JPH0588105B2 - - Google Patents
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- JPH0588105B2 JPH0588105B2 JP61234415A JP23441586A JPH0588105B2 JP H0588105 B2 JPH0588105 B2 JP H0588105B2 JP 61234415 A JP61234415 A JP 61234415A JP 23441586 A JP23441586 A JP 23441586A JP H0588105 B2 JPH0588105 B2 JP H0588105B2
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Description
［産業上の利用分野］
本発明は新規微生物、特にメチロコツカス属に
属する新規微生物に関する。 ［従来の技術、発明が解決しようとする問題点］ メタン資化性菌は、安価で大量かつ安定的に供
給されるメタン、メタノールを唯一の炭素源、エ
ネルギー源として培養することができ、得られる
菌体はタンパク源として利用することができる。 さらに、メタン資化性菌が保持するメタン酸化
酵素を利用してアルカン、アルケン、脂環式化合
物、芳香族化合物、複素環式化合物などの酸化反
応を行ない、相当する化合物を得ることが知られ
ている（特公昭58−31198号、特開昭57−65187
号、特開昭58−47496号）。 しかしながら、これらの方法は雑菌汚染の問題
や酵素の安定性などの問題がある上に、生産物の
回収にも難点があるなど実用化には未だいくつか
の問題が残されている。 これらの問題点の解消を図るには、高温で生育
可能であり、安定した酵素活性をもつメタン資化
性菌の利用が有効であると考えられるが、これま
でにかかるメタン資化性菌は見出されていない。 ［問題点を解決するための手段］ そこで、本発明者らは高温でメタン、メタノー
ルを唯一の炭素源、エネルギー源として生育可能
な微生物を広く探索すべく検討したところ、沖縄
県に土壌より分離した偏性メタン資化性菌が、
53.5℃まで生育可能であり、しかも安定なメタン
モノオキシゲナーゼを保持していることを見出
し、本発明に到達した。 本発明は、メチロコツカス属に属し、メタン存
在下でペプトンまたはカザミノ酸を窒素源として
生育可能であり、かつ53.5℃まで生育可能である
メチロコツカス・エスピーSIM 222株（FERM
BP−1470）を提供するものである。 本発明者らは沖縄県の土壌から下記の方法によ
り目的とする微生物を分離した。 まず、第１表に示す培地成分を蒸留水１に溶
解し、PH７に調整して培地を調製した。 第 １ 表 Na2HPO4・12H2O 1.5ｇ KH2PO4 0.5ｇ MsSO4・7H2Ｏ 0.2ｇ CaCl2・2H2O 0.05ｇ MnSO4・4H2O ５ mg FeSO4・7H2O ５ mg CoSO4・7H2O ５ mg CUSO4・5H2O ５ mg ニコチン酸 200 μg ビオチン ２ μg パントテン酸カルシウム 400 μg 葉 酸 ２ μg イノシトール 1000 μg ｐ−アミノ安息香酸 200 μg ピリドキシン・HCl 400 μg リボフラビン 200 μg チアミン・HCl 400 μg この培地を700ml容振盪フラスコに50ml分注し、
120℃で15分間加圧滅菌した。冷却後、土壌試料
１ｇを入れ、気相部をメタン40容量％、空気50容
量％およびCO210容量％から成るガス混合物で置
換し、52℃で４日間培養を行なつた。 得られた培養液を、上記培養に用いたものと同
じ培地１に寒天20ｇを加えて調製した平板培地
１白金耳画線した。これをメタン40容量％、空気
50容量％、CO210容量％から成る混合ガス雰囲気
下、52℃で７日間培養を行ない、得られたコロニ
ーを単離することによつて目的とする微生物を得
た。 次に、本菌を細菌の分類同定法［バージエイ
ズ・マニユアル・オブ・シスマテイツク・バクテ
リオロジー（Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology）第１版、1984年］に従つて分類
した。以下に、公知菌と比較した同定試験成績を
示す。
属する新規微生物に関する。 ［従来の技術、発明が解決しようとする問題点］ メタン資化性菌は、安価で大量かつ安定的に供
給されるメタン、メタノールを唯一の炭素源、エ
ネルギー源として培養することができ、得られる
菌体はタンパク源として利用することができる。 さらに、メタン資化性菌が保持するメタン酸化
酵素を利用してアルカン、アルケン、脂環式化合
物、芳香族化合物、複素環式化合物などの酸化反
応を行ない、相当する化合物を得ることが知られ
ている（特公昭58−31198号、特開昭57−65187
号、特開昭58−47496号）。 しかしながら、これらの方法は雑菌汚染の問題
や酵素の安定性などの問題がある上に、生産物の
回収にも難点があるなど実用化には未だいくつか
の問題が残されている。 これらの問題点の解消を図るには、高温で生育
可能であり、安定した酵素活性をもつメタン資化
性菌の利用が有効であると考えられるが、これま
でにかかるメタン資化性菌は見出されていない。 ［問題点を解決するための手段］ そこで、本発明者らは高温でメタン、メタノー
ルを唯一の炭素源、エネルギー源として生育可能
な微生物を広く探索すべく検討したところ、沖縄
県に土壌より分離した偏性メタン資化性菌が、
53.5℃まで生育可能であり、しかも安定なメタン
モノオキシゲナーゼを保持していることを見出
し、本発明に到達した。 本発明は、メチロコツカス属に属し、メタン存
在下でペプトンまたはカザミノ酸を窒素源として
生育可能であり、かつ53.5℃まで生育可能である
メチロコツカス・エスピーSIM 222株（FERM
BP−1470）を提供するものである。 本発明者らは沖縄県の土壌から下記の方法によ
り目的とする微生物を分離した。 まず、第１表に示す培地成分を蒸留水１に溶
解し、PH７に調整して培地を調製した。 第 １ 表 Na2HPO4・12H2O 1.5ｇ KH2PO4 0.5ｇ MsSO4・7H2Ｏ 0.2ｇ CaCl2・2H2O 0.05ｇ MnSO4・4H2O ５ mg FeSO4・7H2O ５ mg CoSO4・7H2O ５ mg CUSO4・5H2O ５ mg ニコチン酸 200 μg ビオチン ２ μg パントテン酸カルシウム 400 μg 葉 酸 ２ μg イノシトール 1000 μg ｐ−アミノ安息香酸 200 μg ピリドキシン・HCl 400 μg リボフラビン 200 μg チアミン・HCl 400 μg この培地を700ml容振盪フラスコに50ml分注し、
120℃で15分間加圧滅菌した。冷却後、土壌試料
１ｇを入れ、気相部をメタン40容量％、空気50容
量％およびCO210容量％から成るガス混合物で置
換し、52℃で４日間培養を行なつた。 得られた培養液を、上記培養に用いたものと同
じ培地１に寒天20ｇを加えて調製した平板培地
１白金耳画線した。これをメタン40容量％、空気
50容量％、CO210容量％から成る混合ガス雰囲気
下、52℃で７日間培養を行ない、得られたコロニ
ーを単離することによつて目的とする微生物を得
た。 次に、本菌を細菌の分類同定法［バージエイ
ズ・マニユアル・オブ・シスマテイツク・バクテ
リオロジー（Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology）第１版、1984年］に従つて分類
した。以下に、公知菌と比較した同定試験成績を
示す。
【表】
以上の結果から、本菌はメチロコツカス属に属
するものと認められる。さらに、本菌は下記のよ
うな特徴を有している。 26℃における生育 ＋ 37℃における生育 ＋ 45℃における生育 ＋ 53.5℃における生育 ＋ 運 動 性 − カプセル形成 ＋ コロニーの色 赤褐色 グラム染色 − カタラーゼ ＋ オキシターゼ − 生 育 PH 5.5〜8.5 メタノール耐性濃度 50ｇ／ プロピレンオキサイド耐性濃度 10mmol／ ブチレンオキサイド耐性濃度 12mmol／ 硫酸銅耐性濃度 →100mg／ 炭素源として利用可能な化合物
メタン，メタノール 窒素源として利用可能な化合物
硝酸カリウムなどの硝酸塩；塩化アンモニウム
などのアンモニウム塩；アミノ酸、カザミノ
酸、ペプトン さらに、本菌はメタン存在下でペプトン、カザ
ミノ酸を唯一の窒素源として生育することが可能
であり、硝酸塩を唯一の窒素源として与えた場合
よりも良好な生育を示す。メチロコツカス属に属
する菌株でこのような特徴を持つものは未だ報告
されていない。 また、本菌は次の反応に触媒作用を有する。 オクタン →オクタノール プロペン →１，２−エポキシプロパン １−ブテン→１，２−エポキシブタン ベンゼン →フエノール 従来より、メタン資化性菌のメタン酸化酵素は
多種類の基質の変換を行なうことが知られてお
り、本菌も他のメタン資化性菌と同様に多様な変
換を行なうことが予想される。 以上の菌学的性質より、本発明者らは本菌はメ
チロコツカス属に属する新菌種であると判定し、
本菌をメチロコツカス・エスピーSIM−222株と
命名した。本菌は工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されており、その受託番号はFERM
BP−1470である。 本菌は、少なくとも２個の炭素原子を含む酸化
可能な有機化合物と好気的条件下に接触させるこ
とにより含酸素化合物を製造する能力を有してい
る。 該含酸素化合物を製造するための本菌の培養条
件については、下記第３表に示した組成の培地を
基本培地とし、これに必要な炭素源、エネルギー
源などを適宜添加する。 第 ３ 表 KNO3 １ ｇ NH4Cl 0.1ｇ （NH4）2SO4 0.1ｇ MgSO4・7H2O 2.0ｇ CaCl2・2H2O 0.2ｇ KH2PO4 0.52ｇ NaHPO4・12H2O 1.43ｇ EDTA・鉄アンモニウム塩 ８ mg トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
2.4ｇ ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
10.5ｇ Na2MoO4・2H2O １ mg 微量金属溶液* ２ ml 蒸 留 水 １ 水酸化カリウムでPH6.83に調整 ＊微量金属箔溶液の組成 CuSO4・5H2O 1700mg FeSO4・7H2O 500mg ZnSO4・7H2O 400mg H3BO3 15mg CoCl2・6H2O 50mg EDTA・２ナトリウム塩 250mg MnCl2・4H2O 20mg NiCl2・6H2O 10mg 蒸 留 水 １ 炭素源としてはメタンおよびメタノールを単独
または組合せて用いればよく、また窒素源は第３
表に示したもののほかアミン酸、カザミノ酸、ペ
プトンなどを使用することもできる。また、エネ
ルギー源（電子供与体）として、上記メタン、メ
タノールのほかにホルムアルデヒド、ギ酸または
その塩、エタノール、水素、NADHなどを適宜
添加してもよい。 次に、基質として用いる少なくとも２個の炭素
原子を含む酸化可能な有機化合物を例示すると、
プロパン、ブタン、ペンタン、オクタンなどのア
ルカン；プロペン、ブテン、ペンテン、オクテン
などのアルケン；ジメチルエーテル、ジエチルエ
ーテル、メチルエチルエーテルなどのエーテル
類；シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオ
クタン、シクロデカン、シクロペンテン、シクロ
ヘキセン、シクロオクテン、シクロデセンなどの
脂環式化合物；ベンゼン、トルエン、キシレン、
ビフエニル、インデン、ナフタレン、テトラリ
ン、アントラセンなどの芳香族化合物；チオフエ
ン、ピリジン、チアゾール、ピリミジン、トリア
ジン、キノリンなどの複素環式化合物等がある。 これら基質を酸化する前記メタン資化性菌は偏
性好気性細菌であり、その培養は25〜55℃、好ま
しくは26〜53.5℃、より好ましくは30〜50℃、PH
5.5〜8.5、好ましは6.5〜7.5にて好気的条件下に
回分培養または連続培養を行なえばよい。 菌体培養物はそのまま酵素源として使用するこ
とができるが、遠心分離等の操作により固液分離
して得た微生物菌体を用いることが好ましい。さ
らに、微生物菌体をリン酸緩衝液などの適当な溶
液で洗浄し、該溶液に懸濁して使用することもで
きる。その他、菌体破砕物、精製酵素、固定化菌
体、固定化酵素等の形態として使用することもで
きる。菌体破砕物は、たとえば微生物菌体の懸濁
液を超音波、フレンチプレス、高圧ホモジナイザ
ーなどにより破砕処理して得られ、次いで固液分
離して、適当精製手段を採用して精製酵素とする
ことができる。また、微生物菌体や酵素の固定化
は、常法により行なえばよく、固定化したものを
使用することによつて効率よく反応を行なうこと
ができる。なお、酸化反応は前記した25〜55℃の
温度、PH5.5〜8.5の条件下で行なえばよい。反応
に際し、エネルギー源として前記電子供与体を適
宜添加することが好ましい。 この酸化反応によつて、基質に相応する含酸素
化合物、たとえばアルコール類、オキサイド類、
フエノール類、キノン類等が得られる。 ［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらによつて制限されるものでは
ない。 実施例 １ (1) 微生物の分離 第１表に示す培地成分を蒸留水１に溶解し、
PH7.0に調整した。この培地を60ml容試験管に10
ml入れ、120℃で15分間加圧滅菌した。冷却後、
沖縄県中頭郡与那城村付近にて採集した泥試料１
ｇを入れ、気相部をメタン40容量％、空気50容量
％およびCO210容量％から成るガス混合物で置換
し、往復振盪機（300r.p.m.）にて52℃で７日間
培養した。得られた培養液を0.5ml取り、同一組
成の培地に接種して先と同一条件にて培養した。
この培養液１白金耳を同培地１に寒天20ｇを加
えて調製した平板培地に画線した。52℃で７日
間、先と同一組成の混合ガス雰囲気下で培養し
た。 このようにして得られたコロニーを単離し、同
一平板培地に再度画線し、52℃にて同一雰囲気下
で培養した。得られたコロニーを再単離し、同一
組成の液体培地10に接種後、先と同一組成の混合
ガスにて気相部を置換し、52℃にて生育させ、分
離菌株（メチロコツカス・エスピーSIM−222、
FERM BP−1470）とした。 (2) メタンとメタノールを炭素源、エネルギー源
とした培養 第３表に示す培地成分を蒸留水１に溶解し、
PH6.83に調整した。この培地を700ml容の容器に
50ml入れ、120℃で15分間加圧滅菌した。冷却後、
60mlのメタンを封入し、0.25mlのメタノールを添
加した。上記(1)で得た菌体培養液を2.5ml接種し、
往復振盪培養器（120回／分）にて45℃で24時間
培養した。24時間後の培養液の濁度を波長540nm
の光の吸光度にて測定した結果、2.8であつた。 (3) メタを炭素源とした培養 気相部をメタ：空気＝１：１の混合ガスで置換
し、メタンを唯一の炭素源としたこと以外は前記
(2)の方法と同様にして培養した。24時間後の
540nmの吸光度は1.0であつた。 (4) メタノールを炭素源とした培養 前記(2)で用いたものと同一組成の培地500mlを
1000mlの容器に入れ、120℃で15分間加圧滅菌し
た。冷却後、前記(2)と同じ方法で培養し、得られ
た培養液50mlを接種し、炭素源としてメタノール
を0.2％になるように与えた後、温度を45℃に保
ち、通気量50ml／分、300rpmで撹拌した。培地
のPHは、１規定の硝酸と１規定の水酸化ナトリウ
ムをPH調節器を用いて自動添加することによりPH
6.8〜6.9に調節した。菌体の増殖に伴ない、溶存
酵素は遂には０になつてしまうが、再び上昇を開
始した。溶存酵素上昇と同時に、メタノールを
0.2％になるように添加した。培養開始24時間後
に、メタノールの供給を連続供給にした。メタノ
ールを培養に用いた培地と同一組成の培地に60％
になるように溶解させ、これを２ml／hrの速度で
供給した。通気量は1000ml／分、撹拌は700rpm
とした。培養開始後48時間には、培養に用いた培
地と同一成分で10培に濃縮した液10mlを孔径
0.45μmのフイルターで過後、培養液に添加し
た。培養開始後68時間で８ｇ／の乾燥菌体が得
られた。 実施例 ２ 実施例１の(2)で得られた菌体培養液50mlを5000
×ｇ、10分間の条件で遠心分離し、さらに同一条
件で２度遠心洗浄した。洗浄液として培地成分の
うちリ酸２水素１カリウム、リ酸水素２ナトリウ
ム、硝酸カリウム、硫酸アモニウムおよび塩化ア
モニウムを含まない溶液を用いた。洗浄後、菌体
（メチロコツカス・エスピーSIM−222、FERM
BP−1470）を、同溶液に懸濁し、540nmでの吸
光度が３となるように菌濃度を調節した。この菌
体懸濁液のメタン酸化酵素の活性を測定した。 10ml容試験管２本に密栓をし、５mlのプロピレ
ンを封入した。２本のうち１本には電子供与源と
して1Mのメタノール水溶液4μを添加し、他の
１本には何も添加しなかつた。 これらの試験管に菌体懸濁液１mlを入れ、45℃
で３分間反応させた。３分後、10mMアリルチオ
ウレア水溶液を5μl添加し、氷冷後、液中のプロ
ピレオキサイドの濃度をガスクロマトグラフイー
Kgにて測定した。Gaskuropack 54を充填したガ
ラスカラム（径３mm×2.1m）を150℃に保ち、キ
ヤリアガス流量70ml／分の条件で、フレームイオ
ン検出器にて検出した。生産物の保持時間は、
3.00分で、これはプロピレンオキサイドの標品と
一致した。このようにして測定したプロピレンを
基質とした場合の初期反応速度をメタ酸化酵素の
活性とした。メタノールを電子供与源として与え
た場合のプロピレンオキサイドの生産速度は
320n mol／ml／分／0.D.540＝２であり、電子供
与源を何も与えなかつた場合の生産速度は50n
mol／ml／〓／0.D.540＝２であつた。 先の菌体懸濁液20mlを60ml容試験管に入れ、
1Mメタノール水溶液20μlを加え、45℃で往復振
盪（200rpm）した。５時間後までは、１時間毎
にメタノール溶液を20μl添加した。６時間目に、
水中のメタノール濃度が0mMであることを確認
し、懸濁液の一部を取り、メタン酸化酵素の活性
を先述した方法で測定した。その結果、メタノー
ルを電子供与源として与えた場合の活性は240n
mol／ml〓／0.D.540＝２であり、何も与えない場
合の活性は30n mol／ml／〓／0.D.540＝２であつ
た。 活性測定後、1mMになるようにメタノールを
添加し、その後18時間後までメタノールの添加は
行なわなかつた。 18時間目に、水中のメタノール濃度が0mMで
あることを確認し、菌体懸濁液の一部を取り、先
と同一の方法でメタ酸化酵素の活性を測定した。
その結果、メタノールを電子供与源として与えた
場合の活性は30n mol／ml／〓／0.D.540＝２であ
り、何も与えなかつた場合の活性は0n mol／
ml／〓／0.D.540＝２であつた。 18時間目の活性測定後、1mMになるようにメ
タノールを添加し、20時間目まで１時間毎に
1mMになるようにメタノールを添加した。21時
間目に水中メタノール濃度が0.00mMであること
を確認し、菌体懸濁液の一部を取り、先と同一の
方法でメタン酸化酵素の活性を測定した。その結
果、メタノールを電子供与源として与えた場合の
活性は240n mol／ml／〓／0.D.540＝２であつた。 このように、活性が著しく低下した菌体にメタ
ノールを与えることにより明らかに活性を回復さ
せることが可能であつた。 実施例 ３ 菌体の洗浄および懸濁に次の組成の緩衝液を用
いたこと以外は実施例２と同じ方法で行なつた。 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
2.4ｇ ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
10.5ｇ 蒸 留 水 １ 18時間後のメタン酸化酵素の活性はメタノール
を電子供与源として与えた場合、30n mol／ml／
〓／0.D.540＝２であり、何も与えなかつた場合の
活性は0n mol／ml／〓／0.D.540＝２であつた。 20時間後まで１時間毎に1mMになるようにメ
タノールを添加し、21時間目に、メタン酸化酵素
の活性を測定した。メタノールを電子供与源とし
て与えた場合の活性は240n mol／〓／0.D.540＝
２であり、何も与えなかつた場合の活性は20n
mol／ml／〓／0.D.540＝２であつた。 実施例 ４ 1mMになるようにメタノールを添加する代り
に1mMになるようにホルムアルデヒドを添加し
たこと以外は実施例２と同じ方法で行なつた。 18時間後のメタ酸化酵素の活性はメタノールを
電子供与源として与えた場合、0n mol／ml／
〓／0.D.540＝２であつた。18時間後から20時間目
まで１時間毎に1mMになるようにホルムアルデ
ヒドを添加し、21時間目にメタン酸化酵素の活性
を測定した。メタノールを電子供与源として与え
た場合の活性は200n mol／〓／0.D.540＝２であ
つた。 このように、メタノール同様ホルマリンの添加
によつても活性を回復することが可能であつた。 比較例 １ 1mMになるようにメタノールを添加する代り
に10mMになるようにギ酸ナトリウムを添加した
こと以外は実施例２と同じ方法で行なつた。 18時間後のメタ酸化酵素の活性はメタノールを
電子供与源として与えた場合、40n mol／ml／
〓／0.D.540＝２であつた。20時間後まで１時間毎
に10mMになるようにギ酸ナトリウムを添加した
が、21時間後のメタン酸化酵素の活性はメタノー
ルを電子供与源として与えた場合、30n mol／
ml／〓／0.D.540＝２であり、活性の回復は生じな
かつた。また、ギ酸ナトリウムの代りに1mMに
なるようにエタノールを添加した場合も、活性の
回復は生じなかつた。 比較例 ２ メチロコツカス・エスピーSIM−222株
（FERM BP−1470）の代りにメチロコツカス・
カプスラタス（Ｍ．cmpsulatus）NCIB 11132株
を用い、菌体の洗浄および懸濁に5mM MgCl2を
含む20mM Tris−HCl緩衝液（PH7.0）を用いた
こと以外は実施例２の方法と同様に行なつた。 ０時間時のメタ酸化酵素の活性はメタノールを
電子供与源として与えた場合、314n mol／ml／
min／0.D.540＝２であつた。 18時間後のメタン酸化酵素の活性はメタノール
を電子供与源として与えた場合、141 ｎ mol／
ml／min／0.D.540＝２であつた。 18時間後から20時間後まで、１時間毎に1mM
になるようにメタノールを添加し、21時間目にメ
タン酸化酵素の活性を測定した。その結果、
140n mol／ml／min／0.D.540＝２であつた。 メチロコツカス・カプスラタスNCIB 11132株
においてはメタノールの添加によつて活性を回復
させることはできなかつた。 実施例 ５ 実施例１の(2)と同様に培地を調製、加圧滅菌
し、気相部を混合ガスに置換した後、プロピレン
オキサイドを45℃での水中濃度が0.1ml／にな
るように添加した。この培地に実施例１の(2)で得
られた培養液2.5mlを接種し、45℃で24時間振盪
培養した。同時に、プロピレンオキサイドを添加
しない培地を準備し、先に接種した培養液と同じ
培養液2.5ml接種後、45℃で24時間振盪培養した。 24時間後の培養液の濁度を実施例１の(2)と同じ
方法で測定した結果、プロピレンオキサイドを添
加しなかつた培養液の吸光度は2.3であり、プロ
ピレンオキサイドを添加した培養液の吸光度は
2.1であり、両者に殆んど差はなかつた。 実施例２と同じ方法でそれぞれの培養菌体のメ
タン酸化酵素の活性を測定した。ただし、菌体の
洗浄および懸濁には5mM MgCl2を含む20mM
Tris−HCl緩衝液を用い、活性測定の際に与える
電子供与源は、1Mのメタノール水溶液の代りに
1Mホルムアルデヒド水溶液4μlとした。プロピレ
ンオキサイドを添加せずに培養した菌体の活性は
270n mol／ml／min／0.D.540＝２であり、プロピ
レンオキサイドを添加して培養した菌体の活性は
240 ｎ／mol／ml／min／0.D.540＝２であつた。
0.1ml／のプロピレンオキサイド濃度はメチロ
コツカス・エスピーSIM−222株の増殖、メタン
酸化酵素の活性に殆んど影響しないことが明らか
となつた。 比較例 ３ 菌株としてメチロコツカス．カプスラタス
NCIB 11132株を用い、培地をNMS−培地（J.
Gen.Microbiol.（1970）61，205−218、R.
Whittenbury，K.C.Phillips and J.F.Wikinson）
とし、気相部をメタン50容量％、空気50容量％と
したこと以外は実施例５と同じ方法で行なつた。
その結果、メチロコツカス・カプスラタスNCIB
11132株は増殖しなかつた。 実施例 ６ 炭素源としてメタノールを２％になるように添
加したこと以外は実施例１の(2)と同じ方法でメチ
ロコツカス・エスピーSIM−222株（FERM BP
−1470）を培養した。24時間培養後の540nmでの
吸光度は2.3であつた。メタン酸化酵素の活性は
200n mol／ml／min／0.D.540＝２であつた。 メチロコツカス・エスピーSIM−222株はメタ
ノールを蒸気として供給する方法（特開昭57−
65187）を取らなくても、高濃度メタノール存在
下で旺盛に増殖し、しかも安定してメタンモノオ
キシゲナーゼの活性を保持し得ることが判つた。 実施例 ７ 銅濃度を硫酸銅量として10mg／としたこと以
外は実施例１の(2)と同じ方法でメチロコツカス・
エスピーSIM−222株（FERM BP−1470）を培
養した。24時間後の540nmでの吸光度は2.0であ
り、メタン酸化酵素の活性は220n mol／ml／
min／0.D.540＝２であつた。このような高い銅濃
度でもSIM−222株は旺盛に増殖し、メタン酸化
酵素の活性を保つことが確認された。このような
高濃度で培養できるメタン資化性菌の報告はな
く、他のメタン資化性菌が混入しても容易に排除
することができる。 実施例 ８ 実施例１−(2)の方法で得た培養液を5000×ｇ，
10分の条件で遠心して菌体を集めた後、5mMの
MgCl2を含む20mM Tris−HCl緩衝液で、２度
遠心洗浄した。同緩衝液に540nmの吸光度が２と
なるように菌体を懸濁した。この菌体懸濁液１ml
に1mMになるようにオクタンを添加し、さらに
電子供与源として1mMになるようにメタノール
を添加し、45℃で30分振盪（200rpm）した。そ
の結果、0.3mg／のオクタノールが生成された。 実施例 ９ オクタンの代りに1mMになるようにクロルベ
ンゼンを添加したこと以外は実施例８と同じ方法
で行なつた。その結果、2.5mg／のｐ−クロル
フエノールが生成された。 比較例 ４ メチロコツカス・エスピーSIM−222株の代り
にメチロコツカス・カプスラタス NCIB 11132
株を用い、培地をNMS−培地とし、炭素源とし
てメタノールを２％となるように添加したこと以
外は実施例１の(2)と同じ方法で培養した。24時間
培養後の540nmでの吸光度は1.1であり、メタン
酸化酵素の活性はなかつた。 比較例 ５ メチロコツカス・エスピーSIM−222株の代り
にメチロコツカス・カプスラタスNCIB 11132株
を用い、銅濃度を硫酸銅量として10mg／とした
こと以外は実施例１の(2)と同じ方法で培養した。
24時間培養で菌体の増殖は観察されなかつた。 実施例 10 培養温度を45℃ではなく52℃としたこと以外は
実施例１の(2)と同じ方法でメチロコツカス・エス
ピーSIM−222株（FERM BP−1470）を培養し
た。24時間後の培養液の540nmでの吸光度は2.4
であり、高温の培養条件下でも旺盛に生育するこ
とが確認された。 比較例 ６ 菌株としてメチロコツカス・カプスラタス
NCIB 11132株を用い、培養温度を52℃としたこ
と以外は実施例１の(3)と同じ方法で培養した。24
時間後菌体の増殖は全く生じなかつた。 実施例 11 培地中にペニシリンＧを1.5ユニツト／mlの濃
度になるように、あるいはアンピシリンを2μg／
mlの濃度になるように添加したこと以外は実施例
１−(2)と同じ方法でメチロコツカス・エスピー
SIM−222株（FERM BP−1470）を培養した。
45℃で24時間培養後の540nmでの吸光度はペニシ
リンＧを添加した場合、2.1であり、アンピシリ
ンを添加した場合は2.0であつた。また、何も添
加しなかつた場合は2.0であた。メチロコツカ
ス・エスピーSIM−222株はペニシリン・アンピ
シリンに対し強い耐性を保持しており、他のメタ
ン資化性菌、例えばメチロコツカス・カプスラタ
スNCIB 11083株が混入しても容易に排除でき
る。 比較例 ７ メチロコツカス・エスピーSIM−222株の代り
にメチロコツカス・カプスラタス NCIB 11083
株を用い、培地をNMS−培地（J.Gen.
Microbiol.（1970）61，205−218、R.
Whittenbury，K.C.Phillips and J.F.Wilkinson）
とし、気相部をメタン50容量％、空気50容量％と
し、培地中にペニシリンＧを1.5ユニツト／mlの
濃度になるように、あるいはアンピシリンを
2μg／mlの濃度になるように添加し、45℃で24時
間培養した。24時間後、増殖は全く認められなか
つた。したがつて、メチロコツカス・カプスラタ
ス NCIB 11083株はメチロコツカス・エスピー
SIM−222株に比し、ペニシリン、アンピシリン
に対する耐性が著しく低いことが明らかとなつ
た。 実施例 12 オクタンの代りに気相部に５mlのプロパンを封
入し、電子供与源として20mMになるようにギ酸
ナトリウムを添加したこと以外は実施例８と同じ
方法で行なつた。その結果、0.4mg／のイソプ
ロパノールが生産された。 実施例 13 オクタンの代りに気相部に５mlの１−ブテンを
封入し、電子供与源として20mMになるようにギ
酸ナトリウムを添加したこと以外は実施例８と同
じ方法で行なつた。その結果、150n mol／ml／
〓のブチレンオキサイドが生産された。 実施例 14 オクタンの代りに気相部に５mlのブタンを封入
し、電子供給与源として20mMになるようにギ酸
ナトリウムを添加したこと以外は実施例８と同じ
方法で行なつた。その結果、0.05mg／のイソブ
タノールが生産された。 ［発明の効果］ 本発明により高温で生育可能な新規メタン資化
性菌が提供され、該微生物またはその処理物を酵
素源として各種有機化合物の酸化反応に利用する
ことができる。この場合、酵素源は活性の再生が
可能であり、長期間にわたり使用できる。また、
メタノールを炭素源とした場合でも高いメタンモ
ノオキシゲナーゼ活性を保持するという特性を有
している。また、新規メタン資化性菌はプロピレ
ンオキサイド、ブチレンオキサイド等のオキサイ
ドに対する耐性が公知菌よりも著しく高い。 本発明は食品工業、化学工業などの広い分野に
おいて有効に利用することができる。
するものと認められる。さらに、本菌は下記のよ
うな特徴を有している。 26℃における生育 ＋ 37℃における生育 ＋ 45℃における生育 ＋ 53.5℃における生育 ＋ 運 動 性 − カプセル形成 ＋ コロニーの色 赤褐色 グラム染色 − カタラーゼ ＋ オキシターゼ − 生 育 PH 5.5〜8.5 メタノール耐性濃度 50ｇ／ プロピレンオキサイド耐性濃度 10mmol／ ブチレンオキサイド耐性濃度 12mmol／ 硫酸銅耐性濃度 →100mg／ 炭素源として利用可能な化合物
メタン，メタノール 窒素源として利用可能な化合物
硝酸カリウムなどの硝酸塩；塩化アンモニウム
などのアンモニウム塩；アミノ酸、カザミノ
酸、ペプトン さらに、本菌はメタン存在下でペプトン、カザ
ミノ酸を唯一の窒素源として生育することが可能
であり、硝酸塩を唯一の窒素源として与えた場合
よりも良好な生育を示す。メチロコツカス属に属
する菌株でこのような特徴を持つものは未だ報告
されていない。 また、本菌は次の反応に触媒作用を有する。 オクタン →オクタノール プロペン →１，２−エポキシプロパン １−ブテン→１，２−エポキシブタン ベンゼン →フエノール 従来より、メタン資化性菌のメタン酸化酵素は
多種類の基質の変換を行なうことが知られてお
り、本菌も他のメタン資化性菌と同様に多様な変
換を行なうことが予想される。 以上の菌学的性質より、本発明者らは本菌はメ
チロコツカス属に属する新菌種であると判定し、
本菌をメチロコツカス・エスピーSIM−222株と
命名した。本菌は工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されており、その受託番号はFERM
BP−1470である。 本菌は、少なくとも２個の炭素原子を含む酸化
可能な有機化合物と好気的条件下に接触させるこ
とにより含酸素化合物を製造する能力を有してい
る。 該含酸素化合物を製造するための本菌の培養条
件については、下記第３表に示した組成の培地を
基本培地とし、これに必要な炭素源、エネルギー
源などを適宜添加する。 第 ３ 表 KNO3 １ ｇ NH4Cl 0.1ｇ （NH4）2SO4 0.1ｇ MgSO4・7H2O 2.0ｇ CaCl2・2H2O 0.2ｇ KH2PO4 0.52ｇ NaHPO4・12H2O 1.43ｇ EDTA・鉄アンモニウム塩 ８ mg トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
2.4ｇ ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
10.5ｇ Na2MoO4・2H2O １ mg 微量金属溶液* ２ ml 蒸 留 水 １ 水酸化カリウムでPH6.83に調整 ＊微量金属箔溶液の組成 CuSO4・5H2O 1700mg FeSO4・7H2O 500mg ZnSO4・7H2O 400mg H3BO3 15mg CoCl2・6H2O 50mg EDTA・２ナトリウム塩 250mg MnCl2・4H2O 20mg NiCl2・6H2O 10mg 蒸 留 水 １ 炭素源としてはメタンおよびメタノールを単独
または組合せて用いればよく、また窒素源は第３
表に示したもののほかアミン酸、カザミノ酸、ペ
プトンなどを使用することもできる。また、エネ
ルギー源（電子供与体）として、上記メタン、メ
タノールのほかにホルムアルデヒド、ギ酸または
その塩、エタノール、水素、NADHなどを適宜
添加してもよい。 次に、基質として用いる少なくとも２個の炭素
原子を含む酸化可能な有機化合物を例示すると、
プロパン、ブタン、ペンタン、オクタンなどのア
ルカン；プロペン、ブテン、ペンテン、オクテン
などのアルケン；ジメチルエーテル、ジエチルエ
ーテル、メチルエチルエーテルなどのエーテル
類；シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオ
クタン、シクロデカン、シクロペンテン、シクロ
ヘキセン、シクロオクテン、シクロデセンなどの
脂環式化合物；ベンゼン、トルエン、キシレン、
ビフエニル、インデン、ナフタレン、テトラリ
ン、アントラセンなどの芳香族化合物；チオフエ
ン、ピリジン、チアゾール、ピリミジン、トリア
ジン、キノリンなどの複素環式化合物等がある。 これら基質を酸化する前記メタン資化性菌は偏
性好気性細菌であり、その培養は25〜55℃、好ま
しくは26〜53.5℃、より好ましくは30〜50℃、PH
5.5〜8.5、好ましは6.5〜7.5にて好気的条件下に
回分培養または連続培養を行なえばよい。 菌体培養物はそのまま酵素源として使用するこ
とができるが、遠心分離等の操作により固液分離
して得た微生物菌体を用いることが好ましい。さ
らに、微生物菌体をリン酸緩衝液などの適当な溶
液で洗浄し、該溶液に懸濁して使用することもで
きる。その他、菌体破砕物、精製酵素、固定化菌
体、固定化酵素等の形態として使用することもで
きる。菌体破砕物は、たとえば微生物菌体の懸濁
液を超音波、フレンチプレス、高圧ホモジナイザ
ーなどにより破砕処理して得られ、次いで固液分
離して、適当精製手段を採用して精製酵素とする
ことができる。また、微生物菌体や酵素の固定化
は、常法により行なえばよく、固定化したものを
使用することによつて効率よく反応を行なうこと
ができる。なお、酸化反応は前記した25〜55℃の
温度、PH5.5〜8.5の条件下で行なえばよい。反応
に際し、エネルギー源として前記電子供与体を適
宜添加することが好ましい。 この酸化反応によつて、基質に相応する含酸素
化合物、たとえばアルコール類、オキサイド類、
フエノール類、キノン類等が得られる。 ［実施例］ 次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらによつて制限されるものでは
ない。 実施例 １ (1) 微生物の分離 第１表に示す培地成分を蒸留水１に溶解し、
PH7.0に調整した。この培地を60ml容試験管に10
ml入れ、120℃で15分間加圧滅菌した。冷却後、
沖縄県中頭郡与那城村付近にて採集した泥試料１
ｇを入れ、気相部をメタン40容量％、空気50容量
％およびCO210容量％から成るガス混合物で置換
し、往復振盪機（300r.p.m.）にて52℃で７日間
培養した。得られた培養液を0.5ml取り、同一組
成の培地に接種して先と同一条件にて培養した。
この培養液１白金耳を同培地１に寒天20ｇを加
えて調製した平板培地に画線した。52℃で７日
間、先と同一組成の混合ガス雰囲気下で培養し
た。 このようにして得られたコロニーを単離し、同
一平板培地に再度画線し、52℃にて同一雰囲気下
で培養した。得られたコロニーを再単離し、同一
組成の液体培地10に接種後、先と同一組成の混合
ガスにて気相部を置換し、52℃にて生育させ、分
離菌株（メチロコツカス・エスピーSIM−222、
FERM BP−1470）とした。 (2) メタンとメタノールを炭素源、エネルギー源
とした培養 第３表に示す培地成分を蒸留水１に溶解し、
PH6.83に調整した。この培地を700ml容の容器に
50ml入れ、120℃で15分間加圧滅菌した。冷却後、
60mlのメタンを封入し、0.25mlのメタノールを添
加した。上記(1)で得た菌体培養液を2.5ml接種し、
往復振盪培養器（120回／分）にて45℃で24時間
培養した。24時間後の培養液の濁度を波長540nm
の光の吸光度にて測定した結果、2.8であつた。 (3) メタを炭素源とした培養 気相部をメタ：空気＝１：１の混合ガスで置換
し、メタンを唯一の炭素源としたこと以外は前記
(2)の方法と同様にして培養した。24時間後の
540nmの吸光度は1.0であつた。 (4) メタノールを炭素源とした培養 前記(2)で用いたものと同一組成の培地500mlを
1000mlの容器に入れ、120℃で15分間加圧滅菌し
た。冷却後、前記(2)と同じ方法で培養し、得られ
た培養液50mlを接種し、炭素源としてメタノール
を0.2％になるように与えた後、温度を45℃に保
ち、通気量50ml／分、300rpmで撹拌した。培地
のPHは、１規定の硝酸と１規定の水酸化ナトリウ
ムをPH調節器を用いて自動添加することによりPH
6.8〜6.9に調節した。菌体の増殖に伴ない、溶存
酵素は遂には０になつてしまうが、再び上昇を開
始した。溶存酵素上昇と同時に、メタノールを
0.2％になるように添加した。培養開始24時間後
に、メタノールの供給を連続供給にした。メタノ
ールを培養に用いた培地と同一組成の培地に60％
になるように溶解させ、これを２ml／hrの速度で
供給した。通気量は1000ml／分、撹拌は700rpm
とした。培養開始後48時間には、培養に用いた培
地と同一成分で10培に濃縮した液10mlを孔径
0.45μmのフイルターで過後、培養液に添加し
た。培養開始後68時間で８ｇ／の乾燥菌体が得
られた。 実施例 ２ 実施例１の(2)で得られた菌体培養液50mlを5000
×ｇ、10分間の条件で遠心分離し、さらに同一条
件で２度遠心洗浄した。洗浄液として培地成分の
うちリ酸２水素１カリウム、リ酸水素２ナトリウ
ム、硝酸カリウム、硫酸アモニウムおよび塩化ア
モニウムを含まない溶液を用いた。洗浄後、菌体
（メチロコツカス・エスピーSIM−222、FERM
BP−1470）を、同溶液に懸濁し、540nmでの吸
光度が３となるように菌濃度を調節した。この菌
体懸濁液のメタン酸化酵素の活性を測定した。 10ml容試験管２本に密栓をし、５mlのプロピレ
ンを封入した。２本のうち１本には電子供与源と
して1Mのメタノール水溶液4μを添加し、他の
１本には何も添加しなかつた。 これらの試験管に菌体懸濁液１mlを入れ、45℃
で３分間反応させた。３分後、10mMアリルチオ
ウレア水溶液を5μl添加し、氷冷後、液中のプロ
ピレオキサイドの濃度をガスクロマトグラフイー
Kgにて測定した。Gaskuropack 54を充填したガ
ラスカラム（径３mm×2.1m）を150℃に保ち、キ
ヤリアガス流量70ml／分の条件で、フレームイオ
ン検出器にて検出した。生産物の保持時間は、
3.00分で、これはプロピレンオキサイドの標品と
一致した。このようにして測定したプロピレンを
基質とした場合の初期反応速度をメタ酸化酵素の
活性とした。メタノールを電子供与源として与え
た場合のプロピレンオキサイドの生産速度は
320n mol／ml／分／0.D.540＝２であり、電子供
与源を何も与えなかつた場合の生産速度は50n
mol／ml／〓／0.D.540＝２であつた。 先の菌体懸濁液20mlを60ml容試験管に入れ、
1Mメタノール水溶液20μlを加え、45℃で往復振
盪（200rpm）した。５時間後までは、１時間毎
にメタノール溶液を20μl添加した。６時間目に、
水中のメタノール濃度が0mMであることを確認
し、懸濁液の一部を取り、メタン酸化酵素の活性
を先述した方法で測定した。その結果、メタノー
ルを電子供与源として与えた場合の活性は240n
mol／ml〓／0.D.540＝２であり、何も与えない場
合の活性は30n mol／ml／〓／0.D.540＝２であつ
た。 活性測定後、1mMになるようにメタノールを
添加し、その後18時間後までメタノールの添加は
行なわなかつた。 18時間目に、水中のメタノール濃度が0mMで
あることを確認し、菌体懸濁液の一部を取り、先
と同一の方法でメタ酸化酵素の活性を測定した。
その結果、メタノールを電子供与源として与えた
場合の活性は30n mol／ml／〓／0.D.540＝２であ
り、何も与えなかつた場合の活性は0n mol／
ml／〓／0.D.540＝２であつた。 18時間目の活性測定後、1mMになるようにメ
タノールを添加し、20時間目まで１時間毎に
1mMになるようにメタノールを添加した。21時
間目に水中メタノール濃度が0.00mMであること
を確認し、菌体懸濁液の一部を取り、先と同一の
方法でメタン酸化酵素の活性を測定した。その結
果、メタノールを電子供与源として与えた場合の
活性は240n mol／ml／〓／0.D.540＝２であつた。 このように、活性が著しく低下した菌体にメタ
ノールを与えることにより明らかに活性を回復さ
せることが可能であつた。 実施例 ３ 菌体の洗浄および懸濁に次の組成の緩衝液を用
いたこと以外は実施例２と同じ方法で行なつた。 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
2.4ｇ ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
10.5ｇ 蒸 留 水 １ 18時間後のメタン酸化酵素の活性はメタノール
を電子供与源として与えた場合、30n mol／ml／
〓／0.D.540＝２であり、何も与えなかつた場合の
活性は0n mol／ml／〓／0.D.540＝２であつた。 20時間後まで１時間毎に1mMになるようにメ
タノールを添加し、21時間目に、メタン酸化酵素
の活性を測定した。メタノールを電子供与源とし
て与えた場合の活性は240n mol／〓／0.D.540＝
２であり、何も与えなかつた場合の活性は20n
mol／ml／〓／0.D.540＝２であつた。 実施例 ４ 1mMになるようにメタノールを添加する代り
に1mMになるようにホルムアルデヒドを添加し
たこと以外は実施例２と同じ方法で行なつた。 18時間後のメタ酸化酵素の活性はメタノールを
電子供与源として与えた場合、0n mol／ml／
〓／0.D.540＝２であつた。18時間後から20時間目
まで１時間毎に1mMになるようにホルムアルデ
ヒドを添加し、21時間目にメタン酸化酵素の活性
を測定した。メタノールを電子供与源として与え
た場合の活性は200n mol／〓／0.D.540＝２であ
つた。 このように、メタノール同様ホルマリンの添加
によつても活性を回復することが可能であつた。 比較例 １ 1mMになるようにメタノールを添加する代り
に10mMになるようにギ酸ナトリウムを添加した
こと以外は実施例２と同じ方法で行なつた。 18時間後のメタ酸化酵素の活性はメタノールを
電子供与源として与えた場合、40n mol／ml／
〓／0.D.540＝２であつた。20時間後まで１時間毎
に10mMになるようにギ酸ナトリウムを添加した
が、21時間後のメタン酸化酵素の活性はメタノー
ルを電子供与源として与えた場合、30n mol／
ml／〓／0.D.540＝２であり、活性の回復は生じな
かつた。また、ギ酸ナトリウムの代りに1mMに
なるようにエタノールを添加した場合も、活性の
回復は生じなかつた。 比較例 ２ メチロコツカス・エスピーSIM−222株
（FERM BP−1470）の代りにメチロコツカス・
カプスラタス（Ｍ．cmpsulatus）NCIB 11132株
を用い、菌体の洗浄および懸濁に5mM MgCl2を
含む20mM Tris−HCl緩衝液（PH7.0）を用いた
こと以外は実施例２の方法と同様に行なつた。 ０時間時のメタ酸化酵素の活性はメタノールを
電子供与源として与えた場合、314n mol／ml／
min／0.D.540＝２であつた。 18時間後のメタン酸化酵素の活性はメタノール
を電子供与源として与えた場合、141 ｎ mol／
ml／min／0.D.540＝２であつた。 18時間後から20時間後まで、１時間毎に1mM
になるようにメタノールを添加し、21時間目にメ
タン酸化酵素の活性を測定した。その結果、
140n mol／ml／min／0.D.540＝２であつた。 メチロコツカス・カプスラタスNCIB 11132株
においてはメタノールの添加によつて活性を回復
させることはできなかつた。 実施例 ５ 実施例１の(2)と同様に培地を調製、加圧滅菌
し、気相部を混合ガスに置換した後、プロピレン
オキサイドを45℃での水中濃度が0.1ml／にな
るように添加した。この培地に実施例１の(2)で得
られた培養液2.5mlを接種し、45℃で24時間振盪
培養した。同時に、プロピレンオキサイドを添加
しない培地を準備し、先に接種した培養液と同じ
培養液2.5ml接種後、45℃で24時間振盪培養した。 24時間後の培養液の濁度を実施例１の(2)と同じ
方法で測定した結果、プロピレンオキサイドを添
加しなかつた培養液の吸光度は2.3であり、プロ
ピレンオキサイドを添加した培養液の吸光度は
2.1であり、両者に殆んど差はなかつた。 実施例２と同じ方法でそれぞれの培養菌体のメ
タン酸化酵素の活性を測定した。ただし、菌体の
洗浄および懸濁には5mM MgCl2を含む20mM
Tris−HCl緩衝液を用い、活性測定の際に与える
電子供与源は、1Mのメタノール水溶液の代りに
1Mホルムアルデヒド水溶液4μlとした。プロピレ
ンオキサイドを添加せずに培養した菌体の活性は
270n mol／ml／min／0.D.540＝２であり、プロピ
レンオキサイドを添加して培養した菌体の活性は
240 ｎ／mol／ml／min／0.D.540＝２であつた。
0.1ml／のプロピレンオキサイド濃度はメチロ
コツカス・エスピーSIM−222株の増殖、メタン
酸化酵素の活性に殆んど影響しないことが明らか
となつた。 比較例 ３ 菌株としてメチロコツカス．カプスラタス
NCIB 11132株を用い、培地をNMS−培地（J.
Gen.Microbiol.（1970）61，205−218、R.
Whittenbury，K.C.Phillips and J.F.Wikinson）
とし、気相部をメタン50容量％、空気50容量％と
したこと以外は実施例５と同じ方法で行なつた。
その結果、メチロコツカス・カプスラタスNCIB
11132株は増殖しなかつた。 実施例 ６ 炭素源としてメタノールを２％になるように添
加したこと以外は実施例１の(2)と同じ方法でメチ
ロコツカス・エスピーSIM−222株（FERM BP
−1470）を培養した。24時間培養後の540nmでの
吸光度は2.3であつた。メタン酸化酵素の活性は
200n mol／ml／min／0.D.540＝２であつた。 メチロコツカス・エスピーSIM−222株はメタ
ノールを蒸気として供給する方法（特開昭57−
65187）を取らなくても、高濃度メタノール存在
下で旺盛に増殖し、しかも安定してメタンモノオ
キシゲナーゼの活性を保持し得ることが判つた。 実施例 ７ 銅濃度を硫酸銅量として10mg／としたこと以
外は実施例１の(2)と同じ方法でメチロコツカス・
エスピーSIM−222株（FERM BP−1470）を培
養した。24時間後の540nmでの吸光度は2.0であ
り、メタン酸化酵素の活性は220n mol／ml／
min／0.D.540＝２であつた。このような高い銅濃
度でもSIM−222株は旺盛に増殖し、メタン酸化
酵素の活性を保つことが確認された。このような
高濃度で培養できるメタン資化性菌の報告はな
く、他のメタン資化性菌が混入しても容易に排除
することができる。 実施例 ８ 実施例１−(2)の方法で得た培養液を5000×ｇ，
10分の条件で遠心して菌体を集めた後、5mMの
MgCl2を含む20mM Tris−HCl緩衝液で、２度
遠心洗浄した。同緩衝液に540nmの吸光度が２と
なるように菌体を懸濁した。この菌体懸濁液１ml
に1mMになるようにオクタンを添加し、さらに
電子供与源として1mMになるようにメタノール
を添加し、45℃で30分振盪（200rpm）した。そ
の結果、0.3mg／のオクタノールが生成された。 実施例 ９ オクタンの代りに1mMになるようにクロルベ
ンゼンを添加したこと以外は実施例８と同じ方法
で行なつた。その結果、2.5mg／のｐ−クロル
フエノールが生成された。 比較例 ４ メチロコツカス・エスピーSIM−222株の代り
にメチロコツカス・カプスラタス NCIB 11132
株を用い、培地をNMS−培地とし、炭素源とし
てメタノールを２％となるように添加したこと以
外は実施例１の(2)と同じ方法で培養した。24時間
培養後の540nmでの吸光度は1.1であり、メタン
酸化酵素の活性はなかつた。 比較例 ５ メチロコツカス・エスピーSIM−222株の代り
にメチロコツカス・カプスラタスNCIB 11132株
を用い、銅濃度を硫酸銅量として10mg／とした
こと以外は実施例１の(2)と同じ方法で培養した。
24時間培養で菌体の増殖は観察されなかつた。 実施例 10 培養温度を45℃ではなく52℃としたこと以外は
実施例１の(2)と同じ方法でメチロコツカス・エス
ピーSIM−222株（FERM BP−1470）を培養し
た。24時間後の培養液の540nmでの吸光度は2.4
であり、高温の培養条件下でも旺盛に生育するこ
とが確認された。 比較例 ６ 菌株としてメチロコツカス・カプスラタス
NCIB 11132株を用い、培養温度を52℃としたこ
と以外は実施例１の(3)と同じ方法で培養した。24
時間後菌体の増殖は全く生じなかつた。 実施例 11 培地中にペニシリンＧを1.5ユニツト／mlの濃
度になるように、あるいはアンピシリンを2μg／
mlの濃度になるように添加したこと以外は実施例
１−(2)と同じ方法でメチロコツカス・エスピー
SIM−222株（FERM BP−1470）を培養した。
45℃で24時間培養後の540nmでの吸光度はペニシ
リンＧを添加した場合、2.1であり、アンピシリ
ンを添加した場合は2.0であつた。また、何も添
加しなかつた場合は2.0であた。メチロコツカ
ス・エスピーSIM−222株はペニシリン・アンピ
シリンに対し強い耐性を保持しており、他のメタ
ン資化性菌、例えばメチロコツカス・カプスラタ
スNCIB 11083株が混入しても容易に排除でき
る。 比較例 ７ メチロコツカス・エスピーSIM−222株の代り
にメチロコツカス・カプスラタス NCIB 11083
株を用い、培地をNMS−培地（J.Gen.
Microbiol.（1970）61，205−218、R.
Whittenbury，K.C.Phillips and J.F.Wilkinson）
とし、気相部をメタン50容量％、空気50容量％と
し、培地中にペニシリンＧを1.5ユニツト／mlの
濃度になるように、あるいはアンピシリンを
2μg／mlの濃度になるように添加し、45℃で24時
間培養した。24時間後、増殖は全く認められなか
つた。したがつて、メチロコツカス・カプスラタ
ス NCIB 11083株はメチロコツカス・エスピー
SIM−222株に比し、ペニシリン、アンピシリン
に対する耐性が著しく低いことが明らかとなつ
た。 実施例 12 オクタンの代りに気相部に５mlのプロパンを封
入し、電子供与源として20mMになるようにギ酸
ナトリウムを添加したこと以外は実施例８と同じ
方法で行なつた。その結果、0.4mg／のイソプ
ロパノールが生産された。 実施例 13 オクタンの代りに気相部に５mlの１−ブテンを
封入し、電子供与源として20mMになるようにギ
酸ナトリウムを添加したこと以外は実施例８と同
じ方法で行なつた。その結果、150n mol／ml／
〓のブチレンオキサイドが生産された。 実施例 14 オクタンの代りに気相部に５mlのブタンを封入
し、電子供給与源として20mMになるようにギ酸
ナトリウムを添加したこと以外は実施例８と同じ
方法で行なつた。その結果、0.05mg／のイソブ
タノールが生産された。 ［発明の効果］ 本発明により高温で生育可能な新規メタン資化
性菌が提供され、該微生物またはその処理物を酵
素源として各種有機化合物の酸化反応に利用する
ことができる。この場合、酵素源は活性の再生が
可能であり、長期間にわたり使用できる。また、
メタノールを炭素源とした場合でも高いメタンモ
ノオキシゲナーゼ活性を保持するという特性を有
している。また、新規メタン資化性菌はプロピレ
ンオキサイド、ブチレンオキサイド等のオキサイ
ドに対する耐性が公知菌よりも著しく高い。 本発明は食品工業、化学工業などの広い分野に
おいて有効に利用することができる。
Claims (1)
- １ メチロコツカス属に属し、メタン存在下でペ
プトンまたはカザミノ酸を窒素源として生育可能
であり、かつ53.8℃まで生育可能であるメチロコ
ツカス・エスピーSIM−222株（FERM BP−
1470）。
Priority Applications (3)
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| JP61234415A JPS6391078A (ja) | 1986-10-03 | 1986-10-03 | 新規微生物 |
| EP87114172A EP0263403B1 (en) | 1986-10-03 | 1987-09-29 | Novel microorganism and method for producing oxygenous compounds with said microorganism |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61234415A JPS6391078A (ja) | 1986-10-03 | 1986-10-03 | 新規微生物 |
Publications (2)
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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