JPH0578253A

JPH0578253A - 抗腫瘍剤及び免疫増強剤

Info

Publication number: JPH0578253A
Application number: JP3273054A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiro Kohama; 靖弘小濱; Tsutomu Mimura; 務三村; Kazuhiko Nagata; 和彦永田; Munehiko Donpou; 宗彦鈍宝
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1991-09-24
Publication date: 1993-03-30

Abstract

(57)【要約】【構成】一般式【化１】（式中ｎは３〜８、Ｒ₁及びＲ₂ は水素原子、アルキ
ル、フェニルまたはフェニルアルキルを示す）で表され
る化合物を有効成分とする抗腫瘍剤及び免疫増強剤。【効果】優れた抗腫瘍効果および免疫増強効果を有
し、悪性腫瘍などの治療薬として有効に用いることがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、優れた抗腫瘍剤及び免
疫増強剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、抗腫瘍剤としては、各種の抗癌性
抗生物質、代謝拮抗物質及び免疫賦活物質などに分類さ
れる薬剤が使用されてきた。また、ビス（２−ヒドロキ
シエチル）ジスルフィドに免疫増強作用があることが知
られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従来使用されている上
記の薬剤は、その制癌効果がきわめて微弱であるか、制
癌効果が高い場合にも毒性がきわめて高いという欠点が
あった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、悪性腫瘍
に対して制癌効果が高くかつ安全性の高い薬剤を見いだ
すべく鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに中等度
好熱菌であるバチルス・ステアロサーモフイルス（Baci
llusstearothermophilus ）の培養ろ液中に目的の活性
を見いだし、さらにその有効成分を追求し、その構造を
明らかにすることにより本発明を完成するにいたった。

【０００５】すなわち、本発明は、バチルス・ステアロ
サーモフイルス（Bacillus stear- othermophilus ）の
培養ろ液を有効成分とする抗腫瘍剤及び免疫増強剤並び
に下記の一般式

【０００６】

【化３】

【０００７】（式中ｎは３〜８、Ｒ₁及びＲ₂ は水素原
子、アルキル、フェニルまたはフェニルアルキルを示
す。）で表される化合物を有効成分とする抗腫瘍剤及び
免疫増強剤を要旨とするものである。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
抗腫瘍剤及び免疫増強剤の有効成分は一般式化２（式中
ｎは３〜８、Ｒ₁及びＲ₂ は水素原子、アルキル、フェ
ニルまたはフェニルアルキルを示す。）で表される化合
物である。

【０００９】具体的な化合物としてはビス（２−ヒドロ
キシエチル）トリスルフィド、ビス（２−ヒドロキシヘ
キシル）トリスルフィド、ビス（２−ヒドロキシフェニ
ルプロピル）トリスルフィド、ビス（２−ヒドロキシフ
ェニルブチル）トリスルフィドなどがあげられる。

【００１０】本発明における有効成分である化合物は公
知の化合物であり、ゴム加工の際の加硫（日本ゴム協会
誌４４巻、１２号、１０１０〜１０１４頁、１９７１
年）、染料（特開昭５７−１９２４６６）などとして利
用されているものである。

【００１１】本発明における有効成分である化合物を得
るための方法としては、バチルス・ステアロサーモフイ
ルス（Bacillus stearothermophilus ）の培養ろ液から
抽出精製する方法と共に有機合成法での製造も可能であ
る。

【００１２】まず、バチルス・ステアロサーモフイルス
（Bacillusstearothermophilus ）の培養ろ液から抽出
精製する方法について詳細に述べる。本発明で用いられ
るバチルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stear
othermophilus ）としては、菌株に限定されるものでは
なく、具体例としては例えば、ＮＣＡ−１５０３（微工
研菌寄第４７７８号）、ＵＫ７８８（微工研条寄第２３
７３号）、ＵＫ５６３（微工研菌寄第７２７５号）、Ｉ
ＦＯ−１２５５０、ＩＦＯ−１２９８３，ＩＦＯ−１３
７３７、ＡＴＣＣ−７９５３（微工研菌寄第４７７５
号）、ＡＴＣＣ−８００５（微工研菌寄第４７７６
号）、ＡＴＣＣ−１０１４９（微工研菌寄第４７７７
号）ＡＴＣＣ−１２０１６、ＡＴＣＣ−１２９７６、Ａ
ＴＣＣ−１２９７７，ＡＴＣＣ−１２９７８、ＡＴＣＣ
−１２９７９、ＡＴＣＣ−１２９８０、ＡＴＣＣ−１５
９５１、ＡＴＣＣ−１２９５２、ＡＴＣＣ−２１３６５
などが挙げられる。これらの中で、ＮＣＡ−１５０３
（微工研菌寄第４７７８号）が培養ろ液中の抗腫瘍活性
が高く目的を達成するために最も好都合である。

【００１３】これらの菌株の培養には一般によく用いら
れる培地を使用することができる。具体的には、炭素源
としてはブドウ糖、乳糖、でんぷん、糖蜜などの糖類が
使用できる。また窒素源としてはペプトン、肉エキス、
酵母エキスなどの有機の窒素源と共に塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウムなどの無機の窒素源も使用するこ
とができる。また必要に応じてビタミン、ミネラルを添
加してもよい。

【００１４】培養条件としては、好気培養が採用され、
例えば５８℃、１時間から１２時間培養することにより
培養液を得ることができる。さらに、新鮮な培地を一定
速度で供給しながら培養する連続培養法も適用できる。
培地及び培養条件は上記の条件に応じて適宜選定するこ
とが可能であることは言うまでもない。

【００１５】このようにして培養した培養液は、ろ過あ
るいは遠心などの常法によって菌体を除去したのち、ろ
液を得ることができる。得られたろ液は、フィルターな
どによる除菌処理あるいは滅菌処理により菌体を除いた
のち、そのままあるいは凍結乾燥あるいは各種の濃縮操
作を行うことによって抗腫瘍剤として使用することがで
きるが、さらに有機溶媒などによる活性物質の抽出、カ
ラムクロマトグラフィーなどによる分離手段によって得
られる有効成分を含む画分、もしくは有効成分そのもの
を抗腫瘍剤または免疫増強剤として使用することができ
る。

【００１６】活性物質の抽出には、ブタノール、プロパ
ノール、酢酸エチル、ベンゼン、ヘキサン、クロロホル
ム、トルエンなどの有機溶媒をもちいることができる。
また、カラムクロマトグラフィーとしては吸着クロマト
グラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用する
ことができる。

【００１７】一方、本出願の抗腫瘍剤または免疫増強剤
は有機合成法によっても製造できる。具体的にはディー
・エヌ・ハープらの方法（ジャーナルオブアメリカ
ンケミカルソサイエティー１００巻、１２２２ペー
ジ、１９７８年）により合成できる。

【００１８】本発明の化合物はホ乳動物に対して優れた
抗腫瘍活性および免疫増強作用を有するものであり、抗
腫瘍剤、制ガン剤、免疫増強剤として優れたものであ
る。

【００１９】本発明の化合物は、種々の形態で患者に投
与できる。例えば、錠剤、ペレット剤、カプセル剤、座
剤、液剤、乳剤、けんだく剤などの形態が使用できる。
これらの形態を用いる場合、安定剤、増量剤、着色剤、
芳香剤及び甘味剤のような補助剤を用いることができ
る。また、静脈注射、筋肉注射、皮下注射などによって
も患者に投与可能である。

【００２０】投与量としては体重１ｋｇあたり０．０１
ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５ｍｇ〜５０ｍ
ｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇが適当であ
るが、患者の症状、病状の進行程度などにより適宜最適
投与量を選ぶことは言うまでもない。

【００２１】

【実施例】以下、実施例によりさらに具体的に説明す
る。なお、実施例中、％はＷ／Ｖ％を表す。実施例１バチルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stearot
hermophilus ）ＮＣＡ−１５０３（微工研菌寄第４７７
８号）をグルコース０．３５％、酵母エキス０．３％、
ペプトン０．２％、リン酸カリウム０．０４％、リン酸
２ナトリウム０．０４％、硫酸マグネシウム０．１％か
らなる液体培地に接種し、５８℃、４時間前培養した培
養液２．２Ｌを１８Ｌの同培地を仕込んだ３０Ｌジヤー
フアーメンターに移し５８℃、３．５時間培養した。

【００２２】培養液を遠心し得られた培養ろ液のうち１
０Ｌを以後の処理に用いた。この培養ろ液を限外ろ過膜
（分子量排除限界１．３×１０4）でろ過し透過液９Ｌ
を得た。この透過液９Ｌに対し３Ｌのｎ−ブタノールで
３回抽出を行いｎ−ブタノール層を回収した。ｎ−ブタ
ノール層を減圧濃縮し、１．１３ｇの固形物を得た。こ
の固形物を２００ｍｌの水に溶解したのち活性化ＯＤＳ
レジン（ウオーターズ社製、５５−１０５μ）２０ｇを
加え３０分間攪はんした。これをグラスフイルターでろ
過しＯＤＳレジンを回収し、ＯＤＳレジンに吸着した活
性成分を５００ｍｌの２０容量％アセトニトリルを用い
て溶出し、２０７ｍｇの活性画分（ＣＦ−ＬＢ２０）を
得た。

【００２３】このようにして得られた活性画分（ＣＦ−
ＬＢ２０）をさらに精製するために、高速液体カラムク
ロマト用カラム、デベロシルＯＤＳ−７（野村化学社
製、８×２５０ｍｍ）を用いて５容量％アセトニトリル
−０．０５容量％ＨＣｌから３０容量％アセトニトリル
−０．０５容量％ＨＣｌのリニアーグラジエントで活性
画分を溶出した。さらに活性画分を高速液体カラムクロ
マト用カラム、アサヒパックＧＳ−３２０（旭化成社
製、７．６×５００ｍｍ）を用いて、５０ｍＭ酢酸アン
モニウム（ｐＨ６．７）／アセトニトリル＝９０／１０
からなる溶出液で活性画分を溶出した。このようにして
得た活性画分をＢＳ−１とした。ＢＳ−１を再度、高速
液体カラムクロマトグラフィーを用いて精製し単一標品
を得た。

【００２４】本品の構造を確定するために¹³Ｃ−ＮＭ
Ｒ、¹Ｈ−ＮＭＲ、質量分析を行ったところ、化１（式
中ｎは３、Ｒ₁及びＲ₂は水素原子）で示される構造を
持つビス（２−ヒドロキシエチル）トリスルフィドであ
ることが明らかになった。

【００２５】図１に¹Ｈ−ＮＭＲ、図２に¹³Ｃ−ＮＭＲ
分析結果を示した。

【００２６】実施例２実施例１で得られたＣＦ−ＬＢ２０について、培養細胞
を用いて抗腫瘍活性を調べた。株化されたマウスガン細
胞Ｐ３８８−Ｄ１（国立衛生試験所から入手した）を２
×１０⁵／ｍｌになるように１０％ＦＣＳ(Fetal Calf
Serum)、５０μＭ２−メルカプトエタノールを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地に浮遊させ、３５ｍｍ径のシャーレに
１ｍｌずつまき、滅菌水の懸濁した各種濃度の上記活性
画分ＣＦ−ＬＢ２０とコントロールとして滅菌水のみの
ものを１０μｌ添加し、３７℃で５容量％ＣＯ₂インキ
ュベーター内で４８時間培養した。４８時間後、０．２
％トリパンブルーで２倍希釈し、計数板にて生細胞数を
カウントした。結果を表１に示す。表１の結果からＣＦ
−ＬＢ２０に抗腫瘍活性があることは明らかである。

【００２７】

【表１】

【００２８】実施例３次に、実施例１で得られたＢＳ−１について、培養細胞
を用いて抗腫瘍活性を調べた。株化されたヒトガン細胞
Ｕ９３７（国立衛生試験所から入手した）を２×１０⁵
／ｍｌになるように１０％ＦＣＳ、５０μＭ２−メルカ
プトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊さ
せ、３５ｍｍ径のシャーレに１ｍｌずつまき、滅菌水に
懸濁した各種濃度の上記活性画分ＢＳ−１とコントール
として滅菌水のみのものを１０μｌ添加し３７℃で５容
量％ＣＯ₂インキュベーター内で４８時間培養した。４
８時間後、０．２％トリパンブルーで２倍希釈し、計数
板にて生細胞数をカウントした。結果を表２に示す。表
２の結果からＢＳ−１に抗腫瘍活性があることは明らか
である。

【００２９】

【表２】

【００３０】実施例４実施例１で得られたビス（２−ヒドロキシエチル）トリ
スルフィドを試料として、抗腫瘍活性および免疫増強活
性について検討した。抗腫瘍活性：マウス肥満細胞種Ｐ−８１５（国立衛生試
験所細胞バンクＪＣＲＢ）をＲＰＭＩ１６４０培地
（日水製薬製、１０％牛胎児血清を含む）中、２４穴プ
レートに４×１０⁴ずつまき、種々の濃度の検体を添加
後、総容量２００μＬとし、炭酸ガス培養器中３７℃で
培養した。２４時間後、各ウエルの生細胞数をトリパン
ブルー染色法により計数した。正常細胞としてＢＡＬＢ
／３Ｔ３（ＪＣＲＢ）をＤＭＥＭ（日水製薬製、１０％
牛血清を含む）中、９６穴プレートに４×１０⁴ずつま
き、種々の濃度の検体を添加後、総容量１００μＬで同
様に培養した。４８時間後生細胞数をミクロカルチャー
テトラゾリウム法（M.C.Alley et al., Cancer Res.,
48, 589-601(1988) ）により計数した。

【００３１】免疫増強活性：９６穴プレートに、水上ら
の方法（水上茂樹等、白血球と食作用、講談社、東京,1
979,195頁）に従い調製したエフェクター細胞（カゼイ
ン誘導マウス腹腔マクロファージ）を１００μＬ（４×
１０⁵）ずつまき、検体を種々の濃度となるように添加
後、炭酸ガス培養器中３７℃で培養した。２４時間後各
ウエルをＲＰＭＩ１６４０で洗浄し¹²⁵Ｉ−デオキシウ
リジン（アマシャム製）で標識したＰ−８１５を標的細
胞として２００μＬ（２×１０⁴）ずつまき、さらに２
４時間培養した。培養後、プレートをよく攪はんした
後、１０００rpm、４℃、１０分間遠心分離し、各ウエ
ルより培養上清を１００μＬずつガラス試験管にとり上
清中に放出された放射活性をガンマーカウンター（アロ
カ社製）にて測定した。最大放出として、最終濃度０．
５％トリトンと共に培養したものを用い、次式により細
胞障害性（％）を算出した。

【００３２】

【００３３】抗腫瘍活性については表３に、免疫増強活
性については図３にそれぞれ示した。

【００３４】

【表３】

【００３５】表３の結果から明らかなようにビス（２−
ヒドロキシエチル）トリスルフィドは０．１〜２．５μ
ｇ／ｍｌの範囲で濃度依存的に腫瘍細胞Ｐ−８１５の増
殖を抑制し、２．５μｇ／ｍｌではほぼ完全に増殖を抑
制した。一方、正常細胞ＢＡＬＢ／３Ｔ３に対してはほ
とんど増殖抑制作用を示さなかった。ビス（２−ヒドロ
キシエチル）トリスルフィドのＢＡＬＢ／３Ｔ３に対す
るＰ−８１５への選択毒性は６０倍以上であり、既知の
抗腫瘍剤のブレオマイシンおよび５−フルオロウラシル
に比べて明らかに優れた抗腫瘍作用を示した。

【００３６】また、図３から明らかなように、１〜１０
μｇ／ｍｌの範囲でビス（２−ヒドロキシエチル）トリ
スルフィドは濃度依存的にマクロファージを活性化して
腫瘍細胞Ｐ−８１５障害性を示し、明らかに免疫調節活
性を有することを認めた。

【００３７】実施例５ビス（２−ヒドロキシエチル）トリスルフィド５０ｇ乳糖９３５ｇステアリン酸マグネシウム１５ｇ上記成分をそれぞれ秤量した後、均一に混合し、混合粉
末をハードゼラチンカプセルに２００ｍｇずつ充填しカ
プセル剤を調製した。

【００３８】実施例６ビス（２−ヒドロキシエチル）トリスルフィド５ｍｇブドウ糖１００ｍｇ生理食塩水１０ｍｌ上記の混合液をメンブレンフィルターでろ過後再び除菌
ろ過を行い、そのろ過液を無菌的にバイアルに分注し、
窒素ガスを充填した後、密封して静脈内注射薬とした。

【００３９】

【発明の効果】本発明の抗腫瘍剤は優れた抗腫瘍活性を
有し、悪性腫瘍の治療剤として有効に用いることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の有効成分であるビス（２−ヒドロキシ
エチル）トリスルフィドの¹Ｈ−ＮＭＲの分析図であ
る。

【図２】本発明の有効成分であるビス（２−ヒドロキシ
エチル）トリスルフィドの¹³Ｃ−ＮＭＲの分析図であ
る。

【図３】本発明の有効成分であるビス（２−ヒドロキシ
エチル）トリスルフィドの免疫増強活性についての説明
図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス・ステアロサーモフイルス（Ba
cillus stearothe- rmophilus ）の培養ろ液を有効成分
とする抗腫瘍剤。
【請求項２】バチルス・ステアロサーモフイルス（Ba
cillus stearothe- rmophilus ）の培養ろ液を有効成分
とする免疫増強剤。
【請求項３】下記の一般式【化１】（式中ｎは３〜８、Ｒ₁及びＲ₂ は水素原子、アルキ
ル、フェニルまたはフェニルアルキルを示す。）で表さ
れる化合物を有効成分とする抗腫瘍剤。
【請求項４】下記の一般式【化２】（式中ｎは３〜８、Ｒ₁及びＲ₂ は水素原子、アルキ
ル、フェニルまたはフェニルアルキルを示す。）で表さ
れる化合物を有効成分とする免疫増強剤。