JPH0568573A - 放線菌ｄｎａのクローニングに有用な２機能性コスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、異種宿主、例えば、ストレプトミ
セス・リビダンス中のテトラサイクリンおよびクロロテ
トラサイクリンの合成を指令する分離したＤＮＡ遺伝子
クラスターのクローニングおよび発現に有用である新規
なコスミドに関する。このプラスミド（コスミド）は、
大腸菌中で構成されたコスミドのライブラリーをストレ
プトミセス・リビダンス中のテトラサイクリン抵抗性の
発現についてスクリーニングすることによって分離され
る。プラスミドＬＰ²１２７およびＬＰ²１２８は、テト
ラサイクリンおよびクロロテトラサイクリンの合成を指
令することが寒天のＨＰＬＣ分析およびブロス発酵によ
り示された、このようなテトラサイクリン抵抗性のスト
レプトミセス・リビダンスから回収される。 【効果】 本発明のコスミドは発酵収率の増強や有用産
生物のスクリーニングに使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、種々のクローニングおよび発現
の能力をもつ、新規な有用なコスミドに関する。例え
ば、本発明のコスミドは、ストレプトミセス・アウレオ
ファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）からの
クロロテトラサイクリン、およびこうしてまた、テトラ
サイクリンの生合成のための全体の経路、および異種宿
主ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）中のその発現をエンコードする、遺伝子クラスター
（ｃｌｕｓｔｅｒ）（ＤＮＡ）のクローニングにおいて
有用である。これらのコスミドの使用は、発酵収率の増
強ならびに新規な産生物、例えば、抗生物質、タンパク
質および／またはポリペプチドを決定するための新規な
スクリーンにおいて使用されることに関係する。

【０００２】抗生物質のクロロテトラサイクリンおよび
その誘導体化合物（例えば、テトラサイクリン、デメチ
ルクロロテトラサイクリン、デメチルテトラサイクリ
ン）は、商業的に深部発酵においてストレプトミセス・
アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）により産生される［ズガー
（Ｄｕｇａｒ）、１９４８］。この微生物の工業的操作
の３０年以上の間に、発酵の収率の有意の改良を可能と
した、複雑な発酵技術および培地配合物が開発された
［グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）、１９８５］。収率の
改良のこれらの進歩は、また、抗生物質の産生能力が増
加したストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．
ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）の突然変異の分離により促
進された［ベセロバ（Ｖｅｓｅｌｏｖａ）、１９６
９］。これらの高い産生性の菌株は、突然変異誘発法お
よび引き続く改良された収率についてランダムにスクリ
ーニングすることによって、大部分分離された。同一の
技術は抗生物質の生合成においてブロッキングされた突
然変異の分離を可能とし、これらの突然変異はクロロテ
トラサイクリンの形成の生合成の配列の説明のために重
要な道具であった［マクコーミック（ＭｃＣｏｒｍｉｃ
ｋ）、１９８６］。これらの達成にかかわらず、クロロ
テトラサイクリンの生合成の遺伝子の調節の理解は完全
には実現されなかった。ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ）の遺伝学の分野における最近の開発
は、工業的に重要な代謝物質を産生する有機体の分子遺
伝学を研究するための機会をつくった。

【０００３】ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）の原形質体の融合および引き続く再生により染
色体のマーカーの組み換えの実証［ホップウッド（Ｈｏ
ｐｗｏｏｄ）ら、１９７８およびバルツ（Ｂａｌｔｚ）
ら、１９８１］は、アクチノミセテス属（Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔｅｓ）の遺伝学における重要な事象であっ
た。原形質体の融合の技術の開発の前に、遺伝子の交差
は実証された接合系をもつわずかの種において信頼性を
もって実施することができたのみであり［ホップウッド
（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９６７］、今回の遺伝学的分析
は原形質体化および再生することができる任意の種にお
いて実施することができる。より重要なことには、原形
質体層はプラスミドによる形質転換のために理想的なサ
ブセットであることが証明され、こうしてこれらの有機
体において組み換えＤＮＡ実験を実施する機会をつくっ
た。いくつかの抗生物質抵抗性、例えば、チオストレプ
トファン、ビオマイシンおよびネオマイシン抵抗性の遺
伝子の分離は、生来のストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）プラスミドから容易に選択することが
できるクローニングベクターの構成を可能とした［トン
プソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、１９８２］。

【０００４】クローニングすべき最初の抗生物質の生合
成遺伝子の１つは、抗生物質の色素のウンデシルプロジ
ギオシン（ＵＤＰ）の形成にに関係するＯ−メチルトラ
ンスフェラーゼであった［フェイテルソン（Ｆｅｉｔｅ
ｌｓｏｎ）ら、１９８０］。遺伝子はＵＤＰの生合成の
経路における既知の突然変異を補足するその能力により
同定された。生合成遺伝子を分離するこれらの初期の努
力において使用された他の技術は、メチレノマイシンの
ためのファージＯＣ３１を使用して突然変異のクローニ
ング［チェイター（Ｃｈａｔｅｒ）ら、１９８３］、ア
クチノマシンフェノキサジンシンセターゼについての生
体外の酵素のアッセイを使用して組み換えクローンのｓ
ｉｂ選択［ジョンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９８４］およ
びカンジシンの産生に関係するｐ−アミノ安息香酸シン
セターゼにより与えられるスルホンアミドの抵抗性［ギ
ル（Ｇｉｌ）ら、１９８３］を包含した。バイアラフォ
ス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）の生合成遺伝子は、ブロッキ
ングされた突然変異の相補性を経て同定された［ムラカ
ミら、１９８６］。

【０００５】アクチノルホジンの生合成に関係する遺伝
子を、ストレプトミセス・ケリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の生合成的にブロ
ッキングされた突然変異の相補性によりクローニングさ
れた［マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）ら、１９
８４］。この最後の場合において、異種ストレプトミセ
ス・パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｒｖ
ｕｌｕｓ）の宿主の中に導入したとき、アクチノルホジ
ンを合成する能力を与えることが示された単一のプラス
ミド上で、突然変異の２つのオーバーラッピングするク
ローンの相補的な明確なクラスを組み合わせた。

【０００６】観測の他の重要な系列は、抗生物質の生合
成のための遺伝子が産生性有機体中の同一の抗生物質に
ついて抵抗性の抗原決定基に連鎖されていることであっ
た。こうして、ストレプトマイシン抵抗性を与えるスト
レプトミセス・グリセオフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）からのＤＮＡ断片
は、生合成のブロックを補足するＤＮＡと隣接すること
が示された［ディストラー（Ｄｉｓｔｌｅｒ）ら、１９
８５］。同一の場合はストレプトミセス・フラジアエ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）におい
て見られ、ここでチロシンび生合成の経路において最終
の酵素のアミノ末端のためのＤＮＡ配列を表すように構
成した、混合塩基のオリゴヌクレオチドに対する相同性
について、コスミドのライブラリーをプロービングする
ことによって、生合成遺伝子を同定した［フィッシュマ
ン（Ｆｉｓｈｍａｎ）ら、１９８９］。前にクローニン
グされたチロシン抵抗性遺伝子（ｔｌｒＢ）は、９つの
クラスのブロッキングされた突然変異を補足するＤＮＡ
のこの領域内に含有されることが示された［バルツ（Ｂ
ａｌｔｚ）ら、１９８８］。プロマイシン［バル（Ｖａ
ｒ）２ら、１９８８］およびテトラセノマイシン［モタ
メジ（Ｍｏｔａｍｅｄｉ）ら、１９８７］の場合におい
て、異種宿主のストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中の抗生物質
抵抗性遺伝子の発現についての第１選択は、同一のクロ
ーニングしたＤＮＡ断片上に位置する抗生物質の生合成
遺伝子の引き続く同定を可能とした。

【０００７】核酸プローブの使用は、生合成遺伝子の分
離を促進した。このアプローチは、実施した経路または
前のクローニングに関する情報の前に存在する内容の存
在に依存する。こうして、上のチロシンの場合におい
て、生合成酵素の部分的アミノ酸配列からの情報を使用
してプローブを構成した［フィッシュマン（Ｆｉｓｈｍ
ａｎ）ら、１９８７］。同様に、イソペニシリンＮシン
セターゼのための遺伝子は、酵素のＮ末端のアミノ酸配
列の知識を使用して構成したオリゴヌクレオチドのプロ
ーブに対してハイブリダイゼーションするクローンを同
定することによって、ストレプトミセス・クラブリゲル
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕ
ｓ）からクローニングした［レスキウ（Ｌｅｓｋｉ
ｗ）、１９８８］。エリスロマイシンの生合成に関係す
る遺伝子は、コスミドのライブラリーを前にクローニン
グしたエリスロマイシン抵抗性遺伝子でプロービングす
ることによって同定された［スタンザク（Ｓｔａｎｚａ
ｋ）、１９８６］。同様に、オキシテトラサイクリンの
生合成に関係する遺伝子は、前にクローニングされた抵
抗性抗原決定基［バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）ら、１９８
９］および生合成酵素のアンヒドロテトラサイクリンオ
キシゲナーゼの部分的に説明されたアミノ酸配列に相当
するＤＮＡ配列を表すように合成されたオリゴヌクレオ
チド［ビンニエ（Ｂｉｎｎｉｅ）ら、１９８９］の両者
に対してハイブリダイゼーションすることによって同定
された。異種ａｃｔＩおよびａｃｔＩＩＩプローブの使
用は、ストレプトミセス・ペウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）中のアントラサイ
クリン生合成に関係する遺伝子の同定を可能とした［ス
ツッツマン−エングウォール（Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎ
ｇｗａｌｌ）ら、１９８９］。

【０００８】これらの技術を個々にまたは組み合わせて
使用すると、全体の生合成の経路の分離またはアセング
リングを可能となり、そしてある場合において、異種宿
主中のそれらの発現が可能となった。ビアラフォスのた
めの全生合成クラスターは、相補的活性についての選択
およびビアラフォス抵抗性の異種発現の組み合わせによ
りクローニングされた（ムラカミら、１９８６］。ビア
ラフォス抵抗性について選択することによって、ストレ
プトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓ）中で単一工程で全経路を首尾よく分
離することについて記載されたが、生合成遺伝子の発現
に関して述べられていない。相補的クローンからのアク
チノルホジンのクラスターおよびストレプトミセス・パ
ルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｒｖｕｌｕ
ｓ）中のその発現のアセンブリーは、上で論じられた
［マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）ら、１９８
４］。相同的に誘導されたエリスロマイシン抵抗性抗原
決定基に対してハイブリダイゼーションした２機能性コ
スミドのクローンは、サッカロポリスポラ・エリスレア
（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒ
ｅａ）のライブラリーから分離され、そしてストレプト
ミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）に移したとき、エリスロマイシンの合成
を指令することが示された［スタンザク（Ｓｔａｎｚａ
ｋ）ら、１９８６］。オキシテトラサイクリン抵抗性遺
伝子のプローブおよび生合成遺伝子のプローブ（アンヒ
ドロテトラサイクリンオキシゲナーゼのための）の両者
に対するハイブリダイゼーションを示したＥ．ｃｏｌｉ
コスミドは、ストレプトミセス・リモスス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）からオキシテトラサ
イクリンの生合成クラスターの分離を可能とした［ビン
ニエ（Ｂｉｎｎｉｅ）ら、１９８９］。ストレプトミセ
ス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のプラスミドのベク
ターの中への引き続くサブクローニングは、ストレプト
ミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）中のオキシテトラサイクリンの産生を可
能とした。

【０００９】テトラセノマイシンの産生体からの２つの
オーバーラッピングするクローンは、ストレプトミセス
・グラウセセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌａ
ｕｃｅｓｃｅｎｓ）のブロッキングした突然変異の相補
性およびストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ）中のテトラセノマイシン抵抗性を与える能力
により同定された［モタメジ（Ｍｏｔａｍｅｄｉ）ら、
１９８７］。両者がストレプトミセス・リビダンス
（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の中に別々に存在し、そして
同時に発酵するときか、あるいはそれらが同一のストレ
プトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）宿主
の中に同時に存在するとき、テトラセノマイシンは産生
された。ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅ
ｌｉｃｏｌｏｒ）のａｃｔＩおよびａｃｔＩＩＩプロー
ブに対するハイブリダイゼーションにより、ストレプト
ミセス・ペウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｅ
ｕｃｅｔｉｕｓ）のＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉライブラリー
から分離された２機能性クローンは、ストレプトミセス
・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の中に導入する
とき、色素を添加された抗生物質の合成を指令すること
が示された［スツッツマン−エングウォール（Ｓｔｕｔ
ｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ）、１９８９］。

【００１０】さらに、セプタマイシンＣの産生のための
生合成の経路の分離は起こった［チェン（Ｃｈｅｎ）
ら、１９８８］。この場合において、ストレプトミセス
・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）中のランダムク
ローンは、寒天プラグ発酵法を使用してセファマイシン
Ｃの産生について個々にスクリーニングされた。スクリ
ーニングされた３０，０００のうちのストレプトミセス
・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の１つの形質転
換体は、セファマイシンＣを産生することが示された。

【００１１】本発明は、テトラサイクリンおよびクロロ
テトラサイクリンを産生するための生合成の経路に関係
するＤＮＡ遺伝子のクローニングおよび／または発現に
有用な遺伝子操作の道具を提供する。

【００１２】本発明は、タンパク質および／またはポリ
ペプチドおよび／または抗生物質をクローニングおよび
／または発現する、新規なかつ有用なコスミドに関す
る。例えば、本発明のコスミドは、ストレプトミセス・
アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）からテトラサイクリンおよび
クロロテトラサイクリンの形成のための全生合成経路の
クローニングおよび異種宿主のストレプトミセス・リビ
ダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）中のその発現において有用である。さらに、これら
のコスミドは、これらの抗生物質、クロロテトラサイク
リンおよびテトラサイクリンを産生する生合成経路の遺
伝情報を指定する分離したＤＮＡ遺伝子（クラスター）
のクローニングおよび発現において使用し、そしてこの
分野において知られている厳格なハイブリダイゼーショ
ン条件下に、クロロテトラサイクリンおよびテトラサイ
クリンの形成のための経路をエンコードするＤＮＡの分
離した遺伝子クラスターにハイブリダイゼーションする
ＤＮＡに使用する。さらに、本発明は、これらの抗生物
質および他の産生物の収率を増加するために、そしてテ
トラサイクリンおよびクロロテトラサイクリンまたは他
の所望の産生物に対する新規な類似体の産生についてス
クリーニングする方法において使用することに関する。

【００１３】生合成遺伝子の分離を進行させるために、
テトラサイクリン抵抗性を発現するクローンのための組
み換えストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ）のスクリーンを使用する。ライブラリーからな
る組み換えコスミドにおけるストレプトミセス・アウレ
オファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮ
Ａインサートは必然的に大きい。なぜなら、使用する試
験管内のラムダのパッケージング系の拘束は、生存能力
のある形質導入性ファージ粒子を生ずるために、２５〜
４０ＫｂのＤＮＡインサートをもつコスミド分子を必要
とするからである。テトラサイクリン抵抗性のクローン
をストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕ
ｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ゲノムのクローンのこの集団か
ら選択するとき、制限されたサブセットのコスミドのク
ローンが選択される。これらの多くまたはすべては、選
択したテトラサイクリン抵抗性遺伝子に連鎖した抗生物
質生合成遺伝子を含有することが期待される。十分に大
きくかつ正しく位置するものには、全生合成経路を包含
するサブセットが存在する。こうして、テトラサイクリ
ンおよびクロロテトラサイクリンの形成のための遺伝
子、および事実遺伝子のすべてのクローニングは、領域
の構造または配列の前以て存在する知識なしに可能であ
る。ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）から
のテトラサイクリン抵抗性の抗原決定基［レイネス（Ｒ
ｅｙｎｅｓ）ら、１９８８］およびブロモペルオキシダ
ーゼ［バム・ピー（Ｖａｍ Ｐｅｅ）、１９８８］のク
ローニングに関する報告は発表されたが、これらの研究
はクロロテトラサイクリン生合成遺伝子または全遺伝子
クラスターの分離にまったく拡張されていない。

【００１４】本発明のより詳細な説明を実施例を通して
下に記載する。これらの実施例は本発明の例示であり、
そして本発明を限定しない。

【００１５】ＤＮＡの分離に使用する方法は、浸透緩衝
液中の細胞のリゾチーム消化、引き続くおだやかな溶
菌、タンパク質の抽出および高分子量のＤＮＡの濃縮を
包含する。記載する方法は効率よいが、当業者は認識す
るように、種々の別の手順、例えば、ホップウッド（Ｈ
ｏｐｗｏｏｄ）ら、１９８５により記載されている手順
を使用してことができる。

【００１６】実施例において使用する全体のＤＮＡ源は
ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ
１３８９９であるが、本発明はこの特定の源にまったく
限定ない。テトラサイクリンのクラスの抗生物質を産生
する種々の他のストレプトミセス・アウレオファシエン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅ
ｎｓ）株を本発明において等しく首尾よく使用すること
ができる。これらのストレプトミセス・アウレオファシ
エンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）株は、次のも
のを包含する：クロロテトラサイクリン、テトラサイク
リン、６−デメチルクロロテトラサイクリン、６−デメ
チルテトラサイクリン、７−クロロ−５ａ，１１ａ−デ
ヒドロテトラサイクリン、２−デカルボキシアミド−２
−アセチルテトラサイクリンおよびテトラサイクリン族
の化合物の他の構成員を産生する突然変異株および別の
野生型分離物。本発明は、また、このような化合物を産
生する他の有機体からクロロテトラサイクリン、テトラ
サイクリンおよびテトラサイクリン関係化合物のクロー
ニングに関し、このような有機体は次のものを包含する
が、これらに限定されない：ストレプトミセス・リモス
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）、ス
トレプトミセス・アベラネウス（Ｓ．ａｖｅｌｌａｎｅ
ｕｓ）、ストレプトミセス・ルシタヌス（Ｓ．ｌｕｓｉ
ｔａｎｕｓ）、ストレプトミセス・ビリジファシエンス
（Ｓ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトミセ
ス・プサモチクス（Ｓ．ｐｓａｍｍｏｔｉｃｕｓ）、ア
クチノマヅラ・ブルンネア（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ
ｂｒｕｎｎｅａ）、およびダクチロスポランギウム・
ベスカ（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｖｅｓ
ｃａ）。

【００１７】２機能性コスミドベクターのアームのそれ
らに対して相同性の末端をもつ、所望の３５キロ塩基の
大きさの領域の大きいＤＮＡ断片を発生する、制限エン
ドヌクレアーゼＳａｕ３Ａを使用してストレプトミセス
・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎ
ｓ）ＤＮＡの部分的消化を使用する。この場合におい
て、最適な消化の条件の実験的決定は、１系列の消化を
実施し、そしてアガロースゲルの電気泳動により最終産
生物の試料を分析することによって実施される。当業者
は、別のライブラリーの構成および問題のクローニング
したＤＮＡの回収法を認識している。Ｅ．ｃｏｌｉの使
用、ならびに試料のラムダパッケージングにより付与さ
れた大きさの選択は、他のベクターの使用は同様によく
有用であるので、本発明を限定しない。当業者は認識す
るように、１機能性ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ）ベクター、例えば、ｐＩＪ９２２［リジ
エイト（Ｌｙｄｉａｔｅ）ら、１９８５］を本発明にお
いて使用することができるが、ただしライブラリーの構
成および組み換えプラスミドの回収はアクチノミセテス
（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）中で実施する。

【００１８】実施例において用いる工程は、コスミドの
アームおよび大きさで分画したＤＮＡの結合産生物の試
験管内パッケージング、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ２８１９Ｔへ
の形質導入、形質導入体の集団の収集およびそれらから
ＤＮＡを分離してコスミドのライブラリーを形成するこ
とを包含する。使用する方法を記載するが、本発明は実
施例に記載するものにより限定されない。別法を同一の
目的に使用することができ、不都合な結果は得られな
い。こうして、結合および試験管内パッケージングのた
めに別のプロトコルを使用することができ、ならびに別
の組み換え欠損（ｒｅｃＡ）Ｅ．ｃｏｌｉ宿主、ライブ
ラリー増幅手順（例えば、選択的ブロスの生長）および
プラスミド調製手順を使用することができ、それらのす
べては特定の文献に発表されている［マニアチス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２］。

【００１９】実施例における引き続く工程は、プールし
たコスミドＤＮＡ調製物のストレプトミセス・リビダン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の
中への導入、細胞ライブラリーの発生および１００μｇ
のテトラサイクリン／ｍｌに対する抵抗性を示すストレ
プトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の形
質転換体についてのこのようなライブラリーの引き続く
スクリーニングを記載する。より労力を要するが、形質
転換体をレプリカのプレイティングによりテトラサイク
リン抵抗性について直接スクリーニングすることができ
るであろう。別のレベルのテトラサイクリンを、宿主ま
たは源の有機体が示す生来の抵抗性により指図されるよ
うに、スクリーニングのために使用することができるで
あろう。他のテトラサイクリン感受性の、非制限的宿
主、例えば、ストレプトミセス・グリセオフスクス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）
をストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）の代わりに使用することができるであろう。

【００２０】次に、テトラサイクリン抵抗性ストレプト
ミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）からプラ
スミドＤＮＡを分離し、次いで前記ＤＮＡを試験管内パ
ッケージングし、そしてＥ．ｃｏｌｉの中に形質導入す
ることによって、組み換えプラスミドが得られる。この
ような形質導入体から分離されたプラスミドＤＮＡを、
制限酵素のマッピングの分析により特性決定する；そし
て実施例において分離された２つのプラスミド、ＬＰ²
１２７およびＬＰ²１２８、は、同等の構造を有するこ
とが示された。当業者は認識するように、別の有機体か
らクローニングした同様なＤＮＡ領域は制限部位の配置
において多形性を示すが、テトラサイクリン抵抗性を与
える十分に大きいＤＮＡ断片は後述する性質を与えるこ
とが期待されるであろう。

【００２１】テトラサイクリン抵抗性のプラスミドを有
する性質は、ＬＰ²１２７およびＬＰ²１２８を使用して
得られたストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ）のチオストレプトン抵抗性の形質転換体がま
たテトラサイクリン抵抗性であることを実証することに
よって確証される。テトラサイクリン様抗生物質の緻密
さは、Ｅ．ｃｏｌｉに対して有効であるが、テトラサイ
クリン抵抗性Ｅ．ｃｏｌｉに対してそれほど有効ではな
い抗生物質活性をもつ、前述のチオストレプトンおよび
テトラサイクリン抵抗性ストレプトミセス・リビダンス
（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）による寒天上の産生により実
証される。

【００２２】最後に、テトラサイクリンの合成は、異種
宿主ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中のＬＰ²１２７により
指令されることが実証された。これは寒天およびブロス
の両者の発酵において達成される。本来分離されたテト
ラサイクリン抵抗性ストレプトミセス・リビダンス
（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）およびストレプトミセス・リ
ビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）のＬＰ²１２７形質
転換体の両者は、同一産生物がＤＮＡ源の有機体のスト
レプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ１３
８９９から分離される条件下に、テトラサイクリンおよ
びクロロテトラサイクリンを産生する。他方において、
挿入されたＤＮＡをもたず、プラスミドベクターのみを
含有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ）形質転換体は、抗生物質の産生を示さない。

【００２３】異種宿主によるテトラサイクリンの産生の
実証は、実施例に記載する発酵条件またはＨＰＬＣ分析
系に限定されず、これらは明瞭に効率よい分析を可能と
する。テトラサイクリンの発酵および分析の多数の手順
を記載されてきており、そしてここにおいて代わりに使
用することができる。また、ストレプトミセス・リビダ
ンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）
を実施例において異種宿主として使用するが、抗生物質
生合成遺伝子の異種発現はある数のアクチノミセテス
（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）および他のバクテリア
群において期待され、これらは次のものを包含するが、
これらに限定されない：バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）、コルネバクテリア属（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ａ）、サーモアクチノミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｓ）、ただしそれらはここに記載する比較
的大きいプラスミド構成体で形質転換されることを条件
とする。形質転換されるものは、例えば、比較的非制限
的であることが知られている、ストレプトミセス・グリ
セオフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅ
ｏｆｕｓｃｕｓ）およびストレプトミセス・アンボフチ
スス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆｕｃｈｓ
ｕｓ）を包含する。

【００２４】

【実施例】実施例１：ストレプトミセス・アウレオファシエンス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎ
ｓ）の全体のＤＮＡの調製 ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ
１３８９９の凍結乾燥した調製物を、０．８ｍｌの１×
合成塩溶液（６ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄／、３ｇのＫＨ₂ＰＯ₄
／ｌ、０．５７ｇのクエン酸ナトリウム／ｌ）の中に懸
濁し、そしてベネット寒天（１ｇの酵母エキス／ｌ、２
ｇのＮＺ−アミンＡ／ｌ、１ｇのビーフエキス／ｌ、２
０ｇのＤ−グルコース／ｌ、２０ｇのバクト寒天／ｌ）
上のプレイティングした。２８℃において２日間インキ
ュベーションした後、単一のプレートからの細胞を５ｍ
ｌのトリプシン大豆ブロス［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）］
の中にこすり落とし、そしてマイクロチップをを装備し
たヒート・システムス・ウルトラソニクス（Ｈｅａｔ
Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）Ｗ２００Ｐ
超音波処理装置で短時間（約１０秒間）超音波処理し
た。種培養物を２ｍｌの超音波処理した懸濁液を５０ｍ
ｌのトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）の中に接種し、次
いで２０℃、２００ｒｐｍにおいて２日間インキュベー
ションすることによって生長させた。次いで、種培養物
を２％のグリシンを補充した１００ｍｌのＴＳＢに接種
し、そして２８℃、２００ｒｐｍにおいて４８インキュ
ベーションした。

【００２５】細胞を９８００×ｇで３０分間遠心するこ
とによって収穫する。細胞の沈澱を２００ｍｌのＰ培地
（１００ｇのスクロース／ｌ、０．２ｇのＫ₂ＳＯ₄／
ｌ、２ｍｌの微量元素の溶液／ｌ、これは次の成分から
成る：４０ｍｇのＺｎＣｌ₂／ｌおよび１０ｍｇ／ｌの
各ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ、ＣｕＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、ＭｎＣｌ
₂・４Ｈ₂Ｏ、Ｎａ₄Ｂ₂Ｏ₇・１０Ｈ₂Ｏおよび（ＮＨ_４）
₆ＭＯ₇₂₄・４Ｈ₂Ｏ）で洗浄する。細胞の沈澱を−２０
℃において凍結し、次いで解凍し、そして１２ｍｌの１
０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム［シグマ（Ｓｉｇｍａ）、３
×再結晶化した）を含有するＰ⁺（２５ミリモルのＴＥ
Ｓ、２５ミリモルのＣａＣｌ₂、１０ミリモルのＭｇＣ
ｌ₂、０．３７ミリモルのＫＨ₂ＰＯ₄を含有するように
補充したＰ培地）細胞を室温において２時間インキュベ
ーションし、その時間間でに原形質体の形成が明らかに
なる。２．５ｍｇのプロイテイナーゼＫ［ベーリンガー
・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ）］を添加し、そしてこの混合物を３７℃で１５分間
インキュベーションする。１０ｍｌの０．２モルのＥＤ
ＴＡｐＨ８、０．１モルのトリスｐＨ８を添加し、直ち
に２．４ｍｌの１０％のラウリウ硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）を添加することによって、溶菌を達成する。粘性混
合物を５０℃において６０分間インキュベーションし、
時々おだやかな混合を行う。

【００２６】いったん溶菌が完結すると、２０ｍｌの平
衡化フェノール（５０ｇのフェノール＋６．５ｍｌの１
００ミリモルのＮａＣｌ、１０ミリモルのトリスｐＨ
８、１ミリモルのＥＤＴＡｐＨ８＋０．０５ｇの８−ヒ
ドロキシキノリン）を添加し、この調製物をおだやかな
震盪し、次いでテーブルトップの遠心機で１５００×ｇ
において３０分間遠心する。水性上部層を集め、そして
前述したように再抽出しつる；最初の抽出からの使用済
みのフェノールを２０ｍｌの１０ミリモルのトリスｐＨ
７．４、１ミリモルのＥＤＴＡｐＨ８（ＴＥ）で逆抽出
する。次いで、集めた水性相を等しい体積のクロロホル
ムで抽出し、前述したように遠心し、そして１０ｍｌの
部分を別々の試験管に分配する。１ｍｌの３モルの酢酸
アンモニウムｐＨ５を各々に添加し、１０ｍｌの冷エタ
ノールを粘性溶液の上部層状にした。ＤＮＡをガラス棒
上におだやかに巻き付け、冷エタノールで２回すすぎ、
そして８ｍｌのＴＥの中に一夜４℃において溶解する。
Ａ₂₆₀の分光光度計の読みを存在する合計の核酸（主と
してＤＮＡ）の推定として取る。

【００２７】実施例２：ストレプトミセス・アウレオフ
ァシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）の部分的
消化および大きさの濃縮 ３５キロ塩基（Ｋｂ）の領域のストレプトミセス・アウ
レオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）Ｄ
ＮＡのＳａｕ３Ａ産生物を生ずる部分的消化条件を、実
験的に決定する。１００ミリモルのＮａＣｌ、１０ミリ
モルのトリスｐＨ７．４、１０ミリモルのＭｇＣｌ₂か
ら成る３００μｌの反応緩衝液を含有する１系列の反応
管を準備し、そして制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ
［ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）］を添加して最終濃度を
０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５酵素
ユニット／μｇのＤＮＡとする。反応を３７℃において
６０分間インキュベーションし、次いで６５℃において
２０分間配置し、最後に氷へ取り出す。１２μｌを取り
出し、そして０．５％のアガロースゲルに負荷して既知
の長さの断片と大きさを比較する（ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘ
ｈｏＩで消化したラムダＤＮおよび消化しないもの）。
残りの体積のＤＮＡを５０ｍｌの３モルの酢酸アンモニ
ウムおよび１ｍｌのエタノールの順次の添加および引き
続く−２０℃への冷却により沈澱させる。次いで、沈澱
したＤＮＡを８８００×ｇにおける遠心により沈澱さ
せ、次いで３００μｌの０．３モルの酢酸アンモニウム
の中に溶解し、同様に沈澱させ、沈降させ、エタノール
ですすぎ、真空乾燥し、そして乾燥した沈澱を最後に１
００μｌのＴＥ中に溶解する。１ボルト／ｃｍにおいて
一夜電気泳動した臭化エチジウムで染色したアガロース
ゲルを検査すると、０．０５ユニットのＳａｕ３Ａ／μ
ｇＤＮＡを使用する消化は、大部分が所望の３５Ｋｂの
大きさの範囲にある生成物を与えることが明らかにな
る。

【００２８】実施例３：コスミドのアームの調製 ２機能性コスミドベクターの成分を、図１に示すプラス
ミドＡおよびＢから解放する。プラスミドＡはｐＩＢＩ
２４を含有し、これはＥ．ｃｏｌｉ中の複製および選択
のための複製の由来およびアンピシリン抵抗性遺伝子を
提供する。このプラスミドは、また、アクチノミセテス
（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）中のプラスミドの選択
のためのチオストレプトン抵抗性遺伝子、ならびに試験
管内パッケージングのための基質として働くバクテリオ
ファージラムダからの多数の粘着末端部位（ｃｏｓ）を
提供する。プラスミドＢは、アクチノミセテス（ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）中のプラスミドの維持のための
複製のＳＣＰ２＊由来、および多数のｃｏｓ部位を提供
するように設計する。

【００２９】プラスミドＡは、Ａｓｐ７１８で設計し、
次いで子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）
で脱リン酸化する。次いで、ＤＮＡをクロルパンおよび
クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、そして
真空乾燥する。次いで、ＤＮＡを再懸濁し、そしてＢｇ
ｌＩＩで消化する。プラスミドＢをＳａｌＩで消化し、
引き続いてＣＩＡＰで処理する。クロルパンの抽出、エ
タノール沈澱および真空乾燥後、ＤＮＡを再懸濁し、そ
してＢｇｌＩＩで消化する。

【００３０】前述の消化反応をアガロースゲルに適用
し、そして一夜電気泳動する。前述の機能的領域を含有
する、プラスミドＡからの６Ｋｂの断片およびプラスミ
ドＢからの８．０Ｋｂの断片を、アガロースゲルから電
気溶離により分離する。

【００３１】実施例４：Ｓａｕ３Ａ消化したゲノムＤＮ
Ａへのコスミドのアームの結合および試験管内パッケー
ジング ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒ
ｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡのＳａｕ３Ａ消化しそして
大きさを「検査した」ゲノムの断片を、試験管内結合を
経てコスミドのアームに接合する。約８μｇに相当す
る、４μｌのＳａｕ３Ａ消化したストレプトミセス・ア
ウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）
ＤＮＡを、６６ミリモルのトリスｐＨ７．４、１０ミリ
モルのＭｂｏＩＩ、１ミリモルのＡＴＰ、１０ミリモル
のジチオスレイトールおよび４０ユニット（粘着末端の
ユニット）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ［ニュー・イングラ
ンド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ）］を含有する１０μｌの結合混合物中で、１
μｇのコスミドのアーム１および２の各々と組み合わせ
る。結合混合物を１１℃において１８時間インキュベー
ションし、次いで全体の１０μｌの反応混合物をパッカ
ジーン（Ｐａｋａｇｅｎｅ^R）ラムダＤＮＡパッケージ
ング系抽出物に添加することによって試験管内パッケー
ジング反応させる。室温において２時間インキュベーシ
ョン後、５００μｌのファージ希釈緩衝液（ＰＤＢ）
（１００ミリモルのＮａＣｌ、１０ミリモルのトリスＨ
Ｃｌ、ｐＨ７．４、１０ミリモルのＭｇＳＯ_４）を添加
し、次いで２５μｌのクロロホルムを添加する。この混
合物を渦形成し、そして４℃において貯蔵する。

【００３２】実施例５：大腸菌の中に形質導入および２
機能性コスミドのライブラリーの調製 プールしたプラスミドＤＮＡ調製物または２機能性コス
ミドのライブラリーを得ることができる数千の形質導入
体を得る目的で、試験管内パッケージング反応から誘導
されたファージ調製物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）Ｘ２８１９Ｔ［Ｒ．カーチス（Ｃｕｒｔ
ｉｓｓ）］の中に形質導入する。この目的で、０．３ｍ
ｌのＸ２８１９Ｔの一夜の培養物を１０ｍｌの２０−１
０−５（２０ｇのトリプトン／ｌ、１０ｇの酵母エキス
／ｌ、５ｇのＮａＣｌ／ｌ、５０ｍｇのチミジン／ｌ）
の中に接種し、そして２８℃において２．５時間インキ
ュベーションした。次いで、４つの部分の０．４ｍｌの
Ｘ２８１９Ｔ細胞を０．８ｍｌのＰＤＢと組み合わせ、
そしてマイクロフーグで全速度で５分間回転した。沈澱
した細胞を１００ｍｌのＰＤＢの中に懸濁した。次い
で、試験管内パッケージングからの５０μｌのファージ
調製物を各に添加する。ファージを細胞に３７℃におい
て２５分間吸収させる。２ｍｌの２０−１０−５を各混
合物に添加し、そして懸濁液を震盪しながら２８℃にお
いて２時間インキュベーションする。１／１０ｍｌのア
リコートを、１００ｍｇのアンピシリン／ｌ（ナトリウ
ム塩−シグマ）を補充した２０−１０−５（２０−１０
−５ブロスおよび２０ｇのバクト寒天／ｌ）を含有する
合計５０枚のペトリ皿上に配置する。プレートを２８℃
において一夜インキュベーションし、次いで室温におい
て３日間放置する。５つの代表的なプレートのプレート
のカウントは、合計約１２，０００のアンピシリン抵抗
性コロニーが得られることが明らかにする。

【００３３】各プレートを、５０ミリモルのグルコー
ス、２５ミリモルのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、１０ミリモ
ルのＥＤＴＡ、ｐＨ８（ＧＴＥ）を含有する溶液の５ｍ
ｌでフラッディングする。コロニーを無菌のスプレダー
で懸濁し、そしてすべての溶離液をプールして細胞懸濁
液が得られ、これを９８００×ｇで５分間遠心する。沈
澱した細胞を７２ｍｌのＧＴＥの中に再懸濁する。次い
で、８ｍｌの４０ｍｇのリゾチーム／ｌを含有するＧＴ
Ｅを添加する。リゾチームの消化物を室温において２０
分間インキュベーションする。次いで、１６０ｍｌのア
ルカリ性−ＳＤＳ（８ｇのＮａＯＨ／ｌ、１０ｇのＳＤ
Ｓ／ｌ）を添加し、これはおだやかな混合後粘性リゼイ
トを生ずる。氷上で２０分間インキュベーションした
後、８０ｍｌの５モルの酢酸カリウムを添加し、混合
し、そしてさらに氷上で２０分間インキュベーションす
る。次いで、調製物を９８００×ｇにおいて２０分間遠
心し、上澄み液を集め、２００ｍｌの冷イソプロパノー
ルを添加し、混合し、そして氷上で１５分間インキュベ
ーションし、次いで９８００×ｇで２０分間遠心する。
核酸の沈澱を１％のナトリウムサルコシンを補充した２
０ｍｌのＴＥ中に溶解する。２２ｇのＣｓＣｌを添加
し、いったん溶解したとき、２ｍｌの１０ｍｇの臭化エ
チジウム／ｍｌの溶液を添加する。ＣｓＣｌ−臭化エチ
ジウムの混合物を適当な管の中に適用し、そしてベック
マン（Ｂｅｃｋｍａｎ）７０．１Ｔｉローター中で５
５，０００ｒｐｍで１９時間遠心する。管を取り出し、
そしてプラスミドのバンドを注射器の側面の穿刺により
回収する。臭化エチジウムを、試料から、等しい体積の
水で飽和したブタノールで４回抽出することによって除
去する。水溶液をＴＥで６ｍｌにする；１ｍｌの３モル
の酢酸アンモニウムを添加し、そしてプラスミドＤＮＡ
を１８ｍｌのエタノールで沈澱する。−２０℃に冷却
後、ＤＮＡを３４００×ｇで３０分間遠心することによ
って沈澱する。第２沈澱を同様に実施し、次いでＤＮＡ
をエタノールですすぎ、真空乾燥し、１ｍｌのＴＥ中に
溶解し、そしてＤＮＡ濃度を分光光度測定により決定す
る。

【００３４】実施例６：ストレプトミセス・リビダンス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中の
プラスミドのライブラリーの導入およびストレプトミセ
ス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の組み換え細
胞のライブラリーの構成 前の工程において構成した２機能性プラスミドのライブ
ラリーをストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ５４の中に形質
転換し、ここでストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）遺伝子の表現型の発現を達成する。この目的
で、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ５４の原形質体を本
質的に標準の方法により調製する［ホプウッド（Ｈｏｐ
ｗｏｏｄ）ら、１９８５］。簡単に述べると、１０の５
０ｍｌのアリコートの完全ＹＥＭＥ培地（３ｇの酵母エ
キス／ｌ、５ｇのペプトン／ｌ、３ｇの麦芽エキス／
ｌ、１０ｇのグルコース／ｌ、３４０ｇのスクロース／
ｌ、５ｇのグリシン／ｌ、５ミリモルのＭｇＣｌ₂、４
０ｍｇ／ｌの各Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−ロイシン）の
各の中に０．２ｍｌのの胞子懸濁液を接種することによ
って生長させた、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．
ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ５４の４５時間の培養物からの
細胞を、９８００×ｇで１５分間遠心することによって
沈澱させた。細胞の沈澱をＰ培地で２回洗浄し、次いで
６０ｍｌのＰ⁺の中に懸濁する。１４ｍｇのリゾチーム
／ｍｌを含有するＰ⁺の２０ｍｌを添加し、そして懸濁
液を３０℃において震盪する水浴中で１５０ｒｐｍにお
いて９０分間インキュベーションする。引き続いて、１
００ｍｌのＰ⁺を添加し、そして原形質体の懸濁液を無
菌の非吸収性綿を通過させる。濾液を３８００×ｇにお
いて１０分間遠心し、原形質体の沈澱を再懸濁し、そし
て１００ｍｌのＰ⁺で洗浄し、そして第２回の遠心後、
１２０ｍｌのＰ⁺の中に再懸濁する。タンパク質の調製
物を１．８ｍｌのクリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ）
に分布し、そして−７０℃において凍結する。０．３ｍ
ｌのＴＫ５４原形質体の調製物（約１×１０⁹の原形質
体を含有する）を５ｍｌのＰ⁺を含有する４本の遠心管
の各々に分配することによって、形質転換を分布する。
原形質体を３４００×ｇで１０分間遠心することによっ
て沈澱させ、次いで残留体積の中に再懸濁する。ほぼ１
０μｇのコスミドのライブラリーＤＮＡを各に添加し、
次いで０．５ｍｌの２５％のＰＥＧ１０００（２５ｇの
スクロース／ｌ、２ｍｌの５００×の微量元素の溶液／
ｌ、０．２５ｇのＫ₂ＳＯ₄／ｌ、１００ミリモルのＣａ
Ｃｌ₂、５０ミリモルのトリス−マレエートｐＨ８から
成る溶液の３ｍｌ中に溶解した１ｇのＰＥＧ１０００
（シグマ）］を添加する。混合および３０秒間インキュ
ベーション後、５ｍｌのＰ⁺を添加する。次いで、原形
質体を沈澱させ、そして１ｍｌのＰ⁺の中に再懸濁す
る。次いで、１／１０ｍｌの体積を乾燥したＲ₂ＹＥ寒
天（１００ｇのスクロース／ｌ、０．２５ｇのＫ₂ＳＯ₄
／ｌ、２ｍｌの５００×の微量元素の溶液／ｌ、２ｇの
Ｌ−プロリンＩＬ、２０ｇのＤ−グルコース／ｌ、５ｇ
の酵母エキス／ｌ、０．０５ｇのＫＨ₂ＰＯ₄／ｌ、２５
ミリモルのＣａＣｌ₂、５ミリモルのＭｇＣｌ₂、２０ｇ
のバクト寒天／ｌ）上に広げ、そして２８℃においてイ
ンキュベーションする。２４時間後、各プレートを５０
０μｇのチオストレプトン／ｍｌを含有する柔Ｒ寒天
（前述したように調製するが、酵母エキス、グルコース
またはＫＨ₂ＰＯ₄を含まず、そして８ｇのバクト−寒天
ＩＬ）の３ｍｌでオーバーレイし、次いでさらに１２日
間インキュベーションする。

【００３５】ほぼ９１００チオストレプトン抵抗性のコ
ロニーが得られた。２５ｍｌの各２０％のグリセロール
を含有する３本の管の中に寒天プレートからコロニーを
こすり落とすことによって、コロニーを集めた。コロニ
ーの懸濁液を９０秒間超音波処理し、プールし、次いで
１．８ｍｌのクリオチューブの中に分配し、そして−７
０℃において凍結した。この凍結した調製物はストレプ
トミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）組み換
え細胞ライブラリーを構成する。

【００３６】実施例７：プラスミドＬＰ²１２７を誘導
するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）ＬＬ５３５、テトラサイクリン抵抗性形質転換体
の分離 次に、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ）の組み換え細胞のライブラリーを、テトラサイ
クリン抵抗性についてスクリーニングする。断片化した
ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）の細胞のライブラリーの１／１０ｍｌの部分を、１
００μｇのテトラサイクリン／ｍｌを補充したベンネッ
ト抗原上にプレイティングする。２８℃において５日間
インキュベーションした後、２つのテトラサイクリン抵
抗性コロニーが検出される。これらのうちの１つ、ＬＬ
５３５（最初にＬＬ５２９−２と表示された）をそれ以
上の分析のために選択した。ＬＬ５３５コロニーを、１
００μｇのテトラサイクリン／ｍｌを含有する新鮮なベ
ンネット寒天にストリーキングする。生長は２８℃にお
いて３日間インキュベーションした後に観察される。得
られた生長を、１０ｇのグルコース／ｌ（ＴＳＢＧ）お
よび１００μｇのテトラサイクリン／ｍｌを補充した５
０ｍｌのＴＳＢの中にこすり落とし、そしてこの懸濁液
を３０℃、２００ｒｐｍにおいて３日間インキュベーシ
ョンする。ＬＬ５３５培養物を短時間超音波処理し、そ
して一部分を１．８ｍｌのクリオチューブに分配し、そ
して−７０℃において貯蔵する。残りの体積を使用して
４つの２リットルのフラスコを接種し、各フラスコは５
００ｍｌの１００μｇのテトラサイクリン／ｍｌを含有
する各変性したＹＥＭＥ培地（前述のものであるが、１
６ｇのグリシン／ｌ、２５ミリモルのＭＯＰＳを含有す
るが、ＭｇＣｌ₂、Ｌ−ヒスチジンまたはＬ−ロイシン
を含有しない）を含有する。次いで、２日後に得られた
生長物を前述したようにプラスミドＤＮＡの分離のため
に処理したが、ただし使用したすべての体積は前の実施
例のそれの４倍である。最終のＤＮＡの沈澱を１ｍｌの
ＴＥ中に溶解する。

【００３７】ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）の形質転換体ＬＬ５３５から分離したプ
ラスミドＤＮＡの１０μｌの部分を、前述の方法を使用
して、試験管内パッケージングにかけ、引き続いてＥ．
ｃｏｌｉ Ｘ２８１９Ｔに形質導入する。アンピシリン
抵抗性形質導入体（ＬＬ５３７と表示する）を、１００
μｇのアンピシリン／ｍｌを含有する２０−１０−５寒
天にストリーキングし、そして３０℃において１日間イ
ンキュベーション後に得られた生長物を使用して、２つ
の５００ｍｌの部分の１００μｇのアンピシリン／ｍｌ
を含有する２０−１０−５ブロスを接種する。３０℃、
２００ｒｐｍにおいて一夜インキュベーション後、プラ
スミドＤＮＡを再び前述したように分離する。分離した
プラスミドをＬＰ²１２７と表示する；このプラスミド
の推定した大きさは４３キロ塩基対である。

【００３８】制限エンドヌクレアーゼを使用して単一お
よび二重の消化を実施することによって、制限地図をＬ
Ｐ²１２７についてつくる。ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、Ｂ
ｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩおよびＳ
ｔｕＩ［ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）］についての切断
部位の位置を、各酵素を単独で、およびベクター部分内
の既知の位置において切断する既知の酵素、例えば、Ｅ
ｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶまたはＨｉｎｄＩＩＩと組み合わ
せてを使用する消化により決定する。制限エンドヌクレ
アーゼの消化は、１〜２μｇのプラスミドＤＮＡ、４μ
ｌの使用する制限エンドヌクレアーゼのために最適な塩
の１０×溶液およびほぼ５〜４０単位の酵素を４０μｌ
の合計の体積で組み合わせることによって実施する。使
用する１０×塩溶液は次の通りである：ＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＶおよびＳａｌＩについて、１．５モルのＮａＣ
ｌ、０．０６モルのトリスｐＨ８、０．０６モルのＭｇ
Ｃｌ₂；ＢｇｌＩＩおよびＳｃａＩについて、１．０モ
ルのＮａＣｌ、０．１モルのトリスｐＨ７．４、０．１
モルのＭｇＣｌ₂；ＢｃｌＩについて、０．７５モルの
ＫＣｌ、０．０６モルのトリスｐＨ７．４、０．１モル
のＭｇＣｌ₂；ＢｓｔＢＩについて、０．６モルのＮａ
Ｃｌ、０．０６モルのトリスｐＨ７．４、０．０６モル
のＭｇＣｌ₂；ＣｌａＩについて、０．５モルのＮａＣ
ｌ、０．０６モルのトリスｐＨ８、０．０６モルのＭｇ
Ｃｌ₂；ＥｃｏＲＩについて、０．５モルのトリスｐＨ
８、０．１モルのＭｇＣｌ₂；ＭｌｕＩについて、０．
５モルのＮａＣｌ、０．１モルのトリスｐＨ７．４、
０．１モルのＭｇＣｌ₂；ＳａｃＩについて、０．１モ
ルのトリスｐＨ７．４、０．１モルのＭｇＣｌ₂；およ
びＳｔｕＩについて、１．０モルのＮａＣｌ、０．１モ
ルのトリスｐＨ８、０．１モルのトリスｐＨ７．４、
０．１モルのＭｇＣｌ₂；およびＳｔｕＩについて、
１．０モルのＮａＣｌ、０．１モルのトリスｐＨ８、
０．１モルのＭｇＣｌ₂。二重消化は、製造業者が推奨
するように、両者の酵素に適合性の塩の条件を使用して
実施する。すべての消化反応は３７℃において実施する
が、ただしＢｃｌＩは５０℃において実施し、そしてＢ
ｓｔＢＩについて６５℃において実施する。インキュベ
ーション時間は６０〜１２０分である。５μｌの体積の
トラッキング色素（５０％のグリセロール、０．１モル
のＥＤＴＡｐＨ８、０．２５％のブロモフェノールブル
ー）を添加して反応を停止し、そしてアガロースゲルの
引き続く負荷を促進する。

【００３９】消化の結果は０．８％のアガロースゲルを
通す可視化する。この地図はＬＰ²１２７の直接消化に
より、ならびにサブクローニングした断片の消化により
アセブンリングする。ＢｃｌＩおよびＣｌａＩ部位につ
いてのマッピングは、宿主のメチル化により開始され、
したがって、ＬＰ²１２８の使用により促進される。Ｌ
Ｐ²１２８は、前述の手順により、ＬＰ²１２７の試験管
内パッケージング、Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ１１９（ｄａｍ
−ｄｃｍ−）への形質導入およびプラスミドの分離によ
り得られる。ＬＰ²１２７中でクローニングしたストレ
プトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆ
ａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡにおける３１．９ｋｂについての
より詳細な制限エンドヌクレアーゼ地図は、図３に示
す。

【００４０】実施例８：プラスミドＬＰ²１２８を誘導
したストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）ＬＬ５２９−ＴＴ２、チオストレプトン抵抗性、
テトラサイクリン抵抗性形質転換体の分離 ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＬＬ５２９−ＴＴ２の分離
は、ＬＬ５３５について記載した方法に類似する方法で
実施するが、ただし組み換えストレプトミセス・リビダ
ンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の細胞のライブラリーは
５０μｇのチオストレプトン／ｍｌおよび１００μｇの
テトラサイクリン／ｍｌを含有するベンネット寒天上に
プレイティングする。２８℃において１１日間インキュ
ベーションした後、２つの抵抗性コロニーが観察され
る。これらのうちの１つ、ＬＬ５２９−ＴＴ２を両者の
抗生物質を含有するベンネット寒天にストリーキングす
る。２８℃において３日間インキュベーションした後、
生ずる生長物を使用して１０μｇのチオストレプトン／
ｍｌおよび１００μｇのテトラサイクリン／ｍｌチオス
トレプトン５０ｍｌのＴＳＢを接種する。２８℃、２０
０ｒｐｍにおいて５日間インキュベーション後、プラス
ミドＤＮＡを、イソプロパノール沈澱工程まで前述のプ
ラスミドの分離手順に類似する、ミニ調製手順により調
製する。しかしながら、この場合において、使用する体
積は前述の体積の約１／４である。イソプロパノールの
沈澱後、核酸の沈澱を１ｍｌのＴＥ中に溶解し、そして
等しい体積のクロルパン（１００ミリモルのＮａＣｌ、
１ミリモルのＥＤＴＡｐＨ８、１０ミリモルの酢酸ナト
リウムｐＨ６＋５００ｍｌのクロロホルムを含有する結
合中で平衡化した５００ｇのフェノールおよび０．５ｇ
の８−ヒドロキシキノリン）で撹拌および引き続くマイ
クロフージ（ｍｉｃｏｒｆｕｇｅ）中で全速で３分間回
転することによって抽出する。次に、水性相をクロルパ
ンで再抽出し、次いで同様な方法でクロロホルムで抽出
する。最終の水性層を集め、そして１００μｌの３モル
の酢酸アンモニウムおよび１．８ｍｌのエタノールを添
加して核酸を沈澱させる。−２０℃に冷却後、沈澱反応
物を８８０００×ｇにおいて３０分間遠心する。生ずる
沈澱を３００μｌの０．３モルの酢酸アンモニウム中に
溶解し、同様に１ｍｌのエタノールで沈澱され、そして
遠心する。生ずる沈澱をエタノールですすぎ、真空乾燥
し、そして１ｍｌのＴＥ中に溶解する。

【００４１】ＬＬ５２９−ＴＴ２プラスミドのミニ調製
物を使用して、前に記載したように試験管内パッケージ
ングを実施する。アンピシリン抵抗性形質導入体（ＬＬ
５３８と表示する）を、ＬＬ５３５についての実施例に
おいて概説するように実施するプラスミドの調製のため
に選択する。生ずる精製したプラスミドをＬＰ²１２８
と表示する。ＬＰ²１２８を２０の異なる制限エンドヌ
クレアーゼで消化したとき得られた制限バンドのパター
ンを、ＬＰ²１２７について得られたそれと、同一の電
気泳動したアガロースゲル上の消化産生物を分析するこ
とによって比較する。ＬＰ²１２８について得られたゲ
ルの結合のパターンは、ＬＰ²１２７について得られた
パターンと同一であり、２つのプラスミドは同等である
ことが示される。こうして、図２および図３はＬＰ²１
２８ならびにＬＰ²１２７の構造を記載する。

【００４２】実施例９：プラスミドＬＰ²１２７および
ＬＰ²１２８はプラスミド連鎖テトラサイクリン抵抗性
を与える 直面するテトラサイクリン抵抗性をプラスミドが有する
ことと評価するために、プラスミドＬＰ²１２７および
ＬＰ²１２８をストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の原形質体中
に形質転換し、そして生ずるチオストレプトン抵抗性形
質転換体をテトラサイクリン抵抗性について試験する。
ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎ
ｓ）の原形質体の調製および形質転換および引き続くチ
オストレプトン抵抗性形質転換体についての選択は、前
に記載したように実施する。１０μｇの両者のＬＰ²１
２７およびＬＰ²１２８、ならびに５μｇのテトラサイ
クリン感受性の対照、ＬＰ²１１１（ｐＩＢＩ２４、Ｓ
ＣＰ２＊複製および安定性領域およびチオストレプトン
抵抗性遺伝子から成るベクター）を形質転換する。試験
した各プラスミドについての１５０の形質転換体を、１
００μｇのテトラサイクリン／ｍｌまたは２５μｇのチ
オストレプトン／ｍｌを含有するベンネット寒天プレー
トの対に順次に取り上げる。

【００４３】スタブ（ｓａｔｂ）の生長を２８℃におい
て５日間インキュベーション後に記録する。ＬＰ²１１
１から誘導したすべてのチオストレプトン抵抗性形質転
換体はテトラサイクリン感受性であることが証明される
が、ＬＰ²１２７またはＬＰ²１２８からの試験したチオ
ストレプトン抵抗性形質転換体はテトラサイクリン抵抗
性であることが示される。

【００４４】実施例１０：ＬＰ²１２７およびＬＰ²１２
８を含有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）によるクロロテトラサイクリンおよびテ
トラサイクリンの産生 １系列の実験を実施して、ＬＰ²１２７およびＬＰ²１２
８が異種宿主ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）中のクロロテトラサイクリン（ＣＴＣ）
およびテトラサイクリン（ＴＣ）の生合成を指令するこ
とを実証する。もとの分離物ＬＬ５３５、ならびにＬＰ
²１２７で形質転換したストレプトミセス・リビダンス
（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）は、寒天およびブロスの発酵
においてＣＴＣおよびＴＣを産生するが、挿入されたＤ
ＮＡをもたないプラスミドのクローニングベクターを含
有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ）はテトラサイクリン抗生物質を生じない。スト
レプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）中
に形質転換したＬＰ²１２８は、テトラサイクリンとし
て生物学的に特性決定することができる大腸菌（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に対する活性をもつ抗生物
質の生合成を指令する。このような作用はストレプトミ
セス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）宿主により
産生される。

【００４５】最初に、ストレプトミセス・リビダンス
（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株ＬＬ５３５、ＬＰ²１２７
を分離したチオストレプトン抵抗性分離物を、ベンネッ
ト寒天（２５μｇのチオストレプトン／ｍｌを含有す
る）上に、ほぼ２００コロニー／プレートを与えるよう
に設計した細胞希釈でプレイティングする。ストレプト
ミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株ＬＬ５
３１（前述のプラスミドベクターＬＰ²１１１を含有す
る）を、約４００コロニー／プレートの標的密度で同様
にプレイティングする。

【００４６】３０℃において８日間インキュベーション
した後、ＬＬ５３５のコロニーは、３６６ｎｍＵＶラン
プで照明したとき、黄色のＵＶ蛍光を示す。これはテト
ラサイクリン産生性培養物の特性であるが、ＬＬ５３１
について観測されない。

【００４７】次いで、各々のプレートを生物学的活性に
ついて、アッセイ有機体の一夜の生長物の０．１ｍｌを
接種した５ｍｌの軟２０−１０−５寒天（８ｇのバクト
寒天／ｌ）でコロニーをオバーレイイングすることによ
って試験する。使用したアッセイの株は、次の通りであ
る：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株
Ｔ１３２５、レイセスター大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ）［エリック・クルンイッ
フェ（Ｅｒｉｃ Ｃｌｕｎｄｌｉｆｆｅ）博士］から入
手した、Ｔ１３２５（これはチオストレプトン抵抗性を
与えるプラスミドを含有する）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＭ２９４およびＭＭ２９４
（ＡＴＣＣ３３６２５）、ｐＢＲ３２２（テトラサイク
リンおよびアンピシリン抵抗性を与える）を含有する。
一夜の培養物を、Ｔ１３２５について２５μｇのチオス
トレプトン／ｍｌおよびＭＭ２９４／ｐＢＲ３２２につ
いて１００μｇののアンピシリン／ｍｌを補充した、１
０ｍｌの２０−１０−５中で３７℃において生長させ
る。いったんオバーレイイングしそして一夜３７℃にお
いてインキュベーションした後、プレートをオーバーレ
イ有機体の菌叢中の阻害ゾーンについて検査する。株Ｌ
Ｌ５３１はＥ．ｃｏｌｉ株をもつゾーンを与えず、そし
てほんのわずかのコロニーはグラム陽性Ｔ１３２５をも
つ小さい局在化したゾーンをを与える。これらの後者の
コロニーのすべては、アクチノルホジンの発現に特徴的
な赤色の色素を示す；ストレプトミセス・リビダンス
（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）はこの通常未解明の経路を観
測可能な頻度で発現ことが知られている（ホリノウチ
ら、１９８９）。比較により、株ＬＬ５３５はオーバー
レイ中でＴ１３２５およびＭＭ２９４の生長を完全に阻
害する抗生物質の産生を示す（より少ないコロニー／プ
レートを使用する後者の実験において、阻害の小さい、
明確なおよび非常に大きいゾーンが。これらのアッセイ
の有機体を使用して適当な分離した個々のコロニーの回
りに見られる。ＭＭ２９４／ｐＢＲ３２２を使用するこ
の実験においてオーバーレイしたＬＬ５３５のコロニー
は、コロニーの回りに明確なゾーンを示す。ＭＭ２９４
／ｐＢＲ３２２を使用して見られるこの減少した活性の
効果は、プラスミドｐＢＲ３２２上に存在するテトラサ
イクリン抵抗性の発現による、感受性の減少を示すため
に取る。

【００４８】寒天上で作り上げられる抗生物質は、全面
生長のプレート培養物から抗生物質を抽出することによ
って特性決定される。株ＬＬ５３５およびＬＬ５３１
を、２５μｇのチオストレプトン／ｍｌを含有するベン
ネット寒天上で生長させる；ストレプトミセス・アウレ
オファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴ
ＣＣ１３８９９、ＬＰ²１２７およびＬＰ²１２８中でク
ローニングした源は薬物を含まないベンネット寒天上に
プレイティングする。３０℃において５日間生長後、
２．５４ｃｍ（１インチ）の正方形のブロックを切断
し、そして３ｍｌの酸性メタノール（４リットルのメタ
ノール中の１１．５ｍｌの濃Ｈ₂ＳＯ₄）中で冷浸する。
５分間渦形成した後、上澄み液をアクロ（Ａｃｒｏ^R）
膜のフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣ分析す
る。

【００４９】ＨＰＬＣ分析は、Ｃ１８逆相カラム上でア
イソクラクティカリー（ｉｓｏｃｒａｖｔｉｃａｌｌ
ｙ）に実施し、ここで２２％のＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミドを含有するｐＨ２．９においてオキシレ
ートから成る移動相を使用する。流速は１ｍｌ／分であ
り、そして溶離液は３６５ｎｍにおいて監視する。真性
のテトラサイクリンおよびクロロテトラサイクリンを標
準として使用する。

【００５０】ＨＰＬＣクロマトグラムは、ＬＬ５３５お
よびＡＴＣＣ１３８９９がＴＣおよびＣＴＣと同一の保
持時間をもつ物質を産生することを示す。ＬＬ５３１の
抽出物はこれらのピークを示さない。

【００５１】ＬＰ²１２７、ＬＰ²１２８およびＬＰ²６
３（ｐＩＪ９７０２のＳａｃＩ部位中にクローニングし
たｐＩＢＩ２４から成るプラスミドベクター）を使用し
て得られたストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）のチオストレプトン抵抗性形質転換体を、
アッセイ有機体Ｔ１３２５およびＭＭ２９４を使用する
オーバーレイにより抗生物質の産生について同様に分析
する。ＬＰ²１２７およびＬＰ²１２８の形質転換体は両
者のアッセイ有機体に対して活性な抗生物質の産生を示
すが、ＬＰ²６３は示さず、これにより抗生物質を産生
する能力はＬＰ²１２７およびＬＰ²１２８の中に存在す
るストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕ
ｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡに関連することが示され
る。

【００５２】ブロスの発酵を、また、実施して、ＬＰ²
１２７を有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ）により産生される抗生物質がテトラサ
イクリンおよびクロロテトラサイクリンであることの追
加の確証を得る。ＡＴＣＣ１３８９９、ＬＬ５３１、お
よびＬＬ８７３（ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．
ｌｉｖｉｄａｎｓ）のＬＰ²１２７形質転換体）の５０
ｍｌの種培養物を、５μｇのチオストレプトン／ｍｌを
含有するＳ培地（４ｇの酵母エキス／ｌ、４ｇのペプト
ン／ｌ、１０ｇのグルコース／ｌ、０．５ｇのＭｇＳＯ
_４・７Ｈ₂Ｏ／ｌ）を使用して生長させる。ＡＴＣＣ１
３８９９をチオストレプトンの不存在下に生長させる。
０．５ｍｌの種を１０μｇのチオストレプトン／ｍｌを
含有する２５ｍｌの発酵物（ただしＡＴＣＣ１３８９９
の薬物を含まない）に移す。２８℃において１０インキ
ュベーションした後、最終のマッシュの０．５ｍｌの試
料を４．５ｍｌの酸性メタノールの中に希釈し、前に記
載したように処理し、そしてＨＰＬＣ分析する。また、
少量のＴＣをこれらの３つの株の発酵マッシュにおいて
検出される。

【００５３】Ｅ．ｃｏｌｉ株ＬＬ５３７およびＬＬ５３
８は、プラスミドＬＰ²１２７およびＬＰ²１２８を分離
したＥ．ｃｏｌｉの形質転換体であり、ブダベスト条約
の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド
州ロックビレ１２３０１に受託され、そして次のように
受け入れ番号を与えられた。ＬＰ²１２７を含有する
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ２８１８Ｔ（ＬＬ５３７）は受け入れ
番号ＡＴＣＣ６８３５７を有し、そしてＬＰ²１２８を
含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｘ２８１９Ｔ（ＬＬ５３８）は
受け入れ番号６８３５８を有する。両者は１９９０年６
月１０日に提出され、そして法律的に受け入れられたと
き、一般に入手可能となる。

【００５４】引用文献 １、バルツ（Ｂａｌｔｚ）、Ｒ．Ｈ．およびＰ．マツシ
マ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）、１９８１、ストレプトミ
セス属における原形質体の融合：効率よい遺伝子組み換
えおよび細胞の再生の条件、ジャーナル・オブ・ジェネ
ラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．）１２７：１３７−１４６。 ２、バルツ（Ｂａｌｔｚ）、Ｒ．Ｈ．およびＥ．Ｔ．セ
ノ（Ｓｅｎｏ）、１９８８、ストレプトマイセス・フラ
ジアエの遺伝学およびチロシンの生合成、アナルス・オ
ブ・リビュード・マイクロバイオロジー（Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）４２：５４７−５７４。

【００５５】３、ビッブ（Ｂｉｂｂ）、Ｍ．Ｊ．、Ｊ．
Ｍ．ワード（Ｗａｒｄ）、およびＤ．Ａ．ホプウッド
（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９７８、高い頻度のストレプト
ミセス属の原形質体の中へのプラスミドＤＮＡの形質転
換、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）２７４：
３９８−４００。

【００５６】４、ビンニエ（Ｂｉｎｎｉｅ）、Ｃ．、
Ｍ．ワレン（Ｗａｒｒｅｎ）、およびＭ．Ｊ．バトラー
（Ｂｕｔｌｅｒ）、１９８９、オキシテトラサイクリン
の生合成に関係するストレプトミセス・リモスス遺伝子
のストレプトミス・リビダンスにおけるクローニングお
よび異種発現、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．）１７１：８８７−８９５。

【００５７】５、バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）、Ｍ．
Ｊ．、Ｅ．Ｊ．フレンド（Ｆｒｉｅｎｄ）、Ｉ．Ｓ．ハ
ンター（Ｈｕｎｔｅｒ）、Ｆ．Ｓ．カクズマレク（Ｋａ
ｃｚｍａｒｅｋ）、Ｄ．Ａ．スグデン（Ｓｕｇｄｅｎ）
およびＭ．ワレン（Ｗａｒｒｅｎ）、１９８９、抵抗性
遺伝子の分子クローニングおよびストレプトマイセス・
リモススによるオキシテトラサイクリンの生合成に関係
する連鎖した遺伝子クラスターの構成、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．）２１５：２３１−２３８。

【００５８】６、チャスター（Ｃｈａｓｔｅｒ）、Ｋ．
Ｆ．およびＣ．Ｊ．ブルトン（Ｂｒｕｔｏｎ）、１９８
３、ストレプトマイセス属中の突然変異のクローニング
および抗生物質産生遺伝子の分離、遺伝子（Ｇｅｎｅ）
２６：６７−７８。

【００５９】７、チェン（Ｃｈｅｎ）、Ｃ．Ｗ．、Ｈ．
−Ｆ．リン（リン）、Ｃ．Ｌ．クオ（Ｋｕｏ）、Ｈ．−
Ｈ．ツサイ（Ｔｓａｉ）およびＪ．Ｆ．−Ｙ．ツサイ
（Ｔｓａｉ）、１９８８、フェマイシンＣ産生を与える
ＤＮＡ配列のクローニングおよび発現、バイオ／テクノ
ロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６：１２２２
−１２２４。

【００６０】８、コックス（Ｃｏｘ）、Ｋ．Ｌ．および
Ｒ．Ｈ．バルツ（Ｂａｌｔｚ）、１９８４、ストレプト
ミセス属の種においてバクテリオファージのプラークの
形成の制限、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）１５９：４９９−５０
４。

【００６１】９、ディストラー（Ｄｉｓｔｌｅｒ）、
Ｊ．Ｋ．マンソウリ（Ｍａｎｓｏｕｒｉ）およびＷ．ピ
エペルスバーグ（Ｐｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ）、１９８
５、ストレプトミセス・グリセウスＩＩにおいてストレ
プトマイシンの生合成。生合成遺伝子の隣接するゲノム
の位置および２つのストレプトマイシン抵抗性遺伝子の
１つ、ＦＥＭＳ マイクロバイオロジー・レターズ（Ｆ
ＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．）３０：１５
１−１５４。

【００６２】１０、ダッガー（Ｄｕｇｇｅｒ）、Ｂ．
Ｍ．１９４８、オーレオマイシン：新規な抗生物質につ
いての連続的研究の産生物、アナル・オブ・ニューヨー
ク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ．Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）５１：１７１−１８１。

【００６３】１１、フェイテルソン（Ｆｅｉｔｅｌｓｏ
ｎ）、Ｊ．Ｓ．およびＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏｐｗ
ｏｏｄ）、１９８３、抗生物質の生合成に関係するＯ−
メチルトランスフェラーゼのためのストレプトミセス属
の遺伝子のクローニング、モレキュラー・アンド・ジェ
ネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．）１９０：３９４−３９８。

【００６４】１２、フィッシュメン（Ｆｉｓｈｍｅ
ｎ）、Ｓ．Ｅ．、Ｋ．コックス（Ｃｏｘ）、Ｊ．Ｌ．ラ
ーソン（Ｌａｒｓｏｎ）、Ｐ．Ａ．レイノルヅ（Ｒｅｙ
ｎｏｌｄｓ）、Ｅ．Ｔ．セノ（Ｓｅｎｏ）、Ｗ．−Ｋ．
エー（Ｙｅｈ）、Ｒ．バン・フランク（Ｖａｎ Ｆｒａ
ｎｋ）およびＣ．Ｌ．ヘルシュバーガー（Ｈｅｒｓｈｂ
ｅｒｇｅｒ）、１９８７、マクロリド系抗生物質の生合
成のための遺伝子のクローニング、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、
８４：８２４８−８２５２。

【００６５】１３、ギル（Ｇｉｌ）、Ｊ．Ａ．および
Ｄ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９８３、
カンジジン産生ストレプトミセス・グリセウスのｐ−ア
ミノ安息香酸シンセターゼ遺伝子のクローニングおよび
発現、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２５：１１９−１３２。

【００６６】１４、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）、
Ｊ．Ｊ．１９８５、テトラサイクリンの発酵および突然
変異の発生、ｐ．５−５７、Ｊ．Ｊ．フラブカ（Ｈｌａ
ｖｋａ）およびＪ．Ｈ．ブース（Ｂｏｏｔｈｅ）
（編）、実験製剤学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．７８、テトラサイクリン（Ｔｈｅ
Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ）、スプリンガー−フェ
ルラーグ、ベルリン。

【００６７】１５、ホーン（Ｈｏｈｎ）、Ｂ．および
Ｊ．コリンス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、大きいＤＮＡ断片の
効率よいクローニングのための小さいコスミド、遺伝子
（Ｇｅｎｅ）１１：２９１−２９８。

【００６８】１６、ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、
Ｄ．Ａ．およびＨ．Ｍ．ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）、１９
７８、バクテリアの原形質体の融合：ストレプトミセス
・ケリコロルの融合タンパク質中の組み換え、モレキュ
ラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）１６２：３０７−３１７。 １７、ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、Ｄ．Ａ．、１
９６７、ストレプトミセス・ケリコロル中の遺伝子の分
析およびゲノムの構造、バクテリオリジカル・リビュー
（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．）３１：３７３−４０
３。

【００６９】１８、ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、
Ｄ．Ａ．、Ｍ．Ｊ．ビッブ（Ｂｉｂｂ）、Ｋ．Ｆ．キー
ゼル（Ｋｉｅｓｅｒ）、Ｄ．Ｊ．リジエイト（Ｌｙｄｉ
ａｔｅ）、Ｃ．Ｐ．スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｊ．Ｍ．ワ
ード（Ｗａｒｄ）およびＨ．シュレンプフ（Ｓｃｈｒｅ
ｍｐｆ）、１９８５、ストレプトミセス属の遺伝子操作
−実験室のマニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｎｉｐｕｌ
ａｔｉｏｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−ａ ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、ザ・ジョン・インネス・
ファンデイション（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ ＩｎｎｅｓＦｏ
ｕｎｄａｔｉｏｎ）、英国ノーウィッチ。

【００７０】１９、ホリノウチ、Ｓ．、マルパルチダ
（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）、Ｄ．Ａ．ホップウッド（Ｈ
ｏｐｗｏｏｄ）およびＴ．ベップ、１９８９、ａｓｆＢ
はストレプトミセス・ケリコロルＡ３（２）およびスト
レプトミス・リビダンスにおけるアクチノノルホジン生
合成経路の転写を刺激する、モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．）２１５：３５５−３５７。

【００７１】２０、ジョーズ（Ｊｏｎｅｓ）、Ｇ．Ｈ．
およびＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９
８４、ストレプトマイセス・アンチビオチクスからのフ
ェノキサジンシンターゼ遺伝子の分子クローニングおよ
び発現、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５９：１４１５１
−１４１５７。

【００７２】２１、カッツ（Ｋａｔｚ）、Ｅ．、Ｃ．
Ｊ．トンプソン（Ｔｏｍｐｓｏｎ）およびＤ．Ａ．ホッ
プウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９８３、ストレプトミ
ス・リビダンス中のストレプトマイセス・アンチビオチ
クスからのチロシナーゼ遺伝子のクローニングおよび発
現、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロ
ジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１２９：２
７０３−２７１４。

【００７３】２２、ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）、Ｊ．
Ｌ．およびＣ．Ｌ．ヘルシュバーガー（Ｈｅｒｓｈｂｅ
ｒｇｅｒ）、１９８６、ストレプトミセテのプラスミド
の最小複製はプラスミドＤＮＡの超高レベルを産生す
る、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）１５：１９９−２０
９。

【００７４】２３、レスキウ（Ｌｅｓｋｉｗ）、ｂ．
ｋ．、Ｙ．アハロノウィツ（Ａｈａｒｏｎｏｗｉｔ
ｚ）、Ｍ．メバレチ（Ｍｅｖａｒｅｃｈ）、Ｓ．ウォル
フェ（Ｗｏｌｆｅ）、Ｌ．Ｃ．ビニング（Ｖｉｎｉｎ
ｇ）、Ｄ．Ｗ．Ｓ．ウェストレイク（Ｗｅｓｔｌａｋ
ｅ）およびＳ．Ｅ．ジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）、１９
８８、ストレプトマイセス・カルブリゲルスからのイソ
ペニリシンＮシンセターゼ遺伝子のクローニングおよび
ヌクレオチド配列の決定、遺伝子（Ｇｅｎｅ）６２：１
８７−１９６。

【００７５】２４、リディエイト（Ｌｙｄｉａｔｅ）、
Ｄ．Ｊ．、Ｆ．マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）
およびＤ．Ｊ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９
８５、ストレプトマイセス属のプラスミドＳＣＰ２＊：
その機能的分析および有用なクローニングベクターの中
への発生、遺伝子（Ｇｅｎｅ）３５：２２３−２３５。

【００７６】２５、マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄ
ａ）Ｆ．およびＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏ
ｄ）、１９８４、ストレプトマイセス属の抗生物質の全
生合成経路の分子クローニングおよび異種宿主中のその
発現、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）３０
９：４６２−４６４。

【００７７】２６、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、
Ｔ．、Ｅ．Ｆ．フリトシュ（Ｆｒｉｔｓｈ）およびＪ．
サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、１９８２、分子ク
ローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー、
ニューヨーク。

【００７８】２７、マクコルミック（ＭｃＣｏｒｍｉｃ
ｋ）、Ｊ．Ｒ．Ｄ．１９６８、テトラサイクリンの点ブ
ロックド突然変異および生合成、Ｇ．セルモンチ（Ｓｅ
ｒｍｏｎｔｉ）およびＭ．アレセビク（Ａｌｅｃｅｖｉ
ｃ）（編）、ストレプトマイセスの遺伝学および育種、
Ｙｕｇｓｌａｖ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ａｎｄ Ａｒｔ
ｓ、ザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）。

【００７９】２８、モタメジ（Ｍｏｔａｍｅｄｉ）、
Ｈ．およびＣ．Ｒ．フチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏ
ｎ）、１９８７、テトラセオマイシンＣ、ストレプトマ
イセス・グアセセンスのアトラサイクリン抗腫瘍抗生物
質、の生合成のための遺伝子クラスターのクローニング
および異種発現、プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８４：４４４５−
４４４９。

【００８０】２９、ムラカミ、Ｔ．、Ｈ．アンザイ、
Ｓ．イマイ、Ａ．サトー、Ｋ．ナガオカおよびＣ．Ｊ．
トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、１９８６、ストレプ
トマイセス・ハイグロスコピクスのバイアラフォス（ｂ
ｉａｌａｐｈｏｓ）生合成遺伝子：遺伝子クラスターの
分子クローニングおよび特性決定、モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．）２０５：４２−５０。

【００８１】３０、レイネス（Ｒｅｙｎｅｓ）、Ｊ．
Ｐ．、Ｔ．カルメルス（Ｃａｌｍｅｌｓ）、Ｄ．ドロコ
ウルト（Ｄｒｏｃｏｕｒｔ）およびＧ．チラビイ（Ｔｉ
ｒａｂｙ）、１９８８、大腸菌中のクローニング、発現
およびストレプトマイセス・リモススからのテトラサイ
クリン抵抗性遺伝子のヌクレオチド配列、ジャーナル・
オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１３４：５８５−５９８。

【００８２】３１、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）、Ｆ．、
Ａ．Ｒ．コウルソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）、Ｇ．Ｆ．ホン
グ（Ｈｏｎｇ）、Ｄ．Ｆ．ヒル（Ｈｉｌｌ）およびＧ．
Ｂ．ペターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、１９８２、バク
テリオファージラムダＤＮＡのヌクレオチド配列、ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）１６２：７２９−７７３。

【００８３】３２、スタンザク（Ｓｔａｎｚａｋ）、
Ｒ．、Ｐ．マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）、Ｒ．
Ｈ．バルツ（Ｂａｌｔｚ）およびＲ．Ｎ．ラオ（Ｒａ
ｏ）、１９８６、ストレプトマイセス・エリスレウスか
らのクラスター化エリスロマイシン生合成のストレプト
マイセス・リビダンス中のクローニングおよび発現、バ
イオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
４：２２９−２３２。

【００８４】３３、スツツズマン−エングウォール（Ｓ
ｔｕｒｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ）、Ｋ．Ｊ．および
Ｃ．Ｒ．フチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）、１９８
９、ストレプトマイセス・ペウセチウス中のアントラサ
イクリン抗生物質のためのマルチ遺伝子の族、プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）ＵＳＡ、９６：３１３５−３１３９。

【００８５】３４、スチクリッフェ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆ
ｅ）、Ｊ．Ｇ．１９７９、大腸菌のプラスミドｐＢＲ３
２２の完全なヌクレオチド配列、コールド・スプリング
・ハーバー・シンポジウム（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．）、Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．
４３：７７−９０。

【００８６】３５、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、
Ｃ．Ｊ．、Ｔ．キーザー（Ｋｉｅｓｅｒ）、Ｊ．Ｍ．ワ
ード（Ｗａｒｄ）、およびＤ．Ａ．ホプウッド（Ｈｏｐ
ｗｏｏｄ）、１９８２、ストレプトマイセス属からの抗
生物質抵抗性遺伝子の物理学的分析およびベクターの構
成におけるそれらの使用、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２０：５
１−６２。

【００８７】３６、バン・ピー（ｖａｎ Ｐｅｅ）、
Ｋ．−Ｈ．１９８８、ストレプトマイセス・アウレオフ
ァシエンスＴｕ２４からのブロモペルオキシダーゼ遺伝
子の分子クローニングおよび高いレベルの発現、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ
ｏｇｙ）１７０：５８９０−５８９４。

【００８８】３７、バラ（Ｖａｒａ）、Ｊ．Ａ．、Ｄ．
プリド（Ｐｕｌｉｄｏ）、Ｒ．Ａ．ラカレ（Ｌａｃａｌ
ｌｅ）およびＡ．ジメネズ（Ｊｉｍｅｎｅｚ）、ストレ
プトマイセス・アルボニゲルのプロマイシンの生合成の
経路における２つの遺伝子は密接に連鎖されている、遺
伝子（Ｇｅｎｅ）６９：１３５−１４０。

【００８９】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。

【００９０】１、コスミドＬＰ²１２７およびＬＰ²１２
８。

【００９１】２、産生物を発現するための原核生物の宿
主の中に前記コスミドが挿入されている、上記第１項記
載のコスミド。

【００９２】３、前記宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、
ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・グリセ
オフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏ
ｆｕｓｃｕｓ）、ストレプトミセス・アンボフチスス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆｕｃｈｓｕ
ｓ）、アクチノミセテス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コルネバクテ
リア属（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、またはサーモ
アクチノミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ
ｓ）である、上記第２項記載のコスミド。

【００９３】４、前記宿主はストレプトミセス・リビダ
ンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）で
ある、上記第３項記載のコスミド。

【００９４】５、前記コスミドはテトラサイクリンおよ
びクロロテトラサイクリンの生合成の経路の遺伝情報を
指定するＤＮＡ遺伝子クラスターを含有する、上記第３
項記載のコスミド。

【００９５】６、前記コスミドは、厳格なハイブリダイ
ゼーション条件下に、ＤＮＡ遺伝子クラスターにハイブ
リダイゼーションし、前記ＤＮＡ遺伝子クラスターはテ
トラサイクリンおよびクロロテトラサイクリンの形成の
ための生合成の経路をエンコードする、上記第５項記載
のコスミド。

【００９６】７、前記コスミドはテトラサイクリンおよ
びクロロテトラサイクリンの生合成の経路の遺伝情報を
指定するＤＮＡ遺伝子クラスターを含有する、上記第４
項記載のコスミド。

【００９７】８、前記コスミドは、厳格なハイブリダイ
ゼーション条件下に、ＤＮＡ遺伝子クラスターにハイブ
リダイゼーションし、前記ＤＮＡ遺伝子クラスターはテ
トラサイクリンおよびクロロテトラサイクリンの形成の
ための生合成の経路をエンコードする、上記第７項記載
のコスミド。

【００９８】９、所望の産生物を産生する微生物の生合
成の経路をエンコードするＤＮＡ遺伝子クラスターを操
作して前記産生物の産生を増強することによって、前記
生合成の経路を調節することからなる、所望の産生物の
収率を増強する方法。

【００９９】１０、前記産生物は抗生物質、タンパク質
またはポリペプチドである、上記第９項記載の方法。

【０１００】１１、前記ＤＮＡは原核生物の宿主中で発
現される、上記第１０項記載の方法。

【０１０１】１２、前記宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・
グリセオフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉ
ｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）、ストレプトミセス・アンボフチ
スス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆｕｃｈｓ
ｕｓ）、アクチノミセテス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔ
ｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コルネバク
テリア属（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、またはサー
モアクチノミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｓ）である、上記第１１項記載の方法。

【０１０２】１３、前記宿主はストレプトミセス・リビ
ダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）
である、上記第１２項記載の方法。

【０１０３】１４、前記抗生物質はクロロテトラサイク
リン、テトラサイクリンまたはそれらの類似体である、
上記第１３項記載の方法。

【０１０４】１５、テトラサイクリンまたはクロロテト
ラサイクリンの産生の生合成の経路またはその一部分を
エンコードするＤＮＡ遺伝子クラスターを含有する、Ｌ
Ｐ²１２７およびＬＰ²１２８により発現された、抵抗性
形質転換体についてスクリーニングすることからなる、
テトラサイクリンまたはクロロテトラサイクリンの抗生
物質の類似体についてスクリーニングする方法。

【０１０５】１６、前記ＤＮＡは、テトラサイクリンま
たはクロロテトラサイクリンの産生の生合成の経路また
はその一部分をエンコードするＤＮＡに対して、厳格な
ハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイゼーショ
ンする、上記第１５項記載の方法。

【０１０６】１７、前記宿主は原核生物の宿主中で発現
される、上記第１６項記載の方法。 １８、前記宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプト
ミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・グリセオフスクス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕ
ｓ）、ストレプトミセス・アンボフチスス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆｕｃｈｓｕｓ）、アクチノ
ミセテス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）、バチルス
属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コルネバクテリア属（Ｃｏｒ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、またはサーモアクチノミセス
属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）である、上
記第１７項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】２機能性コスミドベクターの成分の構造および
コスミドのアームを発生する方法。コスミドベクターの
アームＬおよびＲは、図面に示すようにかつ実施例３に
詳細に記載されているように、それぞれ、プラスミドＡ
およびＢから発生される。単一の線は、構成体の大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のレプリコン部
分を表す。プラスミドＡにおいて、Ｅ．ｃｏｌｉ部分は
ｐＢＲ３２２の３．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片
から誘導される［サトクリッフェ（Ｓａｔｃｌｉｆｆ
ｅ）、１９７９］。プラスミドＢは、アクチノミセス属
中の複製機能を提供する、ＳＣＰ２＊［縞模様）からの
５．９ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を含有する。ｐ
ＨＣ７９の７００ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢｓｔＥＩＩｃｏ
ｓを含有する断片から誘導した３つの直列の粘着末端部
位［ホーン（Ｈｏｈｎ）ら、１９８０］を、両者のプラ
スミド［白抜き］上に準備する。プラスミドＡの中に存
在するチオストレプトン抵抗性遺伝子［黒塗り］は、ｐ
ＩＪ７０２から回収した１．１ｋｂのＢｃｌＩ断片から
誘導する［カッツ（Ｋａｔｚ）ら、１９８３］。プラス
ミド［縞模様］中の１．１ｋｂのスペーサー領域を、バ
クテリオファージλのＳａｃＩ断片から誘導する［サン
ガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、１９８２］。

【図２】ＬＰ²１２７およびＬＰ²１２８のために物理学
的地図。両者のプラスミドは、制限マッピングにより同
等の構造を示す；したがって、両者の代表的な、単一の
構造をここでかつ図３に示す。ベクター部分は二重線に
よりを表す；ＴＣ／ＣＴＣ生合成領域は単一の線として
示す。ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．
ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）からクローニングしたＤＮ
Ａは３１．９ｋｂである；表示するベクター領域はｐＩ
ＢＩ−２４［ハッチング］、チオストレプトン抵抗性
［縞模様］である。（＋）のしるしを付けた２つのＥｃ
ｏＲＩ部位は、ベクター誘導であり、そしてベクターお
よびストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａ
ｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡを境界するＳａｕ３Ａ
−ＢｇｌＩＩ接合部をフランキングする。

【図３】ＬＰ²１２７およびＬＰ²１２８中でクローニン
グしたストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．
ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）のＤＮＡについての制限エ
ンドヌクレアーゼ地図。ＬＰ²１２７およびＬＰ²１２８
中でクローニングした３１．９ｋｂのＤＮＡは線状で示
されている。この地図は、ベクターから誘導したＥｃｏ
ＲＩ部位を左および右の開始および終了部分として含む
ように描かれた。制限断片の大きさはキロ塩基で表され
ており、そしてアガロースゲルの電気泳動分析の通常の
分解能の限界（約５００ｂｐ）内まで正確である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:485） (72)発明者 ジエイソン・エイ・ロトビン アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07083 ユニオン・ルーズベルトアベニユー985

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コスミドＬＰ²１２７およびＬＰ²１２
   ８。
2. 【請求項２】 所望の産生物を産生する微生物の生合成
   の経路をエンコードするＤＮＡ遺伝子クラスターを操作
   して前記産生物の産生を増強することによって、前記生
   合成の経路を調節することからなる、所望の産生物の収
   率を増強する方法。
3. 【請求項３】 テトラサイクリンまたはクロロテトラサ
   イクリンの産生の生合成の経路またはその一部分をエン
   コードするＤＮＡ遺伝子クラスターを含有する、ＬＰ²
   １２７およびＬＰ²１２８により発現された、抵抗性形
   質転換体についてスクリーニングすることからなる、テ
   トラサイクリンまたはクロロテトラサイクリンの抗生物
   質の類似体についてスクリーニングする方法。