JPH0690206B2 - 抗原抗体複合物及びその使用方法 - Google Patents
抗原抗体複合物及びその使用方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、抗原抗体複合物、及びこの抗原抗体複合物
の凝集反応試薬としての使用方法に関する。
の凝集反応試薬としての使用方法に関する。
従来において、Rh式血液型の検査に使用する試薬の１つ
に、単クローン性ヒト抗Ｄ抗体がある。この単クローン
性ヒト抗Ｄ抗体の製造法及びその使用方法については、
第13回日本免疫学会（1983年）の研究論文集第416〜417
頁に記載されているほか、昭和58年特許出願公表第5003
66号公報，昭和59年特許出願公開第138959号公報，昭和
60年特許出願公開第70361号公報などに記載されてい
る。又、他の試薬としては、ヒト血清から得られる多ク
ローン性ヒト抗Ｄ抗体があり、これは現在において公的
に認可された試薬として常用されているものである。
又、ウイルス抗原を検出するための方法として逆受身赤
血球凝集反応があり、単クロローン性マウス抗HBs抗体
をヒツジ赤血球に感作して製造した試薬が常用されてい
る。
に、単クローン性ヒト抗Ｄ抗体がある。この単クローン
性ヒト抗Ｄ抗体の製造法及びその使用方法については、
第13回日本免疫学会（1983年）の研究論文集第416〜417
頁に記載されているほか、昭和58年特許出願公表第5003
66号公報，昭和59年特許出願公開第138959号公報，昭和
60年特許出願公開第70361号公報などに記載されてい
る。又、他の試薬としては、ヒト血清から得られる多ク
ローン性ヒト抗Ｄ抗体があり、これは現在において公的
に認可された試薬として常用されているものである。
又、ウイルス抗原を検出するための方法として逆受身赤
血球凝集反応があり、単クロローン性マウス抗HBs抗体
をヒツジ赤血球に感作して製造した試薬が常用されてい
る。
前記した試薬のうち、単クローン性抗体は、対応する抗
原と反応するが、反応が弱いため種々の検査方法のうち
の一部にのみしか使用出来ない問題点がある。例えば、
前記したRh式血液型の検査方法として、抗ヒトグロブリ
ン法，ブロメリン法，アルブミン法及び生理食塩液法が
あるが、前記第13回日本免疫学会で発表された単クロー
ン性ヒト抗Ｄ抗体は、抗ヒトグロブリン法及びブロメリ
ン法による凝集でRh（Ｄ）抗原の血液型の判定はできる
が、他の検査方法、すなわち、アルブミン法、生理食塩
液法では凝集反応を起さないことから、この単クローン
性ヒト抗Ｄ抗体の使用方法が限定されていた。また、前
記多クローン性ヒト抗Ｄ抗体はヒト血清をそのまま使用
するか、又はこのヒト血清を適当な希釈液で希釈したヒ
ト由来の検査試薬であるために、大量の検体を試験する
ためには血清量が多量に必要である。しかしながら、ヒ
ト血清はRh陰性の人にRh陽性の血液を何らかの方法で投
与して得られるのが通常であるので、人手が困難である
という問題点がある。又、ウイルス抗原を検出する試薬
として、単クローン性抗HBs抗体感作ヒツジ赤血球を用
いた場合には、ウイルス抗原の検出感度が低いという問
題点がある。
原と反応するが、反応が弱いため種々の検査方法のうち
の一部にのみしか使用出来ない問題点がある。例えば、
前記したRh式血液型の検査方法として、抗ヒトグロブリ
ン法，ブロメリン法，アルブミン法及び生理食塩液法が
あるが、前記第13回日本免疫学会で発表された単クロー
ン性ヒト抗Ｄ抗体は、抗ヒトグロブリン法及びブロメリ
ン法による凝集でRh（Ｄ）抗原の血液型の判定はできる
が、他の検査方法、すなわち、アルブミン法、生理食塩
液法では凝集反応を起さないことから、この単クローン
性ヒト抗Ｄ抗体の使用方法が限定されていた。また、前
記多クローン性ヒト抗Ｄ抗体はヒト血清をそのまま使用
するか、又はこのヒト血清を適当な希釈液で希釈したヒ
ト由来の検査試薬であるために、大量の検体を試験する
ためには血清量が多量に必要である。しかしながら、ヒ
ト血清はRh陰性の人にRh陽性の血液を何らかの方法で投
与して得られるのが通常であるので、人手が困難である
という問題点がある。又、ウイルス抗原を検出する試薬
として、単クローン性抗HBs抗体感作ヒツジ赤血球を用
いた場合には、ウイルス抗原の検出感度が低いという問
題点がある。
そこでこの出願の発明者らは、前記した試薬としての単
クローン性抗体、多クローン性抗体あるいは単クローン
性ヒト抗HBs抗体感作ヒツジ赤血球等を有する問題点の
解決を図るため、IgGタイプの単クローン性抗体２分子
に、この抗体に対する単クローン性抗IgG抗体又は多ク
ローン抗体IgG抗体を２分子又は１分子を結合した抗原
抗体複合物が、凝集反応試薬としてあるいはその他に有
効に利用できることを見い出した。
クローン性抗体、多クローン性抗体あるいは単クローン
性ヒト抗HBs抗体感作ヒツジ赤血球等を有する問題点の
解決を図るため、IgGタイプの単クローン性抗体２分子
に、この抗体に対する単クローン性抗IgG抗体又は多ク
ローン抗体IgG抗体を２分子又は１分子を結合した抗原
抗体複合物が、凝集反応試薬としてあるいはその他に有
効に利用できることを見い出した。
前記したIgGタイプの単クローン性抗体は、赤血球表面
抗原（血液型物質），ウイルス抗原の判定の際に使用さ
れるもので、具体的には、血液型に対する抗体，ウイル
スに対する抗体である。このようなIgGタイプの単クロ
ーン性抗体に対し、この抗体に対する単クローン性抗Ig
G抗体又は多クローン性抗IgG抗体を反応させたときの反
応系は、第１図（ａ）に示されるように、IgGタイプの
単クローン性抗体（例えば、単クローン性ヒト抗Ｄ抗
体）に単クローン性抗IgG抗体（例えば、単クローン性
抗ヒトIgG抗体）又は多クローン性抗IgG抗体（例えば、
多クローン性抗ヒトIgG抗体）を抗原抗体反応させるこ
とによって、IgGタイプの単クローン性抗体の２分子が
単クローン性抗IgG抗体の２分子又は１分子と結合し抗
原抗体複合物を形成する。この抗原抗体複合物を、検出
目的とする抗原（例えば、Rh（Ｄ）陽性血球）に添加し
て２次反応させると、第１図（ｂ）に示すように、この
抗原に抗原抗体複合物の活性部位が結合して、凝集反応
として人の目で瞬時に感知できる状態となって、目的と
する抗原を検出することができるのである。
抗原（血液型物質），ウイルス抗原の判定の際に使用さ
れるもので、具体的には、血液型に対する抗体，ウイル
スに対する抗体である。このようなIgGタイプの単クロ
ーン性抗体に対し、この抗体に対する単クローン性抗Ig
G抗体又は多クローン性抗IgG抗体を反応させたときの反
応系は、第１図（ａ）に示されるように、IgGタイプの
単クローン性抗体（例えば、単クローン性ヒト抗Ｄ抗
体）に単クローン性抗IgG抗体（例えば、単クローン性
抗ヒトIgG抗体）又は多クローン性抗IgG抗体（例えば、
多クローン性抗ヒトIgG抗体）を抗原抗体反応させるこ
とによって、IgGタイプの単クローン性抗体の２分子が
単クローン性抗IgG抗体の２分子又は１分子と結合し抗
原抗体複合物を形成する。この抗原抗体複合物を、検出
目的とする抗原（例えば、Rh（Ｄ）陽性血球）に添加し
て２次反応させると、第１図（ｂ）に示すように、この
抗原に抗原抗体複合物の活性部位が結合して、凝集反応
として人の目で瞬時に感知できる状態となって、目的と
する抗原を検出することができるのである。
第３図（ａ）及び（ｂ）は、従来の単クローン性ヒト抗
Ｄ抗体を用いてRh式血液型Ｄ抗原を検出する場合の抗ヒ
トグロブリン試験の凝集反応系を示した模式図である。
この反応は、まず、第３図（ａ）に示すようにRh（Ｄ）
陽性血球に単クローン性ヒト抗Ｄ抗体を加え37℃で数十
分間の加温によって単クローン性ヒト抗Ｄ抗体の活性部
位がRh（Ｄ）抗原（Rh（Ｄ）陽性血球）に結合し、抗Ｄ
抗体感作血球を形成する。この状態では、凝集として確
認できないことから、第３図（ｂ）に示すように、次に
抗ヒトグロブリン血清（多クローン性抗ヒトIgG抗体）
を添加することによって多クローン性抗ヒトIgG抗体の
活性部位が単クローン性ヒト抗Ｄ抗体に結合し、凝集反
応として人の目で確認できるようになるのである。
Ｄ抗体を用いてRh式血液型Ｄ抗原を検出する場合の抗ヒ
トグロブリン試験の凝集反応系を示した模式図である。
この反応は、まず、第３図（ａ）に示すようにRh（Ｄ）
陽性血球に単クローン性ヒト抗Ｄ抗体を加え37℃で数十
分間の加温によって単クローン性ヒト抗Ｄ抗体の活性部
位がRh（Ｄ）抗原（Rh（Ｄ）陽性血球）に結合し、抗Ｄ
抗体感作血球を形成する。この状態では、凝集として確
認できないことから、第３図（ｂ）に示すように、次に
抗ヒトグロブリン血清（多クローン性抗ヒトIgG抗体）
を添加することによって多クローン性抗ヒトIgG抗体の
活性部位が単クローン性ヒト抗Ｄ抗体に結合し、凝集反
応として人の目で確認できるようになるのである。
これに対して、この発明の抗原抗体複合物を使用した時
は、前記したように一度の反応で凝集が生成されて瞬時
に血液型の判定が可能となった。
は、前記したように一度の反応で凝集が生成されて瞬時
に血液型の判定が可能となった。
第２図（ａ），第２図（ｂ）及び第２図（ｃ）は、ウイ
ルス抗原の判定の際に用いられる逆受身赤血球凝集反応
にこの発明の抗原抗体複合物を使用した反応系を示す模
式図である。この反応は、まず、第２図（ａ）に示すよ
うに、IgGタイプの単クローン性抗体（例えば、単クロ
ーン性マウス抗HBs抗体）に単クローン性抗IgG抗体（例
えば、単クローン性抗マウスIgG抗体）又は、多クロー
ン性抗IgG抗体（例えば、多クローン性抗マウスIgG抗
体）を抗原抗体反応させることによって、IgGタイプの
単クローン性抗体の２分子が単クローン性抗IgG抗体、
又は、多クローン性抗IgG抗体の２分子または１分子と
結合し、抗原抗体複合物を形成する。次に、第２図
（ｂ）に示すように、長期保存するためにグルタルアル
デヒド処理を行ったヒンジ赤血球に前記した抗原抗体複
合物を感作させると、ウイルス抗原の検出試薬となる抗
原抗体複合物感作ヒツジ赤血球が製造できる、第２図
（ｃ）に示すように、この試薬を検出目的とする抗原
（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原であるHBs抗原）
に添加すると、感作ヒツジ赤血球に吸着している特異抗
体（単クローン性マウス抗HBs抗体）と反応し、凝集反
応が起こり、人の目で凝集が感知できる状態となって、
目的とする抗原を検出することができるのである。
ルス抗原の判定の際に用いられる逆受身赤血球凝集反応
にこの発明の抗原抗体複合物を使用した反応系を示す模
式図である。この反応は、まず、第２図（ａ）に示すよ
うに、IgGタイプの単クローン性抗体（例えば、単クロ
ーン性マウス抗HBs抗体）に単クローン性抗IgG抗体（例
えば、単クローン性抗マウスIgG抗体）又は、多クロー
ン性抗IgG抗体（例えば、多クローン性抗マウスIgG抗
体）を抗原抗体反応させることによって、IgGタイプの
単クローン性抗体の２分子が単クローン性抗IgG抗体、
又は、多クローン性抗IgG抗体の２分子または１分子と
結合し、抗原抗体複合物を形成する。次に、第２図
（ｂ）に示すように、長期保存するためにグルタルアル
デヒド処理を行ったヒンジ赤血球に前記した抗原抗体複
合物を感作させると、ウイルス抗原の検出試薬となる抗
原抗体複合物感作ヒツジ赤血球が製造できる、第２図
（ｃ）に示すように、この試薬を検出目的とする抗原
（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原であるHBs抗原）
に添加すると、感作ヒツジ赤血球に吸着している特異抗
体（単クローン性マウス抗HBs抗体）と反応し、凝集反
応が起こり、人の目で凝集が感知できる状態となって、
目的とする抗原を検出することができるのである。
第４図（ａ）及び第４図（ｂ）は、単クローン性マウス
抗HBs抗体を用いてHBs抗原を検出する従来の逆受身赤血
球凝集反応系を示した模式図である。この反応は、ま
ず、第４図（ａ）に示すように、単クローン性マウス抗
HBs抗体にグルタルアルデヒド処理済みののヒツジ赤血
球に感作して、単クローン性マウス抗HBs抗体感作ヒツ
ジ赤血球を作り、これをHBs抗原検出試薬としていた。
この試薬を用いると、第４図（ｂ）に示すように、HBs
抗原と凝集反応が起こり人の目で確認できるが、前記し
た第２図（ｃ）の凝集反応に比してウイルス抗原の検出
感度が低い。
抗HBs抗体を用いてHBs抗原を検出する従来の逆受身赤血
球凝集反応系を示した模式図である。この反応は、ま
ず、第４図（ａ）に示すように、単クローン性マウス抗
HBs抗体にグルタルアルデヒド処理済みののヒツジ赤血
球に感作して、単クローン性マウス抗HBs抗体感作ヒツ
ジ赤血球を作り、これをHBs抗原検出試薬としていた。
この試薬を用いると、第４図（ｂ）に示すように、HBs
抗原と凝集反応が起こり人の目で確認できるが、前記し
た第２図（ｃ）の凝集反応に比してウイルス抗原の検出
感度が低い。
以上に述べた種々の凝集反応は、抗体の結合によって血
球の間の距離が大きくなるため、血球間の反発力が弱め
られる結果、凝集が起こりやすくなると考えられてい
る。
球の間の距離が大きくなるため、血球間の反発力が弱め
られる結果、凝集が起こりやすくなると考えられてい
る。
この発明の実施例について以下説明する。
実施例１ この実施例は、IgGタイプの単クローン性抗体として単
クローン性ヒト抗Ｄ抗体、単クローン性抗IgG抗体とし
て単クローン性抗ヒトIgG抗体を使用した場合の実施例
である。
クローン性ヒト抗Ｄ抗体、単クローン性抗IgG抗体とし
て単クローン性抗ヒトIgG抗体を使用した場合の実施例
である。
（１） 単クローン性ヒト抗Ｄ抗体の製法 Rh（Ｄ）陰性者のうち抗Ｄ抗体保有者の末梢リンパ球に
EBV（Epstein-Barrウイルス）を感染させトランスフォ
ームした細胞を軟寒天法によりクローニングをして単ク
ローン性ヒト抗Ｄ抗体産生株（B2-1株）をクローン化し
た。（以上は、宇野正恒他、第13回日本免疫学会・1983
研究論文集第416〜417頁記載の方法による。） このようにクローン化したB2-1株とJMS-3株（ヒト由来
細胞）をPEG-1500で融合し、融合細胞を限界希釈法によ
りクローニングを行い単クローン性ヒト抗Ｄ抗体産生株
（B-7-D-10株）を確立した。この抗Ｄ抗体の精製は、50
％硫酸アンモニウム法でIgG分画で粗精製した後、更にD
EAEセファセル（ファルマシア製）を用いて0.0175molリ
ン酸緩衝液（PH6.8）でIgG分画、すなわちIgGタイプの
単クローン性ヒト抗Ｄ抗体を得た。
EBV（Epstein-Barrウイルス）を感染させトランスフォ
ームした細胞を軟寒天法によりクローニングをして単ク
ローン性ヒト抗Ｄ抗体産生株（B2-1株）をクローン化し
た。（以上は、宇野正恒他、第13回日本免疫学会・1983
研究論文集第416〜417頁記載の方法による。） このようにクローン化したB2-1株とJMS-3株（ヒト由来
細胞）をPEG-1500で融合し、融合細胞を限界希釈法によ
りクローニングを行い単クローン性ヒト抗Ｄ抗体産生株
（B-7-D-10株）を確立した。この抗Ｄ抗体の精製は、50
％硫酸アンモニウム法でIgG分画で粗精製した後、更にD
EAEセファセル（ファルマシア製）を用いて0.0175molリ
ン酸緩衝液（PH6.8）でIgG分画、すなわちIgGタイプの
単クローン性ヒト抗Ｄ抗体を得た。
（２） 単クローン性抗ヒトIgG抗体の製法 BALB/CマウスにヒトIgG（ヒト血清をDEAEセファセルを
用いて精製したもの）を免疫後、脾臓を摘出して得られ
た細胞とP3-X63-Ag 8-U1株（BALB/Cマウス由来）をPEG-
4000で融合し、融合細胞を限界希釈法でクローニングを
行い、単クローン性抗ヒトIgG抗体産生株を確立した
（渡辺武、1978、免疫実験操作法IX:2963頁に記載の方
法。）。抗IgG抗体の精製は、前記（１）と同様に行いI
gGタイプの単クローン性抗ヒトIgG抗体を得た。
用いて精製したもの）を免疫後、脾臓を摘出して得られ
た細胞とP3-X63-Ag 8-U1株（BALB/Cマウス由来）をPEG-
4000で融合し、融合細胞を限界希釈法でクローニングを
行い、単クローン性抗ヒトIgG抗体産生株を確立した
（渡辺武、1978、免疫実験操作法IX:2963頁に記載の方
法。）。抗IgG抗体の精製は、前記（１）と同様に行いI
gGタイプの単クローン性抗ヒトIgG抗体を得た。
（３） 単クローン性ヒト抗Ｄ抗体の力価の決定前記
（１）で得た被検抗Ｄ抗体を生理食塩液を用いて0.1ml
の系列で、２倍連続希釈を行い、２％Rh（Ｄ）陽性血球
（生理食塩液浮遊）を１滴ずつ加え、37℃で60分間反応
させた後、生理食塩液で３回洗浄してから、抗ヒトグロ
ブリン血清を２滴ずつ加えて、3400rpmで15秒間遠心分
離した後、凝集を示した最高の希釈倍率を力価とした。
（１）で得た被検抗Ｄ抗体を生理食塩液を用いて0.1ml
の系列で、２倍連続希釈を行い、２％Rh（Ｄ）陽性血球
（生理食塩液浮遊）を１滴ずつ加え、37℃で60分間反応
させた後、生理食塩液で３回洗浄してから、抗ヒトグロ
ブリン血清を２滴ずつ加えて、3400rpmで15秒間遠心分
離した後、凝集を示した最高の希釈倍率を力価とした。
（４） 単クローン性抗ヒトIgG抗体の力価の決定 前記（２）で得た被検抗IgG抗体を希釈液（３％ウシ胎
児血清、0.1％NaN3を含む生理食塩液）を用いて、0.1ml
の系列で２倍連続希釈を行い、２％抗Ｄ感作血球生理食
塩液〔Rh式血液型R1R2血球の２％生理食塩浮遊液１容に
抗Ｄ血清（国家検定済みアルブミン液抗体）を生理食塩
液で100倍したものを１容加え37℃で１時間感作したも
の〕を１滴ずつ加えて、3400rpmで15秒間遠心分離し、
凝集を示した最高の希釈倍数を力価とした。
児血清、0.1％NaN3を含む生理食塩液）を用いて、0.1ml
の系列で２倍連続希釈を行い、２％抗Ｄ感作血球生理食
塩液〔Rh式血液型R1R2血球の２％生理食塩浮遊液１容に
抗Ｄ血清（国家検定済みアルブミン液抗体）を生理食塩
液で100倍したものを１容加え37℃で１時間感作したも
の〕を１滴ずつ加えて、3400rpmで15秒間遠心分離し、
凝集を示した最高の希釈倍数を力価とした。
（５） 抗原抗体複合物の製法 前記（１）で得た単クローン性ヒト抗Ｄ抗体を希釈液
（10％ウシ胎児血清、２％ウシアルブミン、0.1％NaN3
を含む0.013molリン酸緩衝食塩液PH7.0）で希釈し、Rh
（Ｄ）陽性血球との間接抗グロブリン試験で力価が4096
倍になるように調整した液１容に対し、前記（２）で
得、そして前記（４）で求めた力価を256倍に調整した
単クローン性抗ヒトIgG抗体を１容加え、37℃で１時間
加温して製造した。これによって、IgGタイプの単クロ
ーン性ヒト抗Ｄ抗体（単クローン性抗体）２分子に、こ
の抗体に対する単クローン性抗ヒトIgG抗体（単クロー
ン性抗IgG抗体）を２分子又は１分子が結合した抗原抗
体複合物を得た（第１図（ａ）参照）。
（10％ウシ胎児血清、２％ウシアルブミン、0.1％NaN3
を含む0.013molリン酸緩衝食塩液PH7.0）で希釈し、Rh
（Ｄ）陽性血球との間接抗グロブリン試験で力価が4096
倍になるように調整した液１容に対し、前記（２）で
得、そして前記（４）で求めた力価を256倍に調整した
単クローン性抗ヒトIgG抗体を１容加え、37℃で１時間
加温して製造した。これによって、IgGタイプの単クロ
ーン性ヒト抗Ｄ抗体（単クローン性抗体）２分子に、こ
の抗体に対する単クローン性抗ヒトIgG抗体（単クロー
ン性抗IgG抗体）を２分子又は１分子が結合した抗原抗
体複合物を得た（第１図（ａ）参照）。
（６） 抗原抗体複合物のRh式血液型の検査試薬として
凝集反応への使用 前記（５）で得た抗原抗体複合物を、Rh（Ｄ）陽性血球
と反応させると強い凝集反応を認めた（第１図（ｂ）参
照）。Rh（Ｄ）陰性血球とは凝集反応を認めなかった。
凝集反応への使用 前記（５）で得た抗原抗体複合物を、Rh（Ｄ）陽性血球
と反応させると強い凝集反応を認めた（第１図（ｂ）参
照）。Rh（Ｄ）陰性血球とは凝集反応を認めなかった。
次に、この検査例を表１及び表２で示す。表１は、生理
食塩液法で従来試薬の１つである単クローン性ヒト抗Ｄ
抗体とこの発明の抗原抗体複合物を使用して、それぞれ
検査を実施した場合の例である。この抗原抗体複合物を
使用した場合には強い凝集反応が認められたが、単クロ
ーン性ヒト抗Ｄ抗体を使用した場合には何ら反応が認め
られなかった。
食塩液法で従来試薬の１つである単クローン性ヒト抗Ｄ
抗体とこの発明の抗原抗体複合物を使用して、それぞれ
検査を実施した場合の例である。この抗原抗体複合物を
使用した場合には強い凝集反応が認められたが、単クロ
ーン性ヒト抗Ｄ抗体を使用した場合には何ら反応が認め
られなかった。
表２は、前記と同じサンプルについて、現在公的に認め
られた試薬である多クローン性抗Ｄ抗体をアルブミン法
で使用し、この発明の抗原抗体複合物を生理食塩液法で
使用した検査例である。共にRh（Ｄ）陽性血球とは強い
凝集反応が認められ、この抗原抗体複合物が、Rh式血液
型判定の試薬として有用であることが判明した。
られた試薬である多クローン性抗Ｄ抗体をアルブミン法
で使用し、この発明の抗原抗体複合物を生理食塩液法で
使用した検査例である。共にRh（Ｄ）陽性血球とは強い
凝集反応が認められ、この抗原抗体複合物が、Rh式血液
型判定の試薬として有用であることが判明した。
実施例２ この実施例は、IgGタイプの単クローン性抗体として単
クローン性ヒト抗Ｄ抗体、多クローン性抗IgG抗体とし
て多クローン性抗ヒトIgG抗体を使用した場合の実施例
である。
クローン性ヒト抗Ｄ抗体、多クローン性抗IgG抗体とし
て多クローン性抗ヒトIgG抗体を使用した場合の実施例
である。
（１） 単クローン性ヒト抗Ｄ抗体の製法及び力価の決
定は、それぞれ実施例１の（１），（２）と同様に行
う。
定は、それぞれ実施例１の（１），（２）と同様に行
う。
（２） 多クローン性抗ヒトIgG抗体の製法 正常ヒト血清を50％硫酸アンモニウム法でIgG分画と
し、更にDEAEセファセル（ファルマシア製）を用いてIg
G分画を得た。この精製IgGを家兎に免疫し、得られた血
清をノイラミニダーゼ処理ヒト血球で異種凝集素を吸収
後、その血清を50％硫酸アンモニウム法でIgG分画と
し、更にDEAEセファセルで精製し、多クローン性抗ヒト
IgG抗体を得た。
し、更にDEAEセファセル（ファルマシア製）を用いてIg
G分画を得た。この精製IgGを家兎に免疫し、得られた血
清をノイラミニダーゼ処理ヒト血球で異種凝集素を吸収
後、その血清を50％硫酸アンモニウム法でIgG分画と
し、更にDEAEセファセルで精製し、多クローン性抗ヒト
IgG抗体を得た。
（３） 多クローン性抗ヒトIgG抗体の力価の決定は、
実施例１の（４），抗原抗体複合物の製法は実施例１の
（５）と同様に行う。
実施例１の（４），抗原抗体複合物の製法は実施例１の
（５）と同様に行う。
このようにして、IgGタイプの単クローン性抗体２分子
に、この抗体に対する多クローン性抗IgG抗体を２分
子、又は１分子結合した抗原抗体複合物ができる（第１
図（ａ）参照）。
に、この抗体に対する多クローン性抗IgG抗体を２分
子、又は１分子結合した抗原抗体複合物ができる（第１
図（ａ）参照）。
（４） 抗原抗体複合物のRh式血液型の検査試薬として
凝集反応への使用 前記（３）で得た抗原抗体複合物は、Rh（Ｄ）陽性血球
と反応させると強い凝集反応を認め、Rh（Ｄ）陰性血球
とは凝集反応を認めなかった。
凝集反応への使用 前記（３）で得た抗原抗体複合物は、Rh（Ｄ）陽性血球
と反応させると強い凝集反応を認め、Rh（Ｄ）陰性血球
とは凝集反応を認めなかった。
次に、実施例１の表１に対応する検査結果を表３に、実
施例１の表２に対応する検査結果を表４に示す。表3,4
から、単クローン性ヒト抗Ｄ抗体と多クローン性抗ヒト
IgG抗体の複合物の凝集反応性は、実施例１と差を認め
ず、単クローン性ヒト抗Ｄ抗体単独の場合とは異なり、
実施例１と同様に強い凝集反応を示した（第１図（ｂ）
参照）。
施例１の表２に対応する検査結果を表４に示す。表3,4
から、単クローン性ヒト抗Ｄ抗体と多クローン性抗ヒト
IgG抗体の複合物の凝集反応性は、実施例１と差を認め
ず、単クローン性ヒト抗Ｄ抗体単独の場合とは異なり、
実施例１と同様に強い凝集反応を示した（第１図（ｂ）
参照）。
この抗原抗体複合物は、生理食塩液法のほかに前記した
Rh式血液型の検査方法、すなわち、抗ヒトグロブリン
法、ブロメリン法及びアルブミン法のすべての検査方法
において凝集反応を起こす試薬として応用できた。
Rh式血液型の検査方法、すなわち、抗ヒトグロブリン
法、ブロメリン法及びアルブミン法のすべての検査方法
において凝集反応を起こす試薬として応用できた。
この抗原抗体複合物は、次に実施例３及び実施例４にお
いて述べる逆受身赤血球凝集反応にも使用することがで
きる。
いて述べる逆受身赤血球凝集反応にも使用することがで
きる。
実施例３ この実施例は、IgGタイプの単クローン性抗体として単
クローン性マウス抗HBs抗体、単クローン性抗IgG抗体と
して単クローン性抗マウスIgG抗体を使用した場合の実
施例である。
クローン性マウス抗HBs抗体、単クローン性抗IgG抗体と
して単クローン性抗マウスIgG抗体を使用した場合の実
施例である。
（１） 単クローン性マウス抗HBs抗体の製法 BALB/CマウスにHBs抗原（HBs抗原陽性血漿を密度勾配超
遠心分離法にて精製したＢ型肝炎ウイルス関連抗原）を
免疫原として、実施例１の（２）と同様の方法で単クロ
ーン性マウス抗HBs抗体産生株を確立した。抗HBs抗体の
精製は、セファローズ4B（ファルマシア製）に精製HBs
抗原を結合させたアファニティークロマトグラフィーを
用いて、4mol塩化マグネシウムで解離した分画、すなわ
ちHBs抗原に特異な単クローン性マウス抗HBs抗体を得
た。
遠心分離法にて精製したＢ型肝炎ウイルス関連抗原）を
免疫原として、実施例１の（２）と同様の方法で単クロ
ーン性マウス抗HBs抗体産生株を確立した。抗HBs抗体の
精製は、セファローズ4B（ファルマシア製）に精製HBs
抗原を結合させたアファニティークロマトグラフィーを
用いて、4mol塩化マグネシウムで解離した分画、すなわ
ちHBs抗原に特異な単クローン性マウス抗HBs抗体を得
た。
（２） 単クローン性抗マウスIgG抗体の製法 ウシアルブミンを安定剤として含有する単クローン性抗
マウスIgGラット抗体（イムノテック製）を、ブルーセ
ルロファイン（生化学工業製）を用いて0.1molトリス塩
酸緩衝液PH8.0でウシアルブミンをカラムに結合させた
素通り分画、すなわちIgGタイプの単クローン性抗マウ
スIgG抗体を得た。
マウスIgGラット抗体（イムノテック製）を、ブルーセ
ルロファイン（生化学工業製）を用いて0.1molトリス塩
酸緩衝液PH8.0でウシアルブミンをカラムに結合させた
素通り分画、すなわちIgGタイプの単クローン性抗マウ
スIgG抗体を得た。
（３） 抗原抗体複合物の製法 前記（１）で得た単クローン性マウス抗HBs抗体を280nm
における紫外部吸収法で、0.15molリン酸緩衝食塩液PH
7.4（以下PBSという）を希釈液として10mg/mlの濃度に
調整したものに、前記（２）で得た単クローン性抗マウ
スIgG抗体を同様にして1mg/mlの濃度に調整したものを
等容加え４℃で16時間反応させて抗原抗体複合物を製造
した（第２図（ａ）参照）。
における紫外部吸収法で、0.15molリン酸緩衝食塩液PH
7.4（以下PBSという）を希釈液として10mg/mlの濃度に
調整したものに、前記（２）で得た単クローン性抗マウ
スIgG抗体を同様にして1mg/mlの濃度に調整したものを
等容加え４℃で16時間反応させて抗原抗体複合物を製造
した（第２図（ａ）参照）。
（４） 抗原抗体複合物のHBs抗原検査試薬として逆受
身赤血球凝集反応への使用 （イ）感作血球の製法 グルタルアルデヒド処理したヒツジ赤血球にタンニン酸
を用いて、前記（３）で得た抗原抗体複合物又は前記
（１）で得た単クローン性マウス抗HBs抗体を等容加え3
7℃で１時間混合し反応させた。それぞれPBsで５回遠心
洗浄し、２％正常ウマ血清加PBSで１％浮遊液とし感作
ヒツジ赤血球（感作血球）を製造した（第２図（ｂ）参
照）。
身赤血球凝集反応への使用 （イ）感作血球の製法 グルタルアルデヒド処理したヒツジ赤血球にタンニン酸
を用いて、前記（３）で得た抗原抗体複合物又は前記
（１）で得た単クローン性マウス抗HBs抗体を等容加え3
7℃で１時間混合し反応させた。それぞれPBsで５回遠心
洗浄し、２％正常ウマ血清加PBSで１％浮遊液とし感作
ヒツジ赤血球（感作血球）を製造した（第２図（ｂ）参
照）。
（ロ）検査用試薬としての使用 前記（４）−（イ）で得た抗原抗体複合物を感作した試
薬は、従来試薬の１つである単クローン性マウス抗HBs
抗体のみを感作した場合よりも検出感度が約５倍高いこ
とを認めた。
薬は、従来試薬の１つである単クローン性マウス抗HBs
抗体のみを感作した場合よりも検出感度が約５倍高いこ
とを認めた。
次に、この検査例を表５で示す。表５は、Ｖ型パーマネ
ントマイクロプレートを用いて、約5ng/mlのHBs抗原を
含むヒト血清を1.5倍連続希釈したものを検体として、
従来試薬の１つである単クローン性抗HBs抗体のみと、
この発明の抗原抗体複合物をそれぞれ感作した血球を使
用して検査を実施した例である（第２図（ｃ）参照）。
この抗原抗体複合物を使用した場合には7.59倍希釈（約
0.66ng/ml）のHBs抗原まで凝集反応が認められたが、単
クローン性マウス抗HBs抗体のみを使用した場合には1.5
0倍希釈（約3.3ng/ml）のHBs抗原までしか凝集反応が認
められず、この抗原抗体複合物を使用することにより、
逆受身赤血球凝集反応においてHBs抗原の検出感度が単
クローン性マウス抗HBs抗体のみを使用した場合に比べ
て約５倍上昇することが判明した。
ントマイクロプレートを用いて、約5ng/mlのHBs抗原を
含むヒト血清を1.5倍連続希釈したものを検体として、
従来試薬の１つである単クローン性抗HBs抗体のみと、
この発明の抗原抗体複合物をそれぞれ感作した血球を使
用して検査を実施した例である（第２図（ｃ）参照）。
この抗原抗体複合物を使用した場合には7.59倍希釈（約
0.66ng/ml）のHBs抗原まで凝集反応が認められたが、単
クローン性マウス抗HBs抗体のみを使用した場合には1.5
0倍希釈（約3.3ng/ml）のHBs抗原までしか凝集反応が認
められず、この抗原抗体複合物を使用することにより、
逆受身赤血球凝集反応においてHBs抗原の検出感度が単
クローン性マウス抗HBs抗体のみを使用した場合に比べ
て約５倍上昇することが判明した。
実施例４ この実施例は、IgGタイプの単クローン性抗体として単
クローン性マウス抗HBs抗体、多クローン性抗IgG抗体と
して多クローン性抗マウスIgG抗体を使用した場合の実
施例である。
クローン性マウス抗HBs抗体、多クローン性抗IgG抗体と
して多クローン性抗マウスIgG抗体を使用した場合の実
施例である。
（１） 単クローン性マウス抗HBs抗体の製法 実施例３の（１）と同様の方法でHBs抗原に特異な単ク
ローン性マウス抗HBs抗体を得ることができる。
ローン性マウス抗HBs抗体を得ることができる。
（２） 多クローン性抗マウスIgG抗体の製法 BALB/Cマウス血清を硫酸アンモニウムを用いてIgGと
し、Poterの方法（R.R.Poter,Biochem.,J.,73,p.119,19
59）でマウスIgG−Fcを精製した。この精製マウスIgG−
Fcをフロイントコンプリートアジュバントと共に家兎に
免疫し、採血して得られた抗血清をマウスIgG−Fc結合
セファローズ4Bによって分画して多クローン性抗マウス
IgG抗体を得た。
し、Poterの方法（R.R.Poter,Biochem.,J.,73,p.119,19
59）でマウスIgG−Fcを精製した。この精製マウスIgG−
Fcをフロイントコンプリートアジュバントと共に家兎に
免疫し、採血して得られた抗血清をマウスIgG−Fc結合
セファローズ4Bによって分画して多クローン性抗マウス
IgG抗体を得た。
（３） 抗原抗体複合物の製法 前記（１）で得た単クローン性マウス抗HBs抗体を280nm
における紫外部吸収法で、0.15molリン酸緩衝食塩液PH
7.4（以下PBSという）を希釈液として10mg/mlの濃度に
調整したものに、前記（２）で得た多クローン性抗マウ
スIgG抗体を同様にして10mg/mlの濃度に調整したものを
等容加え４℃で16時間反応させた抗原抗体複合物を製造
した（第２図（ａ）参照）。
における紫外部吸収法で、0.15molリン酸緩衝食塩液PH
7.4（以下PBSという）を希釈液として10mg/mlの濃度に
調整したものに、前記（２）で得た多クローン性抗マウ
スIgG抗体を同様にして10mg/mlの濃度に調整したものを
等容加え４℃で16時間反応させた抗原抗体複合物を製造
した（第２図（ａ）参照）。
（４） 抗原抗体複合物のHBs抗原検査試薬として逆受
身赤血球凝集反応への使用 （イ）感作血球の製法 グルタルアルデヒド処理したヒツジ赤血球にタンニン酸
を用いて、前記（３）で得た抗原抗体複合物、又は前記
（１）で得た単クローン性マウス抗HBs抗体を等容加え3
7℃で１時間混合し反応させた。それぞれPBSで５回遠心
洗浄し、２％正常ウマ血清加PBSで１％浮遊液とし感作
ヒツジ赤血球（感作血球）を製造した（第２図（ｂ）参
照）。
身赤血球凝集反応への使用 （イ）感作血球の製法 グルタルアルデヒド処理したヒツジ赤血球にタンニン酸
を用いて、前記（３）で得た抗原抗体複合物、又は前記
（１）で得た単クローン性マウス抗HBs抗体を等容加え3
7℃で１時間混合し反応させた。それぞれPBSで５回遠心
洗浄し、２％正常ウマ血清加PBSで１％浮遊液とし感作
ヒツジ赤血球（感作血球）を製造した（第２図（ｂ）参
照）。
（ロ）検査用試薬としての使用 前記（４）の（イ）で得た抗原抗体複合物を感作した試
薬は、従来試薬の１つである単クローン性マウス抗HBs
抗体のみを感作した場合よりも検出感度が約３倍高いこ
とを認めた。
薬は、従来試薬の１つである単クローン性マウス抗HBs
抗体のみを感作した場合よりも検出感度が約３倍高いこ
とを認めた。
次に、この検査例を表６で示す。表６は、Ｖ型パーマネ
ントマイクロプレートを用いて、約5ng/mlのHBs抗原を
含むヒト血清を1.5倍連続希釈したものを検体として、
従来試薬の１つである単クローン性マウス抗HBs抗体の
みと、この発明の抗原抗体複合物をそれぞれ感作した血
球を使用して検査を実施した例である（第２図（ｃ）参
照）。この抗原抗体複合物を使用した場合には5.06倍希
釈（約0.99ng/ml）のHBs抗原まで凝集反応が認められた
が、単クローン性マウス抗HBs抗体のみを使用した場合
には1.50倍希釈（約3.3ng/ml）のHBs抗原までしか凝集
反応が認められず、この抗原抗体複合物を使用すること
により、逆受身赤血球凝集反応においてHBs抗原の検出
感度が単クローン性マウス抗HBs抗体のみを使用した場
合に 比べて約３倍上昇することが判明した。
ントマイクロプレートを用いて、約5ng/mlのHBs抗原を
含むヒト血清を1.5倍連続希釈したものを検体として、
従来試薬の１つである単クローン性マウス抗HBs抗体の
みと、この発明の抗原抗体複合物をそれぞれ感作した血
球を使用して検査を実施した例である（第２図（ｃ）参
照）。この抗原抗体複合物を使用した場合には5.06倍希
釈（約0.99ng/ml）のHBs抗原まで凝集反応が認められた
が、単クローン性マウス抗HBs抗体のみを使用した場合
には1.50倍希釈（約3.3ng/ml）のHBs抗原までしか凝集
反応が認められず、この抗原抗体複合物を使用すること
により、逆受身赤血球凝集反応においてHBs抗原の検出
感度が単クローン性マウス抗HBs抗体のみを使用した場
合に 比べて約３倍上昇することが判明した。
この抗原抗体複合物は、上記の血液凝集反応、逆受身赤
血球凝集反応の他に、ラテックス凝集反応などにも応用
することができる。
血球凝集反応の他に、ラテックス凝集反応などにも応用
することができる。
以上の説明からも明らかなように、血液型判定の際に使
用する抗体は、従来の単クローン性抗体のみの試薬で
は、一部の検査方法に対してのみしか凝集反応が起こさ
ず実用的に使用することが困難であったが、この発明の
抗原抗体複合物は、Rh式血液型の検査試薬として使用し
た場合において、凝集反応を利用する全ての検査方法に
おいて有効に利用することができると共に多クローン性
抗Ｄ抗体のようにヒト血清を必要としないので、原材料
の入手も容易である利点がある。更に、この発明の抗原
抗体複合物を感作したヒツジ赤血球においては、ウイル
ス例えばHBs抗原に対して顕著な凝集反応を示し、従来
の単クローン性マウス抗HBs抗体のみを感作したヒツジ
赤血球による試薬に比べて約３倍〜５倍の感度で反応す
るため、検査試薬として非常に有効である。
用する抗体は、従来の単クローン性抗体のみの試薬で
は、一部の検査方法に対してのみしか凝集反応が起こさ
ず実用的に使用することが困難であったが、この発明の
抗原抗体複合物は、Rh式血液型の検査試薬として使用し
た場合において、凝集反応を利用する全ての検査方法に
おいて有効に利用することができると共に多クローン性
抗Ｄ抗体のようにヒト血清を必要としないので、原材料
の入手も容易である利点がある。更に、この発明の抗原
抗体複合物を感作したヒツジ赤血球においては、ウイル
ス例えばHBs抗原に対して顕著な凝集反応を示し、従来
の単クローン性マウス抗HBs抗体のみを感作したヒツジ
赤血球による試薬に比べて約３倍〜５倍の感度で反応す
るため、検査試薬として非常に有効である。
第１図（ａ）はこの発明の抗原抗体複合物の製造方法の
模式図及び抗原抗体複合物の模式図を示し、第１図
（ｂ）は抗原抗体複合物とRh（Ｄ）陽性血球の凝集反応
の模式図を示し、第２図（ａ）はこの発明の抗原抗体複
合物の製造方法の模式図及び抗原抗体複合物の模式図を
示し、第２図（ｂ）は抗原抗体複合物とヒツジ赤血球の
感作方法及び抗原抗体複合物感作ヒツジ赤血球の模式図
を示し、第２図（ｃ）は抗原抗体複合物感作ヒツジ赤血
球とHBs抗原の逆受身赤血球凝集反応の模式図を示し、
第３図（ａ）及び第３図（ｂ）は従来の試薬である単ク
ローン性抗体を使用した抗ヒトグロブリン検査法での凝
集反応模式図を示し、第４図（ａ）は従来の試薬である
単クローン性マウス抗HBs抗体感作ヒツジ赤血球の製法
の模式図を示し、第４図（ｂ）は、従来の試薬である単
クローン性マウス抗HBs抗体感作ヒツジ赤血球を使用し
たHBs抗原の逆受身赤血球凝集反応の模式図である。
模式図及び抗原抗体複合物の模式図を示し、第１図
（ｂ）は抗原抗体複合物とRh（Ｄ）陽性血球の凝集反応
の模式図を示し、第２図（ａ）はこの発明の抗原抗体複
合物の製造方法の模式図及び抗原抗体複合物の模式図を
示し、第２図（ｂ）は抗原抗体複合物とヒツジ赤血球の
感作方法及び抗原抗体複合物感作ヒツジ赤血球の模式図
を示し、第２図（ｃ）は抗原抗体複合物感作ヒツジ赤血
球とHBs抗原の逆受身赤血球凝集反応の模式図を示し、
第３図（ａ）及び第３図（ｂ）は従来の試薬である単ク
ローン性抗体を使用した抗ヒトグロブリン検査法での凝
集反応模式図を示し、第４図（ａ）は従来の試薬である
単クローン性マウス抗HBs抗体感作ヒツジ赤血球の製法
の模式図を示し、第４図（ｂ）は、従来の試薬である単
クローン性マウス抗HBs抗体感作ヒツジ赤血球を使用し
たHBs抗原の逆受身赤血球凝集反応の模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松倉 晴道 大阪府大阪市城東区森之宮２丁目４番43号 大阪府赤十字血液センター内 (72)発明者 大久保 康人 大阪府大阪市城東区森之宮２丁目４番43号 大阪府赤十字血液センター内
Claims (2)
- 【請求項１】IgGタイプの単クローン性抗体２分子に、
この抗体に対する単クローン性抗IgG抗体又は多クロー
ン抗体IgG抗体を２分子又は１分子結合した抗原抗体複
合物。 - 【請求項２】IgGタイプの単クローン性抗体２分子に、
この抗体に対する単クローン性抗IgG抗体又は多クロー
ン抗体IgG抗体を２分子又は１分子結合した抗原抗体複
合物を凝集反応に使用する抗原抗体複合物の使用方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-139887 | 1986-06-16 | ||
| JP13988786 | 1986-06-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63127162A JPS63127162A (ja) | 1988-05-31 |
| JPH0690206B2 true JPH0690206B2 (ja) | 1994-11-14 |
Family
ID=15255904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62145950A Expired - Lifetime JPH0690206B2 (ja) | 1986-06-16 | 1987-06-10 | 抗原抗体複合物及びその使用方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0321604B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0690206B2 (ja) |
| DE (1) | DE3780315D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| FR2676123B1 (fr) * | 1991-05-02 | 1994-06-17 | Pasteur Diagnostics | Complexe agglutinant et reactif d'identification d'antigenes sur les parois cellulaires. |
| JP3569074B2 (ja) * | 1996-05-27 | 2004-09-22 | 積水化学工業株式会社 | イムノアッセイ法 |
| US20070269840A1 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-22 | Idexx Laboratories, Inc. | In-situ equilibrium dialysis |
| CN106483303A (zh) * | 2015-08-24 | 2017-03-08 | 北京中检安泰诊断科技有限公司 | 人类血型检测试剂盒及其制备方法 |
| CN108693346B (zh) * | 2017-09-25 | 2021-03-09 | 广东睿碁生物科技有限公司 | 外源凝集素a1血型检测试剂卡及其制备方法 |
| CN108693360B (zh) * | 2017-09-25 | 2021-03-09 | 广东睿碁生物科技有限公司 | 氧化锆微珠稀有血型检测试剂卡及其制备方法 |
| CN108693361B (zh) * | 2017-09-25 | 2021-03-09 | 广东睿碁生物科技有限公司 | 氧化锆微珠abo血型正反定型试剂卡及其制备方法 |
| CN108693359B (zh) * | 2017-09-25 | 2021-02-09 | 广东睿碁生物科技有限公司 | 氧化锆微珠Rh血型分型试剂卡及其制备方法 |
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Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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