JPH0578313B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

「発明の利用分野」 本発明は、体液、例えば血清等に含まれるスー
パーオキシドジスムターゼ（以下、SODと略称
する。）活性測定法に関する。 「発明の背景」 自然界に於て、微生物、植物、高等動物など好
気的成物は、分子状酸素を有効に利用して生命維
持に不可欠なエネルギーを効率よく得ているが、
同時に種々の活性酸素が生成し、これが生体にさ
まざまな害を及ぼすことが知られている。例えば
活性酸素の１つであるスーパーオキシドアニオン
（以下、O₂−． とする。）は炎症、発癌、老化、ま
た、核酸・酵素・脂質などの変性の原因となるな
ど、広範囲にわたり生体にとつて有害である。 SODは好気的成物のすべてに普遍的に存在し、
超酸化物不均化酵素ともよばれ、生体内のO₂−．
の不均化反応、即ち、2O₂−． ＋2H⁺→O₂＋H₂O₂
を触媒する酵素であり、生体を酸素毒性から守つ
ている。 赤血球、白血球、組織切片中のSOD活性測定
と臨床的意義に関する報告は多いが、血清中の
SODについては蛋白成分をはじめ種々の成分が
SOD測定値に影響を及ぼす為、未だ充分な検討
はなされていない。現在行われているSOD活性
測定法は、いずれの方法もO₂−． を発生させる系
とO₂−． を検出する系とから構成され、SODがO₂
−． の不均化を促進することによつてO₂−． の生成
量が減少するのを利用したものである。 SOD活性測定法に於けるO₂−． の発生系には、
超酸化化合物、例えば超酸化カリウムによりO₂
−． を生成させる系や還元型補酵素と電子伝達体の
反応によりO₂−． を生成させる系等もあるが、現
在、主としてキサンチンにキサンチンオキシダー
ゼを作用させる方法が一般に用いられている。こ
の反応を次に示す。 キサンチン＋O₂＋H₂Ｏキサンチンオキシダー
ゼ −−−−−−−−−−−→ 尿酸＋2H⁺＋O₂−． また、O₂−． の検出系には、O₂−． の還元作用を
利用したニトロテトラゾリウムブルー（以下、
NO₂−TBと略称する。）法、チトクロームＣ法、
O₂−． の酸化作用を利用したエピネフリン法、ピ
ロガロール法、６−ヒドロキシドーパミン法など
がある。 これらSOD活性測定法の原理を、O₂−． の発生
系にキサンチン、キサンチンオキシダーゼを用
い、O₂−． の検出系に、NO₂−TB法を用いた方法
を例にとり下式に示す。

【表】 即ち、O₂−． 発生系に於て、例えばキサンチン
オキシダーゼはキサンチンと分子状酸素（O₂）
との反応を触媒し、O₂−． を生じるが、この系に
SODが存在すると、O₂−． の不均化が促進され生
じたO₂−． はO₂とH₂O₂とになる。ここに生成する
O₂−． はチトクロームＣ、NO₂−TBなどを還元・
発色させ、又、エピネフリン、ピロガロール、６
−ヒドロキシド−パミンなどを酸化・発色させる
性質を有するので、この性質を利用して試薬盲検
値に対する検体吸光度の減少を測定しSOD活性
値を求めている。従つて、これらの方法はいずれ
も試薬盲検値が高い為測定精度が悪く、また、測
定範囲も狭いなどの欠点を有している。 かかる状況に於て、本発明者らはO₂−． を基質
とするSOD活性の測定法について鋭意研究を重
ね、電子伝達体の共存下、O₂−． にSODが作用し
て生ずるH₂O₂を定量することによりSOD活性が
測定し得ることを見出し、先に特許出願している
（特願昭60−40526号）。また、更にそれを改良し
た試薬盲検値の変動がなく且つ感度及び検量線の
直線性に優れたSOD活性測定法についても特許
出願している（特願昭60−144168号）。 この前者の発明は、通常O₂−． はそれ自体の不
均化反応により次第にH₂O₂に変化するが、そこ
に電子伝達体が存在するとO₂−． 自体の不均化反
応によるH₂O₂生成は起らず、この系にSODが存
在する場合のみ、その活性量に比例してH₂O₂が
生成するという事実に基づきなされたものであ
り、後者の発明は、前者の発明に更にマレイミド
又はマレイミド誘導体を反応系に共存させると、
試薬盲検値の変動がなくなり、且つ感度及び直線
性も改善されるという事実に基づきなされたもの
である。しかしながら、その後の研究の結果、上
記方法では検量線の直線性がSOD活性値約
100U／mlまでであり、SODの高値を示す試料に
ついては実用上必ずしも満足し得るものではない
ことが判明した。 「発明の目的」 本発明は、電子伝達体、マレイミド又は特定の
マレイミド誘導体、及び特定のカルボニル化合物
の共存下、O₂−． にSODが作用して生ずるH₂O₂を
定量することにより行う体液中のSOD活性の測
定法に於て、検量線の直線性に優れ、且つ検量範
囲が極めて広い、精度の高いSOD活性測定法を
提供することを目的とする。 「発明の構成」 本発明は、スーパーオキシドアニオンを基質と
し、電子伝達体、一般式〔Ａ〕

【式】 （式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を表
わす。）で示される化合物、及び一般式〔Ｂ〕

【化】 （式中、R¹，R²及びR³は夫々独立して水素原
子、低級アルキル基、水酸基、スルホン酸基又は
低級アルコキシ基を表わす。）で示されるカルボ
ニル化合物の存在下、これにスーパーオキシドジ
スムターゼ（SOD）が作用して生ずる過酸化水
素を定量することにより行うSOD活性測定法に
於て、臭素イオンの共存下に該測定を行うことを
特徴とするSOD活性測定法の発明である。 即ち、本発明は、SODが存在するO₂−． 生成系
に、電子伝達体、マレイミド又は特定のマレイミ
ド誘導体、及び特定のカルボニル化合物を共存さ
せ、この系で生成するH₂O₂を測定することによ
つてSOD活性を測定しようとする際、O₂−． 生成
系に臭素イオンを共存させると、検量線の直線性
が改善されるということを本発明者らが初めて見
出し完成させたものである。 本発明に於ける臭素イオンを他のハロゲンイオ
ンと置き換えた場合には、本発明の如き効果は得
られない。即ち、臭素イオンの代りに他のハロゲ
ンイオンを用いた場合には、検量線が何段にも折
れ曲がつたり、或は、全く発色せず、測定不能で
あつたりで、むしろ逆効果であることが確認され
ている。 このように、ハロゲンイオン中で臭素イオンだ
けが本発明の目的を達成し得、他のハロゲンイオ
ンの場合には却つて逆効果であるということは、
極めて意外なことである。 本発明に用いられる臭素イオンの濃度は特に限
定されないが、通常、O₂−． 生成系中、0.05ミリイ
オン当量／〜10ミリイオン当量／が好ましく
用いられる。臭素イオン源としては、臭素イオン
B^- _rを解離するものであればいずれにてもよいが、
通常は無機及び有機の臭素塩類がより好ましく用
いられる。無機臭素塩類としては、例えば、臭化
アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、
臭化リチウム、臭化マグネシウム等の塩類や、臭
化水素酸をアルカリ性物質で中和したその他の塩
類などが挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。また、有機臭素塩類としては、例え
ば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、テ
トラメチルアンモニウムブロミド、セチルジメチ
ルエチルアンモニウムブロミド、及びセチルピリ
ジニウムブロミドなどのカチオン性界面活性剤
や、臭化水素酸を有機塩基性物質例えばアミン類
等で中和した化合物などが挙げられるが、これら
に限定されるものではない。 本発明に用いられる一般式〔Ａ〕で示される化
合物としては、例えばマレイミド、Ｎ−エチルマ
レイミド（以下NEMと略称する。）等が使用で
きるが、なかでもNEMが水に対する溶解性が優
れているという点で好ましく用いられる。 本発明に於て用いられる一般式〔Ａ〕で示され
る化合物の濃度は、反応液中0.5mmol／ｌ以上で
あれば有効であるが、通常は２〜40mmol／ｌの範
囲が好ましく用いられる。 本発明に用いられる一般式〔Ｂ〕で示されるカ
ルボニル化合物としては、例えば２−ヒドロキシ
−４−メトキシベンゾフエノン−５−スルホン
酸、ｏ−ヒドロキシベンゾフエノン、ｐ−ヒドロ
キシベンゾフエノンなどが挙げられる。使用濃度
は反応液中0.5mmol／ｌ以上であれば有効である
が、通常は1mmol／ｌ〜40mmol／ｌの範囲が好
ましく用いられる。 本発明の方法に於て用いられる電子伝達体とし
ては、例えばフエナジンメトサルフエート
（PMS）、１−メトキシ−５−メチルフエナジニ
ウムメチルサルフエート（１−メトキシPMS）、
９−ジメチルアミノベンゾ−α−フエナゾキソニ
ウムクロリド（メルドラブルー）等が挙げられる
がこれらに限定されるものではなく、これらと同
等の作用を有する電子伝達体は全て使用可能であ
る。これらは夫々単独で用いても２種以上混合し
て用いてもかまわない。これら電子伝達体の使用
濃度は特に限定されないが、通常0.001〜1mMが
好ましく用いられる。 本発明に用いられるO₂−． 生成系としては、キ
サンチンとキサンチンオキシダーゼとの反応によ
りO₂−． を生成させる系、超酸化化合物（例えば
超酸化カリウム）によりO₂を生成させる系、又
は還元型補酵素と電子伝達体との反応によりO₂
−． を生成させる系が主として用いられるが、その
他の方法、例えば還元型フラビンとO₂との反応、
低原子価の遷移金属イオンによるO₂の還元、O₂
の電解還元などにより生成するO₂−． 等も利用で
きることは勿論である。 酵素反応の液性は中性からアルカリ性であれば
よいが、通常PH７〜10が好ましく用いられる。 本発明の方法は、SODの作用により一定時間
内に生成したH₂O₂量を測定することによつて酵
素活性を求める方法であり、H₂O₂と反応して発
色する発色剤を酵素反応系に存在させ、その呈色
の単位時間当りの吸光度変化量からSOD活性を
求める、いわゆるレイト法でも測定可能である
が、又、一定時間酵素反応させ反応を停止させた
後に吸光度を測定する、いわゆるエンド法でも測
定可能である。一般に、用手法で行う場合にはエ
ンド法を用いることが多い。エンド法は、所定時
間酵素反応させた後に反応を停止させ生成した
H₂O₂を定量する方法である為、反応停止剤が必
要となる。この場合、一定時間酵素反応と発色反
応を行つた後反応停止剤を加えて反応を停止させ
吸光度を測定する方法でも、又一定時間酵素反応
させた後反応停止剤を加えて酵素反応を停止させ
ると同時に発色反応を行わせる方法でも可能であ
るが、前者の方法によると発色剤やPODにより
酵素反応が阻害されることがある為、後者の、反
応を停止させると同時に発色反応を行わせる方法
が好ましい。反応停止剤としては、H₂O₂の定量
が通常ペルオキシダーゼ（POD）と被酸化性呈
色試薬とを用いて行われたり、４価のチタン化合
物と２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−
（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フ
エノール又は／及びその塩とから成る試薬を用い
て行われることを考慮すると、液性が中性付近で
且つこれら呈色試薬の発色に影響を与えないよう
な反応停止剤が要求される。 これらの要求にかなうものとして本発明者らは
先の特許出願（前述）に於てデシル硫酸又はその
塩、ドデシル硫酸又はその塩、及びドデシルベン
ゼンスルホン酸又はその塩から成る群より選ばれ
た１種又は２種以上の混合物を反応停止剤として
取り上げ、これらを用いることにより問題点が解
決し得ることを見出したが、本発明に於てもこれ
らの反応停止剤が停止剤としての効果になんら変
りがなく有効に使用し得ることを確認した。 反応停止剤の濃度は、1.5mmol／ｌ以上であれ
ば充分その機能を発揮するが、通常３〜100mm
ol／ｌが好ましく用いられる。又液性は、最終呈
色液の液性が発色反応の至適条件に合うように自
由に選択できるが、通常はPODの安定性、被酸
化性呈色試薬の安定性、呈色に適した液性などを
考慮してPH４〜９が好ましく用いられる。 本発明のSOD活性測定法におけるH₂O₂の定量
法及びH₂O₂定量用試薬としては、従来行われて
いるH₂O₂のいずれの定量法でも、又、従来用い
られているH₂O₂のいずれの定量用試薬でもよく、
例えばペルオキシダーゼと被酸化性呈色試薬との
組合せでH₂O₂を定量する方法及びこれに用いる
被酸化性呈色試薬その他の定量用試薬はすべて使
用可能である。かかる被酸化性呈色試薬としては
例えば、４−アミノアンチピリン（以下４−
AAPと略称する。）と、フエノール系化合物又
は、Ｎ，Ｎ−ジ置換アニリン系化合物とを組合せ
た被酸化性呈色試薬、３−メチルベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾン（MBTH）とアニリン系化合物
との組合せ試薬、２，2′−アジノビス（３−エチ
ルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
（ABTS）、トリフエニルメタン系ロイコ色素、
ベンジジン誘導体、ｏ−トリジン誘導体、ジフエ
ニルアミン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導
体、ｏ−フエニレンジアミン、ロイコメチレンブ
ルー誘導体等が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。この他、PODを用いない方法
として最近開発された４価のチタン化合物と２−
（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プ
ロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フエノール
又は／及びその塩との組合せ試薬を用いる方法等
もH₂O₂の定量法として使用できる。 被酸化性呈色試薬及び酸化発色後のその呈色を
より安定化させるには、本発明者らが先の特許出
願に於て述べたように、β−シクロデキストリン
又は／及びその誘導体、若しくはγ−シクロデキ
ストリン又は／及びその誘導体を溶液中に共存さ
せればよい。 これらの濃度としてはβ−シクロデキストリン
は溶解中通常0.01〜1.5重量／容量％、γ−シク
ロデキストリンは0.1〜３重量／容量％、β−シ
クロデキストリン誘導体は0.1〜５重量／容量％、
γ−シクロデキストリン誘導体は0.1〜５重量／
容量％が夫々用いられ、又、これら２種以上の化
合物を上記濃度で任意の比率で混合して用いても
よい。 シクロデキストリン誘導体としては例えば、 β−CD（−OH）₁₉（ONO₂）₂ β−CD（−OH）_19.2（OPO₃Ｈ）_1.8 β−CD（−OH）₁₉（OSO₃Ｈ）₂ β−CD（−OH）_18.5（−Ｏ−CH₂−CO₂Ｈ）_2.5 β−CD（−OH）_19.3（−Ｏ−CH₂CH₂CH₂−
SO₃Ｈ）_1.7 β−CD（−OH）_18.5（−Ｏ−CH₂CH₂CH₂−
SO₃Ｈ）_2.5 β−CD（−OH）_18.0（−Ｏ−CH₂CH₂CH₂−
SO₃Ｈ）_3.0 β−CD（−OH）₇（−OCH₃）₁₄ β−CD（−OCH₃）₂₁ 等が挙げられるが、これらに限定されるものでは
ない。 本発明の方法を実施するには、例えば、キサン
チンを0.05〜20mmol／ｌ、電子伝達体、例えば１
−メトキシPMSを0.001〜１mmol／ｌ、臭素イオ
ンを0.05〜10ミリイオン当量／、一般式〔Ａ〕
で示される化合物、例えばNEMを２〜40mmol／
ｌ一般式〔Ｂ〕で示されるカルボニル化合物を１
〜40mmol／ｌ含むPH約７〜10の緩衝液（第１試
液）の一定量に、一定量の血清を加え、37℃に加
温後、キサンチンオキシダーゼの反応液中濃度が
10〜200U／ｌになるようにキサンチンオキシダ
ーゼを含むPH７〜10の緩衝液（第２試液）の一定
量を加えて37℃で一定時間酵素反応させる。その
後、反応停止剤、POD、被酸化性呈色試薬、及
び要すればβ−（又は／及びγ−）シクロデキス
トリン又は／及びその誘導体を含む緩衝液（第３
試液）の一定量を加えて酵素反応を停止させると
同時に生成したH₂O₂と被酸化性呈色試薬との発
色反応を開始させ、37℃で一定時間反応させた後
呈色度を測定する。第３試液の液性は、最終呈色
液の液性が被酸化性呈色試薬の至適発色液性にな
るように適宜選択すればよい。 以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に
詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により
何ら限定されるものではない。 「実施例」 実施例 １ ［試薬］ 第１試液 キサンチンを0.3mmol／ｌ−メトキシPMSを
0.03mmol／ｌ、臭化ナトリウムを７mmol／ｌ、
NEMを８mmol／ｌ、HMBPを５mmol／ｌの濃度
になるように、0.05Mリン酸塩緩衝液（PH8.0）
に溶解した。 第２試液 キサンチンオキシダーゼを60U／の濃度にな
るように、0.05Mリン酸塩緩衝液（PH8.0）に溶
解した。 第３試液 ドデシル硫酸ナトリウムを70mmｏ／、Ｎ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−ｍ−トリイジンナトリウム（TOOS）を
0.2％、４−AAPを0.02％、PODを5000U／の
濃度になるように、0.2Mリン酸−ナトリウム溶
液に溶解した。 ［試料］ Sigma社製人由来SOD（Product Number
S7006）をイオン交換水で、50，100，150U／ml
になるように溶解し調製した。 ［操作法］ 試料100uをとり、第１試液1.0mlを加え、37
℃恒温槽中３分間加温後、第２試液1.0mlを加え
て、更に37℃で20分間加温した。次いで、第３試
液2.0mlを加えて混和し、37℃で５分間加温後、
試料の代りにイオン交換水を用いて同様に操作し
た試薬盲検を対照として、波長555nmの吸光度を
測定した。別にイオン交換水を対照として試薬盲
検の吸光度を測定した。 第１図にSOD活性値と吸光度との関係を示す。
第１図から明らかな如く、各SOD活性値に対し
てプロツトした吸光度を結ぶ検量線は原点を通
り、SOD活性値150U／mlまで直線性を示した。 比較例 １ ［試薬］ 第１試液 実施例1.の第１試液の組成から、臭化ナトリウ
ムを除いた組成の試液を調製した。 第２試液 実施例1.の第２試液に同じ。 第３試液 実施例1.の第３試液に同じ。 ［試料］ 実施例1.に同じ。 ［操作法］ 実施例1.に同じ。 実施例1.及び比較例1.の試薬盲検の吸光度と検
体（SOD150U／ml含有）の吸光度を表１に示す。
また、比較例1.の検量線を第２図に示す。

【表】 体吸光度は試薬盲検を対照として測定し
た値
表１より明らかな如く、試薬盲検吸光度は、実
施例1.と比較例1.と間に有意差がないが、検体吸
光度は実施例1.と比較例1.とで明らかに差があ
り、第１図に示したように、本発明の方法は、
SOD150U／mlまで直線性を有しているが、第２
図に示す如く、比較例1.では、SOD150U／mlの
吸光度は、直線域から大幅に外れている。 実施例 ２ ［試薬］ 第１試液 実施例1.の第１試液に於て、臭化ナトリウム７
mmol／ｌの代りに、セチルトリメチルアンモニウ
ムブロミド2.75mmol／ｌを用いた試液を調製し
た。 第２試液 実施例1.の第２試液に同じ。 第３試液 実施例1.の第３試液に同じ。 ［試料］ 実施例1.に同じ。 ［操作法］ 実施例1.に同じ。 第３図に本実施例に於けるSOD活性値と吸光
度との関係を示す。第３図より明らかな如く、各
SOD活性値に対してプロツトした吸光度を結ぶ
検量線は原点を通り、SOD活性値150U／mlまで
直線性を示した。 実施例 ３ ［試薬］ 第１試液 実施例2.の第１試液に於て、セチルトリメチル
アンモニウムブロミド2.75mmol／ｌの代りに、テ
トラメチルアンモニウムブロミド５mmol／ｌを用
いた試液を調製した。 第２試液 実施例1.の第２試液に同じ。 第３試液 実施例1.の第３試液に同じ。 ［試料］ 実施例1.に同じ。 ［操作法］ 実施例1.に同じ。 比較例２，３ 実施例3.の第１試液に於けるテトラメチルアン
モニウムブロミドをテトラメチルアンモニウムク
ロリド（比較例２）又はテトラメチルアンモニウ
ムアイオダイド（比較例３）に置き換えた第１試
液を用い、その他は実施例3.と全く同様にして
SOD活性値を測定し、検量線を作成した。 実施例3.及び比較例２，3.の検量線を第４図に
示す（但し、実施例3.の検量線は−○−で示し、
比較例2.の検量線は−−×−−で示す。また、比
較例３の測定結果は・で示した。）。第４図より明
らかな如く、各SOD活性値に対してプロツトし
た吸光度を結ぶ検量線は、実施例3.ではSOD活性
値150U／mlまで原点を通る直線になるが、比較
例２ではSOD活性値０〜50U／ml、50〜100U／
ml及び100〜150U／mlで夫々検量線の傾きが異な
り定量性がなく、また比較例３ではいずれの場合
も全く発色せず、測定不能であつた。 「発明の効果」 以上に詳述した如く、本発明は、体液、例えば
血清等に含まれるSODの活性値を、電子伝達体、
マレイミド又は特定のマレイミド誘導体、特定の
カルボニル化合物及び臭素イオンの存在下、
SODの作用でO₂−． から生成するH₂O₂を測定する
ことにより求める方法を提供するものであり、本
測定系に臭素イオンを共存させたことにより、検
量線の直線性が改善され、検量範囲が一段と広く
なつた点に顕著な効果を奏する発明であつて、斯
業に貢献するところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に於て得られた検量線を、
第２図は比較例１に於て得られた検量線を、ま
た、第３図は実施例２に於て得られた検量線を
夫々示す。また、第４図は実施例３及び比較例２
に於て得られた検量線と、比較例３に於て得られ
た測定結果を示す（但し、−○−は実施例３の検
量線を表わし、−−×−−は比較例２の検量線を
表わす。また、・は比較例３の測定結果を示す。）。
いずれも、横軸の各SOD活性値（Ｕ／ml）につ
いて得られた吸光度を縦軸に沿つてプロツトした
点を結んだものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ スーパーオキシドアニオンを基質とし、電子
   伝達体、一般式〔Ａ〕 【式】 （式中、Ｒは水素原子又は低級アルキル基を表
   わす。）で示される化合物、及び一般式〔Ｂ〕 【化】 （式中、R¹，R²及びR³は夫々独立して水素原
   子、低級アルキル基、水酸基、スルホン酸基又は
   低級アルコキシ基を表わす。）で示されるカルボ
   ニル化合物の存在下、これにスーパーオキシドジ
   スムターゼ（SOD）が作用して生ずる過酸化水
   素を定量することにより行うSOD活性測定法に
   於て、臭素イオンの共存下に該測定を行うことを
   特徴とするSOD活性測定法。