anal.
Biochem.72，248−254（1976）により実施した。
る。 この新規酵素は熱安定性であり、かつ特に良好
な反応（ただしR1＝Ｈ、Ｘ＝CH、R2＝Ｈ；R1＝
Cl、Ｘ＝CH、R2＝Ｈ；R1＝Ｈ、Ｘ−R2＝Ｓ；
R1＝Cl、Ｘ−R2＝Ｓ；R1＝Ｈ、Ｘ＝CH、R2＝
Ｈ、Ｙ＝Ｓ；R1＝Cl、Ｘ＝CH、R2＝Ｈ、Ｙ＝
Ｓ）が生じる。 ［従来の技術］ Biochimica et Biophysica Acta，744
（1983），180−188，Elsevier Biomedicai Press
から既にプソイドモナス株からのプロリンアシ
ラーゼ（Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アミド−ヒ
ドロラーゼ）は公知である。しかしこの文献に記
載された酵素は50℃の温度で既に極めて急速に失
活してしまう。しかし工業的利用のために、高い
安定性を有する酵素が必要である。反応操作のた
めには、高めに温度で作業することが特に有利で
あり、この温度が基質の反応速度および溶解性を
本質的に高める。本発明による酵素は本質的に熱
安定性である。 ［発明の構成］ 本発明による酵素は次の特性により特徴づけら
れる。 １ 反応性： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンのアセチル基を分
割し、その際、最終生成物として酢酸およびＬ−
プロリンが生じ、酢酸およびＬ−プロリンを縮合
し、その際、最終生成物としてＮ−アセチル−Ｌ
−プロリンおよび水が生じる； ２ 基質特異性； Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロロアセ
チル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−プロリ
ン、Ｎ−プロピオニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチ
リル−Ｌ−プロリン、Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリ
ン、Ｎ−カプロイル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−クロロア
セチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、Ｎ
−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−２−カル
ボン酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−ピペコリン
酸、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−
Ｌ−プロリン、グリシル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ア
セチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ
−メチオニンおよびＮ−クロロアセチル−Ｌ−バ
リンを加水分解する； ３ 最適PH値： 最適PH値は6.8±0.5である； ４ PH安定性： 22℃で３週間にわたりPH7.0〜10.0の範囲内で
良好な安定性を示す； ５ 最適温度： 最適温度は、PH値7.5で65℃である； ６ 温度安定性： 70℃で、PH7.5で30分間インキユベートした後
に、活性度損失は検出されない； ７ 阻害剤および活性化剤の影響： 特に１，10−フエナントロリン、２−メルカプ
トエタノール、４−クロロメルクリベンゾエー
ト、４−ヒドロキシメルクリベンゾエート、
Hg2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+，Sn2+，Zn2+，PO4 3+
が阻害作用し、アポ酵素に関してCo2+および
Zn2+が活性化作用する； ８ 分子量： 分子量は380000±40000ダルトンである； ９ サブユニツト： 分子はそれぞれ45000±5000ダルトンを有する
８個の同じ大きさのサブユニツトからなる； 10 KM値： 基質のＮ−アセチル−Ｌ−プロリンに対する
KM値は5mM（30℃、0.1Mトリス−HCl緩衝液、
PH7.0）である。 本発明によるＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシ
ラーゼは、コマモナス テストステロニ菌株
（Comamonasu testosteroni）DSM5416または
アルカリゲネス デニトリフイカンス菌株
（Alkaligens denitrificans）DSM5417を用いて
得ることができる。この双方の菌株は、西ドイツ
国ブラウンシユバイク（Braunschweig）在の
Deutschen Sammlung von Mikloorga nismen
und Zellkulturen GmbH（DSM）に寄託されて
いる。 次の特性は、菌株DSM5416がコマモナス テ
ストステロニ種に属することを示す。 この菌株は、幅0.5〜0.7μm、長さ1.5〜3.0μm
で、グラム陰性で、１本以上の極性の鞭毛により
運動する桿状の形で増殖し、芽胞を形成しない。
この細胞は３％のKOHで溶解する。アミノペプ
チダーゼ（Cerny）反応、オキシダーゼ反応、カ
タラーゼ反応およびフエニルアラニンデアミナー
ゼ反応は陽性であり、レクチナーゼ反応およびウ
レアーゼ反応は陰性である。この増殖は偏性好気
性であり、PH5.6でMac−Conkey寒天および
Simmons−Citrat寒天において陽性であり、37
℃および41℃でSS寒天およびCetrimid寒天では
陰性である。色素形成、ONPG反応、ADH反応
およびVP反応は陰性である。硝酸還元は陽性で
あり、脱窒素作用は陰性である。でんぷん、ゼラ
チン、カゼイン、DNA，Tween80およびエスク
リン（Asculin）を加水分解しない。増殖のため
にビタミンが必要で、チロシン分解は陽性であ
る。次の基質は増殖のために炭素源およびエネル
ギー源として使用した：グルコン酸塩、グルセリ
ン、ピルビン酸塩、Ｌ−乳酸塩、リンゴ酸塩、ア
ジピン酸塩、レブリン酸塩、ムカート、Ｄ−酒石
酸塩、セバシン酸塩、２−ケトグルタル酸塩、酢
酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、Ｎ−アシル−Ｌ
−プロリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−
アスパラギン酸塩、ノルロイシンおよびγ−アミ
ノブチレート。増殖させないためには、アラビノ
ース、グルコース、フルクトース、ラクトース、
マルトース、マンノース、サツカロース、キシロ
ース、マンニツト、２−ケトグルコン酸塩、Ｎ−
アセチルグルコースアミン、カプロン酸塩、クエ
ン酸塩、グルコール酸塩、マロン酸塩、フエニル
アセテート、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、
Ｌ−セリンおよびＬ−トリプトフアンを使用す
る。 次の特性は、菌株DSM5417がアルカリゲネス
デニトリフイカンス種に属することを示す。 この菌株は、幅0.5〜0.6μm、長さ1.0〜2.0μm
で、グラム陰性で、周鞭毛により運動する桿状の
形で増殖し、芽胞を形成しない。この細胞は３％
のKOHで溶解する。アミノペプチダーゼ
（Cerny）反応、オキシダーゼ反応カタラーゼ反
応は陽性であり、フエニルアラニンデアミナーゼ
反応、レクチナーゼ反応およびウレアーゼ反応は
陰性である。この増殖は好気性であり、PH5.6で、
36℃でMac−Conkey寒天、SS寒天および
Simmons−Citrat寒天において陽性であり、41
℃でおよびCetrimid寒天では陰性である。色素
形成、ONPG反応、ADH反応およびVP反応は
陰性である。硝酸還元および脱窒素作用は陽性で
ある。貯蔵物質としてポリ−β−ヒドロキシ酪酸
（PHB）を生成する。でんぷん、ゼラチン、カゼ
イン、DNA，Tween80およびエスクリン
（Asculin）を加水分解しない。チロシン分解は
陽性である。次に基質は増殖のために炭素源およ
びエネルギー源として使用した：酢酸塩、アジピ
ン酸塩、カプロン酸塩、クエン酸塩、Ｌ−乳酸
塩、リンゴ酸塩、プロピオン酸塩、フエニルアセ
テート、アゼライン酸塩、グルコン酸塩、Ｎ−ア
セチルグルコースアミン、Ｎ−アセチル−Ｌ−プ
ロリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン酸塩お
よびＬ−グルタミン酸塩。増殖させないために
は、アラビノース、グルコース、フルクトース、
マンノース、マルトース、キシロース、マンニツ
ト、２−ケトグルコン酸塩、グルコール酸塩、レ
ブリン酸塩、マロン酸塩、シユウ酸塩、メソー酒
石酸塩、イタコン酸塩、ピメリン酸塩、セバシン
酸塩、スベリン酸塩、Ｌ−アラニン、およびＬ−
セリンを使用する。 微生物は、−80℃で凍結することによるかまた
は−196℃で液体窒素中で、凍結乾燥培養として
保存する。 作業培養は、斜面培地小管（Schragagar−
Rohrchen、西ドイツ国、Darmstadt，Merck社
のカゼインペプトン−ダイズ粉末ペプトン−寒
天）で管理した。 本発明によるＮ−アシル−プロリン−アシラー
ゼを得るために、炭素および窒素の供給源、誘導
物質としての鉱物塩およびＮ−アシル−Ｌ−プロ
リンを含有し、コマモナス テストステロニ
DSM5416を使用する場合、付加的に、たとえば
酵母抽出物として複合体の形ビタミン源を含有す
る水性培養基中のコマモナス テストステロニ
DSM5416またはアルカリゲネス デニトリフイ
カンスDSM5417を、出発PH値6.0〜8.0で温度25℃
〜35℃で好気的に培養し、細胞物質を分離し、酵
素を細胞から単離する。 酵素は、たとえばコマモナス テストステロニ
DSM5416またはアルカリゲネス デニトリフイ
カンスDSM5417を公知方法で、所望のサイズの
バイオリアクター中で培養するようにして大量に
得ることができる。 必要な培養にとつて次のことが重要である： 良好な通気（好気性生物）； 培養基の出発PH値6.0〜8.0； 酵素の誘導のため、培養基中のＮ−アセチル−
Ｌ−プロリンの存在（0.06〜0.1重量％）； ビタミンの存在（たとえば酵母抽出物として複
合体の形で）； この酵母は、細胞を溶解した後、酵素精製の公
知方法の組合せにより得ることができる。この酵
素は、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロロ
アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ
−プロリンのからＬ−プロリンを取得すために使
用する。さらに、この酵素はＮ−アセチル−Ｌ−
プロリン、Ｎ−プロピオニル−Ｌ−プロリンおよ
びＮ−ブチリル−Ｌ−プロリンをＬ−プロリンか
ら製造するために使用することができる。 ［実施例］ 本発明を、次に実施例により詳説した。 例 １：Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼ
の製造者の追跡 ３土壌試料および１浄化加工試料を0.9％
（ｗ／ｖ）のNaClと共に懸濁させ、この懸濁液１
mlもしくは希釈していない浄化加工試料１mlを液
体培養基（増菌培養基）50mlに植え込んだ。この
液体培養基は次の組成を有していた： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン ５ｇ 酵母抽出物 0.1ｇ H2HPO4 ２ｇ NaCl １ｇ MgSO4・7H2Ｏ 0.3ｇ CaCl2・2H2Ｏ 0.1ｇ 微量元素溶液 １ml H2Ｏ（脱塩水） 全量1l PH値 5.6もしくは7.4 微量元素溶液は次の組成を有していた： FeCl3・6H2Ｏ 250mg ZnCl2 75mg H3BO3 30mg CuSO4・5H2Ｏ 20mg MnCl2・4H2Ｏ 20mg CoCl2・6H2Ｏ 14mg （NH4）6Mo7O24・4H2Ｏ 10mg 0.01N HCl 全量100ml PH値 〜1.7 増菌培養基50mlを500mlのエルレンマイヤーフ
ラスコ［接合部（Aufsatz）および側部の４個の
差し込み口（Schikane）を備えている］に装入
し、オートクレーブにかけた。微量元素溶液は無
菌濾過し、それぞれのフラスコに冷却後に装入し
た。このフラスコを前記したように植え込み30℃
で好気性にラウンドシエイカーで200rpmで３日
間インキユベートした。厚く覆つた成分を無菌の
0.9％（ｗ／ｖ）のNaCl溶液で通常の方法で希釈
し、寒天プレート（1.2％の寒天を有する増菌培
養基、PH値：5.6）上に平板培養した。寒天プレ
ートを５日間30℃でインキユベートし、良好に発
育したコロニーを個別化し、あわせて４回から５
回同じ培養基上に植え込んだ。 コロニー形態および顕微鏡画像により単一に生
じた系統を、次に液体培養基（接合部および側部
の４個の差し込み口を備えた500mlのエルレンマ
イヤーフラスコ）100ml中で、30℃で円形振盪機
で200rpmで増殖させた。この培養基は次の組成
を有していた： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン ４ｇ （NH4）2SO4 ２ｇ 酵母抽出物 １ｇ K2HPO4 ２ｇ MgSO4・7H2Ｏ 0.3ｇ CaCl2・2H2Ｏ 0.1ｇ NaCl １ｇ 微量元素溶液 １ml H2Ｏ（脱塩水） 全量1l PH値 7.0 24〜48時間後に細胞を含む培養基を遠心分離
（15分、冷却遠心分離機中4500ｇ）し、この細胞
を0.9％（ｗ／ｖ）のNaCl溶液で２回洗浄し、
0.1Mのトリス−HCl緩衝液（PH値7.0）10mlで再
懸濁させた。 この懸濁液の微生物は超音波処理（Sonifier−
Cell Disrupter Ｂ−30 Branson Sonic Power
Co.社、Danbury，Commectict，USA）により
溶かした（２分間パルス処理、相応して１分間の
純粋な音波処理時間）。細胞断片および不溶解の
細胞を冷却遠心分離機で30分間５℃で40000Gで
遠心分離した。澄んだ上澄液（粗製抽出液）を酵
素テストで使用した。酵素の活性度の測定のため
の標準反応成分は次の組成を示す： 0.1MのトリスーHCl−緩衝液中の30mMのＮ
−アセチル−Ｌ−プロリン（PH値：7.0に調節）
1.0ml 0.1MのトリスーHCl−緩衝液（PH値：7.0）
1.95ml 粗製抽出液 0.05ml この反応を粗製抽出液の添加により開始し、反
応バツチを通常30℃で10分間インキユベートし
た。インキユベート時間および粗製抽出液量は、
酵素反応および後続するプロリン検出の直線領域
を越えないように測つた。 反応生成物のＬ−プロリンの検出はニンヒドリ
ン検出により行つた（YaronおよびMlynar，
Biochem.Biophys.Res.Commun.32（４），658−
663（1968））。 酵素テスト物質50μlを100％の酢酸1.25ml中に
ピペツトで取り、それにより酵素反応を停止させ
た。引続き0.1MのトリスーHCl−緩衝液（PH
値：7.0）0.45mlおよびニンヒドリン試薬（ニン
ヒドリン３ｇを加熱しながら100％の酢酸60mlと
6Mリン酸40mlとからなる混合物に溶かした）
1.25mlを添加した。ニンヒドリン試薬を毎日新た
に添加した。 試料ガラス容器を螺嵌蓋でゆるく閉め、100℃
で30分間インキユベートし、引続き氷浴で冷却し
た。 酵素による加水分解により遊離したＬ−プロリ
ンは、ニンヒドリンで100℃で黄色の色素を形成
し、この吸光は分光分析装置で480nmで、１バツ
チに対して粗製抽出物なしで測定した。試料50μl
当りの５〜100nmolの範囲のＬ−プロリンの検量
直線に基づき生じたＬ−プロリンの濃度を測定し
た。酵素活性度は国際単位で表し、その際、１単
位（Ｕ）は、１分当り放出したＬ−プロリン
1μmolの量に相当する。 タンパク質測定は、米国、イリノイ州、Rock
ford在、Pierce Chemical Co社のタンパク質測
定キツトを用いて、Bradford，Anal.
Biochem.72，248−254（1976）により実施した。
【表】
【表】
表１に示したように、菌株Ｂ−Ｋは前記したテ
スト方法において特に最も高い活性度を示し、従
つて酵素の製造に使用した。菌株Ｂ−ＫおよびＢ
−A1は、西ドイツ国ブラウンシユバイク
（Braunschweig）在のDeutschen Sammlung
von Mikloorganismen und Zellkulturen
GmbH（DSM）により、コマモナス テストステ
ロニComamonas testosteroniおよびアルカリゲ
ネス デニトリフイカンス Alcaligenes
denitrificansとして確認された。 例２：コマモナス テストステロニ DSM5416
の増殖およびアシラーゼ形成 ａ 多様な炭素源上の増殖およびアシラーゼ形成 コマモナス テストステロニ DSM5416を例
１に記載したように培養基中で増殖させ、細胞を
超音波にりより溶かし、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリ
ンの比活性度を測定した。４ｇ／ｌの濃度を有す
る培養基の炭素源を変え、増殖およびアシラーゼ
形成に関する影響を測定した。
スト方法において特に最も高い活性度を示し、従
つて酵素の製造に使用した。菌株Ｂ−ＫおよびＢ
−A1は、西ドイツ国ブラウンシユバイク
（Braunschweig）在のDeutschen Sammlung
von Mikloorganismen und Zellkulturen
GmbH（DSM）により、コマモナス テストステ
ロニComamonas testosteroniおよびアルカリゲ
ネス デニトリフイカンス Alcaligenes
denitrificansとして確認された。 例２：コマモナス テストステロニ DSM5416
の増殖およびアシラーゼ形成 ａ 多様な炭素源上の増殖およびアシラーゼ形成 コマモナス テストステロニ DSM5416を例
１に記載したように培養基中で増殖させ、細胞を
超音波にりより溶かし、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリ
ンの比活性度を測定した。４ｇ／ｌの濃度を有す
る培養基の炭素源を変え、増殖およびアシラーゼ
形成に関する影響を測定した。
【表】
【表】
表２から見られるように、Ｎ−アシル−Ｌ−ア
シラーゼは、コマモナス テストステロニ
DSM5416による、炭素源としてＮ−アセチル−
Ｌ−プロリンを用いた増殖の際にのみ形成され
る。その他の炭素源を用いた増殖の際には酵素活
性は検出されなかつた。 ｂ 異なる出発PH値における増殖およびアシラー
ゼ形成 例１に記載したと同様であるが、Ｎ−アセチル
−Ｌ−プロリン２ｇ／ｌを有する培養基におい
て、PH値を6.0〜8.0の範囲で、段階的に0.5単位づ
つ変化させた。17.5時間のインキユベート時間の
後に、培養基のPH値、600μmでの光学密度の測定
による増殖、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラ
ーゼの比活性度を測定した。
シラーゼは、コマモナス テストステロニ
DSM5416による、炭素源としてＮ−アセチル−
Ｌ−プロリンを用いた増殖の際にのみ形成され
る。その他の炭素源を用いた増殖の際には酵素活
性は検出されなかつた。 ｂ 異なる出発PH値における増殖およびアシラー
ゼ形成 例１に記載したと同様であるが、Ｎ−アセチル
−Ｌ−プロリン２ｇ／ｌを有する培養基におい
て、PH値を6.0〜8.0の範囲で、段階的に0.5単位づ
つ変化させた。17.5時間のインキユベート時間の
後に、培養基のPH値、600μmでの光学密度の測定
による増殖、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラ
ーゼの比活性度を測定した。
【表】
表３は、最終PH値および増殖が培養基の出発PH
値により影響されないことを示す。6.0〜7.5のPH
範囲内において、アシラーゼの比活性度は本質的
に影響されず、PH8.0で酵素活性度のほぼ３分の
１が達成されるにすぎない。 ｃ 多様なＮ−アセチル−Ｌ−プロリン濃度での
増殖およびアシラーゼ形成 例１に記載したと同様の培養基中でＮ−アセチ
ル−Ｌ−プロリン濃度は１ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの範
囲内で段階的に１ｇ／ｌづつ変化させた。24時間
インキユベート時間の後に増殖およびＮ−アシル
−Ｌ−プロリン−アシラーゼの比活性度を測定し
た。
値により影響されないことを示す。6.0〜7.5のPH
範囲内において、アシラーゼの比活性度は本質的
に影響されず、PH8.0で酵素活性度のほぼ３分の
１が達成されるにすぎない。 ｃ 多様なＮ−アセチル−Ｌ−プロリン濃度での
増殖およびアシラーゼ形成 例１に記載したと同様の培養基中でＮ−アセチ
ル−Ｌ−プロリン濃度は１ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの範
囲内で段階的に１ｇ／ｌづつ変化させた。24時間
インキユベート時間の後に増殖およびＮ−アシル
−Ｌ−プロリン−アシラーゼの比活性度を測定し
た。
【表】
表４は、達成した細胞密度がＮ−アセチル−Ｌ
−プロリンの使用量に依存することを示す。Ｎ−
アセチル−Ｌ−プロリンなしではわずかな増殖が
見られたにすぎず、これは培養基中にある酵母抽
出物に起因する。Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン濃
度が増加すると共に、アシラーゼの比活性度は上
昇し、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン４ｇ／ｌで最
適値を達成する。 ｄ 多様な（NH4）2SO4濃度での増殖およびアシ
ラーゼ形成 例１に記載したと同様な培養基中で、（NH4）2
SO4濃度を１ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの範囲で段階的に
１ｇ／ｌづつ変化させる。23時間のインキユベー
ト時間の後に、増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロ
リン−アシラーゼの形成を測定した。
−プロリンの使用量に依存することを示す。Ｎ−
アセチル−Ｌ−プロリンなしではわずかな増殖が
見られたにすぎず、これは培養基中にある酵母抽
出物に起因する。Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン濃
度が増加すると共に、アシラーゼの比活性度は上
昇し、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン４ｇ／ｌで最
適値を達成する。 ｄ 多様な（NH4）2SO4濃度での増殖およびアシ
ラーゼ形成 例１に記載したと同様な培養基中で、（NH4）2
SO4濃度を１ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの範囲で段階的に
１ｇ／ｌづつ変化させる。23時間のインキユベー
ト時間の後に、増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロ
リン−アシラーゼの形成を測定した。
【表】
表５は、２ｇ／ｌ（NH4）2SO4濃度での増殖お
よびアシラーゼの形成が最適であることを示し
た。（NH4）2SO4は明らかにアシラーゼの形成を
促進する、それというのも（NH4）2SO4なしでは
アシラーゼの比活性が最適値の20％にすぎず、一
方達成した細胞密度は本質的に減少していないた
めである。この場合培養基中に存在する酵母抽出
物およびＮ−アセチル−Ｌ−プロリンから遊離し
たＬ−プロリンは、細胞の増殖のための窒素源と
して役立つ。 ｅ 多様な酵母抽出物濃度での増殖およびアシラ
ーゼ形成 例１に記載したと同様の培養基中で、酵母抽出
濃度を１ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの範囲で段階的に１
ｇ／ｌづつ変化させた。24時間のインキユベート
時間の後に、増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリ
ン−アシラーゼの比活性を測定した。
よびアシラーゼの形成が最適であることを示し
た。（NH4）2SO4は明らかにアシラーゼの形成を
促進する、それというのも（NH4）2SO4なしでは
アシラーゼの比活性が最適値の20％にすぎず、一
方達成した細胞密度は本質的に減少していないた
めである。この場合培養基中に存在する酵母抽出
物およびＮ−アセチル−Ｌ−プロリンから遊離し
たＬ−プロリンは、細胞の増殖のための窒素源と
して役立つ。 ｅ 多様な酵母抽出物濃度での増殖およびアシラ
ーゼ形成 例１に記載したと同様の培養基中で、酵母抽出
濃度を１ｇ／ｌ〜５ｇ／ｌの範囲で段階的に１
ｇ／ｌづつ変化させた。24時間のインキユベート
時間の後に、増殖およびＮ−アシル−Ｌ−プロリ
ン−アシラーゼの比活性を測定した。
【表】
【表】
表６は、アシラーゼの形成が酵母抽出物濃度１
ｇ／ｌで最適であり、一方で達成した細胞密度は
酵母抽出物濃度の増加と共に上昇することを示
す。酵母抽出物なしで細胞は増殖せず、このこと
は菌株の複合増殖培養基の必要性を示す。 ｆ 培養基中に酢酸塩およびＮ−アシル−Ｌ−プ
ロリンを同時に提供した場合の増殖およびアシ
ラーゼ形成 例１に記載したと同様の培養基中でＮ−アセチ
ル−Ｌ−プロリン濃度を0.2〜1.0ｇ／ｌに減少さ
せ、付加的に酢酸Na4ｇ／ｌを使用した。34時間
インキユベートした後に増殖およびＮ−アシル−
Ｌ−プロリン−アシラーゼの比活性度を測定し
た。
ｇ／ｌで最適であり、一方で達成した細胞密度は
酵母抽出物濃度の増加と共に上昇することを示
す。酵母抽出物なしで細胞は増殖せず、このこと
は菌株の複合増殖培養基の必要性を示す。 ｆ 培養基中に酢酸塩およびＮ−アシル−Ｌ−プ
ロリンを同時に提供した場合の増殖およびアシ
ラーゼ形成 例１に記載したと同様の培養基中でＮ−アセチ
ル−Ｌ−プロリン濃度を0.2〜1.0ｇ／ｌに減少さ
せ、付加的に酢酸Na4ｇ／ｌを使用した。34時間
インキユベートした後に増殖およびＮ−アシル−
Ｌ−プロリン−アシラーゼの比活性度を測定し
た。
【表】
表７はアシラーゼがＮ−アセチル−Ｌ−プロリ
ンの存在でのみ形成されるが、同時に酢酸塩によ
つても減少しない。このことは炭素源として酢酸
塩およびＮ−アセチル−Ｌ−プロリンを同時に提
供することにより、十分に大量のバイオマスを得
ることができ、その際、アシラーゼの形成を十分
に誘導するためには、誘導物質0.6ｇ／ｌで十分
である。 ｇ 後期指数増殖期において、培養基へのＮ−ア
セチル−Ｌ−プロリンの添加の場合の増殖およ
びアシラーゼ形成 前記ｆに記載したように行つた。誘導物質のＮ
−アセチル−Ｌ−プロリンは、12時間のインキユ
ベート時間の後の後期指数増殖期においてようや
く培養基に添加された。その後、培養基を更に24
時間インキユベートし、増殖およびＮ−アシル−
Ｌ−プロリン−アシラーゼの活性を測定した。
ンの存在でのみ形成されるが、同時に酢酸塩によ
つても減少しない。このことは炭素源として酢酸
塩およびＮ−アセチル−Ｌ−プロリンを同時に提
供することにより、十分に大量のバイオマスを得
ることができ、その際、アシラーゼの形成を十分
に誘導するためには、誘導物質0.6ｇ／ｌで十分
である。 ｇ 後期指数増殖期において、培養基へのＮ−ア
セチル−Ｌ−プロリンの添加の場合の増殖およ
びアシラーゼ形成 前記ｆに記載したように行つた。誘導物質のＮ
−アセチル−Ｌ−プロリンは、12時間のインキユ
ベート時間の後の後期指数増殖期においてようや
く培養基に添加された。その後、培養基を更に24
時間インキユベートし、増殖およびＮ−アシル−
Ｌ−プロリン−アシラーゼの活性を測定した。
【表】
表７および表８の比較は、アシラーゼ形成を十
分に誘導するために、酢酸含有培養基中でＮ−ア
セチル−Ｌ−プロリン0.6ｇ／ｌで十分であるこ
とを示している。この場合、誘導物質は接種の前
に、すでに培養基に添加しておくのが有利であ
る。 ｈ 培養基中に酢酸Naおよび多様なＮ−アセチ
ル−アミノ酸およびＮ−クロロアセチル−アミ
ノ酸の同時供給の際の増殖およびアシラーゼ形
成 前記ｆに記載したように、行つた。Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−プロリンの代わりに、多様なＮ−アセチ
ル−アミノ酸およびＮ−クロロアセチル−アミノ
酸を濃度１ｇ／ｌで培養基に添加した。24時間の
インキユベート時間の後に増殖およびＮ−アシル
−Ｌ−プロリン−アシラーゼの比活性を測定し
た。
分に誘導するために、酢酸含有培養基中でＮ−ア
セチル−Ｌ−プロリン0.6ｇ／ｌで十分であるこ
とを示している。この場合、誘導物質は接種の前
に、すでに培養基に添加しておくのが有利であ
る。 ｈ 培養基中に酢酸Naおよび多様なＮ−アセチ
ル−アミノ酸およびＮ−クロロアセチル−アミ
ノ酸の同時供給の際の増殖およびアシラーゼ形
成 前記ｆに記載したように、行つた。Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−プロリンの代わりに、多様なＮ−アセチ
ル−アミノ酸およびＮ−クロロアセチル−アミノ
酸を濃度１ｇ／ｌで培養基に添加した。24時間の
インキユベート時間の後に増殖およびＮ−アシル
−Ｌ−プロリン−アシラーゼの比活性を測定し
た。
【表】
表９からわかるように、テストしたＮ−アセチ
ル−アミノ酸およびＮ−クロロアセチル−アミノ
酸の中で、もつぱらＮ−アセチル−Ｌ−プロリン
だけがアシラーゼ形成を誘導した。 例３：Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンの精製 ａ コマモナス テストステロニ DSM 5416の
培養および粗製抽出物の取得 コマモナステストステロニDSM5416を傾斜寒
天（西ドイツ国 Darmstadt在、Merk AG社の
カゼインペプトン−大豆粉末ペプトン−寒天）上
で培養し、傾斜寒天試験管１個当り、無菌の0.9
％（ｗ／ｖ）のNaCl溶液4.5mlで懸濁させた。こ
うして得られた細胞懸濁液を、４個のエルレンマ
イヤーフラスコ（2l、４個の差し込み口を有す
る）用の接種物として用い、このフラスコは、例
１に記載したと同様にそれぞれ接種培養基500ml
を有していた。このエルレンマイヤーフラスコを
21時間ラウンドシエイカーで30℃で100rpmでイ
ンキユベートし、細胞を例１に記載したと同様に
収穫し、洗浄し、PH7.0の0.1MトリスーHCl緩衝
液30ml中に再懸濁させ、超音波で溶かした。 ｂ 70℃−加熱沈澱 細胞を含んでいない粗製抽出物（38.5ml）を30
分間に、水浴で70℃の温度でインキユベートし
た。この時間の後に沈澱したタンパク質を遠心分
離（40000Gで５℃で30分間）により分離した。 ｃ 濾過による濃縮 70℃の添加沈澱の残分（34.5ml）を、撹拌セル
（米国、デンバー在W.R.Grace Co.社，Amicon
Divisionのモデル8050）中で、４バールの圧力
で、窒素下で、排除限界100000ダルトン（YM
100）の平面膜を通して濾過により濃縮した。 ｄ Mono Ｑでの高速プロテイン液体クロマト
グラフイー（FPLC） 濾過の保持物（4.5ml）を、0.5×５cmのMonoQ
−カラム（スウエーデン国、Pharmacia／LKB
社、Uppsala）に装入し、１ml／分の流れでクロ
マトグラフイーにかけた。アニオン交換体は、試
料供給の前に、PH7.0の0.1MトリスーHCl緩衝液
で平衡化させた。PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝
液中で、０〜0.4Mに直線的に上昇するNaClの勾
配液で溶離した。酵素の溶離は、0.2〜0.25Mの
NaClで行つた。１行程当り0.2mlの試料容量で、
合計14工程行つた。活性フラクシヨンを合わせ、
−20℃で凍結させた。
ル−アミノ酸およびＮ−クロロアセチル−アミノ
酸の中で、もつぱらＮ−アセチル−Ｌ−プロリン
だけがアシラーゼ形成を誘導した。 例３：Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンの精製 ａ コマモナス テストステロニ DSM 5416の
培養および粗製抽出物の取得 コマモナステストステロニDSM5416を傾斜寒
天（西ドイツ国 Darmstadt在、Merk AG社の
カゼインペプトン−大豆粉末ペプトン−寒天）上
で培養し、傾斜寒天試験管１個当り、無菌の0.9
％（ｗ／ｖ）のNaCl溶液4.5mlで懸濁させた。こ
うして得られた細胞懸濁液を、４個のエルレンマ
イヤーフラスコ（2l、４個の差し込み口を有す
る）用の接種物として用い、このフラスコは、例
１に記載したと同様にそれぞれ接種培養基500ml
を有していた。このエルレンマイヤーフラスコを
21時間ラウンドシエイカーで30℃で100rpmでイ
ンキユベートし、細胞を例１に記載したと同様に
収穫し、洗浄し、PH7.0の0.1MトリスーHCl緩衝
液30ml中に再懸濁させ、超音波で溶かした。 ｂ 70℃−加熱沈澱 細胞を含んでいない粗製抽出物（38.5ml）を30
分間に、水浴で70℃の温度でインキユベートし
た。この時間の後に沈澱したタンパク質を遠心分
離（40000Gで５℃で30分間）により分離した。 ｃ 濾過による濃縮 70℃の添加沈澱の残分（34.5ml）を、撹拌セル
（米国、デンバー在W.R.Grace Co.社，Amicon
Divisionのモデル8050）中で、４バールの圧力
で、窒素下で、排除限界100000ダルトン（YM
100）の平面膜を通して濾過により濃縮した。 ｄ Mono Ｑでの高速プロテイン液体クロマト
グラフイー（FPLC） 濾過の保持物（4.5ml）を、0.5×５cmのMonoQ
−カラム（スウエーデン国、Pharmacia／LKB
社、Uppsala）に装入し、１ml／分の流れでクロ
マトグラフイーにかけた。アニオン交換体は、試
料供給の前に、PH7.0の0.1MトリスーHCl緩衝液
で平衡化させた。PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝
液中で、０〜0.4Mに直線的に上昇するNaClの勾
配液で溶離した。酵素の溶離は、0.2〜0.25Mの
NaClで行つた。１行程当り0.2mlの試料容量で、
合計14工程行つた。活性フラクシヨンを合わせ、
−20℃で凍結させた。
【表】
例４：PH値による反応速度の依存性
Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの存在
で、化合物のＮ−アセチル−Ｌ−プロリンから酢
酸を加水分解により分離する反応速度は、反応混
合物のPH値に依存して決めるれる。テストバツチ
は次の組成を有していた： 下記の0.1M緩衝液中のＮ−アセチル−Ｌ−プ
ロリン10mM 2.95ml アシラーゼ 0.05ml アシラーゼ添加による反応の開始の前に、基質
緩衝液混合物のPH値を、0.1Mの酢酸／NaOH緩
衝液において4.0〜5.0の範囲内で、0.1Mのクエン
酸／NaOH緩衝液において5.0〜6.0の範囲内で、
0.1MのK2HPO4／KH2PO4緩衝液において6.0〜
7.5の範囲内で、0.1Mトリス−HCl緩衝液におい
て6.2〜9.0の範囲内で、および1.0MのNa2CO3／
NaHCO3緩衝液において9.0〜10.0の範囲内で、
2N NaOHの添加により、所望のPH値に調節し
た。30℃で10分間の反応時間の後に、酵素活性
を、生成したＬ−プロリンのニンヒドリン検定に
より測定した。 トリス−HCl緩衝液においての反応速度の最適
値は、6.2〜7.2のPH範囲であり、リン酸カリウム
緩衝液においての最適PH値は、＞7.5の範囲である
が、反応速度はトリス−HCl緩衝液と比較して15
％より少ない。リン酸塩は酵素を阻害した。 例５：最適反応温度 PH7.5の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の10mMN
−アセチル−Ｌ−プロリン2.95mlを有する反応バ
ツチを、22〜85℃の温度で10分間にあらかじめ温
度調節し、次いで反応をアシラーゼ0.05mlを添加
することで開始した。５分間の反応時間の後、酵
素活性を生じたＬ−プロリンのニンヒドリン検出
で測定した。 最大反応速度は65℃で達成され、30℃の標準温
度によるよりもフアクター2.3だけ高かつた。 例６：Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの
安定性 ａ PH安定性 Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼのPH安
定性は4.2〜10.4のPH範囲で試験した。FPLC／
Mono Ｑで精製した酵素を、異なるPH値を有す
る0.1Mの異なる緩衝液で10倍に希釈し、３週間
22℃で貯蔵した。異なる時間で試料（0.2ml）を
取り出し、その酵素活性を、次の組成の反応バツ
チ中で測定した： PH7.5の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の10mMN
−アセチル−Ｌ−プロリン 2.8ml アシラーゼ（１：10に希釈） 0.2ml 表１から明らかなように、酵素はクエン酸によ
り急速に失活し、PH7.4および10.4のトリス−HCl
緩衝液およびNa炭酸塩緩衝液中であまり活性度
の損失は確認できなかつた。
で、化合物のＮ−アセチル−Ｌ−プロリンから酢
酸を加水分解により分離する反応速度は、反応混
合物のPH値に依存して決めるれる。テストバツチ
は次の組成を有していた： 下記の0.1M緩衝液中のＮ−アセチル−Ｌ−プ
ロリン10mM 2.95ml アシラーゼ 0.05ml アシラーゼ添加による反応の開始の前に、基質
緩衝液混合物のPH値を、0.1Mの酢酸／NaOH緩
衝液において4.0〜5.0の範囲内で、0.1Mのクエン
酸／NaOH緩衝液において5.0〜6.0の範囲内で、
0.1MのK2HPO4／KH2PO4緩衝液において6.0〜
7.5の範囲内で、0.1Mトリス−HCl緩衝液におい
て6.2〜9.0の範囲内で、および1.0MのNa2CO3／
NaHCO3緩衝液において9.0〜10.0の範囲内で、
2N NaOHの添加により、所望のPH値に調節し
た。30℃で10分間の反応時間の後に、酵素活性
を、生成したＬ−プロリンのニンヒドリン検定に
より測定した。 トリス−HCl緩衝液においての反応速度の最適
値は、6.2〜7.2のPH範囲であり、リン酸カリウム
緩衝液においての最適PH値は、＞7.5の範囲である
が、反応速度はトリス−HCl緩衝液と比較して15
％より少ない。リン酸塩は酵素を阻害した。 例５：最適反応温度 PH7.5の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の10mMN
−アセチル−Ｌ−プロリン2.95mlを有する反応バ
ツチを、22〜85℃の温度で10分間にあらかじめ温
度調節し、次いで反応をアシラーゼ0.05mlを添加
することで開始した。５分間の反応時間の後、酵
素活性を生じたＬ−プロリンのニンヒドリン検出
で測定した。 最大反応速度は65℃で達成され、30℃の標準温
度によるよりもフアクター2.3だけ高かつた。 例６：Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの
安定性 ａ PH安定性 Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼのPH安
定性は4.2〜10.4のPH範囲で試験した。FPLC／
Mono Ｑで精製した酵素を、異なるPH値を有す
る0.1Mの異なる緩衝液で10倍に希釈し、３週間
22℃で貯蔵した。異なる時間で試料（0.2ml）を
取り出し、その酵素活性を、次の組成の反応バツ
チ中で測定した： PH7.5の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の10mMN
−アセチル−Ｌ−プロリン 2.8ml アシラーゼ（１：10に希釈） 0.2ml 表１から明らかなように、酵素はクエン酸によ
り急速に失活し、PH7.4および10.4のトリス−HCl
緩衝液およびNa炭酸塩緩衝液中であまり活性度
の損失は確認できなかつた。
【表】
ｂ 熱安定性
PH7.5の0.1Mトリス−HCl緩衝液に溶かしたア
シラーゼを、30分間20〜85℃の温度でインキユベ
ートした。次いで酵素活性度を30℃で次の組成の
反応バツチ中で測定した： PH7.5の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の10mM Ｎ
−アセチル−Ｌ−プロリン 2.95ml アシラーゼ 0.05ml 70℃で30分間インキユベートした後、酵素の活
性損失は検出できず、しかし高めた温度で酵素は
急速に失活した。 例７：阻害物質および活性化物質の影響 Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンの加水分解的分割
の反応速度に関する。異なる化学的試薬ならびに
金属カチオンおよびアニオンの影響は、30℃で次
の組成の反応バツチ中で測定した： PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の30mM Ｎ
−アセチル−Ｌ−プロリン 1.0ml 前記緩衝液中の３もしくは30mMの阻害物質
1.0ml PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝液 0.95ml アシラーゼ 0.05ml ａ 異なる化学的試薬の影響 表12から、１，10−フエナントロリン、２−メ
ルカプトエタノール、４−クロロメルクリベンゾ
エートおよび４−ヒドロキシメルクリベンゾエー
トはアシラーゼを明らかに阻害することがわかつ
た。基質の添加によつて反応を開始する前に、酵
素を10分間30℃で作用物質と共に前インキユベー
トした。
シラーゼを、30分間20〜85℃の温度でインキユベ
ートした。次いで酵素活性度を30℃で次の組成の
反応バツチ中で測定した： PH7.5の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の10mM Ｎ
−アセチル−Ｌ−プロリン 2.95ml アシラーゼ 0.05ml 70℃で30分間インキユベートした後、酵素の活
性損失は検出できず、しかし高めた温度で酵素は
急速に失活した。 例７：阻害物質および活性化物質の影響 Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンの加水分解的分割
の反応速度に関する。異なる化学的試薬ならびに
金属カチオンおよびアニオンの影響は、30℃で次
の組成の反応バツチ中で測定した： PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の30mM Ｎ
−アセチル−Ｌ−プロリン 1.0ml 前記緩衝液中の３もしくは30mMの阻害物質
1.0ml PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝液 0.95ml アシラーゼ 0.05ml ａ 異なる化学的試薬の影響 表12から、１，10−フエナントロリン、２−メ
ルカプトエタノール、４−クロロメルクリベンゾ
エートおよび４−ヒドロキシメルクリベンゾエー
トはアシラーゼを明らかに阻害することがわかつ
た。基質の添加によつて反応を開始する前に、酵
素を10分間30℃で作用物質と共に前インキユベー
トした。
【表】
【表】
ｂ 異なる金属カチオンの影響
表13から、天然の酵素を、テストした金属カチ
オンにより活性化したものはなかつたことが示さ
れた。Cd2+，Cu2+，Fe2+、Fe3+，Hg2+，Sn2+お
よびZn2+が阻害作用した。基質の添加により反
応を開始する前に、酵素を30℃で10分間作用物質
と共に前インキユベートした。
オンにより活性化したものはなかつたことが示さ
れた。Cd2+，Cu2+，Fe2+、Fe3+，Hg2+，Sn2+お
よびZn2+が阻害作用した。基質の添加により反
応を開始する前に、酵素を30℃で10分間作用物質
と共に前インキユベートした。
【表】
【表】
ｃ 異なるアニオンの影響
表14から、アシラーゼがリン酸塩により著しく
阻害され、炭酸塩および窒素化物により弱く阻害
されることが示された。リン酸塩の阻害機構は非
競争的であつた。基質の添加により反応を開始す
る前に、酵素を30℃で10分間作用物質とともに前
インキユベートした。アニオンの濃度はそれぞれ
10mMである。
阻害され、炭酸塩および窒素化物により弱く阻害
されることが示された。リン酸塩の阻害機構は非
競争的であつた。基質の添加により反応を開始す
る前に、酵素を30℃で10分間作用物質とともに前
インキユベートした。アニオンの濃度はそれぞれ
10mMである。
【表】
ｄ １，10−フエナントロリンにより失活したア
シラーゼ（アポ酵素）に関する異なるカチオン
の影響 FPLC／Mono Ｑ精製した酵素を、１，10−フ
エナントロリンの存在で４℃で24時間インキユベ
ートした。引続き酵素とキレート形成剤の１，10
−フエナントロリンを、Sephadex Ｇ−25M（PD
−10，Pharmacia社／LKB，Upps a1a，スエー
デン国）のゲル濾過により分離した。酵素含有フ
ラクシヨンを合わせ活性度を異なるカチオンの不
在でまたは存在で測定した。 表15から、１，10−フエナントロリンにより失
活したアシラーゼ（アポ酵素）が、Co2+および
Zn2+により、最初の活性度の80％ないし54％ま
で再活性することが示された。ｂに記載したよう
に、Cu2+，Fe2+，Fe3+，Hg2+およびSn2+は阻害
した。これはＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラ
ーゼがコバルトまたは亜鉛依存性の金属酵素であ
ることを意味する。
シラーゼ（アポ酵素）に関する異なるカチオン
の影響 FPLC／Mono Ｑ精製した酵素を、１，10−フ
エナントロリンの存在で４℃で24時間インキユベ
ートした。引続き酵素とキレート形成剤の１，10
−フエナントロリンを、Sephadex Ｇ−25M（PD
−10，Pharmacia社／LKB，Upps a1a，スエー
デン国）のゲル濾過により分離した。酵素含有フ
ラクシヨンを合わせ活性度を異なるカチオンの不
在でまたは存在で測定した。 表15から、１，10−フエナントロリンにより失
活したアシラーゼ（アポ酵素）が、Co2+および
Zn2+により、最初の活性度の80％ないし54％ま
で再活性することが示された。ｂに記載したよう
に、Cu2+，Fe2+，Fe3+，Hg2+およびSn2+は阻害
した。これはＮ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラ
ーゼがコバルトまたは亜鉛依存性の金属酵素であ
ることを意味する。
【表】
例８：分子量および下位単位の数および大きさの
測定 天然の酵素の分子量はSuperose12HR10／30の
ゲル濾過により測定した。FPLCシステム
（Pharmacia社／LKB，Uppsala，スエーデン
国）が結合したカラム（1.0×30cm）を流動速度
0.3ml／分で運転し、その際、FPLC／Mono Ｑ
で精製した酵素0.2mlを試料として使用した。標
準タンパク質としてアプロチニン、キモトリプシ
ノゲンＡ、アルドラーゼ、カタラーゼおよびフエ
リチンを使用した。Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−
アシラーゼの分子量は380000±40000ダルトンで
あつた。 ナトリウムドデシルスルフエート（SDS）の存
在でのゲル電気泳動により酵素の下位単位の数お
よび大きさを測定した。下位単位の分子量は
45000±5000ダルトンである。これはＮ−アシル
−Ｌ−プロリン−アシラーゼが同じ大きさの８個
の下位単位から構成されていることを意味する。
検量線に対して、ホスホリラーゼｂ（ウサギの筋
肉）、アルブミン（ウシ血清）、オバルブミン（ニ
ワトリの卵白）、カルボアンヒドラーゼ（ウシ赤
血球）およびトリプシン阻害剤（大豆）を使用し
た。 例９：アシラーゼ活性度の基質濃度への存在性 Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの存在
下での化合物Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンからの
酢酸の加水分解的分割の反応速度の依存性を、次
の組成の反応バツチで測定した： PH7.0の0.1Mのトリス−HCl緩衝液中のＮ−ア
セチル−Ｌ−プロリン 1.0ml PH7.0の0.1Mのトリス−HCl緩衝液 1.95ml アシラーゼ 0.05ml 反応温度は30℃で、インキユベート時間は10分
であつた。反応バツチのＮ−アセチル−Ｌ−プロ
リン濃度は１〜50mMの範囲で変えた。Ｎ−アセ
チル−Ｌ−プロリンのKM−値は前記の条件下で
5mMであつた。 例10：Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの
基質特異性 ａ 異なるＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸もしくはＮ
−クロロアセチル−Ｌ−アミノ酸の加水分解 アシラーゼの活性は、異なるＮ−アセチル−Ｌ
−アミノ酸もしくはＮ−クロロアセチル−Ｌ−ア
ミノ酸とともに次の組成の反応バツチ中で測定し
た： 20mMのＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸もしくはＮ
−クロロアセチル−Ｌ−アミノ酸 1.0ml PH7.0のトリス−HCl緩衝液 0.95ml アシラーゼ 0.05ml 反応温度は30℃で、インキユベート時間は15分
〜24時間であつた。それぞれ反応バツチ0.2mlに
異なる時間に10％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸
0.2mlを添加し、変性タンパク質を卓上遠心機中
で11000rpmで10分間遠心分離した。上澄み液を、
25％（ｖ／ｖ）の２，２−チオジエタノールおよ
び0.1％のフエノール１：５もしくは１：50を有
するPH2.2の0.1MのNa−シトレート緩衝液で希釈
した。遊離したアミノ酸をアミノ酸分析機（LC
5001，Biotronic社、Maintal，FRG）により定
量的に測定した。表16において＊で示した基質お
よび相応する生成物はHPLCにより定量分析し
た。 比活性の測定のために、Ｎ−アセチル−Ｌ−プ
ロリンを用いた加水分解率は比較可能な反応条件
下で同様に100％に定めた。 表16から明らかなように、Ｎ−アセチル−およ
びＮ−クロロアセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロ
ロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸
ならびにＮ−クロロアセチル−Ｄ，Ｌ−チアゾリ
ジン−２−カルボン酸は有利に加水分解した。そ
の他に、Ｎ−クロロアセチル−Ｄ，Ｌ−ピペコリ
ン酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−メチオニン、Ｎ
−クロロアセチル−Ｌ−バリンならびにＮ−アセ
チル−アラニンも、明らかに遅い反応速度で反応
した。
測定 天然の酵素の分子量はSuperose12HR10／30の
ゲル濾過により測定した。FPLCシステム
（Pharmacia社／LKB，Uppsala，スエーデン
国）が結合したカラム（1.0×30cm）を流動速度
0.3ml／分で運転し、その際、FPLC／Mono Ｑ
で精製した酵素0.2mlを試料として使用した。標
準タンパク質としてアプロチニン、キモトリプシ
ノゲンＡ、アルドラーゼ、カタラーゼおよびフエ
リチンを使用した。Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−
アシラーゼの分子量は380000±40000ダルトンで
あつた。 ナトリウムドデシルスルフエート（SDS）の存
在でのゲル電気泳動により酵素の下位単位の数お
よび大きさを測定した。下位単位の分子量は
45000±5000ダルトンである。これはＮ−アシル
−Ｌ−プロリン−アシラーゼが同じ大きさの８個
の下位単位から構成されていることを意味する。
検量線に対して、ホスホリラーゼｂ（ウサギの筋
肉）、アルブミン（ウシ血清）、オバルブミン（ニ
ワトリの卵白）、カルボアンヒドラーゼ（ウシ赤
血球）およびトリプシン阻害剤（大豆）を使用し
た。 例９：アシラーゼ活性度の基質濃度への存在性 Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの存在
下での化合物Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンからの
酢酸の加水分解的分割の反応速度の依存性を、次
の組成の反応バツチで測定した： PH7.0の0.1Mのトリス−HCl緩衝液中のＮ−ア
セチル−Ｌ−プロリン 1.0ml PH7.0の0.1Mのトリス−HCl緩衝液 1.95ml アシラーゼ 0.05ml 反応温度は30℃で、インキユベート時間は10分
であつた。反応バツチのＮ−アセチル−Ｌ−プロ
リン濃度は１〜50mMの範囲で変えた。Ｎ−アセ
チル−Ｌ−プロリンのKM−値は前記の条件下で
5mMであつた。 例10：Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼの
基質特異性 ａ 異なるＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸もしくはＮ
−クロロアセチル−Ｌ−アミノ酸の加水分解 アシラーゼの活性は、異なるＮ−アセチル−Ｌ
−アミノ酸もしくはＮ−クロロアセチル−Ｌ−ア
ミノ酸とともに次の組成の反応バツチ中で測定し
た： 20mMのＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸もしくはＮ
−クロロアセチル−Ｌ−アミノ酸 1.0ml PH7.0のトリス−HCl緩衝液 0.95ml アシラーゼ 0.05ml 反応温度は30℃で、インキユベート時間は15分
〜24時間であつた。それぞれ反応バツチ0.2mlに
異なる時間に10％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸
0.2mlを添加し、変性タンパク質を卓上遠心機中
で11000rpmで10分間遠心分離した。上澄み液を、
25％（ｖ／ｖ）の２，２−チオジエタノールおよ
び0.1％のフエノール１：５もしくは１：50を有
するPH2.2の0.1MのNa−シトレート緩衝液で希釈
した。遊離したアミノ酸をアミノ酸分析機（LC
5001，Biotronic社、Maintal，FRG）により定
量的に測定した。表16において＊で示した基質お
よび相応する生成物はHPLCにより定量分析し
た。 比活性の測定のために、Ｎ−アセチル−Ｌ−プ
ロリンを用いた加水分解率は比較可能な反応条件
下で同様に100％に定めた。 表16から明らかなように、Ｎ−アセチル−およ
びＮ−クロロアセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロ
ロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸
ならびにＮ−クロロアセチル−Ｄ，Ｌ−チアゾリ
ジン−２−カルボン酸は有利に加水分解した。そ
の他に、Ｎ−クロロアセチル−Ｄ，Ｌ−ピペコリ
ン酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−メチオニン、Ｎ
−クロロアセチル−Ｌ−バリンならびにＮ−アセ
チル−アラニンも、明らかに遅い反応速度で反応
した。
【表】
酸＊
【表】
ｂ 異なるプロリン誘導体の加水分解
アシラーゼの活性をａに記載したと同様に多様
なプロリン誘導体を用いて測定した。 比活性の測定のために、Ｎ−アセチル−Ｌ−プ
ロリンを用いた加水分解率は比較可能な反応条件
下で同様に100％に定めた。 表17から明らかなように、このアシラーゼはＬ
−特異的であつた。それというのもＮ−アセチル
−Ｄ−プロリンは加水分解されなかつたためであ
る。この酵素は、基質結合のため明らかに遊離カ
ルボキシ基が必要である。それというのもＮ−ア
セチル−Ｌ−プロリンアミドおよびＮ−アセチル
−Ｌ−プロリンメチルエステルは加水分解されな
かつたためである。Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−プ
ロリンは、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンよりも
3.6倍だけ早く加水分解した。1/3から1/20だけの
加水分解率は、Ｎ−ホルミル−Ｌ−プロリン、Ｎ
−プロピオオニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチリル
−Ｌ−プロリン、Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリン、
Ｎ−カプロリル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−
Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｎ−ベンジルオキシカ
ルボニル−グリシル−Ｌ−プロリンおよびグリシ
ル−Ｌ−プロリンで得られた。
なプロリン誘導体を用いて測定した。 比活性の測定のために、Ｎ−アセチル−Ｌ−プ
ロリンを用いた加水分解率は比較可能な反応条件
下で同様に100％に定めた。 表17から明らかなように、このアシラーゼはＬ
−特異的であつた。それというのもＮ−アセチル
−Ｄ−プロリンは加水分解されなかつたためであ
る。この酵素は、基質結合のため明らかに遊離カ
ルボキシ基が必要である。それというのもＮ−ア
セチル−Ｌ−プロリンアミドおよびＮ−アセチル
−Ｌ−プロリンメチルエステルは加水分解されな
かつたためである。Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−プ
ロリンは、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンよりも
3.6倍だけ早く加水分解した。1/3から1/20だけの
加水分解率は、Ｎ−ホルミル−Ｌ−プロリン、Ｎ
−プロピオオニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチリル
−Ｌ−プロリン、Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリン、
Ｎ−カプロリル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−
Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｎ−ベンジルオキシカ
ルボニル−グリシル−Ｌ−プロリンおよびグリシ
ル−Ｌ−プロリンで得られた。
【表】
【表】
例11： Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼ
によるＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−プロリンの加水分
解の立体特異性 Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−
Ｄ，Ｌ−プロリンおよびＮ−アセチル−Ｄ−プロ
リンの加水分解は次の組成の反応バツチ中で実施
した： PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の20mM基
質 1.0ml PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝液 0.95ml アシラーゼ 0.05ml この反応バツチを30℃で２時間インキユベート
し、次いで生じたＬ−プロリンの量を、例10に記
載したように、アミノ酸分析により測定した。 表18は、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラー
ゼが、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンを加水分解し
たが、Ｎ−アセチル−Ｄ−プロリンを加水分解し
なかつたことを示した。
によるＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−プロリンの加水分
解の立体特異性 Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチル−
Ｄ，Ｌ−プロリンおよびＮ−アセチル−Ｄ−プロ
リンの加水分解は次の組成の反応バツチ中で実施
した： PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の20mM基
質 1.0ml PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝液 0.95ml アシラーゼ 0.05ml この反応バツチを30℃で２時間インキユベート
し、次いで生じたＬ−プロリンの量を、例10に記
載したように、アミノ酸分析により測定した。 表18は、Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラー
ゼが、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンを加水分解し
たが、Ｎ−アセチル−Ｄ−プロリンを加水分解し
なかつたことを示した。
【表】
例12：Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−プロピ
オニル−Ｌ−プロリンおよびＮ−ブチリル−Ｌ−
プロリンの合成 逆反応の、酢酸とＬ−プロリンとからのＮ−ア
セチル−Ｌ−プロリンの合成を、次の組成の反応
バツチ中で行つた： PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の1M酢酸ナ
トリウム＋5ML−プロリン １ml アシラーゼ（FPLC−精製） １ml この反応バツチを30℃でインキユベートした。
異なる時間で試料を取り出し、一定量の10％
（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を添加し、変性したタ
ンパク質を11000rpmで10分間卓上遠心機で遠心
分離した。残分を、相応する希釈度により溶離剤
でHPCLにより分析した。 ７日間のインキユベート時間の後で、反応バツ
クのＮ−アセチル−Ｌ−プロリン濃度は
0.2mol／ｌで、使用した酢酸ナトリウムの量に
対して40％の収率に相当した。酵素を含まない対
照バツクはＮ−アセチル−Ｌ−プロリンを含有し
ていなかつた。 Ｎ−プロピオニル−Ｌ−プロリンおよびＮ−ブ
チリル−Ｌ−プロリンも同様に、Naプロピオネ
ートもしくはNaブチレートとＬ−プロリンとか
ら合成することができた。Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−
プロリン、Ｎ−フエニルアセチル−Ｌ−プロリン
およびＮ−フエニルプロピオニル−Ｌ−プロリン
の安息香酸ナトリウム、フエニル酢酸ナトリウム
もしくはフエニルプロピオン酸ナトリウム（それ
ぞれ反応バツチ中0.05M）と、Ｌ−プロリンとか
らの合成は成功しなかつた。
オニル−Ｌ−プロリンおよびＮ−ブチリル−Ｌ−
プロリンの合成 逆反応の、酢酸とＬ−プロリンとからのＮ−ア
セチル−Ｌ−プロリンの合成を、次の組成の反応
バツチ中で行つた： PH7.0の0.1Mトリス−HCl緩衝液中の1M酢酸ナ
トリウム＋5ML−プロリン １ml アシラーゼ（FPLC−精製） １ml この反応バツチを30℃でインキユベートした。
異なる時間で試料を取り出し、一定量の10％
（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を添加し、変性したタ
ンパク質を11000rpmで10分間卓上遠心機で遠心
分離した。残分を、相応する希釈度により溶離剤
でHPCLにより分析した。 ７日間のインキユベート時間の後で、反応バツ
クのＮ−アセチル−Ｌ−プロリン濃度は
0.2mol／ｌで、使用した酢酸ナトリウムの量に
対して40％の収率に相当した。酵素を含まない対
照バツクはＮ−アセチル−Ｌ−プロリンを含有し
ていなかつた。 Ｎ−プロピオニル−Ｌ−プロリンおよびＮ−ブ
チリル−Ｌ−プロリンも同様に、Naプロピオネ
ートもしくはNaブチレートとＬ−プロリンとか
ら合成することができた。Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−
プロリン、Ｎ−フエニルアセチル−Ｌ−プロリン
およびＮ−フエニルプロピオニル−Ｌ−プロリン
の安息香酸ナトリウム、フエニル酢酸ナトリウム
もしくはフエニルプロピオン酸ナトリウム（それ
ぞれ反応バツチ中0.05M）と、Ｌ−プロリンとか
らの合成は成功しなかつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 微生物により製造したＮ−アシル−Ｌ−プロ
リン−アシラーゼにおいて、次の特性： １ 反応性： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリンのアセチル基を分
割し、その際、最終生成物として酢酸およびＬ−
プロリンが生じ、酢酸およびＬ−プロリンを縮合
し、その際、最終生成物としてＮ−アセチル−Ｌ
−プロリンおよび水が生じる； ２ 基質特異性： Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−クロロアセ
チル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−プロリ
ン、Ｎ−プロピオニル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチ
リル−Ｌ−プロリン、Ｎ−バレリル−Ｌ−プロリ
ン、Ｎ−カプロイル−Ｌ−プロリン、Ｎ−アセチ
ル−Ｌ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−クロロア
セチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸、Ｎ
−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−２−カル
ボン酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−ピペコリン
酸、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−
Ｌ−プロリン、グリシル−Ｌ−プロリン、Ｎ−ア
セチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ
−メチオニンおよびＮ−クロロアセチル−Ｌ−バ
リンを加水分解する； ３ 最適PH値： 最適PH値は6.8±0.5である； ４ PH安定性： 22℃で３週間にわたりPH7.0〜10.0の範囲内で
良好な安定性を示す； ５ 最適温度： 最適温度は、PH値7.5で65℃である； ６ 温度安定性： 70℃で、PH7.5で30分間インキユベートした後
に、活性度損失は検出されない； ７ 阻害剤および活性化剤の影響： 特に１，10−フエナントロリン、２−メルカプ
トエタノール、４−クロロメルクリベンゾエー
ト、４−ヒドロキシメルクリベンゾエート、
Hg2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+，Sn2+，Zn2+，PO4 3+
が阻害作用し、アポ酵素に関してCo2+および
Zn2+が活性化作用する； ８ 分子量： 分子量は380000±40000ダルトンである； ９ サブユニツト： 分子はそれぞれ45000±5000ダルトンを有する
８個の同じ大きさのサブユニツトからなる； 10 KM値： 基質のＮ−アセチル−Ｌ−プロリンに対する
KM値は5mM（30℃、0.1Mトリス−HCl緩衝液、
PH7.0）である； を有することを特徴とする微生物により製造した
Ｎ−アシル−Ｌ−プロリン−アシラーゼ。 ２ 炭素および窒素の供給源、誘導物質としての
鉱物塩およびＮ−アシル−Ｌ−プロリンを含有
し、コマモナス テストステロニDSM5416を使
用する場合、付加的に、たとえば酵母抽出物とし
て複合体の形ビタミン源を含有する水性培養基中
のコマモナステストステロニDSM5416またはア
ルカリゲネス デニトリフイカンスDSM5417を
出発PH値6.0〜8.0で温度25℃〜35℃で好気的に培
養し、細胞物質を分離し、酵素を細胞から単離す
ることを特徴とする請求項１記載のＮ−アシル−
Ｌ−プロリン−アシラーゼの製造方法。 ３ 請求項１記載のＮ−アシル−Ｌ−プロリン−
アシラーゼを使用して、Ｎ−アセチル−Ｌ−プロ
リン、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−
ホルミル−Ｌ−プロリン、Ｎ−プロピオニル−Ｌ
−プロリン、Ｎ−ブチリル−Ｌ−プロリン、Ｎ−
バレリル−Ｌ−プロリン、Ｎ−カプロイル−Ｌ−
プロリン、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−プロリン、Ｎ
−クロロアセチル−Ｄ，Ｌ−プロリン、Ｎ−ホル
ミル−Ｄ，Ｌ−プロリン、Ｎ−プロピオニル−
Ｄ，Ｌ−プロリン、Ｎ−ブチリル−Ｄ，Ｌ−プロ
リン、Ｎ−バレリル−Ｄ，Ｌ−プロリンまたはＮ
−カプロイル−Ｄ，Ｌ−プロリンからＬ−プロリ
ンならびに Ｎ−アセチル−Ｌ−ピペコリン酸、Ｎ−クロロア
セチル−Ｌ−ピペコリン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ，
Ｌ−ピペコリン酸またはＮ−クロロアセチル−
Ｄ，Ｌ−ピペコリン酸からＬ−ピペコリン酸なら
びに Ｎ−アセチル−Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン
酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−４
−カルボン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チアゾリ
ジン−４−カルボン酸またはＮ−クロロアセチル
−Ｄ，Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸からチ
アゾリジン−４−カルボン酸ならびに Ｎ−アセチル−Ｌ−チアゾリジン−２−カルボン
酸、Ｎ−クロロアセチル−Ｌ−チアゾリジン−２
−カルボン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−チアゾリ
ジン−２−カルボン酸またはＮ−クロロアセチル
−Ｄ，Ｌ−チアゾリジン−２−カルボン酸からチ
アゾリジン−２−カルボン酸を取得する方法およ
びＬ−プロリンおよびそれぞれのカルボン酸から
Ｎ−アセチル−Ｌ−プロリン、Ｎ−プロピオニル
−Ｌ−プロリンおよびＮ−ブチリル−Ｌ−プロリ
ンを製造する方法。
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| JPH03175984A JPH03175984A (ja) | 1991-07-31 |
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