JPH0573388B2 - - Google Patents
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- JPH0573388B2 JPH0573388B2 JP33062587A JP33062587A JPH0573388B2 JP H0573388 B2 JPH0573388 B2 JP H0573388B2 JP 33062587 A JP33062587 A JP 33062587A JP 33062587 A JP33062587 A JP 33062587A JP H0573388 B2 JPH0573388 B2 JP H0573388B2
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- trs40
- neopululanase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2451—Glucanases acting on alpha-1,6-glucosidic bonds
- C12N9/2457—Pullulanase (3.2.1.41)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、多糖体プルラン及びでん粉のα−
1.4および1.6グルコシド結合を切断する能力をも
つネオプルラナーゼ（本願においてネオプルラナ
ーゼとは、後述する通り、バチルスサーモフイル
ムスTRS40が生産するプルラナーゼ類似の酵素
をいう）をコードするプラスミド並びにそのプラ
スミドを有する枯草菌に関するものである。 従来の技術および本発明が解決しようとする
問題点 従来、プルランに作用する酵素としては、プル
ランの末端からグルコース単位で作用するグルコ
アミラーゼ、α−1.6グルコシド結合だけを切断
するプルラナーゼ、プルラン中のα−1.4グルコ
シド結合を切断してイソパノースを与えるイソプ
ルラナーゼ、パノース（62−α−Glucosyl
maltose）を生成するサーモアクチノミセス ヴ
ルガリカス（Thermoactinomyces vulgaricus）
のアミラーゼ（TVA）などが知られている。 本発明の酵素はプルランに作用してパノースを
生成する点ではTVAと同様であるが、同時に本
酵素はグルコース、マルトースを生成する点で全
くTVAと異り、新しい作用特異性をもつ新規酵
素である。また本酵素ではでん粉にも作用しα−
アミラーゼの一種ともいえる。 α−アミラーゼはでん粉糖化産業などにおいて
広く用いられる酵素であるので、本酵素単独乃至
は他の各種酵素と混合使用することにより色々な
用途が開発されるものと期待される。 問題点を解決するための手段および作用 本発明は新規なプラスミド、それを有する枯草
菌及びそれを利用して耐熱性のネオプルラナーゼ
を製造する方法に関するものである。 本発明者等は、プルランを分解し主としてパノ
ースを生成する耐熱性のあるネオプルラナーゼを
分泌するバチルス ステアロサーモフイルス
TRS40を大阪市鶴見区の堆肥より分離したので
あるが、本酵素は従来報告されているどのブルラ
ナーゼともその活性が異つており、本発明者等に
よつてネオプルラナーゼと命名された酵素であ
る。なお、バチルス ステアロサーモーフイルス
TRS40は次のような菌学的性質を有している。 一 形態学的性質 (1) 細胞の形及び大きさ……（0.6〜1.0）×（２
〜3.5）μの桿菌。連鎖性なく莢膜は少い。
加糖肉汁寒天培地では肉汁寒天培地と同一の
桿菌の形を示す。 (2) 運動性……あり。 (3) 胞子……（0.4〜0.5）×（0.5〜0.6）μの長
円形で末端付近に存在し膜壁はうすい。60
℃・16時間で形成するものが多い。胞子のう
のふくらみは認められる。 (4) グラム染色性……陽性。 二 生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養……生育良好。表面はや
や乾き白色に近い。 (2) 肉汁寒天斜面培養……拡布状となり表面の
光沢なし。 (3) 肉汁液体培養……PH7.0で生育良好。液は
混濁する。 (4) ゼラチン穿刺培養……ゼラチンを液化す
る。 (5) 食塩肉汁液体培養……７％の食塩水濃度で
は生育しない。 (6) グルコース・アスパラギン寒天培地……生
育不良。 (7) グルコース・ナイトレイト寒天培地……僅
かに生育。 三 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元……陽性。 (2) でん粉の加水分解……でん粉を含むシヤー
レ上で生育させるときヨード呈色は陰性。 (3) クエン酸の醗酵性……陽性。 (4) カタラーゼの生成……陰性。 (5) 生育の範囲……トリプシン、酵母エキス、
食塩を含む培地で65℃まで生育。最適生育温
度は60℃。 (6) 糖の醗酵性……グルコース、ラクトース、
しよ糖から酸を形成。ただし、ガス発生を伴
わない。 (7) アセチルメチルカルビノールの生成……陽
性。 (8) ゼラチンの分解……陽性。 以上の結果をバージエーのマニアル・オブ・
システマテイツク・バクテリオデターミネーシ
ヨン第２巻（Bergey′s Manual Systematic
Bacteriodetermination vol2.（1986））と照合
して本菌はバチルス ステアロサーモフイルス
（Bacillus stearothermophilus）と同定した。 つぎに本菌株の生産する酵素を詳細に説明す
る。 一 作用及び基質特異性 本酵素はプルランに作用し、最終的にパノー
ス、グルコース、マルトースを生じる。量的に
はパノースが最も多い。 でん粉に作用させると主としてマルトースと
グルコースを生じるが、反応後期には分枝デキ
ストリンとしてパノース及びイソマルトシルマ
ルトース（isomaltosyl maltose 略称IMM）
を生成する。還元糖の生成に較べてヨード呈色
の減少が速やかでα−アミラーゼの一種と考え
られる。一般にα−アミラーゼは比較的でん粉
をよく加水分解する糖化型と、でん粉の液化速
度は大きいが糖化度の低い液化型に大別され
る。そして、前者をでん粉に作用させた場合、
得られる最小の低分子リミツトデキストリンは
IMMである。本発明の酵素はでん粉に作用さ
せると最初からグルコースやマルトースを生成
し、糖化型のグループに属するが、最小のリミ
ツトデキストリンはIMMではなくパノースで
ある。この点において著だ特異なα−アミラー
ゼである。更に、本酵素はプルランとでん粉に
同濃度、同条件で作用させると、プルランに対
してでん粉に対すると同等もしくはそれ以上に
作用する。TVAはでん粉への作用の方がプル
ランへの作用より著しく大きい。この意味で
TVAはα−アミラーゼの一種と考えられるの
に対し、本酵素はプルラナーゼの一種であり、
これを従来のプルラナーゼと区別するため、ネ
オプルラナーゼと命名した。 また、本酵素をβ−サイクロデキストリンに
マルトースがα−1.6グルコシル結合で結合し
たマルトシル−β−サイクロデキストリンに作
用させると、まずそのα−1.6結合を切断し、
マルトースとβ−サイクロデキストリンを生じ
る。ついでβ−サイクロデキストリンも再分解
を受け、グルコース、マルトース及びマルトト
リオースを与える。 即ち、本酵素は主としてマルトースを認識
し、マルトースがα−1.4結合で結合していて
もα−1.6結合で結合していても、その結合を
切断する新しい作用特異性をもつ酵素と考える
ことができる。 二 作用PH PH5.0〜7.5。測定は0.05M酢酸ナトリウム−
酢酸緩衝液（PH４〜６）又はリン酸２ナトリウ
ム−リン酸１カリウム緩衝液（PH６〜８）を用
い、0.5％プルラン中で60℃、15分間反応させ
る。生成した還元糖はDNS法で測定。 三 作用最適PH 前記二の条件でおよそPH6.0。 四 作用温度 0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）、0.5％プルラン
中で各種温度下15分間反応させたところ、75℃
まで反応した。 五 作用最適温度 前記の条件下60〜65℃であつた。 六 熱安定性 0.2M酢酸緩衝液（PH6.0）中で各種温度で60
分間加熱し残存活性を測定したところ、65℃に
おいて60％の活性が残存していた。更にこの系
に１ｍM.EDTAを加えると90％以上活性は残
存した。 七 PH安定性 PH5.5より9.0の間で安定（各種緩衝液を用い
PHを調整し、60℃・60分放置後、PH7.0に調整
し残存活性を測定した）。 八 精製方法 培養上澄液を硫安分画（35〜60％飽和）した
後、沈でん物を少量の水に溶解し透析後、PH
8.0でDEAE−celluloseに吸着させた。ついで
食塩濃度を0.6Mまで漸次上昇させて酵素を溶
出した。さらにセフアデツクスＧ−200のカラ
ムクロマトグラフイーを２回繰返した後、α−
サイクロデキストリンを結合したセフアロース
6B（Sepharose 6B）カラムでアフイニテイク
ロマトグラフイを行つた。 溶出液の蛋白質の吸収は１個のピークを示
し、酵素活性のピークと完全に一致した。この
活性区分をSDS−PAGEにより電気泳動を行う
と単一バンドを示した。 九 分子量 62000dalton（SDS−PAGE法） 十 生産物 プルランからはパノースの他グルコース、マ
ルトースを与えた。また、でん粉からグルコー
ス、マルトース、パノース、IMMを与えた。 十一 力価測定方法 １％プルラン（0.2M酢酸緩衝液（PH6.0）に
溶解）0.25mlに酵素液0.25mlを加え、60℃・15
分間反応させ、生ずる還元力の増加をDNS法
により定量した。上記反応で１分間当り１ｍ
molの還元糖を生ずる酵素力を１単位とした。 以上の理化学的性質から、本発明酵素はこれま
でに報告されたことのない新規なプルラナーゼで
あるといえる。 本発明では、かかる耐熱性のあるネオプルラナ
ーゼの遺伝子をバチルス ステアロサーモフイル
ス、殊にバチルス ステアロサーモフイルス
TRS40から調製し、制限酵素ヒンドを用いて
切断する。ヒンドを使用するのは、酵素の分子
量の大きさ、生成蛋白質の細胞外への分泌に必要
なキヤリア−蛋白質に相当する遺伝情報（シグナ
ル配列）などを有効に保持した遺伝子の断片が得
られるためである。切断処理法は常法による。 切断した断片をシヨツトガン方式でベクタープ
ラスミド、たとえばPTB522（Journal of
General Microbiology、第131巻、第1757頁、
1985年刊行に記載あり）に組換え、枯草菌を宿主
として複製維持できる組換えプラスミドを作成す
る。目的とするプラスミドは、分子量約2.2Mdで
制限酵素Ｅ co RIに対する切断箇所が２ケ所で
あり、Ｅ co RIで処理したときのDNA断片の
分子量が0.8、0.4及び1.0（Md）で示されうる
DNA断片を含む組換えプラスミドである。さら
に具体的には、該DNA断片を前記PTB522に組
込み、本発明者等によつてPPP10と命名された
組換えプラスミドは、遺伝子工学的一般的な手法
により目的物質生産を可能とするための所望性質
（コピー数、薬剤耐性の種類、各種制限酵素の切
断箇所など）を有する。このプラスミドPPP10
の制限酵素地図は添付の第１図に示す。 本願の第２発明（本願の特許請求の範囲第２項
に記載のものをいう。以下おなじ）は、前述の組
換えプラスミドで形質転換せしめた新規の微生物
である。この場合、宿主枯草菌はアミラーゼ生産
能を失つた枯草菌であれば菌株の如何を問わず利
用できる。かかる欠損株は常法により容易に取得
できる。 実施例 実施例 １ （組換えプラスミドの生成と形質転換された枯
草菌の培養） まずバチルス ステアロサーモフイルス
TRS40の染色体DNAを以下により調製する。 バチルス ステアロサーモフイルスTRS40を
100mlＬ培地を含む500ml容フラスコ中で一夜、60
℃で培養した。これを遠心集菌し、20mlのTE緩
衝液（10ｍＭトリス、１ｍＭ・EDTA、PH8.5）
で洗浄し、３mlの15％しよ糖−50ｍＭトリス（PH
8.5）−50M・EDTA−１mg／mlリゾチームに懸濁
し、氷中で30分間静置した。これに３mlの１％ザ
ルコシル−50ｍＭトリス（PH8.5）−50ｍＭ・
EDTAを添加し、混合した。ついで5.4ｇCsClを
加え0.3mlのエチジウムブロマイド液（10mg／ml）
を加え、RP65Tローター（日立製作所製）で超
遠心場で分離した。超遠心終了後、DNA区分を
注射針で抜き取り、ｎ−ブタノールで３回抽出を
繰り返してエチジウムブロマイドを除去した。こ
のDNA試料を10ｍＭトリス（PH7.5）−0.1ｍＭ・
EDTA中で透析し４℃で保存した。 次いで以下の通りに制限酵素及びリガーゼで処
理してベクタープラスミドを調製する。即ち、一
方では枯草菌を宿主として複製維持できるベクタ
ープラスミドPTB522（テトラサイクリン耐性）
を常法により調製し、ついでバチルス ステアロ
サーモフイルスTRS40の染色体DNA及び
PTB522を制限酵素ヒンドで切断する。その反
応条件は次の通りである。 (A)TR40DNA 10×Hind緩衝液 牛血清アルブミン（５mg／ml） 水 Hind溶液 30μ 10μ 2μ 56μ 2μ (B)pTB522 10×Hind緩衝液 牛血清アルブミン（５mg／ml） 水 Hind溶液 10μ 10μ 2μ 76μ 2μ 表中、10×Hind緩衝液とは、100ｍＭトリス
（PH7.4）、100ｍMMgcl2、500ｍMNacl、10ｍＭ
ジチオスレイトールを含む。 上記溶液で37℃・1.5〜２時間反応させる。上
記で得られるＡ、Ｂ、２種類のDNAを混合し、
3M酢酸カリウム20μ加え、その後エタノール
0.45mlを加えて遠心し、上澄を除いた。沈でんは
エタノールで洗浄し、脱水・脱塩し、デシケータ
ーで乾燥した。この乾燥物に２×リガーゼ緩衝液
（132ｍＭトリス（PH7.6）−13.2M・Mgcl2）100μ
、100ｍＭジチオスレイトール20μ、５ｍ
Ｍ・ATP20μ、水60μを加え混合した後、
DNAリガーセ1μを加え、８℃・16時間保ち、
DNA溶液とした。 第３段階としては、上述のベクターを枯草菌に
導入してクローニングする段階である。 バチルス ズブチリスNA1は、通常の変異処
理により得られるアミラーゼ欠損株の１つである
が（日本農芸化学会昭和61年度京都大会にて発
表。講演番号2A−22）、これをＬ培地で一夜培養
した後、その１mlを100ml容フラスコ内のTFI培
地20mlに植菌する。 これを37℃で培養し、対数増殖期を外れてから
１時間後、500ml容フラスコ内のTF培地36mlに
４ml植菌し、1.5時間培養してコンピテント セ
ルを得る。 TF、TF培地は夫々以下の通りである。
1.4および1.6グルコシド結合を切断する能力をも
つネオプルラナーゼ（本願においてネオプルラナ
ーゼとは、後述する通り、バチルスサーモフイル
ムスTRS40が生産するプルラナーゼ類似の酵素
をいう）をコードするプラスミド並びにそのプラ
スミドを有する枯草菌に関するものである。 従来の技術および本発明が解決しようとする
問題点 従来、プルランに作用する酵素としては、プル
ランの末端からグルコース単位で作用するグルコ
アミラーゼ、α−1.6グルコシド結合だけを切断
するプルラナーゼ、プルラン中のα−1.4グルコ
シド結合を切断してイソパノースを与えるイソプ
ルラナーゼ、パノース（62−α−Glucosyl
maltose）を生成するサーモアクチノミセス ヴ
ルガリカス（Thermoactinomyces vulgaricus）
のアミラーゼ（TVA）などが知られている。 本発明の酵素はプルランに作用してパノースを
生成する点ではTVAと同様であるが、同時に本
酵素はグルコース、マルトースを生成する点で全
くTVAと異り、新しい作用特異性をもつ新規酵
素である。また本酵素ではでん粉にも作用しα−
アミラーゼの一種ともいえる。 α−アミラーゼはでん粉糖化産業などにおいて
広く用いられる酵素であるので、本酵素単独乃至
は他の各種酵素と混合使用することにより色々な
用途が開発されるものと期待される。 問題点を解決するための手段および作用 本発明は新規なプラスミド、それを有する枯草
菌及びそれを利用して耐熱性のネオプルラナーゼ
を製造する方法に関するものである。 本発明者等は、プルランを分解し主としてパノ
ースを生成する耐熱性のあるネオプルラナーゼを
分泌するバチルス ステアロサーモフイルス
TRS40を大阪市鶴見区の堆肥より分離したので
あるが、本酵素は従来報告されているどのブルラ
ナーゼともその活性が異つており、本発明者等に
よつてネオプルラナーゼと命名された酵素であ
る。なお、バチルス ステアロサーモーフイルス
TRS40は次のような菌学的性質を有している。 一 形態学的性質 (1) 細胞の形及び大きさ……（0.6〜1.0）×（２
〜3.5）μの桿菌。連鎖性なく莢膜は少い。
加糖肉汁寒天培地では肉汁寒天培地と同一の
桿菌の形を示す。 (2) 運動性……あり。 (3) 胞子……（0.4〜0.5）×（0.5〜0.6）μの長
円形で末端付近に存在し膜壁はうすい。60
℃・16時間で形成するものが多い。胞子のう
のふくらみは認められる。 (4) グラム染色性……陽性。 二 生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養……生育良好。表面はや
や乾き白色に近い。 (2) 肉汁寒天斜面培養……拡布状となり表面の
光沢なし。 (3) 肉汁液体培養……PH7.0で生育良好。液は
混濁する。 (4) ゼラチン穿刺培養……ゼラチンを液化す
る。 (5) 食塩肉汁液体培養……７％の食塩水濃度で
は生育しない。 (6) グルコース・アスパラギン寒天培地……生
育不良。 (7) グルコース・ナイトレイト寒天培地……僅
かに生育。 三 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元……陽性。 (2) でん粉の加水分解……でん粉を含むシヤー
レ上で生育させるときヨード呈色は陰性。 (3) クエン酸の醗酵性……陽性。 (4) カタラーゼの生成……陰性。 (5) 生育の範囲……トリプシン、酵母エキス、
食塩を含む培地で65℃まで生育。最適生育温
度は60℃。 (6) 糖の醗酵性……グルコース、ラクトース、
しよ糖から酸を形成。ただし、ガス発生を伴
わない。 (7) アセチルメチルカルビノールの生成……陽
性。 (8) ゼラチンの分解……陽性。 以上の結果をバージエーのマニアル・オブ・
システマテイツク・バクテリオデターミネーシ
ヨン第２巻（Bergey′s Manual Systematic
Bacteriodetermination vol2.（1986））と照合
して本菌はバチルス ステアロサーモフイルス
（Bacillus stearothermophilus）と同定した。 つぎに本菌株の生産する酵素を詳細に説明す
る。 一 作用及び基質特異性 本酵素はプルランに作用し、最終的にパノー
ス、グルコース、マルトースを生じる。量的に
はパノースが最も多い。 でん粉に作用させると主としてマルトースと
グルコースを生じるが、反応後期には分枝デキ
ストリンとしてパノース及びイソマルトシルマ
ルトース（isomaltosyl maltose 略称IMM）
を生成する。還元糖の生成に較べてヨード呈色
の減少が速やかでα−アミラーゼの一種と考え
られる。一般にα−アミラーゼは比較的でん粉
をよく加水分解する糖化型と、でん粉の液化速
度は大きいが糖化度の低い液化型に大別され
る。そして、前者をでん粉に作用させた場合、
得られる最小の低分子リミツトデキストリンは
IMMである。本発明の酵素はでん粉に作用さ
せると最初からグルコースやマルトースを生成
し、糖化型のグループに属するが、最小のリミ
ツトデキストリンはIMMではなくパノースで
ある。この点において著だ特異なα−アミラー
ゼである。更に、本酵素はプルランとでん粉に
同濃度、同条件で作用させると、プルランに対
してでん粉に対すると同等もしくはそれ以上に
作用する。TVAはでん粉への作用の方がプル
ランへの作用より著しく大きい。この意味で
TVAはα−アミラーゼの一種と考えられるの
に対し、本酵素はプルラナーゼの一種であり、
これを従来のプルラナーゼと区別するため、ネ
オプルラナーゼと命名した。 また、本酵素をβ−サイクロデキストリンに
マルトースがα−1.6グルコシル結合で結合し
たマルトシル−β−サイクロデキストリンに作
用させると、まずそのα−1.6結合を切断し、
マルトースとβ−サイクロデキストリンを生じ
る。ついでβ−サイクロデキストリンも再分解
を受け、グルコース、マルトース及びマルトト
リオースを与える。 即ち、本酵素は主としてマルトースを認識
し、マルトースがα−1.4結合で結合していて
もα−1.6結合で結合していても、その結合を
切断する新しい作用特異性をもつ酵素と考える
ことができる。 二 作用PH PH5.0〜7.5。測定は0.05M酢酸ナトリウム−
酢酸緩衝液（PH４〜６）又はリン酸２ナトリウ
ム−リン酸１カリウム緩衝液（PH６〜８）を用
い、0.5％プルラン中で60℃、15分間反応させ
る。生成した還元糖はDNS法で測定。 三 作用最適PH 前記二の条件でおよそPH6.0。 四 作用温度 0.1Mリン酸緩衝液（PH6.0）、0.5％プルラン
中で各種温度下15分間反応させたところ、75℃
まで反応した。 五 作用最適温度 前記の条件下60〜65℃であつた。 六 熱安定性 0.2M酢酸緩衝液（PH6.0）中で各種温度で60
分間加熱し残存活性を測定したところ、65℃に
おいて60％の活性が残存していた。更にこの系
に１ｍM.EDTAを加えると90％以上活性は残
存した。 七 PH安定性 PH5.5より9.0の間で安定（各種緩衝液を用い
PHを調整し、60℃・60分放置後、PH7.0に調整
し残存活性を測定した）。 八 精製方法 培養上澄液を硫安分画（35〜60％飽和）した
後、沈でん物を少量の水に溶解し透析後、PH
8.0でDEAE−celluloseに吸着させた。ついで
食塩濃度を0.6Mまで漸次上昇させて酵素を溶
出した。さらにセフアデツクスＧ−200のカラ
ムクロマトグラフイーを２回繰返した後、α−
サイクロデキストリンを結合したセフアロース
6B（Sepharose 6B）カラムでアフイニテイク
ロマトグラフイを行つた。 溶出液の蛋白質の吸収は１個のピークを示
し、酵素活性のピークと完全に一致した。この
活性区分をSDS−PAGEにより電気泳動を行う
と単一バンドを示した。 九 分子量 62000dalton（SDS−PAGE法） 十 生産物 プルランからはパノースの他グルコース、マ
ルトースを与えた。また、でん粉からグルコー
ス、マルトース、パノース、IMMを与えた。 十一 力価測定方法 １％プルラン（0.2M酢酸緩衝液（PH6.0）に
溶解）0.25mlに酵素液0.25mlを加え、60℃・15
分間反応させ、生ずる還元力の増加をDNS法
により定量した。上記反応で１分間当り１ｍ
molの還元糖を生ずる酵素力を１単位とした。 以上の理化学的性質から、本発明酵素はこれま
でに報告されたことのない新規なプルラナーゼで
あるといえる。 本発明では、かかる耐熱性のあるネオプルラナ
ーゼの遺伝子をバチルス ステアロサーモフイル
ス、殊にバチルス ステアロサーモフイルス
TRS40から調製し、制限酵素ヒンドを用いて
切断する。ヒンドを使用するのは、酵素の分子
量の大きさ、生成蛋白質の細胞外への分泌に必要
なキヤリア−蛋白質に相当する遺伝情報（シグナ
ル配列）などを有効に保持した遺伝子の断片が得
られるためである。切断処理法は常法による。 切断した断片をシヨツトガン方式でベクタープ
ラスミド、たとえばPTB522（Journal of
General Microbiology、第131巻、第1757頁、
1985年刊行に記載あり）に組換え、枯草菌を宿主
として複製維持できる組換えプラスミドを作成す
る。目的とするプラスミドは、分子量約2.2Mdで
制限酵素Ｅ co RIに対する切断箇所が２ケ所で
あり、Ｅ co RIで処理したときのDNA断片の
分子量が0.8、0.4及び1.0（Md）で示されうる
DNA断片を含む組換えプラスミドである。さら
に具体的には、該DNA断片を前記PTB522に組
込み、本発明者等によつてPPP10と命名された
組換えプラスミドは、遺伝子工学的一般的な手法
により目的物質生産を可能とするための所望性質
（コピー数、薬剤耐性の種類、各種制限酵素の切
断箇所など）を有する。このプラスミドPPP10
の制限酵素地図は添付の第１図に示す。 本願の第２発明（本願の特許請求の範囲第２項
に記載のものをいう。以下おなじ）は、前述の組
換えプラスミドで形質転換せしめた新規の微生物
である。この場合、宿主枯草菌はアミラーゼ生産
能を失つた枯草菌であれば菌株の如何を問わず利
用できる。かかる欠損株は常法により容易に取得
できる。 実施例 実施例 １ （組換えプラスミドの生成と形質転換された枯
草菌の培養） まずバチルス ステアロサーモフイルス
TRS40の染色体DNAを以下により調製する。 バチルス ステアロサーモフイルスTRS40を
100mlＬ培地を含む500ml容フラスコ中で一夜、60
℃で培養した。これを遠心集菌し、20mlのTE緩
衝液（10ｍＭトリス、１ｍＭ・EDTA、PH8.5）
で洗浄し、３mlの15％しよ糖−50ｍＭトリス（PH
8.5）−50M・EDTA−１mg／mlリゾチームに懸濁
し、氷中で30分間静置した。これに３mlの１％ザ
ルコシル−50ｍＭトリス（PH8.5）−50ｍＭ・
EDTAを添加し、混合した。ついで5.4ｇCsClを
加え0.3mlのエチジウムブロマイド液（10mg／ml）
を加え、RP65Tローター（日立製作所製）で超
遠心場で分離した。超遠心終了後、DNA区分を
注射針で抜き取り、ｎ−ブタノールで３回抽出を
繰り返してエチジウムブロマイドを除去した。こ
のDNA試料を10ｍＭトリス（PH7.5）−0.1ｍＭ・
EDTA中で透析し４℃で保存した。 次いで以下の通りに制限酵素及びリガーゼで処
理してベクタープラスミドを調製する。即ち、一
方では枯草菌を宿主として複製維持できるベクタ
ープラスミドPTB522（テトラサイクリン耐性）
を常法により調製し、ついでバチルス ステアロ
サーモフイルスTRS40の染色体DNA及び
PTB522を制限酵素ヒンドで切断する。その反
応条件は次の通りである。 (A)TR40DNA 10×Hind緩衝液 牛血清アルブミン（５mg／ml） 水 Hind溶液 30μ 10μ 2μ 56μ 2μ (B)pTB522 10×Hind緩衝液 牛血清アルブミン（５mg／ml） 水 Hind溶液 10μ 10μ 2μ 76μ 2μ 表中、10×Hind緩衝液とは、100ｍＭトリス
（PH7.4）、100ｍMMgcl2、500ｍMNacl、10ｍＭ
ジチオスレイトールを含む。 上記溶液で37℃・1.5〜２時間反応させる。上
記で得られるＡ、Ｂ、２種類のDNAを混合し、
3M酢酸カリウム20μ加え、その後エタノール
0.45mlを加えて遠心し、上澄を除いた。沈でんは
エタノールで洗浄し、脱水・脱塩し、デシケータ
ーで乾燥した。この乾燥物に２×リガーゼ緩衝液
（132ｍＭトリス（PH7.6）−13.2M・Mgcl2）100μ
、100ｍＭジチオスレイトール20μ、５ｍ
Ｍ・ATP20μ、水60μを加え混合した後、
DNAリガーセ1μを加え、８℃・16時間保ち、
DNA溶液とした。 第３段階としては、上述のベクターを枯草菌に
導入してクローニングする段階である。 バチルス ズブチリスNA1は、通常の変異処
理により得られるアミラーゼ欠損株の１つである
が（日本農芸化学会昭和61年度京都大会にて発
表。講演番号2A−22）、これをＬ培地で一夜培養
した後、その１mlを100ml容フラスコ内のTFI培
地20mlに植菌する。 これを37℃で培養し、対数増殖期を外れてから
１時間後、500ml容フラスコ内のTF培地36mlに
４ml植菌し、1.5時間培養してコンピテント セ
ルを得る。 TF、TF培地は夫々以下の通りである。
【表】
このコンピテント セル１mlに前述により得ら
れたDNA溶液を混合し、37℃・30分間激しく振
盪培養後、遠心集菌し、Ｌ培地１mlを加えて37
℃・1.5時間振盪培養する。その培養液を100μ
づつテトラサイクリン25μｇ／mlを含む寒天平板
に塗抹し、37℃１夜培養し、形質転換体を得た。 この形質変換体をPLL寒天平板（１％プルラ
ン、0.2％トリプトン、0.2％イーストエキス、0.2
％Nacl、1.5％寒天（PH7.3））にレプリカし、37
℃１夜培養後、平板上にエタノールを注ぎ数時間
放置し、ハローを形成するコロニーを取得した。
このクローン株の保持する組換えプラスミドを
pPP10と命名した。 実施例 ２ （ネオプルラナーゼの製造） 実施例１により得られたpPP10を保持するバチ
ルス ズブチリスNA1を2.5％可溶性でん粉を含
むＬ培地（25μｇ／mlテトラサイクリン含有）に
て37℃・24時間培養した。培養液を遠心分離して
上澄を採り60℃・15分間加熱処理をした。この段
階で培養上澄液中の蛋白質は殆んど耐熱製のネオ
プルラナーゼのみであることが、SDSポリアクリ
ルアミド電気永動により確認された。 ネオプルラナーゼ活性測定法により関連菌株を
測定したところ、次のようであつた。
れたDNA溶液を混合し、37℃・30分間激しく振
盪培養後、遠心集菌し、Ｌ培地１mlを加えて37
℃・1.5時間振盪培養する。その培養液を100μ
づつテトラサイクリン25μｇ／mlを含む寒天平板
に塗抹し、37℃１夜培養し、形質転換体を得た。 この形質変換体をPLL寒天平板（１％プルラ
ン、0.2％トリプトン、0.2％イーストエキス、0.2
％Nacl、1.5％寒天（PH7.3））にレプリカし、37
℃１夜培養後、平板上にエタノールを注ぎ数時間
放置し、ハローを形成するコロニーを取得した。
このクローン株の保持する組換えプラスミドを
pPP10と命名した。 実施例 ２ （ネオプルラナーゼの製造） 実施例１により得られたpPP10を保持するバチ
ルス ズブチリスNA1を2.5％可溶性でん粉を含
むＬ培地（25μｇ／mlテトラサイクリン含有）に
て37℃・24時間培養した。培養液を遠心分離して
上澄を採り60℃・15分間加熱処理をした。この段
階で培養上澄液中の蛋白質は殆んど耐熱製のネオ
プルラナーゼのみであることが、SDSポリアクリ
ルアミド電気永動により確認された。 ネオプルラナーゼ活性測定法により関連菌株を
測定したところ、次のようであつた。
【表】
組換えプラスミドpPP10を保持するバチルス
ズブチリスNAより得たネオプルラナーゼは、
60℃、65℃で夫々60分間熱処理したところ、夫々
90％以上、60％程度の酵素活性を維持しており、
耐熱性に富むことが確認された。 本発明の効果 一般に好熱菌であるバチルス ステアロサーモ
フイルスは、枯草菌に較べ培養時の最終菌体濃度
が低く、菌体生産物を大量に取得するのが比較的
困難である。そこで本発明ではバチルス ステア
ロサーモフイルス中の耐熱性酵素であるネオプル
ラナーゼの遺伝子を枯草菌に組込むことにより、
ネオプルラナーゼを大量に取得することを可能と
したものである。就中、バチルス ステアロサー
モフイルスTRS40のDNAをヒンドにより処理
して得られるDNA断片をpTB522に組込んだバ
チルス ズブチリスNA1は本願発明を効果的に
実現可能とするものである。しかして本発明によ
るときは、宿主菌にα−アミラーゼ及びプロテア
ーゼ欠損の変異株であるバチルス ズブチリス
NA1を用いるので、培養液に含まれる菌体外
分泌酵素は殆んど本菌株にクローン化された耐熱
性のネオプルラナーゼのみとなり、その遺伝子が
増幅されることにより、当該酵素の生産性を顕著
に向上せしめ得ることや、中温菌に好熱菌の遺伝
子がクローン化されたことにより、たとえば60
℃・15分間の加熱処理により培養液中の耐熱性
のネオプルラナーゼ以外の蛋白質は殆んど変性沈
でんしてしまうことから、目的酵素の濃縮・精製
はバチルス ステアロサーモフイルスTRS40を
培養しこれから本件酵素を濃縮・精製することよ
りも遥かに簡便・効率的に行うことができる。
ズブチリスNAより得たネオプルラナーゼは、
60℃、65℃で夫々60分間熱処理したところ、夫々
90％以上、60％程度の酵素活性を維持しており、
耐熱性に富むことが確認された。 本発明の効果 一般に好熱菌であるバチルス ステアロサーモ
フイルスは、枯草菌に較べ培養時の最終菌体濃度
が低く、菌体生産物を大量に取得するのが比較的
困難である。そこで本発明ではバチルス ステア
ロサーモフイルス中の耐熱性酵素であるネオプル
ラナーゼの遺伝子を枯草菌に組込むことにより、
ネオプルラナーゼを大量に取得することを可能と
したものである。就中、バチルス ステアロサー
モフイルスTRS40のDNAをヒンドにより処理
して得られるDNA断片をpTB522に組込んだバ
チルス ズブチリスNA1は本願発明を効果的に
実現可能とするものである。しかして本発明によ
るときは、宿主菌にα−アミラーゼ及びプロテア
ーゼ欠損の変異株であるバチルス ズブチリス
NA1を用いるので、培養液に含まれる菌体外
分泌酵素は殆んど本菌株にクローン化された耐熱
性のネオプルラナーゼのみとなり、その遺伝子が
増幅されることにより、当該酵素の生産性を顕著
に向上せしめ得ることや、中温菌に好熱菌の遺伝
子がクローン化されたことにより、たとえば60
℃・15分間の加熱処理により培養液中の耐熱性
のネオプルラナーゼ以外の蛋白質は殆んど変性沈
でんしてしまうことから、目的酵素の濃縮・精製
はバチルス ステアロサーモフイルスTRS40を
培養しこれから本件酵素を濃縮・精製することよ
りも遥かに簡便・効率的に行うことができる。
第１図……ベクタープラスミドpTB522を用い
て調製した組換えプラスミドpPP10の制限酵素地
図、図中、太線で示した2.2Mdのヒンド断片に
相当する部分は、バチルス ステアロサーモフイ
ルスTRS40由来の耐熱性ネオプルラナーゼ遺伝
子である。ただし、円内の数字は分子サイズを
Mdで表わしたもの。
て調製した組換えプラスミドpPP10の制限酵素地
図、図中、太線で示した2.2Mdのヒンド断片に
相当する部分は、バチルス ステアロサーモフイ
ルスTRS40由来の耐熱性ネオプルラナーゼ遺伝
子である。ただし、円内の数字は分子サイズを
Mdで表わしたもの。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ バチルス ステアロサーモフイルス（Bacil
−lus stearothermophilus）TRS40（微工研菌寄
託第9609号）の染色体DNAを制限酵素ヒンド
（Hind ）により処理して得られるネオプルラ
ナーゼをコードするDNA断片とヒンドで処理
して得られたベクター断片とを結合させた分子量
2.2Mdの組換えDNAを枯草菌を宿主として複製
維持されたことを特徴とする組換えプラスミド。 ２ バチルス ステアロサーモフイルスTRS40
の染色体DNAを制限酵素ヒンドにより処理し
て得られるネオプルラナーゼをコードするDNA
断片とヒンドで処理して得られたベクター断片
とを結合させた分子量2.2Mdの組換えDNAを複
製維持した宿主であることを特徴とする形質転換
された枯草菌。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33062587A JPH01171488A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 組換えプラスミド及びそれにより形質転換された枯草菌 |
| JP5085761A JPH0691818B2 (ja) | 1987-12-25 | 1993-03-18 | 形質転換された枯草菌によるネオプルラナーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33062587A JPH01171488A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 組換えプラスミド及びそれにより形質転換された枯草菌 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5085761A Division JPH0691818B2 (ja) | 1987-12-25 | 1993-03-18 | 形質転換された枯草菌によるネオプルラナーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01171488A JPH01171488A (ja) | 1989-07-06 |
| JPH0573388B2 true JPH0573388B2 (ja) | 1993-10-14 |
Family
ID=18234755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33062587A Granted JPH01171488A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 組換えプラスミド及びそれにより形質転換された枯草菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01171488A (ja) |
-
1987
- 1987-12-25 JP JP33062587A patent/JPH01171488A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01171488A (ja) | 1989-07-06 |
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