JPH0566546B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は食品及び体液、殊に尿中の亜硝酸塩な
いしは亜硝酸塩を形成する細菌を検出するための
組成物に関するものである。 （従来技術） 尿路感染症の発生頻度は高いがそのほとんどが
無症候性であり、婦人に多くみられる。細菌尿症
を治療せずに放置すると、しばしば顕性尿路感染
症へ移行し問題となる。しかし尿中に排泄された
細菌を検出することによりそのような感染を早期
に診断することができる。その際に生物学的方法
を用いる場合には常在菌による汚染を避けて採尿
した後定量培養し、10⁵／ml以上の細菌を検出す
ることが必要である。しかし、この定量培養に
は、煩雑な手技と多くの時間とを必要とするた
め、より簡単で迅速な化学的方法によつて菌量を
概測することが行われている。 尿路感染症の原因菌として最も頻度の高い大腸
菌（E.coli）をはじめとしてプロテウス
（Proteus）、クレブシエラ（Klebsiella）などの
諸菌およびブドウ球菌（Staphylococcus）、腸球
菌（Enterococcus）などの菌体中には硝酸塩を
亜硝酸塩に還元する酵素が存在する。しかして、
正常人の膀胱尿は無菌であるので、尿中に亜硝酸
塩が検出されれば上述の何れかの菌が腎盂や膀胱
などの尿路に感染しておりその感染部において尿
中の硝酸塩を亜硝酸塩に還元したものと見なすこ
とができる。 尿路中の細菌検出のための公知の鋭敏な方法は
排泄尿中のこの亜硝酸塩の量をグリース
（Grieas）試験で検出することに基づいている。
このグリース試験により亜硝酸塩を測定するため
の典型的試薬はスルフアニル酸及び１−ナフチル
アミンの酸性溶液から成る。すなわちグリース試
験においては、試料中に存在する亜硝酸塩はスル
フアニル酸をジアゾ化し、ジアゾニウム塩は１−
ナフチルアミンとカツプリングして赤色の染料と
なり、その濃度は亜硝酸塩の濃度と比較するた
め、例えば予め作製した検量線を用いて比色分析
により亜硝酸塩濃度を測定することができる。こ
の方法の欠点は試薬溶液の不安定性、操作の煩雑
性にある。この欠点を回避するために、試薬組成
物を固着させた担体上でグリース試験を実施する
という測定方法が提案された。 すなわち、体液中の成分の測定するための試薬
組成物を担体に固着させるいわゆるドライケミス
トリーの分野において、スルフアニル酸、１−ナ
フチルアミン／及び固体の有機酸より成る試薬混
合物は既に公知である（Fischl及びPinto“Clin.
Chim.Acta”第２巻、527〜533頁、1957年参照）。
これらの試薬混合物は乾燥状態においては溶液よ
りも著しく安定であり長時間の貯蔵も可能であ
る。このような測定剤に関する他の例としては例
えばジアゾ化し得るアミン、Ｎ，Ｎ−ジアルキル
−２−ナフチルアミン、及び固体の有機酸より成
る試薬混合物が記載されている米国特許第
3415717号などがあげられる。しかしながら、こ
れらの公知試験片は検出最低限界が亜硝酸ナトリ
ウム0.1〜１mg／100mlであり、細菌感染の際に検
出すべき亜硝酸塩痕跡量を測定できる感度を有し
ていない。それ故に高感度でかつより安定な試験
片が望まれている。 本発明者らは上述の従来技術の欠点を考慮しつ
つ、鋭意研修し本発明を完成させた。 （発明の目的） 本発明は上記従来技術における問題点を解決す
るためのものであり、その目的とするところは細
菌感染の際に検出すべき亜硝酸塩量を十分に判定
できる感度を有し、且つ安定な亜硝酸塩測定用組
成物及び該組成物を担持した試験片を提供するこ
とにある。 （発明の構成） すなわち本発明の亜硝酸塩測定用組成物は、ジ
アゾ化し得るアミン、酸成分及びカツプリング成
分らなる亜硝酸塩測定用組成物において、カツプ
リング成分として一般式Ｉ： 〔式中、 Ｒは水素原子又は炭素原子数１ないし６の直鎖
アルキル基を表わし、 ｎは１ないし６の整数である。〕 で表わされる化合物又はその水溶性塩を含むこ
とを特徴とする。 本発明者らはカツプリング成分として上記一般
式（Ｉ）で表わされる化合物又はその水溶性塩を
使用すると感度が良く細菌感染の際に検出すべき
亜硝酸塩量（亜硝酸塩痕跡量0.02mg／100ml）を
十分に検出し得ることを見い出した。 本発明においてカツプリング成分として好適に
使用される化合物を以下に記載するがもちろんこ
れらに限定されるものでない： Ｎ−（１−ナフチル）−３−アミノプロパンスル
ホン酸、 Ｎ−（２−メチル−１−ナフチル）−３−アミノ
プロパンスルホン酸、 Ｎ−（２−エチル−１−ナフチル）−３−アミノ
プロパンスルホン酸、 Ｎ−（１−ナフチル）−４−アミノブタンスルホ
ン酸、 Ｎ−（１−ナフチル）−２−アミノエタンスルホ
ン酸、 これらの化合物はほとんど文献未記載のもので
あるが、公知方法により容易に製造することがで
きる。 例えば、１−ナフチルアミンに相当するサルト
ンを反応させる〔小田ら、工業化学雑誌、59巻９
号、1028〜1030頁（1956年）〕方法や１−ナフチ
ルアミンと分子末端にハロゲンを有するアルキル
ルホン酸とを反応させる〔N.E.グツド（Good）
ら、アナリテイカル、バイオケミストリー
（Analytical Biochemistery）、104巻、300〜310
頁（1980年）〕方法などがあげられる。 このようにして製造されたカツプリング成分を
ジアゾ化し得るアミノ及び酸成分と混合すること
により本発明の亜硝酸塩測定用組成物が得られ
る。本発明の組成物を吸収性担体に包含させ、使
用の際便利なように該担体をプラスチツクシート
等の支持体で貼付せしめ、試験片とした場合、特
に簡便で貯蔵安定性に優れた測定用具を得ること
ができる。最も多用される吸収性担体は紙であ
るが、不織物、綿、木片等も使用可能である。
又、測定用組成物を所望により適当な接着剤例え
ば、ゼラチン、ポリビニルアルコールなどの合成
樹脂等とともに上記プラスチツクシート例えばポ
リ塩化ビニールシート、ポリスチレンシート、ポ
リエステルシート等の支持体上に塗布した後乾燥
することにより固着させることも可能であり、更
に種々の変形が容易になし得ることは明らかであ
る。 ジアゾ化し得るアミンとしては、例えばスルフ
アニル酸、アルサニル酸、Ｐ−アミノ安息香酸、
殊に好ましくはスルフアニルアミドが挙げられ
る。 酸成分としては、固体有機酸、例えば酒石酸、
クエン酸、蓚酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク
酸、グルタル酸、好ましくは酒石酸、クエン酸、
及び蓚酸を使用するのが良い。 試験片の製造方法としては例えば以下の方法が
挙げられる。すなわち、水又は有機溶剤又は水と
有機溶剤とより成る混合物中にジアゾ化し得るア
ミン、カツプリング成分及び固体有機酸を各々所
定濃度で溶解し、この溶液に吸収性担体、好まし
くは紙を浸漬した後引き上げて乾燥させて試験
紙を調製する。次いでこの試験紙を所望の大き
さ、形状に切断した後プラスチツクシート等の支
持体に貼付することにより本発明の亜硝酸塩測定
用組成物を担持した試験片を得ることができる。 溶液100ml当たりのジアゾ化し得るアミンの量
は0.5〜10mM、好ましくは１〜7mM、更に好ま
しくは1.5〜5mMとすると良い。又、カツプリン
グ成分の量は0.1〜5mM、好ましくは0.2〜3mM、
更に好ましくは0.5〜2mMとすると良い。更にこ
の場合、カツプリング成分に対するジアゾ化し得
るアミンのモル比すなわちアミン／カツプリング
成分は1/2〜1/7をとることができる（実際には
１：１で反応する）。 又、固体有機酸の濃度は重量比で２〜15％、好
ましくは2.5〜12％、更に好ましくは３〜８％と
すると良い。 上記各成分を溶解するための適当な有機溶剤と
しては、低級脂肪族アルコール、殊にメタノール
が好ましい。もちろん、各成分を溶解することが
でき容易に蒸発する他の溶剤を使用することもで
きる。 さらに試験片は尿中の亜硝酸塩を形成する細菌
の検出に適当であるばかりでなく、全く一般的に
亜硝酸塩ないし亜硝酸塩を形成する細菌の検出、
例えば飲料水又は食料品中における亜硝酸塩ない
し亜硝酸塩を形成する細菌の検出にも使用するこ
とができる。 （実施例） 以下の実施例において本発明を更に詳細に説明
する。なお、本発明は下記実施例に限定されるも
のではない カツプリング成分の製造 製造例１：Ｎ−（１−ナフチル）−３−アミノプ
ロパンスルホン酸ナトリウムの合成 １−ナフチルアミン11.8gを１−プロパノール
300mlに溶解する。この溶液に１，３−プロパン
サルトン10.1gをメタノール20mlに溶かした溶液
を加え、約３時間加熱還流する。次いで室温ま
で、冷却し1NNaOH水溶液を加えて中和した後、
溶媒を蒸発乾固する。メタノール／ベンゼン混合
溶剤を用いて再結晶し、白色結晶7.8gを得た（収
率33％）。 物性値 薄層クロマトグラフイー〔シリカゲルプレー
ト（メルク社製）、展開溶媒；クロ ロホ
ルム：メタノール：水＝８：５：２〕 UV吸収あり ニンヒドリン反応＋ Rf＝0.14 赤外線吸収スペクトル〔KBr錠剤、 ν_nax cm^-1〕 ν_SO3 1200，1050cm^-1；ν_NH3400cm^-1 ν_C＝Ｃ 1620cm^-1；ν_CH22850cm^-1 融点；208〜209℃（分解） 製造例２：Ｎ−（２−メチル−１−ナフチル）−３
−アミノプロパンスルホン酸ナトリウムの合成 ２−メチル−１−ナフチルアミン12.6gを１−
プロパノール300mlに溶解する。この溶液に１，
３−プロパンサルトン9.8gをメタノール20mlに溶
かした溶液を加え、約３時間加熱還流する。次い
で室温まで冷却し、1N NaOH水溶液を加えて中
和した後、溶媒を蒸発乾固する。メタノール／ベ
ンゼン混合溶剤を用いて再結晶し、白色結晶4.4g
を得た（収率18％）。 物性値 薄層クロマトグラフイー〔シリカゲルプレー
ト（メルク社製）、展開溶媒；クロ ロホ
ルム：メタノール：水＝８：５：２〕 UV吸収あり ニンヒドリン反応＋ Rf＝0.33 赤外線吸収スペクトル〔KBr錠剤、 ν_nax cm^-1〕 ν_SO3 1200，1050cm^-1；ν_NH3400cm^-1 ν_C＝Ｃ 1620cm^-1；ν_CH22930cm^-1 ν_CH22950cm^-1 融点；228〜229℃（分解） 亜硝酸塩測定用組成物の調製 実施例 １： スルフアニルアミド0.3g、Ｎ−（１−ナフチル）
−３−アミノプロパンスルホン酸ナトリウム
0.2g、酒石酸3.0gを適量のメタノールに溶かし、
更にメタノールを加えて全良を100mlとして本発
明の亜硝酸塩測定組成物のメタノール溶液を調製
した。 実施例 ２〜９： 実施例１と同様の方法で、ただしジアゾ化し得
るアミン、カツプリング成分及び酸成分の種類を
変えて各種の本発明の組成物を調製した。 比較例： 実施例１と同様の方法で、ただしＮ−（１−ナ
フチル）−３−アミノプロパンスルホン酸ナトリ
ウムの代わりに１−ナフチルアミンを使用して従
来の亜硝酸塩測定用組成物を調製した。 実施例及び比較例の亜硝酸塩測定用組成物を第
１表にまとめて示す。

【表】 亜硝酸塩測定用試験片の製造 実施例 10： 紙（Schleicher＆Schｕ¨ll社製，No.2316）を
実施例１の組成物中に所定時間浸漬した後、引き
上げ乾燥させた。次いで得られた試験紙を５mm×
５mmの大きさ（５mm角）に切断し、両面接着テー
プを用いて（厚さ0.35mmで）５mm×８cmの大きさ
のポリスチレンシートの一端に貼付して図に示す
本発明の組成物を担持した亜硝酸濃度測定用試験
片を製造した。図中、１は試験紙、２はポリスチ
レンシートの支持体である。支持体２上には所望
により数字、文字、記号や標準色調等を貼付又は
印刷等により記載してもよい。 実施例 11〜18： 実施例10と同様の方法で、ただし実施例１の組
成物の代わりに実施例２〜９の組成物を用いて試
験片を製造した。 比較例 ２： 実施例10と同様の方法で、ただし実施例１の組
成物の代わりに比較例１の組成物を用いて試験片
を製造した。 性能比較試験 実施例10〜18及び比較例２の亜硝酸濃度測定用
試験片を濃度の異なる亜硝酸塩を含有した尿中に
浸漬することにより分析精度を評価した。 実施例11〜18及び比較例２の亜硝酸濃度測定用
試験片の性能比較試験の結果を第２表にまとめて
示す。

【表】

【表】 第２表の結果により明らかなように、本発明の
亜硝酸塩測定用組成物を担持した試験片は従来の
試験片に比べて検出最低限界の値が1/3〜1/5とな
り、検出感度が非常に向上しているのが判る。 （発明の効果） 上述のように、本発明の亜硝酸塩測定用組成物
及び該組成物を担持した試験片は、従来の亜硝酸
塩測定用組成物及び該組成物を担持した試験片に
比べて!?かに高感度であり、例えば尿路感染症の
ような細菌感染の有無を判定する際に検出すべき
尿中の亜硝酸塩痕跡量0.02mg／100mlを十分に検
出することができる。 更に、本発明の組成物及び該組成物を担持した
試験片は亜硝酸塩を形成する尿又は尿路中の細菌
の検出に適しているのみならず例えば飲料水又は
食料品等に対して用いることができ、全く一般手
に亜硝酸塩ないし亜硝酸塩を形成する細菌の検出
に使用することができる。 このように、本発明の組成物及び該組成物を担
持した試験片は各種試料中の亜硝酸塩の高感度な
検出及びその結果に基づく簡便迅速な判定に優れ
た効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

図は本発明の亜硝酸塩測定用組成物を担持した
試験片の一実施例の斜視図である。 図中、１……試験紙、２……支持体。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ジアゾ化し得るアミン、酸成分及びカツプリ
   ング成分からなる亜硝酸塩測定用組成物におい
   て、カツプリング成分として一般式Ｉ： 〔式中、 Ｒは水素原子又は炭素原子数１ないし６の直鎖
   アルキル基を表わし、 ｎは１ないし６の整数である。〕 で表わされる化合物又はその水溶性塩を含むこと
   を特徴とする亜硝酸塩測定用組成物。