JPH05996B2

JPH05996B2 -

Info

Publication number: JPH05996B2
Application number: JP58147179A
Authority: JP
Inventors: Chikahiro Sakasawa; Nobuo Kato
Original assignee: Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1983-08-11
Filing date: 1983-08-11
Publication date: 1993-01-07
Also published as: JPS6037992A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、アルコール類及び／又はアルデヒド
類の製造法にある。本発明者らは、アルデヒド類を基質とする微生
物反応に関する研究の一環としてアルデヒド不均
化酵素によるアルコール−アルデヒドの交換反応
を見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明の要旨は、一般式（）： RCH₂OH （）（式中、Ｒはアルキル基又はアルケニル基をあ
らわす。）で示されるアルコール類と、一般式（）： R′CHO （）（式中、R′は水素原子、アルキル基又はアル
ケニル基をあらわし、ＲとR′は相異なる。）で示されるアルデヒド類とを、微生物の生産する
アルデヒドデイスミユーターゼの存在下に反応さ
せて、一般式（）： R′CH₂OH （）（式中、R′は一般式（）におけると同義）で示されるアルコール類及び／又は一般式
（）： RCHO （）（式中、Ｒは一般式（）におけると同義）で示されるアルデヒド類を得ることを特徴とする
アルコール類及び／又はアルデヒド類の製造法に
存する。以下、本発明を詳細に説明する。まず、本発明方法において用いられるアルデヒ
ドデイスミユーターゼ（アルデヒド不均化酵素）
は、補酵素の添加なしにアルデヒド類の酸化還元
を同時に行なう酵素であり、たとえばシユードモ
ナスプチダF61（Pseudomonas PutidaF61
（FERM Ｐ−No.7165）から得られる。このシユードモナスプチダF61の菌学的性質を
以下に示す。第一次鑑別（オキソイドCM3培地（30℃）で生育させた
形態と整理観察）形態桿菌グラム − 芽胞 − 運動性＋コロニーの形態淡黄色、円形、不透明、全円、
光沢あり、低凹型、24時間に直径0.5mm 生育温度（℃）５＋ 37 ＋ 41 − 45 − カタラーゼ＋オキシダーゼ＋Ｏ−ＦテストＯ一次鑑別による同定：グラム陰性、酸化により
糖を分解。第二次鑑別ピオシアニン − 螢光＋ DL−アルギニン＋ベタイン＋グルコース＋乳酸塩＋酢酸塩＋ペニシリンＧ − ストレプトマイシンクロラムフエニルコール − テトラサイクリンノボビオシン − ポリミキシンＢ０／129 − レバン − 生育因子要求性 − グルコースからのガス生成 − グリコースからの酸生成＋ ONPG − アルギニンジヒドロゲナーゼ＋リジンデカルボキシラーゼ − オルニチンデカルボキシラーゼ − 硝酸塩から亜硝酸塩への還元 − 硝酸塩から窒素ガスへの還元 − デオキシリボヌクレエース − ゼラチン含有高層培養（20℃） − ゼラチン含有平地培養 − カゼイン加水分解 − 澱粉加水分解 − 卵黄反応 − リパーゼ活性 − NH₃ ＋インドール − H₂Ｓ − “トウイーン（Tween）80”加水分解 − 以上により、本菌株は、シユードモナスプチダ
と同定された。なお、同定に際しては、）バー
ジーズマニユアルオブデイターミネイテイ
ブバクテリオロジー（Bergey′s Manual of
Determinative Bacteriology），8th edition
（1974）及び）コーワン（Cowan）らのマニユ
アルフオアジアイデンテイフイケーシヨン
オブメデイカルバクテリア（Manual for
the Identification of Medical Bacteria）
（1974）が参照された。この微生物の培養に必要な栄養物としては、と
くに限られるものではなく、通常微生物の培養に
用いられるものが利用される。たとえば、炭素源
としては、グルコース、シユクロース、フラクト
ース、グリセロール、ソルビトール、糖蜜、澱粉
加水分解物等の糖質、酢酸、フマル酸等の有機
酸、等が利用される。窒素源としては、硝酸塩
類、アンモニウム塩類、コーンステイープリカ
ー、酵母エキス、肉エキス、酵母粉末、大豆加水
分解液、綿実粉、ポリペプトン、ペントン等が挙
げられる。無機塩としては、リン酸カリウム、リ
ン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム等が利用できる。培養温度は、20〜40℃、特に25〜37℃が好適で
ある。培養は、通常16〜72時間程度、好気的に行
なわれる。このようにして得られるアルデヒドデイスミユ
ーターゼは、主として微生物の菌体内に存在して
おり、培養物より採取した菌体自体を使用するこ
ともできるし、さらに超音波処理、硫安分別、イ
オン交換クロマトグラフイー、ゲル過等の公知
の方法によつて分離精製して使用することもでき
る。すなわち、培養後得られた菌体を遠心分離によ
つて集めた後、超音波処理、ホモゲナイザー、ガ
ラスビーズによる磨砕等の機械的手段又は細胞溶
解酵素等による化学的手段により細胞を破砕した
後、遠心分離により上清を得る。つぎに、この上
清を硫安分別、“DEAE−セフアセル”等のイオ
ン交換クロマトグラフイー、ハイドロキシアパタ
イト等による吸着クロマトグラフイー、“セフア
クリル”、“セフアデツクス”等によるゲルクロマ
トグラフイー等、フエニル−クロルセフアロース
等による疎水クロマトグラフイー等の組み合わせ
で精製される。この精製酵素の性質は次のとおりである。分子量：2.2×10⁵（ゲルろ過）（5.5×10⁴のサブユニツト４個）等電点：PH4.8 至適PH：8.0 至適温度：40℃ HgCl₂、PCMB（ｐ−クロロマーキユリーベ
ンゾエート）、ヨウ化酢酸、Zn、Cu、Feで阻
害される。本発明方法においては、一般式（）及び
（）で示されるアルコール類及びアルデヒド類
を上記アルデヒドデイスミユーターゼの存在下に
反応させる。一般式（）及び（）におけるＲ及びR′は、
互いに異なり、Ｒは直鎖又は分枝したアルキル基
及びアルケニル基から、R′は水素原子ならびに
直鎖又は分枝したアルキル基及びアルケニル基か
ら選ばれるが、好ましくは、Ｒ及びR′が炭素数
１〜４のアルキル基及び炭素数２〜６のアルケニ
ル基から選ばれる。アルコール類及びアルデヒド
類の量比は、通常等モル程度である。反応は、通常PH5.5〜9.5、好ましくはPH７〜９
で、通常使用される緩衝液、たとえばリン酸カリ
ウム等、中で行なわれる。アルデヒドデイスミユーターゼは、精製物に限
らず、菌体（固定化菌体も用いうる）、抽出液、
粗精製物のいずれの形でも用いられるが、反応温
度は通常10〜45℃、好ましくは30〜40℃である。
反応時間は、デイスミユーターゼの使用量（通常
0.01〜10ユニツト程度）、基質の濃度および種類
ならびに反応温度によつて異なるが、10分〜100
時間、通常30分〜48時間程度から選ばれる。基質
であるアルデヒド類の濃度は、通常1mM〜数Ｍ
から選ばれる。反応が終了すると、基質アルコール類及びアル
デヒド類のアルコール−アルデヒド交換反応によ
り、対応するアルコール類R′CH₂OH及びアルデ
ヒド類RCHOが得られる。本発明方法による反応は、次式で表わされる。 RCH₂OH＋H₂Ｏ＋EX→RCHO＋EX−H₂ R′CHO＋EX−H₂→R′CH₂OH＋EX （Ｅはデイスミユーターゼー、Ｘは補欠分
子）このようにして得られた生成物は常法にしたが
つて、たとえばイオン交換樹脂処理、等によつて
単離される。本発明方法によれば、酸化還元反応に補酵素の
添加を必要とせず、アルコール類及びアルデヒド
類のアルコール−アルデヒド交換反応により、対
応するアルコール類及び／又はアルデヒド類を得
ることができ、たとえば充填方式による固定化菌
体を用いたバイオリアクターに好適である。以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説明
する。参考例１シユードモナスプチダF61を、１当たりペプ
トン10ｇ、肉エキス５ｇ、K₂HPO₄１ｇ、NaCl
５ｇ及びホルムアルデヒド１ｇ（PH7.0）の組成
よりなる培地１を２フラスコに28本接種し、
30℃、48時間振盪培養する。培養液28より得ら
れた菌体200ｇを10mMリン酸カリウム緩衝液
（PH7.0）１に懸濁したのち、超音波処理（19K
Hz、30分）する。ついで遠心分離（16000×ｇ、
30分）し、菌体抽出液を得る。上清25ｇに、水
500mlに溶解したプロタミン硫酸塩を攪拌下に滴
下して加える。30分間攪拌し、溶液を遠心分離
（83000×ｇ、30分間）する。得られた上清溶液
（1500ml）にPH7.0で、固形硫安を60％飽和になる
ように添加し、生じる沈澱を遠心分離により除去
する。硫安を90％飽和まで上清溶液に添加する。
遠心分離により集められた沈澱を10mMリン酸カ
リウム緩衝液（PH7.0）200mlに溶解する。酵素溶液（220ml）に、固体NaCl（4M）を加
え、混合物を“フエニル−セフアロース”カラム
（４×50cm）（4M NaClを含むリン酸カリウム緩
衝液10mMで平衡化）に導入する。緩衝液でカラ
ムを洗浄後、NaCl濃度減少−エチレングリコー
ル濃度増加（最終濃度０、50％。全容量６）の
勾配で溶出させる（流速：19cm／時間）。活性区
分を集め、10mMリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）
で透析する。透析した溶液を限外ろ過により100mlまで濃縮
し、10mMリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）を用
いて“DEAE−セフアセル”カラム（2.5×45cm）
に導入する。カラムは平衡緩衝液2.5で洗浄さ
れ、ついで100mM NaClを含む緩衝液２で洗
浄される。酵素は、NaCl増加（100→300mM、
2.5）による直線勾配（流速10cm／時間）法に
より溶出される。活性成分を集め、10mMリン酸
カリウム緩衝液により透析する。酵素溶液50mlをハイドロキシアパタイトカラム
（2.5×21cm）（上記緩衝液で予め平衡化）に導入
する。リン酸カリウム緩衝液濃度を10、50、100
及び200mMに増加させて段階的に溶出を行なう
（流速：８cm／時間）。酵素活性は200mMリン酸
カリウム緩衝液（PH7.0）で溶出されるフラクシ
ヨンにあらわれる。これらのフラクシヨンを集め
10mMりん酸カリウム緩衝液（PH7.0）で透析し、
限外ろ過で濃縮し、18ml（3470ユニツト）の精製
酵素を得た。この精製酵素溶液は５℃で保管され
る。（活性の測定）アルデヒドデイスミユーターゼ活性は、20mM
アルデヒド、100mM KCl及び酵素（最終容量10
ml）を含む標準反応混合物を用い、PHスタツトで
測定する。反応はN₂雰囲気下に撹拌しながら30℃で行な
い、酸の生成を10mM NaOHでPH７に保ちつつ、
滴定する。活性１ユニツトは、１分間に1μmolの
酸を生成する酵素活性として定義される。実施例１第１表に示すアルデヒド類及びアルコール類そ
れぞれ10mMを、参考例１で得られたデイスミユ
ーターゼ８ユニツト／mlの存在下に、0.05Mりん
酸カリウム緩衝液中、30℃で60分間反応させ（PH
8.0）、アルコール−アルデヒド交換反応によりそ
れぞれ対応するアルコール類及びアルデヒド類を
得た（モル％）。【表】

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（）： RCH₂OH （）（式中、Ｒはアルキル基又はアルケニル基をあ
らわす。）で示されるアルコール類と、一般式（）： R′CHO （）（式中、R′は水素原子、アルキル基又はアル
ケニル基をあらわし、ＲとR′は相異なる。）で示されるアルデヒド類とを、微生物の生産する
アルデヒドデイスミユーターゼの存在下に反応さ
せて、一般式（）： R′CH₂OH （）（式中、R′は一般式（）におけると同義）で示されるアルコール類及び／又は一般式
（）： RCHO （）（式中、Ｒは一般式（）におけると同義）で示されるアルデヒド類を得ることを特徴とする
アルコール類及び／又はアルデヒド類の製造法。