JPS6337632B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、コリネバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属及びノカルデイア属に属する微生物か
ら成る群から選定されるオレフインを酸化して相
応するエポキシドに転化し得る能力を有する菌を
用いてオレフインを酸化させてエポキシド類を製
造する方法に係り、特には、特定の培養液で馴養
した微生物を用いて、オレフインから直接相応す
るエポキシド類を製造する方法に関する。 従来の技術 コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、ノカルデイア属等に属する微生物を用いて、
オレフインを酸化し相応するエポキシドを直接に
製造する方法は既に知られている（特公昭56−40
号公報、特開昭57−2692号公報）。かかる方法で
は、前記菌体を特殊な天然有機物培地、例えば
NB培地〔ニユートリエントブロスNo.２（オキソ
イド社製）〕を用いて培養増殖させ、次いで増殖
させた菌体により、オレフインを酸化しエポキシ
ド類を生産する方法が採用されていた。 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、上記により培養、増殖させた菌
体は、エポキシド生産活性が低く、また、その活
性に不安定さがあり常に一定の活性を有する菌体
を得ることができず、しかも高価で特殊な培地を
必要とする等、エポキシド類の工業生産上問題が
あつた。 本発明は、かかる問題を解決しようとするもの
で、安定して、しかも高収率で安価にオレフイン
から直接に微生物を用いて相応するエポキシド類
を製造する方法を提案することを目的とするもの
である。 問題点を解決するための手段 本発明は、コリネバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属及びノカルデイア属に属する微生物群
から選定されるオレフインを酸化して相応するエ
ポキシドに転化し得る能力を有する菌を用いてオ
レフインを酸化させてエポキシド類を製造する方
法において、前記菌をあらかじめアミノ型窒素
源とアンモニア型窒素源及び炭素源とを含有し、
前記アミノ型窒素源中の窒素元素を炭素源中の
炭素元素に対して重量比で0.02〜0.2の範囲とし、
かつ前記アンモニア型窒素源中の窒素元素を炭
素源中の炭素元素に対して重量比で0.02〜0.1の
範囲とした、培養液を用いて培養することより成
る微生物によるエポキシド類の製造方法である。 作 用 本発明で使用するコリネバクテリウム属、ブレ
ビバクテリウム及びノカルデイア属に属する微生
物群から選定されるオレフインを酸化して相応す
るエポキシドに転化し得る能力を有する菌（以下
「エポキシド生産菌」という）は、コリネバクテ
リウム・アルカナムATCC21194（工業技術院微生
物工業技術研究所寄託番号FERM−Ｐ−4598）、
コリネバクテリウム・ハイドロカーボクラスタス
ATCC15108（同、FERM―Ｐ―4599）、ブレビバ
クテリウム・ブタニカムATCC21196（同、
FERM―Ｐ―4600）、ブレビバクテリウム・ケト
グルタミカムATCC15587（同、FERM―Ｐ―
4601）、ノカルデイア・コラリーナＢ―276（同、
FERM―Ｐ―4094）、ノカルデイア・ブタニカ
ATCC21197（同、FERM―Ｐ―4602）、並びにノ
カルデイア・パラフイニカATCC21198（同、
FERM―Ｐ―4603）を例示し得る。 これらの菌のうち、ノカルデイア・コラリーナ
―276の菌学的性状は、特公昭56−40号公報に、
コリネバクテリウム・アルカナムATCC21194、
ブレビバクテリウム・ブタニカムATCC21196、
ノカルデイア・ブタニカATCC21197及びノカル
デイア・パラフイニカATCC21198の菌学的性状
は、特公昭47−48673号公報に、コリネバクテリ
ウム・ハイドロカーボクラスタスATCC15108の
菌学的性状は、特公昭46−41588号公報に、また、
ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム
ATCC15587の菌学的性状は、米国特許第3591456
公報にそれぞれ詳記されている。 本発明では、上記エポキシド生産菌を培養、増
殖するに際し、アミノ型窒素源とアンモニア型窒
素源及び炭素源を含んだ培養液を用いるのである
が、前記培養増殖を数段階に分けて行う場合は、
必らずしも全段階で前記の培養液を用いる必要は
なく、最終段階でのみ用いることで十分に本発明
の目的を達成し得る。 アミノ型窒素源としては、醗酵で通常用いられ
るアミノ化合物であれば、何をもちいても特に支
障はないが、特には、尿素及びアミノ酸が、また
アミノ酸の中でも、グルタミン酸、カザミノ酸、
グリシン、メチオニン、リジン、アスパラギン
酸、グルタミン、アスパラギン、スレオニン等が
好ましい。 アンモニア型窒素源としては、アンモニア又は
アンモニウム塩、特には、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモ
ニウム等を用いることが好ましい。 また、炭素源としては、グルコース、シユクロ
ース、フラクトース、廃糖蜜のような糖類、酢
酸、エチレングリコール、プロピレングリコー
ル、ｎ―パラフイン、α―オレフイン等を用いる
ことができる。 この炭素源は、培養増殖の開始時に一度に培養
液に加えてもよく、又、培養増殖の全期間に亘つ
て少量ずつ分割して又は連続的に添加してもよ
い。また炭素源の添加量は、菌体の種類及び菌体
の目標増殖量等を勘案し適宜選定される。アミノ
型窒素源の添加量は、アミノ型窒素源中の窒素元
素が炭素源中の炭素元素に対して重量比で0.02〜
0.2と、またアンモニア型窒素源の添加量は、同
様に窒素元素の炭素元素に対する重量比を0.02〜
0.1とすることが後述する実施例から明らかなよ
うに、エポキシドの生産活性を著るしく高くする
ことができるものである。尚、アミノ型窒素源或
いはアンモニア型窒素源のいずれか一方を添加し
た培養液及び上記範囲を外れた量を添加した培養
液を用いても、エポキシド生産活性を十分に高く
することができない。 この培養液には、上記窒素源及び炭素源以外に
通常の菌体の増殖において必要とする無機塩、例
えばリン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化カリウム、硫酸鉄等が加えられる。 上記条件に調製された培養液に菌を接種し、回
分式又は半回分式培養法で、好気的条件下に培養
増殖させることによりエポキシド生産活性の高い
菌体を得ることができる。この場合の培養条件
は、菌の種類、目標菌体増殖等を勘案して適宜選
定される。 以上のようにして培養増殖されたエポキシド生
産活性の高い菌体は、既知のオレフインを酸化し
てエポキシドを製造する方法に供される。例え
ば、上述の条件で培養増殖された菌体をその濃度
が２〜30ｇ／となるように調製して反応槽に収
容する。これに原料オレフイン及び空気、酸素、
酸素富化ガスのような酸素含有ガスを供給して酸
化させる。このとき、原料オレフインがプロピレ
ンやブテンのようにガス状で供給できる場合は、
酸素含有ガスと共に連続的に導入することが好ま
しい。一方、原料オレフインが液状物の場合は、
あらかじめ全量を反応槽に収容しておくか、又は
連続的或いは間歇的にポンプ等により供給するこ
とが好ましい。尚、原料オレフインは、前述のプ
ロピレンやブテンのようにα―，β―，γ―位に
二重結合を有する直鎖状又は分岐鎖状のオレフイ
ン或いはスチレン等、芳香環を有するオレフイン
等エポキシド生産菌が酸化し得るオレフインであ
れば、いずれでも本発明の効果を奏する。上記酸
化反応はPH５〜９の領域で、20〜50℃の温度下に
１〜６日間行われる。又、この反応は常圧下で行
い得るが、加圧下で行うことによりエポキシドの
生産性を向上させることもできる。一方、酸化反
応中に前述した菌体の培養増殖に用いた炭素源、
窒素源、更には、その他の無機塩成分を適宜添加
することにより菌体のエポキシド生産活性を維持
し、或いはさらに高めた状態でエポキシドを生産
することができる。この酸化反応は、回分方式で
も連続方式でも行い得る。酸化反応により生成し
たエポキシドは、吸収或いは相分離、抽出、蒸留
等の公知の手段を適用して分離採取できる。 実施例 実施例１〜12，比較例１〜13 （種菌の調製） ノカルデイア・コラリーナB276（工業技術院微
生物工業技術研究所寄託番号FERM―Ｐ―4094）
の３白金耳をNBG培地（オキソイド社製“ラブ
レンコ”パウダー10ｇ、中性バクテリオロジカル
ペプトン10ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース
10ｇに水道水を加えて１とし、オートクレープ
中で120℃、15分加熱殺菌した液体培地）50mlを
入れた500mlの坂口フラスコに接種し、30℃の温
度で24時間振盪培養（148回／分）した。 （菌体の培養増殖及び菌懸濁液の調製） リン酸水素二カリウム1.79ｇ、硫酸マグネシウ
ム・７水塩1.5ｇ、塩化カリウム0.5ｇ、硫酸第一
鉄・７水塩50mg及び第１表に示した窒素源及び炭
素源を１の水道水に溶解させて殺菌した培養液
をそれぞれ準備した。 次に、この培養液１に上記で調製した菌体50
mlを接種し、空気の通気量を0.5l／min，温度30
℃、PH6.8〜7.2の条件下に菌体を60時間培養増殖
した。次いで、この培養液を15000Gで10分間遠
心分離し、上澄液を除いた。これを0.1モル濃度
のリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄し、培地〔0.1モ
ル濃度のリン酸緩衝液（PH7.5）１に対し、リ
ン酸水素二カリウム1.75ｇ、硫酸マグネシウム・
７水素３ｇ、硫酸第一鉄・７水素50mgを溶解して
もの〕で１回洗浄し、当該培地に乾燥菌体濃度と
して３ｇ／となるように再懸濁して菌体懸濁液
を調製した。 （エポキシド生産活性の評価） 上記により調製した菌懸濁液10mlとグルコース
液（50重量／容量％）0.6ml及び消泡剤（日本油
脂製デイスホームCC―222）0.1mlとを内径18mm
φのチユーブ型の反応器に入れ、５容量％のプロ
ピレン―空気混合ガスを60ml／minの速度で吹き
込み出口ガス中のプロピレンオキサイドの量をガ
スクロマトグラフイーで測定し、エポキシドの生
産活性を調べた。この結果を第１表に示す。

【表】 実施例13〜14、比較例14〜15 前記実施例１及び７と比較例１及び11と同一の
方法により培養増殖し調製した菌体懸濁液を用
い、第２表に示すオレフインについてエポキシド
生産活性を評価した。評価は、500ml容の坂口フ
ラスコに菌体懸濁液20ml及び第２表に示すオレフ
イン0.1mlと溶剤としてｎ―テトラデカン２mlと
を収容し密栓したのち、30℃の温度下に24時間、
150回／分の往復振盪しつつ酸化反応させた。反
応終了後50mlのエーテルで抽出し、該抽出物をガ
スクロマトグラフイーで分析し、エポキシドの生
成量を測定した。この結果を第２表に示した。

【表】

【表】

【表】 発明の効果 実施例から明らかなようにアミノ型窒素源とア
ンモニア型窒素源とを所定の量、共存させること
により高価な培地を用いることなく、エポキシド
を高収率で製造することができる。また、実施例
13〜14の結果より種々のオレフインから相応する
エポキシドを生産する場合も本効果を奏すること
は明白である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
   属及びノカルデイア属に属する微生物群から選定
   されるオレフインを酸化して相応するエポキシド
   に転化し得る能力を有する菌を用いてオレフイン
   を酸化させてエポキシド類を製造する方法におい
   て前記菌をあらかじめ、 アミノ型窒素源とアンモニア型窒素源と炭素
   源とを含有し、 前記アミノ型窒素源中の窒素元素を炭素源中
   の炭素元素に対して重量比で0.02〜0.2の範囲
   とし、かつ 前記アンモニア型窒素源中の窒素元素を炭素
   源中の炭素元素に対して重量比で0.02〜0.1の
   範囲とした 培養液を用いて培養することを特徴とする微生
   物によるエポキシド類の製造法。