JPS6225977A

JPS6225977A - 新規なアミラ−ゼ

Info

Publication number: JPS6225977A
Application number: JP60143518A
Authority: JP
Inventors: Yoshiyuki Takasaki; 高崎　義幸
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-06-29
Filing date: 1985-06-29
Publication date: 1987-02-03
Also published as: JPH0155877B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔技術分野〕本発明はハシルス属細菌の生産する新規なアミラーゼに
関するものである。

、！′・１−ｉ−アミラーゼやα−アミラーゼは自然界に広く存
在することが知られているが、より分子量の大きい、例
えば、マルトトリオース（Ｇ３）。

マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ
５）マルトヘキサオース（Ｇ６）などのオリゴ糖単位で
切断するアミラーゼについての報告は少ない。

こわらオリゴ糖は、食品の増量剤、賦形剤あるいは１ｒ
味調整剤として注目されている。特に、０４〜Ｇ７の各
オリゴ糖ば、診断用アミラーゼの活性測定用基質として
も注目されている。

〔目的及び効果〕

本発明者は、これらオリゴ糖の製法を確立することを目
的として、広（自然界より漱住物の検索を行ってきた結
果、アミロース、アミロペクチン５澱粉などのα−グル
カンを特異的にマルトテトラオース（Ｇ４）に加水分解
する新規なアミラーゼがバシルス・ザーキュランス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）と同定した細
菌により生産らマルトテトラオース単位で加水分解する
ことが知られている。

しかし、この酵素はアミロペクチンやグリコーゲンから
は高分子量のりミツトデキストリンを残すと報告されて
いる。〔アーカイブ　バイオケミストリー　アンド　バ
イオフィジクス（ＡｒｃｈｉｖｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）１４５巻１
０５頁（１９７１））。そして、この酵素による澱粉か
らのマルトテトラオースの収量は約５５％、アミロペク
チンからの収量は５２％、と報告されている〔アメリカ
合衆国特許ＵＳＰ３．６５４．０Ｂ２．　　（１９７２
）、アミラーゼ　シンポジウム、６巻、３１頁（１９７
１））。

しかるに、本発明のハシルス属細菌の生産するアミラー
ゼは、澱粉から約６５％〜７５％の極めて高い収量でマ
ルトテトラオースを生成することが認められた。マルト
テトラオースの収量は、使用する澱粉の種類、液化度（
ＤＢ）　、酵素量などにより影響されるが、通常、グル
コース１〜５％、マルトース５〜１５％第１表マルトトリオース５〜１５％、マルトテトラオース６５
〜７５％、マルトペンタオース１〜５％、その他の？！
頻１〜１５％である。

たとえば、０６４２％のポテトスターチを使用したとき
のＩ！組成は第１表に示す通りである。

表から明らかなように、本発明の酵素は、澱粉に作用さ
セたとき、高分子蓋のりミツトデキストリンを殆ど残す
ことなく、澱粉からマルトテトラオースを極めて高い収
量で生成する。

これは、本発明の酵素がシュードモナス　スッツエリの
酵素とは、基質特異性において著しく異なった酵素とい
うことができる。この他、本発明の酵素はシュードモナ
ス　スッツエリの酵素に比べ、最適作用ｐＨ知見に基づ
いてなされたものである。

〔横　成〕

本発明は、澱粉から主成分としてマルトテトラオースを
約６５〜７５％の収量で生成する新規なアミラーゼＧ４
に関するものである。

以下に、本発明の内容を、更に具体的に説明する。

本発明により生産される酵素は、下記の酵素的性質を有
する。

＋１１　　作用；アミロース、アミロペクチン、グリコ
ーゲンなどのα−グルカンをマルトテトラオースを主成
分とする分解物に分解する。

本酵素はエンド型の分解様式を持つα−アミラーゼの一
種であり、液化澱粉に作用させるとき、約６５〜７５％
の収量でマルトテトラオースが得られる。

（２）作用温度範囲及び最適作用温度；１％可溶性澱粉
、０．０５Ｍリン酸緩衝液の下で作用させたとき約７５
℃まで作用し、最適作用温度は約５０℃である。（第１
図（ａ））。

（３）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐ　Ｈ；約４〜約１２
の広い範囲に作用す−〜合、５０℃、１０分間の加熱で
約４０％失活し、５５℃、１０分間の加１、−１後、残存活性を測定した。その結果、ｐＨ６〜９範囲で
安定であった〔第１図（ｄ）〕。

（６）安定化；カルシウムイオンが存在するとき、熱安
定性の増加が認められた〔第１図（Ｃ）の破線〕。

（７）阻害剤；本酵素は、５Ｘ１０−３ＭのＨｇＣ１，
、Ｃｕ５Ｏ，、ＺｎＳＯ４、ＡｇＮＯ３により、それぞ
れ、約１００％、約９５％、約５０％、約３０％阻害さ
れた。

（８）精製方法；本酵素は、液体培養物の遠心上澄液か
ら、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）カラム　クロマトグラフィーとバイオゲル（Ｂ
ｉｏｇｅｌ）Ａｏ、５ｍカラム　クロマトグラフィー及
び同ゲルによる再クロマトグラフィーにより電気泳動的
に均一まで精製することができる。

（９）分子量；バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）Ａｏ、５ｍ
を用いたゲル濾過法により測定した分子量は約１万であ
った。

−ｆｉｌ最適作用ｐＨは、本発明の酵素はｐＨ６〜８．
５の広いｐＨ範囲にあるのに対し、シェードモナス　ス
ツツエリ酵素はｐＨ８付近にあること、（２）本発明の
酵素を澱粉に作用させたとき、約６５〜７５％の収量で
マルトテトラオースが得られるのに対し、シュードモナ
ス　スツヅエリの酵素の場合は約５５％であること、（
３）本発明の酵素の分子量は１万前後にあるのに対し、
シュードモナス　スツツエリの酵素は、４８，０００と
５８．０００にある〔バイオケミストリー　アンド　バ
イオフィジクスアクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍｔｓｔｒｙ　　
ａｎｄＲｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　　Ａｃｔａ）５６６巻、
８８頁（１９７９））など、本発明の酵素とシュードモ
ナス　スッツエリの酵素とは、澱む）からのマルトテト
ラオースの収量、最適作用ｐ　ｔ［、分子量などの性質
において、顕著な違いのあるものであり、新規な酵素と
いうことができる。

本発明の酵素を生産する例示菌として、ハシルス　勺−
キ１ランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
）Ｇ−４を挙げる。本閑の菌（３）肉汁；混濁、沈降す
る。

（４）肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色、周辺及び表
面凹凸あり。

（５）グルコース肉汁寒天；生育良好、淡黄〜淡褐色。

（６）グルコース硝酸寒天；生育悪い。

（７）ボテ［；生育良好、乳白色に生育。

（８）グルコース・アスパラギン寒天；生育あまり良く
ない。淡黄〜黄褐色。

（９）チロシン寒天；良く生育する、わずかに褐色。

（１０）ミルク；ゆっくり凝固、ペプトン化。

（１１）インドール；生成しない。

（１２）カタラーゼ；生成する。

（Ｉ３）アセチルメチルカルビノール；生成しない。

（１４）硫化水素；生成しない。

（１５）クエン酸；利用する。

（１６）硝酸塩の還元；陰性。

（１７）クエン酸；利用する。

（１８）食塩肉汁；８％食塩含有培地までよ（生育し、
１０％食塩でも少し生育する。

（１９）　炭水化物の利用；Ｄ−グルコース、Ｄ−フラ
クトース、Ｄ−マン（２０）最適生育温度；２６℃前後
。

（２１）最高生育温度；約６０℃ （２２）死滅温度；１００℃で３０分間加熱しても死滅
しない。

以上の菌学的性質について、バージェイス　マニュアル
　オプ　テタミネーティブ　バクテリオロジ−（Ｂｅｒ
ｇｅｙｌ　ｓ　　Ｍａｎｎｕａｌｏｆ　　Ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）の第７
版及び第８版〔ザ　ウィリアムス　アンド　ゥイルキン
ス　カンパニー（Ｔｈｅ　　Ｗｉ　　Ｉ　　Ｉ　　ｉａ
ｍｓ　　　ａｎｄ　　Ｗｉ　　ＩｋｉｎｓＣｏｍｐａｎ
ｙ）、（１９５７年及び１９７４年）を参照し７、本菌
をノ＼シルス　す−キュランス（１３ａｃｉｌｌｕｓ　
　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の一種と同定し、ハシルス　サ
ーキュランスＧ−４と命名した。

本発明によるアミラーゼＧ４を生産するための培養は、
窒素源として肉エキス、ペプトン２酵母エキス、カゼイ
ン、コーン・ヌティーブ・す２．）カー、大豆粕など、
通常、微生物の培養に対し良く用いられる有機窒素ｌｉ
ｔい源が使用され、炭素源としては、澱粉、デキストリン、
マルトース、グ、：１゛仁−８１，２，−ウ、。−、、
、，１，！、、ヵ、０．□あわ、６゜や、７、。わ、。

６１．６−お”−養源として、無機窒素源、リン酸塩、
マグネシウム塩と各種金属塩を蒼む培地が使用される。

培養はｒ、　Ｈ５〜９、温度２０〜６０℃で好気的に行
われる。

アミラーゼＧ４は、菌体外に生産される酵素であるので
、培養終了後、濾過または遠心分離により除菌し、上澄
液を回収する。必要により濃縮し、硫安、硫酸ナトリウ
ムによる塩析によるか、または、アセトン、イソプロパ
ツール、エタノール、メタノールなどの有機溶媒を加え
て、酵素を沈澱物として収得し、乾燥、保存する。

アミラーゼＧ４を用いて、澱粉を糖化する反応は次のよ
うにして行う。

澱粉は、酸または、α−アミラ〜ゼにより液化される。

液化度はマルトテトラオースの収量に影響するので、望
ましくはｒ）Ｅ２０以下の液化澱わ）が使用される（Ｄ
Ｅは固形分中の還元力をグルコースとして表した百分率
）。基質濃度は、通常、５〜４０％で行われる。反応ｐ
Ｈは、通常５〜９、温度は４０〜６０℃である。本酵素
は、カルシウムイオンの存在により、著しく熱安定化さ
れるので、糖化反応に際して、５１０−’〜２Ｘ１０−
ｇＭ程度のカルシウム塩が添加される。

アミラーゼＧ４による、澱粉、アミロペクチン、グリコ
ーゲンなどα−１，６−グルコシド結合の分岐をもつ基
質を用いる糖化反応においては、イソアミラーゼ、ブル
ナラーゼなどのα−１，６−グルジダーゼの存在下で反
応を行うと、徳化反応を促進するため、アミラーゼＧ４
を節減したり、また、マルトテトラオースの収量を増加
することができる。

角フラスコに入れ、１２０℃で１０分間殺菌したのち、
バチルス・サーキュランスＧ４（ａｔ工研条寄第８２０
号）を接種し、３０℃で４日間振盪培養（１６０ｒｐｍ
）Ｌ、た。

培養後、遠心分離して得た上澄液について生産されたア
ミラーゼＧ４を測定した結果、培地１ｍｊｌ当たり６．
４単位であった。

実施例　２実施例１で得られた酵素液を使用して、澱粉の糖化を行
った。

基質としては、ＤＦ、４．２の液化澱粉１００ｒｎｌ；
（固形分）に、塩化カルシウム５×１０″３Ｍとアミラ
ーゼＧ４を基質１ｇ当たり２単荀加えたもの、及びこれ
にクレブシラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属のプルラナー
ゼ（ナガセ生化学製）を基質１ｇ当たり、２中１１″！
すたＬＪ５単位加え、水で全音１　ｍ　ｊ！とじて、５
０で反応させた。反応開始後、２０時間目“１と４４時
間目に一定屡を採り、生成したフル１−テ１ラオースを
高速液体クロマトグラフ法により定量した。結果を第２
表に示す。

第　　　　２　　　　表り′１表から明らかなように、アミラーゼＧ４を用いて、澱粉
を糖化する反応において、プルラナーゼを共存させて糖
化反応を行うと、糖化反応が促進され、アミラーゼＧ４
単独の場合よりも、マルトテ１ラオース含量の高い糖化
物が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）、　　（ｂ）、　　（Ｃ）と（ｄ）はそれ
ぞれ、アミラーゼＧ４（’／、）吋刹↓γ１（・１．戸（（事移叶ケ２−國別紙官庁出願手続ネ市ｊＦ書（自発）昭和６１年８月２２日１、事件の表示　　　昭和６０年特許願第　　１４３５
１８号２、発明の名称新規なアミラーゼ３、補正をする者氏　　名　　（１１４）工業技術院長　飯　塚　幸　三
４、指定代理人７、補正の対象　　明細書の「発明の詳細な説明」の欄
（１）明細書筒３頁丁未より第２行目のｒＤＥ４２％」
をｒＤＥ４．２％」に訂正する。（２）明細書第５頁第１３行目のｒｐＨ６〜９」をｒｐ
Ｈ６〜９の」に訂正する。（３）明細書第６頁第１６行目の「スツヅエリ」を「ス
ツツエリ」に訂正する。

Claims

【特許請求の範囲】

澱粉から、主成分としてマルトテトラオースを約６５〜
７５％の収量で生成するバシルス属品由来新規なアミラ
ーゼＧ４