JPH0566110B2 - - Google Patents
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- JPH0566110B2 JPH0566110B2 JP60286200A JP28620085A JPH0566110B2 JP H0566110 B2 JPH0566110 B2 JP H0566110B2 JP 60286200 A JP60286200 A JP 60286200A JP 28620085 A JP28620085 A JP 28620085A JP H0566110 B2 JPH0566110 B2 JP H0566110B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- sub
- absorption spectrum
- δppm
- spectrum
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungi isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Reinforced Plastic Materials (AREA)
- Lining Or Joining Of Plastics Or The Like (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
産業上の利用分野
この発明は新規化合物FR−68504に関するもの
である。さらに詳細には、この発明は優れた抗腫
瘍作用を有するFR−68504、その製造法、それを
含有する抗腫瘍剤およびその生産菌に関するもの
である。 従来技術およびこの発明が解決しようとする問題
点 従来から種々の抗腫瘍作用を有する物質が知ら
れているが、これらはその抗腫瘍作用、副作用等
の点で必ずしも満足されるものではない。そこ
で、この発明者等は抗腫瘍作用を有する新規化合
物の創製を企図した。 発明の構成および効果 この発明の新規化合物FR−68504は下記の理化
学的性質を有する。 (a) 元素分析値（％）： C45.65；H6.62 (b) 分子量： 236［SIMS：ｍ／z237（Ｍ＋１）］ (c) 融点： 157−159℃ (d) 比旋光度： ［α］23 D＝−5.8°（Ｃ＝1.0、H2O） (e) UVスペクトラム： 末端吸収（H2O） (f) IRスペクトラム： νNujol nax：3400、3250、1300、1100、 1030、950、850cm-1 (g) 1HNMRスペストラム：（D2O） δppm：3.94−3.78（4H、ｍ）、3.57（1H、dd、
Ｊ＝9.2および5.3Hz）、3.36−3.25（2H、ｍ）、
3.01−2.88（4H、ｍ） (h) 13C NMRスペクトラム： δppm：71.0(d)、70.6(d)、70.4(d)、 69.6(d)、68.6(d)、55.1(d)、 53.5(d)、46.6(t)、46.5(t) (i) 溶解性： 可溶：水 難溶：メタノール、エタノール、アセトン 不溶：酢酸エチル、クロロホルム (j) 呈色反応： 陽性：モーリツシユ反応、硫酸セリウムとの反
応 陰性：ニンヒドリン反応、塩化第二鉄−フエリ
シアン化カリウム反応、ドラーゲンドルフ試
薬との反応、ヨード蒸気 (k) 物質の性質： 中性物質 (l) 結晶の色と形： 無色柱状晶 (m) 薄層クロマトグラフイー（シリカゲル・シー
ト）：溶媒 Rf値 クロロホルム：イソプロパノール：水 （５：10：１） 0.50 イソプロパノール：水（85：15） 0.70 このFR−68504は、例えばアマウロアスカス属
に属するFR−68504生産菌を培地に培養し、得ら
れる培養物からFR−68504生産菌を採取すること
により製造される。 FR−68504生産菌のうち、アマウロアスカス・
オーレウス（Amauroascus aureus）Ｆ−3405株
はこの発明者等が鳥取県三徳山のふもとで採取し
た土壌試料から常法により分離したものであり、
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第
946号として寄託されている。 次に、Ｆ−3405株の菌学的性質について説明す
る。 Ｆ−3405株は、培地上で有性及び無性の生殖器
官を形成し、その形態的特徴から子のう菌類アマ
ウロアスカス属（Amauroascus Schro¨ter）に所
属すると思われる。本菌株の形態的、培養的及び
生理的特徴を以下に示す。 コーンミール寒天上またはYpSs寒天上で約一
月間培養した後、有性生殖形態として子のう果が
形成される。また、無性生殖形態も種々の培地上
でよく形成され、分生子形成様式は全分節型（ホ
ロアルスリツク：holoarthric）である。 子のう果は表在性、球形から亜球形、黄色で直
径0.5〜１mm、気生菌糸が織り交つて形成され、
隣り合う子のう果が密集して直径３mm以上のスト
ロマ様の集塊となる。子のう果壁は薄壁で、末端
が波状かラセン状に縮れた菌糸からなる。子のう
は子のう果中に不規則に散在し、かたく巻きつい
た子のう果原基を中心に房状に形成され、消毛性
の一重壁子のうち、短い柄部をもつた倒卵形から
洋なし形、長さ13〜15.5μｍ、幅９〜10μｍ、子の
う胞子を８個形成する。子のう胞子は一細胞、黄
色、球形、直径４〜5μｍ、初め刺状で成熟する
と網目状になる長さ0.5μｍの隆起をもつ。分節型
分生子は頂生または中間生で、一細胞、無色、滑
面、円筒形または卵形で、両端または一端が裁断
状、長さ８〜18μｍ、幅４〜6μｍで大きさは様々
である。栄養菌糸は隔壁をもち、無色、滑面で分
枝する。菌糸細胞は円筒形で幅1.5〜5μｍ。厚膜
胞子は形成されない。 麦芽抽出寒天上での生育はやや速やかで、25
℃、２週間培養後、直径3.5cmに拡がる。集落表
面は平坦またはやや盛り上がり、フエルト状から
羊毛状、色調は薄い黄色である。集落全体は円
形。有性、無性とも胞子の形成は観られない。集
落裏面は黄色から暗い黄色。YpSs寒天上では、
同一条件で麦芽抽出寒天上と同じ速さで生育し、
集落表面は平坦でフエルト状、円形状に拡がり、
薄い黄色から黄味灰の色調を示す。集落裏面は薄
い黄色。子のう果の形成には一ケ月程度の培養を
要す。コーンミール寒天上の集落は同一条件下で
直径2.0cmと抑制的に生育する。集落表面は平坦
で薄く、フエルト状、中心部に子のう果が形成さ
れ、３、４週間後には子のう胞子が成熟する。色
調は集落表面、裏面ともに薄い黄色である。 Ｆ−3405株の生育温度範囲は５〜29℃で、最適
生育温度は23〜26℃である。また本菌株の生育PH
範囲はPH３〜10で、最適生育PHはPH５〜７であ
る。 Ｆ−3405株は、アマウロアスカス属の分類基準
に従えば、子のう果の大きさ、子のう胞子の表面
構造・色調・大きさ等から、アマウロアスカス・
オーレウス・エイダム・フオン・アークス
（Amauroascus aureus（Eidam）von Arx）と思
われる。本菌株は、培養的特徴、有性生殖形態の
形状等多くの点でクエーンら（Kuehn et al.）、
フオン・アークス（von Arx）、宇田川の記載
［J.A.von Arx（1971）“On Arachnoitus and
related genera of the Gymnoascaceae.”
Persconia、６(3)：371−380.H.H.kuehn、K.
Tubaki and G.F.Orr（1964）“Arachnoitus
aureus.” Mycologia、56：863−872、宇田川、
椿他（編）（1978）菌類図鑑、P.338、講談社］と
一致した。また無性生殖形態についても、クエー
ンらが報告した典型的なクリソス リウム
（Chrysosporium）型の分生子は形成しなかつた
が、宇田川によつて示された分節型分生子が観ら
れた。以上の事項から、Ｆ−3405株をアマウロア
スカス・オーレウス（Amauroascus aureus）の
一新菌株と同定し、アマウロアスカス・オーレウ
ス・Ｆ−3405（Amauroascus aureus Ｆ−3405）
と命名した。 この発明で使用するFR−68504生産菌は、例え
ばＸ線、紫外線等の照射処理、例えばナイトロジ
エン・マスタード、アザセリン、亜硝酸、２−ア
ミノ リン、Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（NTG）等の変異誘起剤によ
る処理、フアージ接触、形質転換、形質導入、遺
伝子操作技術、接合等の通常用いられる菌種変異
処理方法により、FR−68504生産能を高めること
ができる。FR−68504の生産は原則的には一般微
生物の培養方法に準ずるが、普通は液体培地によ
る深部培養法が有利である。培養に用いられる培
地としては、アマウロアスカス属に属するFR−
68504生産菌が利用する栄養源を含有する培地で
あればよい。すなわち、合成培地、半合成培地あ
るいは天然培地が用いられ、培地組成は炭素源と
しては、例えばグルコース、シユークロース、マ
ルトース、グリセリン、でん粉、液化でん粉等が
用いられ、窒素源としては、例えば肉エキス、カ
ゼイン加水分解物、ペプトン、グルテンミール、
コーンミール、綿実粉、大豆粉、コーンスチープ
リカー、乾燥酵母、酵母エキス、尿素、りん酸ア
ンモニウム等が用いられる。このほか、例えばり
ん酸水素２ナトリウム、りん酸２水素カリウム、
塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カル
シウム等の無機塩も必要に応じて培地に添加され
る。 また、培養中発泡の著しい時には、例えば大豆
油、亜麻仁油等の植物油、オクタデカノール、テ
トラデカノール、ヘプタノール等の高級アルコー
ル類、シリコン化合物等の消泡剤を適宜添加すれ
ばよい。 培養温度は30℃前後が適当であり、培養容量の
増大に従つて適宜種培養を行なうと好結果が得ら
れることが多い。本培養の培養時間は50〜100時
間位が適当であり、培地が濃厚になるのに従つ
て、培養時間をさらに延長してもよい。 以上述べた培養条件は使用生産菌株の特性に応
じてそれぞれの最適の条件を選択して適用され
る。 次に、培養により生成したFR−68504は通常、
培養物中の菌体外に蓄積されることが多いので、
一般には遠心分離、ろ過等の手段により菌体およ
びろ液（上澄液）に分離した後ろ液から一般抗生
物質の製造に用いられる手段により分離、精製お
よび採取される。すなわち、通常、上記ろ液（上
澄液）に減圧濃縮、溶媒抽出、液生変換、例えば
陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂、非イオン
性吸着樹脂等の樹脂による処理、例えば活性炭、
けい酸、シリカゲル、アルミナ、セルロース等の
吸着剤による処理、結晶化、再結晶等の手段を任
意の順序に組合せまたは反復して適用することに
より、目的物質、FR−68504を分離、精製するこ
とができる。 この発明のFR−68504は優れた抗腫瘍作用を有
し、抗腫瘍剤として有用であり、FR−68504はそ
れをそのまままたは医薬として許容される担体と
混合して、カプセル、錠剤、顆粒、粉剤、バツカ
ル錠、舌下錠および溶液のような医薬組成物の形
で、人を含む哺乳動物に抗腫瘍剤として投与する
ことができる、 医薬として許容される担体としては、例えば蔗
糖、でん粉、マンニツト、ソルビツト、乳糖、ブ
ドウ糖、セルロース、タルク、燐酸カルシウム、
炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポ
リプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴ
ム、ポリエチレングリコール、蔗糖、でん粉等の
結合剤、例えばでん粉、カルボキシメチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロースのカルシウム
塩、ヒドロキシプロピル−でん粉、グリコールで
ん粉ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、燐酸カル
シウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステア
リン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウ
リル硫酸ナトリウム等の潤滑剤、例えばクエン
酸、メントール、グリチルリジンのアンモニウム
塩、グリシン、オレンジ粉末等の芳香剤、安息香
酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパ
ラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン
酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、例え
ばメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ス
テアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、例えば界面
活性剤等の分散剤、水性希釈剤例えば水、例えば
カカオ脂、ポリエチレングリコール、白色ワセリ
ン等のベースワツクスのような医薬用として常用
される種々の有機もしくは無機担体が挙げられ
る。 目的化合物の投与量は疾患の種類、患者の体重
および／または年齢、およびさらに投与経路のよ
うな種々の要因によつて変化する。 FR−68504の最適投与量は通常、注射の場合は
0.01mg〜10mg／Kg／日、または経口投与の場合は
0.5〜50mg／Kg／日の投与範囲から選択される。 以下実施例によりこの発明を説明する。 実施例 １ 可溶性でん粉（１％）、とうもろこしでん粉
（１％）、グリコース（１％）、綿実粉（１％）、乾
燥酵母（１％）、トン（0.5％）、コーン・スチ
ー・リカー（0.5％）、炭酸カルシウム（0.2％）
を含有する培地（80）を水酸化ナトリウム水溶液
でPH6.0に調整し、これを250容エーレンマイヤ
ー・フラスコに注入し120℃で30分間減菌する。 この培地にアマウロアスカス・オーレウスＦ−
3405株の斜面培養物から１白金耳培地に接種し、
ロータリー・シエーカー（200回転、３インチ・
スロー）上で25℃、120時間培養した。得られた
培養物３づつを前もつて120℃で30分間減菌した
上記と同じ培地（80）を含む250容エーレンマイ
ヤー・フラスコ30本に接種した後、ロータリー・
シエーカー上で72時間培養した。 別にグルコース（２％）、トン（0.5％）、乾燥
酵母（１％）および炭酸カルシウム（0.2％）を
含有する培地（150）をPH6.5に水酸化ナトリウ
ム水溶液で調整したものを200容ジヤー・フア
ーメンターに入れ120℃で30分間減菌する。これ
に上記培養物２を接種し、毎分200回転で150
の通気を行ない、144時間25℃で培養する。 得られた培養物をけい藻土（２Kg）を濾過助剤
として用い濾過する。濾液（70）を塩酸でPH
6.5に調整し、活性炭（20）を充填したカラム
に通過させる。このカラムを水（100）で洗浄
し、10％メタノール水（80）で溶出する。活性
画分を集め、200mlまで減圧濃縮して目的物質を
得る。これを水−メタノールから再結晶してFR
−68504（２ｇ）を無色柱状晶として得る。 実施例 ２ （注射剤） FR−68504を減菌し、これをバイアルに５mgず
つ入れ、密封する。用時に、バイアルに滅菌注射
用蒸留水を２ml加えて、注射に供する。 次に、この発明のFR−68504の薬理作用につい
て下記試験例で詳細に説明する。 試験例 １ （白血病細胞に対する抗腫瘍活性） 白血病P388細胞を７週令雌BDF1マウスに腹腔
内接種（接種量１×106細胞数／マウス）した。
腫瘍細胞の移植後24時間目に、生理食塩水に溶解
したFR−68504をマウスに腹腔内投与した。FR
−68504は腫瘍細胞移植後１、２および３日目に
１回ずつマウスに投与した。対照動物には生理食
塩水のみを復腔内投与した。注射量は0.2mlとし、
各試験群のマウスは５匹とした。抗腫瘍活性は各
群の平均生存数(T)の対照群の平均生存日数(C)に対
する百分率（Ｔ／Ｃ×100）で示した。 結果を表１に示す。
である。さらに詳細には、この発明は優れた抗腫
瘍作用を有するFR−68504、その製造法、それを
含有する抗腫瘍剤およびその生産菌に関するもの
である。 従来技術およびこの発明が解決しようとする問題
点 従来から種々の抗腫瘍作用を有する物質が知ら
れているが、これらはその抗腫瘍作用、副作用等
の点で必ずしも満足されるものではない。そこ
で、この発明者等は抗腫瘍作用を有する新規化合
物の創製を企図した。 発明の構成および効果 この発明の新規化合物FR−68504は下記の理化
学的性質を有する。 (a) 元素分析値（％）： C45.65；H6.62 (b) 分子量： 236［SIMS：ｍ／z237（Ｍ＋１）］ (c) 融点： 157−159℃ (d) 比旋光度： ［α］23 D＝−5.8°（Ｃ＝1.0、H2O） (e) UVスペクトラム： 末端吸収（H2O） (f) IRスペクトラム： νNujol nax：3400、3250、1300、1100、 1030、950、850cm-1 (g) 1HNMRスペストラム：（D2O） δppm：3.94−3.78（4H、ｍ）、3.57（1H、dd、
Ｊ＝9.2および5.3Hz）、3.36−3.25（2H、ｍ）、
3.01−2.88（4H、ｍ） (h) 13C NMRスペクトラム： δppm：71.0(d)、70.6(d)、70.4(d)、 69.6(d)、68.6(d)、55.1(d)、 53.5(d)、46.6(t)、46.5(t) (i) 溶解性： 可溶：水 難溶：メタノール、エタノール、アセトン 不溶：酢酸エチル、クロロホルム (j) 呈色反応： 陽性：モーリツシユ反応、硫酸セリウムとの反
応 陰性：ニンヒドリン反応、塩化第二鉄−フエリ
シアン化カリウム反応、ドラーゲンドルフ試
薬との反応、ヨード蒸気 (k) 物質の性質： 中性物質 (l) 結晶の色と形： 無色柱状晶 (m) 薄層クロマトグラフイー（シリカゲル・シー
ト）：溶媒 Rf値 クロロホルム：イソプロパノール：水 （５：10：１） 0.50 イソプロパノール：水（85：15） 0.70 このFR−68504は、例えばアマウロアスカス属
に属するFR−68504生産菌を培地に培養し、得ら
れる培養物からFR−68504生産菌を採取すること
により製造される。 FR−68504生産菌のうち、アマウロアスカス・
オーレウス（Amauroascus aureus）Ｆ−3405株
はこの発明者等が鳥取県三徳山のふもとで採取し
た土壌試料から常法により分離したものであり、
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第
946号として寄託されている。 次に、Ｆ−3405株の菌学的性質について説明す
る。 Ｆ−3405株は、培地上で有性及び無性の生殖器
官を形成し、その形態的特徴から子のう菌類アマ
ウロアスカス属（Amauroascus Schro¨ter）に所
属すると思われる。本菌株の形態的、培養的及び
生理的特徴を以下に示す。 コーンミール寒天上またはYpSs寒天上で約一
月間培養した後、有性生殖形態として子のう果が
形成される。また、無性生殖形態も種々の培地上
でよく形成され、分生子形成様式は全分節型（ホ
ロアルスリツク：holoarthric）である。 子のう果は表在性、球形から亜球形、黄色で直
径0.5〜１mm、気生菌糸が織り交つて形成され、
隣り合う子のう果が密集して直径３mm以上のスト
ロマ様の集塊となる。子のう果壁は薄壁で、末端
が波状かラセン状に縮れた菌糸からなる。子のう
は子のう果中に不規則に散在し、かたく巻きつい
た子のう果原基を中心に房状に形成され、消毛性
の一重壁子のうち、短い柄部をもつた倒卵形から
洋なし形、長さ13〜15.5μｍ、幅９〜10μｍ、子の
う胞子を８個形成する。子のう胞子は一細胞、黄
色、球形、直径４〜5μｍ、初め刺状で成熟する
と網目状になる長さ0.5μｍの隆起をもつ。分節型
分生子は頂生または中間生で、一細胞、無色、滑
面、円筒形または卵形で、両端または一端が裁断
状、長さ８〜18μｍ、幅４〜6μｍで大きさは様々
である。栄養菌糸は隔壁をもち、無色、滑面で分
枝する。菌糸細胞は円筒形で幅1.5〜5μｍ。厚膜
胞子は形成されない。 麦芽抽出寒天上での生育はやや速やかで、25
℃、２週間培養後、直径3.5cmに拡がる。集落表
面は平坦またはやや盛り上がり、フエルト状から
羊毛状、色調は薄い黄色である。集落全体は円
形。有性、無性とも胞子の形成は観られない。集
落裏面は黄色から暗い黄色。YpSs寒天上では、
同一条件で麦芽抽出寒天上と同じ速さで生育し、
集落表面は平坦でフエルト状、円形状に拡がり、
薄い黄色から黄味灰の色調を示す。集落裏面は薄
い黄色。子のう果の形成には一ケ月程度の培養を
要す。コーンミール寒天上の集落は同一条件下で
直径2.0cmと抑制的に生育する。集落表面は平坦
で薄く、フエルト状、中心部に子のう果が形成さ
れ、３、４週間後には子のう胞子が成熟する。色
調は集落表面、裏面ともに薄い黄色である。 Ｆ−3405株の生育温度範囲は５〜29℃で、最適
生育温度は23〜26℃である。また本菌株の生育PH
範囲はPH３〜10で、最適生育PHはPH５〜７であ
る。 Ｆ−3405株は、アマウロアスカス属の分類基準
に従えば、子のう果の大きさ、子のう胞子の表面
構造・色調・大きさ等から、アマウロアスカス・
オーレウス・エイダム・フオン・アークス
（Amauroascus aureus（Eidam）von Arx）と思
われる。本菌株は、培養的特徴、有性生殖形態の
形状等多くの点でクエーンら（Kuehn et al.）、
フオン・アークス（von Arx）、宇田川の記載
［J.A.von Arx（1971）“On Arachnoitus and
related genera of the Gymnoascaceae.”
Persconia、６(3)：371−380.H.H.kuehn、K.
Tubaki and G.F.Orr（1964）“Arachnoitus
aureus.” Mycologia、56：863−872、宇田川、
椿他（編）（1978）菌類図鑑、P.338、講談社］と
一致した。また無性生殖形態についても、クエー
ンらが報告した典型的なクリソス リウム
（Chrysosporium）型の分生子は形成しなかつた
が、宇田川によつて示された分節型分生子が観ら
れた。以上の事項から、Ｆ−3405株をアマウロア
スカス・オーレウス（Amauroascus aureus）の
一新菌株と同定し、アマウロアスカス・オーレウ
ス・Ｆ−3405（Amauroascus aureus Ｆ−3405）
と命名した。 この発明で使用するFR−68504生産菌は、例え
ばＸ線、紫外線等の照射処理、例えばナイトロジ
エン・マスタード、アザセリン、亜硝酸、２−ア
ミノ リン、Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（NTG）等の変異誘起剤によ
る処理、フアージ接触、形質転換、形質導入、遺
伝子操作技術、接合等の通常用いられる菌種変異
処理方法により、FR−68504生産能を高めること
ができる。FR−68504の生産は原則的には一般微
生物の培養方法に準ずるが、普通は液体培地によ
る深部培養法が有利である。培養に用いられる培
地としては、アマウロアスカス属に属するFR−
68504生産菌が利用する栄養源を含有する培地で
あればよい。すなわち、合成培地、半合成培地あ
るいは天然培地が用いられ、培地組成は炭素源と
しては、例えばグルコース、シユークロース、マ
ルトース、グリセリン、でん粉、液化でん粉等が
用いられ、窒素源としては、例えば肉エキス、カ
ゼイン加水分解物、ペプトン、グルテンミール、
コーンミール、綿実粉、大豆粉、コーンスチープ
リカー、乾燥酵母、酵母エキス、尿素、りん酸ア
ンモニウム等が用いられる。このほか、例えばり
ん酸水素２ナトリウム、りん酸２水素カリウム、
塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カル
シウム等の無機塩も必要に応じて培地に添加され
る。 また、培養中発泡の著しい時には、例えば大豆
油、亜麻仁油等の植物油、オクタデカノール、テ
トラデカノール、ヘプタノール等の高級アルコー
ル類、シリコン化合物等の消泡剤を適宜添加すれ
ばよい。 培養温度は30℃前後が適当であり、培養容量の
増大に従つて適宜種培養を行なうと好結果が得ら
れることが多い。本培養の培養時間は50〜100時
間位が適当であり、培地が濃厚になるのに従つ
て、培養時間をさらに延長してもよい。 以上述べた培養条件は使用生産菌株の特性に応
じてそれぞれの最適の条件を選択して適用され
る。 次に、培養により生成したFR−68504は通常、
培養物中の菌体外に蓄積されることが多いので、
一般には遠心分離、ろ過等の手段により菌体およ
びろ液（上澄液）に分離した後ろ液から一般抗生
物質の製造に用いられる手段により分離、精製お
よび採取される。すなわち、通常、上記ろ液（上
澄液）に減圧濃縮、溶媒抽出、液生変換、例えば
陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂、非イオン
性吸着樹脂等の樹脂による処理、例えば活性炭、
けい酸、シリカゲル、アルミナ、セルロース等の
吸着剤による処理、結晶化、再結晶等の手段を任
意の順序に組合せまたは反復して適用することに
より、目的物質、FR−68504を分離、精製するこ
とができる。 この発明のFR−68504は優れた抗腫瘍作用を有
し、抗腫瘍剤として有用であり、FR−68504はそ
れをそのまままたは医薬として許容される担体と
混合して、カプセル、錠剤、顆粒、粉剤、バツカ
ル錠、舌下錠および溶液のような医薬組成物の形
で、人を含む哺乳動物に抗腫瘍剤として投与する
ことができる、 医薬として許容される担体としては、例えば蔗
糖、でん粉、マンニツト、ソルビツト、乳糖、ブ
ドウ糖、セルロース、タルク、燐酸カルシウム、
炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチル
セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポ
リプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴ
ム、ポリエチレングリコール、蔗糖、でん粉等の
結合剤、例えばでん粉、カルボキシメチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロースのカルシウム
塩、ヒドロキシプロピル−でん粉、グリコールで
ん粉ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、燐酸カル
シウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステア
リン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウ
リル硫酸ナトリウム等の潤滑剤、例えばクエン
酸、メントール、グリチルリジンのアンモニウム
塩、グリシン、オレンジ粉末等の芳香剤、安息香
酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパ
ラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン
酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、例え
ばメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ス
テアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、例えば界面
活性剤等の分散剤、水性希釈剤例えば水、例えば
カカオ脂、ポリエチレングリコール、白色ワセリ
ン等のベースワツクスのような医薬用として常用
される種々の有機もしくは無機担体が挙げられ
る。 目的化合物の投与量は疾患の種類、患者の体重
および／または年齢、およびさらに投与経路のよ
うな種々の要因によつて変化する。 FR−68504の最適投与量は通常、注射の場合は
0.01mg〜10mg／Kg／日、または経口投与の場合は
0.5〜50mg／Kg／日の投与範囲から選択される。 以下実施例によりこの発明を説明する。 実施例 １ 可溶性でん粉（１％）、とうもろこしでん粉
（１％）、グリコース（１％）、綿実粉（１％）、乾
燥酵母（１％）、トン（0.5％）、コーン・スチ
ー・リカー（0.5％）、炭酸カルシウム（0.2％）
を含有する培地（80）を水酸化ナトリウム水溶液
でPH6.0に調整し、これを250容エーレンマイヤ
ー・フラスコに注入し120℃で30分間減菌する。 この培地にアマウロアスカス・オーレウスＦ−
3405株の斜面培養物から１白金耳培地に接種し、
ロータリー・シエーカー（200回転、３インチ・
スロー）上で25℃、120時間培養した。得られた
培養物３づつを前もつて120℃で30分間減菌した
上記と同じ培地（80）を含む250容エーレンマイ
ヤー・フラスコ30本に接種した後、ロータリー・
シエーカー上で72時間培養した。 別にグルコース（２％）、トン（0.5％）、乾燥
酵母（１％）および炭酸カルシウム（0.2％）を
含有する培地（150）をPH6.5に水酸化ナトリウ
ム水溶液で調整したものを200容ジヤー・フア
ーメンターに入れ120℃で30分間減菌する。これ
に上記培養物２を接種し、毎分200回転で150
の通気を行ない、144時間25℃で培養する。 得られた培養物をけい藻土（２Kg）を濾過助剤
として用い濾過する。濾液（70）を塩酸でPH
6.5に調整し、活性炭（20）を充填したカラム
に通過させる。このカラムを水（100）で洗浄
し、10％メタノール水（80）で溶出する。活性
画分を集め、200mlまで減圧濃縮して目的物質を
得る。これを水−メタノールから再結晶してFR
−68504（２ｇ）を無色柱状晶として得る。 実施例 ２ （注射剤） FR−68504を減菌し、これをバイアルに５mgず
つ入れ、密封する。用時に、バイアルに滅菌注射
用蒸留水を２ml加えて、注射に供する。 次に、この発明のFR−68504の薬理作用につい
て下記試験例で詳細に説明する。 試験例 １ （白血病細胞に対する抗腫瘍活性） 白血病P388細胞を７週令雌BDF1マウスに腹腔
内接種（接種量１×106細胞数／マウス）した。
腫瘍細胞の移植後24時間目に、生理食塩水に溶解
したFR−68504をマウスに腹腔内投与した。FR
−68504は腫瘍細胞移植後１、２および３日目に
１回ずつマウスに投与した。対照動物には生理食
塩水のみを復腔内投与した。注射量は0.2mlとし、
各試験群のマウスは５匹とした。抗腫瘍活性は各
群の平均生存数(T)の対照群の平均生存日数(C)に対
する百分率（Ｔ／Ｃ×100）で示した。 結果を表１に示す。
【表】
試験例 ２
（メラノーマ細胞に対する抗腫瘍活性）
マウスメラノーマB16細胞をC57BL／６マウス
に継代移植し、移植後15日目にマウスの腹腔中よ
り腫瘍塊を採取し、さらに細胞数を調整して、細
胞浮遊液とした。その浮遊液（0.2ml、1.0×106細
胞数）を８週令雌マウスの腹腔内に移植した。移
植後24時間目にFR−68504を減菌水に溶解したも
のをマウスに投与した。 FR−68504の投与は１日１回４日間上記の腫瘍
細胞を移植したマススの腹腔内に投与した。な
お、この試験ではマウスは１群５匹とし、対照群
のマウスには生理食塩水のみを投与した。また注
射量はいずれの場合も0.2mlとした。抗腫瘍活性
はＴ／Ｃ％で示した。 結果を表２に示す。
に継代移植し、移植後15日目にマウスの腹腔中よ
り腫瘍塊を採取し、さらに細胞数を調整して、細
胞浮遊液とした。その浮遊液（0.2ml、1.0×106細
胞数）を８週令雌マウスの腹腔内に移植した。移
植後24時間目にFR−68504を減菌水に溶解したも
のをマウスに投与した。 FR−68504の投与は１日１回４日間上記の腫瘍
細胞を移植したマススの腹腔内に投与した。な
お、この試験ではマウスは１群５匹とし、対照群
のマウスには生理食塩水のみを投与した。また注
射量はいずれの場合も0.2mlとした。抗腫瘍活性
はＴ／Ｃ％で示した。 結果を表２に示す。
【表】
試験例 ３
（白血病細胞に対する抗腫瘍活性）
白血病L1210細胞をDBA／２マスウに継代移
植し、移植後７日目の腹腔より腹水を採取し、そ
の腫瘍細胞を分離し、さらに細胞数を調整し、細
胞浮遊液とした。その浮遊液の0.2ml（１×106細
胞数）を８週令雌のBDF1マウスの腹腔内に移植
した。移植後24時間目にFR−68504を減菌水に溶
解したものをマウスの腹腔内に投与した。FR−
68504の投与は移植後１日１回４日間上記の腫瘍
細胞を移植したマウスの腹腔内に投与した。な
お、この試験ではマウスは１群５匹とし、対照群
のマウスには生理食塩水のみを投与した。また注
射量はいずれの場合も0.2mlとした。抗腫瘍活性
はＴ／Ｃ％で示した。 結果を表３に示す。
植し、移植後７日目の腹腔より腹水を採取し、そ
の腫瘍細胞を分離し、さらに細胞数を調整し、細
胞浮遊液とした。その浮遊液の0.2ml（１×106細
胞数）を８週令雌のBDF1マウスの腹腔内に移植
した。移植後24時間目にFR−68504を減菌水に溶
解したものをマウスの腹腔内に投与した。FR−
68504の投与は移植後１日１回４日間上記の腫瘍
細胞を移植したマウスの腹腔内に投与した。な
お、この試験ではマウスは１群５匹とし、対照群
のマウスには生理食塩水のみを投与した。また注
射量はいずれの場合も0.2mlとした。抗腫瘍活性
はＴ／Ｃ％で示した。 結果を表３に示す。
【表】
試験例 ４
（肺癌細胞に対する抗腫瘍活性）
マウス肺癌カルシノーマをC57BL／６マウスに
継代移植し、移植後15日目の皮下より腫瘍塊を採
取し、細胞数を調整し、細胞浮遊液とした。この
浮遊液0.2ml（2.5×106細胞数）を８週令雌BDF
塵埃マウスの皮下に移植した。移植後24時間目
に、FR−68504を滅菌水に溶解したものをマウス
の腹腔内に投与した。FR−68504の投与は１日１
回４日間行なわれた。なお、この試験ではマウス
は１群５匹とし、対照群のマウスには生理食塩水
のみを投与した。また注射量はいずれの場合も
0.2mlとした。抗腫瘍活性はＴ／Ｃ％で示した。 結果を表４に示す。
継代移植し、移植後15日目の皮下より腫瘍塊を採
取し、細胞数を調整し、細胞浮遊液とした。この
浮遊液0.2ml（2.5×106細胞数）を８週令雌BDF
塵埃マウスの皮下に移植した。移植後24時間目
に、FR−68504を滅菌水に溶解したものをマウス
の腹腔内に投与した。FR−68504の投与は１日１
回４日間行なわれた。なお、この試験ではマウス
は１群５匹とし、対照群のマウスには生理食塩水
のみを投与した。また注射量はいずれの場合も
0.2mlとした。抗腫瘍活性はＴ／Ｃ％で示した。 結果を表４に示す。
【表】
上記試験例１〜４から明らかなように、FR−
68504は優れた抗腫瘍活性を示した。 試験例 ５ （急性毒性） ５週令雄ddYマウスを用いる急性毒性試験の結
果からFR−68504のLD50値（腹腔内投与）は50
mg／Kgであつた。
68504は優れた抗腫瘍活性を示した。 試験例 ５ （急性毒性） ５週令雄ddYマウスを用いる急性毒性試験の結
果からFR−68504のLD50値（腹腔内投与）は50
mg／Kgであつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記理化学的性質を有するFR−68504 (a) 元素分析値（％）： C45.65；H6.62 (b) 分子量： 236［SIMS：ｍ／z237（Ｍ＋１）］ (c) 融点： 157−159℃ (d) 比旋光度： ［α］23 D＝−5.8°（Ｃ＝1.0、H2O） (e) UVスペクトラム： 末端吸収（H2O） (f) IRスペクトラム： νNujol nax：3400、3250、1300、1100、 1030、950、850cm-1 (g) 1HNMRスペクトラム：（D2O） δppm：3.94−3.78（4H、ｍ）、3.57（1H、dd、
Ｊ＝9.2および5.3Hz）、3.36−3.25（2H、ｍ）、
3.01−2.88（4H、ｍ） (h) 13C NMRスペクトラム： δppm：71.0(d)、70.6(d)、70.4(d)、 69.6(d)、68.6(d)、55.1(d)、 53.5(d)、46.6(t)、46.5(t) (i) 溶解性： 可溶：水 難溶：メタノール、エタノール、アセトン 不溶：酢酸エチル、クロロホルム (j) 呈色反応： 陽性：モーリツシユ反応、硫酸セリウムとの反
応 陰性：ニンヒドリン反応、塩化第二鉄−フエリ
シアン化カリウム反応、ドラーゲンドルフ試
薬との反応、ヨード蒸気 (k) 物質の性質： 中性物質 ２ アマウロアスカス（Amauroascus）属に属
するFR−68504生産菌を培地に培養し、得られる
培養物からFR−68504を採取することを特徴とす
るFR−68504の製造法。 ３ FR−68504を含有する抗腫瘍剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB858500039A GB8500039D0 (en) | 1985-01-02 | 1985-01-02 | Compound |
| GB8500039 | 1985-01-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61205491A JPS61205491A (ja) | 1986-09-11 |
| JPH0566110B2 true JPH0566110B2 (ja) | 1993-09-21 |
Family
ID=10572326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60286200A Granted JPS61205491A (ja) | 1985-01-02 | 1985-12-18 | 新規化合物ｆｒ−６８５０４、その製造法およびその用途 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4670259A (ja) |
| EP (1) | EP0187528B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61205491A (ja) |
| AT (1) | ATE61412T1 (ja) |
| DE (1) | DE3582047D1 (ja) |
| GB (1) | GB8500039D0 (ja) |
-
1985
- 1985-01-02 GB GB858500039A patent/GB8500039D0/en active Pending
- 1985-12-18 JP JP60286200A patent/JPS61205491A/ja active Granted
- 1985-12-23 EP EP85309460A patent/EP0187528B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-12-23 AT AT85309460T patent/ATE61412T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-23 DE DE8585309460T patent/DE3582047D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-12-24 US US06/813,065 patent/US4670259A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0187528A3 (en) | 1988-02-03 |
| US4670259A (en) | 1987-06-02 |
| GB8500039D0 (en) | 1985-02-13 |
| JPS61205491A (ja) | 1986-09-11 |
| EP0187528A2 (en) | 1986-07-16 |
| DE3582047D1 (de) | 1991-04-11 |
| EP0187528B1 (en) | 1991-03-06 |
| ATE61412T1 (de) | 1991-03-15 |
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