JPH06104066B2 - α―インターフェロン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子系 - Google Patents

α―インターフェロン活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子系

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JPH06104066B2
JPH06104066B2 JP57174426A JP17442682A JPH06104066B2 JP H06104066 B2 JPH06104066 B2 JP H06104066B2 JP 57174426 A JP57174426 A JP 57174426A JP 17442682 A JP17442682 A JP 17442682A JP H06104066 B2 JPH06104066 B2 JP H06104066B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトα−インターフェロン活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子系、すなわち該ポリペプチ
ドをコードする遺伝子、該遺伝子を含んで成るベクター
及び該ベクターにより形質転換された宿主に関する。本
発明の遺伝子系によりコードされるポリペプチドは免疫
モデレーター（調節体）として有用であり、特に抗‐ウ
イルス性、抗癌性、および抗‐腫瘍性剤である。従っ
て、該ポリペプチドを含む医薬組成物およびウイルス性
感染、癌および腫瘍の治療方法をも提供する。
インターフェロン（“IFN"）は分子量10000から40000で
ある大部分グリコシド化したポリペプチドである。それ
は、ウイルス、二重鎖RNA、細胞内微生物、微生物の生
成物または種々の化学剤のようなIFN誘発物質に触れる
ことによって脊椎の細胞によって生成される（１）。IF
Nsは正常な細胞においては通常見られない。ウイルス性
感染および他の攻撃物から防護するために脊椎動物の正
常細胞を補助する。IFNsは免疫モデレーター活性を有す
ることが発見されている。インターフェロン・ポリペプ
チドの学名はまだ確立していない。最近の勧告による
と、分類は動物の種（たとえば“Hu"ヒト由来を示
す）、抗原特異性（α，βおよびγ型、各々α‐，β
‐，またはγ‐IFN-抗体との抗原‐抗体反応に基づ
く）、構造および生理学上の相違（サブタイプはアラビ
ア数字、すなわちα１，α２などで表わす）、および細
胞由来のタイプ（Leは白血球由来であり、Lyはリンパ芽
球細胞由来であり、Ｆは線維芽細胞由来である）に基づ
いている。たとえばHuIFN-α１（Ly）またはHuLyIFN-α
１は、サブタイプ１のα‐タイプインターフェロンを示
し、それはヒトリンパ芽球細胞から誘導される。これら
の命名（種類）に加えて、インターフェロンが直接
“親”細胞（progenitor cell）から直接得られるか、
また微生物内で合成から得られるか分類することおよび
インターフェロンが特別のサブタイプであるかまたは２
つもしくはそれ以上のインターフェロンサブタイプの混
合物であるか明らかにすることが必要である。
IFNポリペプチドのためのコード化のDNA配列、組み換え
DNA分子およびそれらを含むホストに関する学名もまた
まだ確立していない。インターフェロンに関するDNA配
列に対して用いられている学名は、省略形でコード化さ
れており、たとえば大腸菌Escherichia coli HB 101（Z
-pBR322（Pst）/HcIF-2h）は、組み換えプラズミド（pl
asmid）DNAZ-pBR322（Pst）/HcIF-2hを含む細菌株（E.c
oli HB101）すなわちPstIの位置（異なる外来のDNAの挿
入の位置）にHcIF-α１挿入体を含むプラズミドpBR322
でチューリッヒ（Ｚ）で発明されたことを示す。“H"は
ヒト由来であり“C"は相補的DNA（complementary）を示
しおよびα１はサブタイプを表わす〔cf.C.ワイスマ
ン、（３）〕。与えられた学名の場合、IFN遺伝子（白
血球）の由来を表示してはいない。本出願において、同
様の単名を採用されるが、IFN遺伝子の由来を（リンパ
芽球細胞）表わす。
現在までHuIFNsの三つの類が同定され： HuIFN-α,HuIFN-βおよびHuIFN-γが挙げられる。HuIFN
-α（以前はLeIFNと命名され、白血球インターフェロン
もしくはLyIFN、リンパ芽球インターフェロン）はヒト
白血球（ヒトの供与血液から得られる新鮮な細胞）およ
びたとえばウイルスの誘発によるリンパ芽球細胞〔E.A.
ハアベルら、（４）およびA.D.サガルら、（５）〕によ
って生成される。pH2で安定であり（IFNsは酸に対して
安定であり、以前は“タイプI"として表わされてい
た）、主としてグルコシル化の程度〔例、M.ルビンスタ
インら、（６）およびアミノ酸組成（下記参照）〕が異
なる個々のインターフェロンポリペプチドの混合物から
なる。単離され、精製された二つの成分、一方は、分子
量15000から18000で、グルコシル化されていず、他方
は、分子量21000から22000で、グルコシル化されてい
る。W.E.ステュワート、IIら（７）は、非‐グルコシル
化インターフェロンは、ほとんどもしくはすべてのHuIF
N-α活性を保有していることを報告している。リンパ芽
球細胞からのアミノ酸配列の部分は報告されている〔K.
C.ゾーンら、（８）〕。構造的に、生理学的に異なった
HuIFN-αの種々の型はすでに知られている。特にヒト個
体は、HuIFN-αの対立形質多様性を生ずる可能性があ
る。
HuIFN-β（以前にFIFNもしくはFiFN、“タイプI"と称す
る）はdsRNAの誘発から生ずるヒトの線維芽細胞（たと
えば新生児の包皮）によっておよびごくわずかの程度、
HuIFN-αとともに、ウイルスの誘発から生ずるヒトリン
パ芽球細胞によって生成する。HuIFN-βもpH2で安定
（従って“タイプI"に属する）である。少なくてもHuIF
N-βの二つのタイプは記載されている33,48）。分子量
は、約20000および22000である。アミノ酸配列は部分的
に知られている。
HuIFN-γ〔以前はIIFNと称する（免疫インターフェロン
もくは“タイプII"インターフェロン）〕は抗原もしく
はミトゲン（mitogen）に対応してT-リンパ球によって
生成される。pH2で酸不安定であり、HuIFN-αおよびHuI
FN-βは、血清学上区別される。
HuIFNsは抗‐ウイルス性、抗‐癌性および抗‐腫瘍性剤
として有用である。
抗‐ウイルス性剤として、たとえばウイルス性呼吸器感
染、ヘルペスシンプレックスケラテテス、急性出血性結
膜炎、水痘帯状疱疹、肝炎Ｂ、巨大細胞封入体症および
他の治療のために用いられる。
抗‐癌性または抗‐腫瘍性剤としてHuIFNsは骨肉腫、急
性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ホドキンス病、メラノ
マ、胸癌、リンパ肉腫および乳頭腫および他の治療のた
めに用いられる。
HuIFNsは、経口もしくは非経口的投与たとえば、局部的
に、静脈内、筋肉内、鼻内、皮内または皮下投与のため
に医薬として許容され得る形状で、たとえば経口投与用
として錠剤、バイアル、シロップ、粉末、溶液または懸
濁液、注射もしくは注入溶液、または懸濁液、目薬、軟
膏、スプレー、およびその他存在する。
製剤は、通常たとえば筋肉内に一日に１〜３回約106−1
07ユニット用量（病気に適用の状態および患者の状態に
よって）を投与する。ウイルス感染では通常、毎日また
は一日に三回まで数日間−数週間にわたって処理し、一
方癌および腫瘍では数カ月−数年にわたって一日に１回
−数回または週に一回−数回処理する。
現在までHuIFN-αの不十分な量が誘発ヒト細胞、たとえ
ばヒトリンパ芽球細胞（例、ブルキットスリンパ“ナマ
ルワ（Namalwa）”細胞）または、供与者の新鮮な血液
から得られるヒト白血球からのみ生成されている。HuIF
N-βは主にヒト線維芽細胞から得られる。粗HuIFN-α
（2.6×109IU）は培養ナワルワ細胞の8001から得られ、
粗HuIFN-αの約1011IUは毎年血液センターで（例ヘルシ
ンキのフィンランド赤十字センター）で得られる。HuIF
N-αの特異活性は、４×108−109UI/mgの範囲である。
広範囲でかつ市販用に適用のために要するHuIFN-αの量
は、他の医薬用化合物に比して非常に低い。
純粋なHuIFN-αの100gは10−3000万投与量を提供しう
る。しかしながらこのような量は工業的に合理的なコス
トでヒト組織培養、かつヒト白血球を用いての経費およ
び技術的に生産することはできない。
大規模生産への他の欠点としては、インターフェロン‐
混合物が得られ、それらを各々のサブ‐タイプに分離す
るのには厄介であり、費用がかかりすぎる。従って純粋
な、個々のインターフェロン種の治療への適用に際して
は、満足すべき評価を得ることはむずかしい。
これらの方法の工業的応用は、培養できるヒト細胞（ヒ
ト腫瘍細胞およびある種の線維芽細胞）または相対的に
多量得ることのできるヒト細胞（白血球およびリンパ
球）によって生成されるHuIFNsに限られる。しかしなが
らこれらの方法は、費用がかかりかつ複雑である。
インターフェロンの個々の種の工業的な大量生成のため
の問題への解決は分子生物学の進歩から、すなわち細菌
細胞における特異性非‐細菌性成熟核遺伝子を発現する
ことが可能になったことからなされた。最近、S.N.コー
エンとH.W.ボイヤー（９）は生物学的に機能を有するDN
A配列を複製する一般方法について報告している。この
方法は環状プラスミドDNAを開裂して第一の線状（棒
状）DNA断片（Segment）を与える段階；この第一の断片
に表現型体質のための遺伝子を持った第二の線状DNA断
片を挿入して組み換えDNA分子を与える（修復された環
状プラスミド）段階；組み換えDNA分子を持つ単細胞微
生物への形質転換；形質転換体を適当な栄養条件下に非
‐形質転換微生物とともに増殖させる；およびP-単細胞
微生物から形質転換体を分離することからなる。形質転
換体は望ましい蛋白質を生成しうる。
先行技術： HuIFN-α‐およびHuIFN-β‐様活性をもつポリペプチド
のためにコード化されたヒト白血球および線維芽細胞か
ら誘導したDNA配列、該DNA配列を含む組み換えDNA分
子、該組み換えDNA分子で形質転換したホスト、ポリペ
プチド、該ポリペプチドを含む培養液およびこれに関す
る組成物の生成についての方法は種々の特許出願書およ
び他の出版物において記載されている。センダイウイル
スで誘発されたヒト白血球、いくつかのHuIFN-α‐様活
性をもつDNA配列をもつポリペプチド、組み換えDNA、お
よびそれらの製造のためのホストを出発物質として用い
ることがC.ワイスマンによって報告されている〔3;S.ナ
ガタら、（10）、N.ナンタイら、（11）およびM.ストロ
イリら、（12）参照〕。
白血球、特にセンダイウイルスで誘発されたヒト骨髄芽
球細胞ラインKG-1から誘導された、部分的に精製した分
子量21000をもつHuIFN-α−様ポリペプチド、対応するD
NAs同じく８つの異なるヒトLeIFNcDNAsの構造はD.V.ゴ
エデルら、（13,14）によって報告されている。
HuIFN-α‐様活性をもつポリペプチドの製造方法は、ヒ
トリンパ芽球ナワルワ細胞またはヒト血液白血球で開始
し、ニューキャスル病ウイルスで誘発されることが一般
的概念でヨーロッパ特許出願番号34307（15）に開示さ
れているがしかし、具体的なデータおよび詳細は述べら
れていない。
ヒト線維芽細胞、特に新生児の包皮から得られたものか
ら開始し、HuIFN-βのためコード化に、ポリ（Ｉ）：ポ
リ（Ｃ）DNAsによって誘発された、組み換えDNA分子、
およびそれらを含む微生物は、ヨーロッパ特許出願2803
3〔（16）；タニグチら．（17）〕、デアニクら．（1
8）およびゴエデルら．（19）参照〕に記載されてい
る。
mRNAs,DNAs,組み換えDNA分子およびHuIFN-β１およびHu
IFN-β２を生成できる細菌株は英国特許出願2,063,882
（20）記載のように二重らせんポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）
で誘発されたヒト線維芽細胞、特に包皮細胞FS11または
SV80から開始する遺伝子工学の方法によって得られる。
DNAs、組み換えDNA分子、後者を含むE.coliおよびヒト
線維芽細胞から得られたmRNA経て製造された、HuIFN-β
活性をもつポリペプチド、特にポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）
で誘発されたヒト包皮FS-4およびそれを製造するための
方法は、ベルギー特許番号887397（２）に開示されてい
る。
一般的に、いかなる具体的なデータ、または詳細なしに
HuIFN-β‐様活性を持つポリペプチドを製造するための
方法は、ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）で誘発されるヒト線維
芽細胞（新生児の包皮）からの開始は、ヨーロッパ特許
出願34306（22）に開示されている。
ヒトリンパ芽球インターフェロン“HuIFN（Ly）”は種
々の誘発体での刺激によってナマルワ細胞において多様
な量を生成することができる〔M.O.ジョンストンら（2
4）〕。センダイウイルスによって誘発されたナマルワ
細胞によって生成したHuIFN（Ly）は、HuIFN-α（Ly）
（70−90％）およびHuIFN-β（Ly）（10−30％）を含む
ことが示されている。それは少なくても７つの成分から
なる〔K.C.ゾーンら、（８）およびG.アレンら（25）;
E.A.ハアベルら．（４）およびA.D.サーガルら、（５）
参照〕。リンパ芽球インターフェロンポリペプチドの全
構造は現在まで未知であるけれども、HuIFN-α（Ly）は
HuIFN-α（Le）とは異なっている。リンパ芽球インター
フェロンの主成分のグルコシル化はほとんどないように
思われる。種々の成分はまだ単離されておらず精製され
ていない。
発明の目的 臨床試験はリンパ芽球HuIFNsの混合物で行なわれてお
り、それらの治療効能を測定するためには個々に生成
し、および種々の成分に分解することが望ましい。前記
載の組み換えDNA過程のいずれもヒトリンパ芽球インタ
ーフェロンの合成に指図されていない。本発明の目的は
この問題を組み換えDNA技術（手段）で解決することで
ある。更に本発明の目的は、HuLyIFNsの種々のサブタイ
プの構造（アミノ酸配列）を説明することであり、およ
び多くの患者の治療のために安全な供給をするために十
分な量の個々のインターフェロンを製造することを可能
にせしめることである。
発明の要約 本発明は量において（多量）リンパ芽球HuIFNsと同様の
生理学的活性を持つ個々のポリペプチドの生成の問題を
解決することである。単一ポリペプチドは今まで知られ
ているHuIFN-α（Le）およびHuIFN-βの成分と同一であ
るか異なっているかのどちらかである。免疫学上、およ
び生物学上HuLyIFN-αまたはHuLyIFN-βの活性を示すポ
リペプチドを含む医薬用剤および使用方法を提供する。
用語、使用される省略語についての説明 クローン（Clone）：単細胞から無性的に誘導された細
胞個体群。このような個体群は遺伝的に同一であると仮
定する。
オペロン（Operon）：隣接した遺伝子からなる遺伝子ユ
ニットは対等にオペレーターおよびレプレサーの制御下
に表わす。
コントロール配列の発現（表示）（Expression control
sequence）：実施的に遺伝子に連結している場合、構
造遺伝子の発現を制御し、調整するヌクレオチドの配
列、他の間すなわちプロモーターおよびリボゾームの結
合位置を含む。
プロモーター（Promotor）:RNAポリメラーゼが結合しお
よび転写を始めるDNA断片（セグメント）。
リボゾームの結合位置（Ribosomal binding site）：翻
訳のためにかくことのできないリボゾームへのmRNAの結
合をさせる配列 発現（Expression）：転写および翻訳からなる過程 転写（Transcription）:DNAに含まれる遺伝子情報をRNA
鎖に相補的な塩基配列をもつように刻まれる塩基対を含
む過程 翻訳（Translation）:mRNAに存在する遺伝子情報を蛋白
質合成中特別のアミノ酸を刻むようにする過程。
ヌクレオチド（Nucleotide）：プリン、ピリミジン塩
基、リボースまたは2-デオキシリボース残基およびリン
酸残基からなる核酸の構成体。リボヌクレオチド塩基は
A,G,CおよびＵであり、一方デオキシリボヌクレオチド
においてはＵはＴで置き換わる。
ベクトルまたはクローニングベイクル（Vector or clon
ing vehicle）:DNA配列、たとえばプラスミドまたはフ
ァージDNA、それはホスト細胞において自主的に複製で
き、形質転換細胞の同定における使用に適するマーカー
を含む、たとえばテトラサイクリン抵抗性（不応性）も
しくはアンピシリン抵抗性（不応性）、および他のDNA
断片（セグメント）は付着した断片（セグメント）の複
製をもたらすように実験的に付着させうる。
プラスミド（Plasmid）：ホスト細胞で複製できるクロ
マトゾーム外の環状の二重鎖DNA。
組み換え（交雑）DNA〔Recombinant（hybrid）DNA〕：
生きている細胞の外で会合する異なった遺伝子からのDN
A断片（セグメント）からなり、あるホスト細胞を感染
することができ、その中で持続できる。
ヌクレアーゼ（Nuclease）：核酸のホスホジエステル結
合の鎖を開裂することができる酵素。
リボヌクレアーゼ（Ribonuclease）:RNAのホスホジエス
テル結合を開裂することができる酵素。
制限エンドヌクレアーゼ（Restriction endonucleas
e）：重合体鎖以内で特別の目標配列でポリヌクレオチ
ドを切断する酵素。開裂化合物は、“ブラントblunt"
（“フラッシュflushed"）末端もしくは“スタガードst
aggered"（“ステッキィsticky"）末端を持つDNA断片
（フラグメント）を増加させる。
エキソヌクレアーゼ（Exonuclease）：鎖の末端からDNA
を分解する酵素。
リゾチーム（Lysozyme）：ある細菌の細胞壁にある多糖
類を分解する酵素。
リバーストランスクリプターゼ（Reverse trans cripta
se）:RNAテンプレートから相補的な一本鎖DNAを合成
し、そのDNA鎖を二重らせん型に転換するRNA腫瘍ウイル
スによってコード化された酵素。
DNAポリメラーゼ（DNA polymerase）:DNAの３′‐５′
ホスホジエステルの結合の生成を触媒する酵素。
DNAリガーゼ（DNA ligase）：エンドヌクレアーゼによ
って導入された型の一本鎖DNAホスホジエステル結合の
開裂の修復を触媒する酵素。
ポリヌクレオチドキナーゼ（Polynucleotidekinase）:D
NAの５′‐位の水酸基のリン酸化を触媒する酵素。
形質転換（Transformation）：外因性のDNA、たとえば
プラスミドまたは交雑DNAを細胞内への導入は細胞内に
おける該DNAの確立という結果になる。
略語 A:アデノシンもしくはデオキシアデノシン一リン酸残基 U:ウリジン一リン酸残基 T:デオキシチミジン一リン酸残基 C:シチジンもしくはデオキシシチジン一リン酸残基 G:グアノシンもしくはデオキシグアノシン一リン酸残基 I:イノシン一リン酸残基 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dCTP:デナキシシチジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCMP:デオキシシチジン一リン酸 dGMP:デオキシグアノシン一リン酸 RNA:リボ核酸 mRNA:メッセンジャーリボ核酸 tRNA:転移リボ核酸 rRNA:リボゾームリボ核酸 dsRNA:二重鎖リボ核酸 DNA:デオキシリボ核酸 cDNA:相補性デオキシリボ核酸（酵素的にmRNA配列から
合成される） dscDNA:二重鎖相補性デオキシリボ核酸 ApPr:β‐ラクトアメーゼ遺伝子のコントロール配列の
発現 IFN:インターフェロン HuLy:ヒトリンパ芽球細胞 本発明はインターフェロン‐様ポリペプチドまたは該DN
Aに交雑（雑種）するためにコード化されるDNA、特に組
み換えDNA、ヒトリンパ芽球細胞から誘導されたDNA配
列、または該配列の断片、変種または突然変異体を含む
DNA、 該組み換えDNAsの少なくとも１つで形質転換したホス
ト、ヒトリンパ芽球インターフェロン、または断片また
はその誘導体の免疫学上および生物学上の活性を示すポ
リペプチド、該ペプチドを含んでなる医薬組成物および
ヒトにおけるウイルス性感染、癌、腫瘍の治療で、該医
薬組成物の形態で該ポリペプチドの効果的な量を投与す
ること、に関するものである。
本発明は、該組み換えDNAの少なくとも１つで形質転換
したホストを培養し、望ましいポリペプチドを集めるこ
とを特徴とする、ヒトリンパ芽球インターフェロンの免
疫学上および生物学上活性を示すポリペプチドを生成す
る方法および形質転換したホスト微生物を生成するため
の方法に関するものである。
形質転換したホスト微生物の生成のための方法は、次の
段階からなる： （１）誘発ヒトリンパ芽球細胞からヒトリンパ芽球ポリ
（Ａ）RNAを分離し、HuLyIFN-mRNAのために濃縮する、 （２）このテンプレート（鋳型）から一本鎖相補性DNA
を、そこから二本鎖cDNA製造する、 （３）dscDNAを適当なベクトルDNAに導入する、 （４）得られた組み換えDNAで適当なホスト微生物を形
質転換する、 （５）ヒトリンパ芽球IFNcDNAもしくはDNA断片で形質転
換した、クローンを選択しおよびホスト微生物を培養す
る、任意に、形質転換したホストから組み換えDNAsを分
離し、必要に応じてIFN活性をもつポリペプチドのレベ
ルを改善するために組み換えDNAs変異させ、（４）およ
び（５）の段階を再び行なう。
1.ヒトリンパ芽球細胞の誘発およびHuLyIFNm-RNAのため
に濃縮したヒトリンパ芽球ポリ（Ａ）RNAの単離 HuLyIFNm-RNAのために濃縮したヒトリンパ芽球ポリ
（Ａ）RNAの分離は、種々の既知の方法によって達成さ
れ得る。本発明において用いられる方法は次の段階から
なる： a.LyIFN合成のためヒトリンパ芽球細胞の誘発、 b.誘発細胞の破壊、 c.蛋白、リポ蛋白、DNAsおよび異種のRNAsを混同物から
のリンパ芽球ポリ（Ａ）RNAの分離、 d.LyIFN特異性mRNAのための濃縮。
a.LyIFN合成のためヒトリンパ芽球細胞の誘発 IFN誘発体への露出の結果として、ヒトリンパ芽球細胞
は、LyIFNmRNAおよび続いてヒトLyIFNを生成する。
適するIFN誘発体は、たとえば種々の化学剤、二本鎖RNA
〔例ポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）〕、または特にある種のウ
イルス、特にパラミクソウイルス、プソイドミクソウイ
ルスおよびレオビリジアル科であり、例としてはニュー
カッスル病ウイルス（株110,B1,ラ・ソタまたはテキサ
ス），センダイウイルス、青舌病ウイルス、麻疹ウイル
ス、流行性耳下腺炎ウイルス、パラ‐インフルエンザＩ
型、II型またはIII型またはセムリキ森林ウイルスが挙
げられる。
ヒトリンパ芽球細胞は好都合にブルキットスリンパ種の
患者から得られる。このような細胞系統の１つであるナ
マルワはウイルス性の刺激で、IFNの高レベルを生成す
る（26）。ナマルワ細胞とは別に、リンパ芽球細胞、た
とえばダウディ細胞、アクバ細胞、NC-37細胞、RN-2細
胞および当該分野で既知の他の細胞が用いられる。
誘発以前に、リンパ芽球細胞は低級直鎖アルカン酸、た
とえば、リンパ芽球細胞によるIFN生成を高めることが
知られているブチル酸もしくはその塩で前処理する（2
7,28）。更に必要に応じてもしくは所望ならばリンパ芽
球細胞を、同類体IFNの少量と処理することによってプ
ライマー化する。
リンパ芽球細胞の誘発は、文献記載の類似の方法を用い
て行なう。リンパ芽球細胞、たとえばナマルワ細胞は、
慣例上の栄養培地（例RPMI1640培地）、で約10％胎牛血
清を加え、十分な細胞密度（例、106−107細胞/ml）で
増殖させる。遠心によって培地から分離した細胞は栄養
培地で懸濁し、適するウイルスを適当な期間で（例、５
−16時間）106細胞に対して約200血球凝集ユニットの濃
度になるように添加（例、ニューカッスル病ウイルス）
して、誘発させる。誘発細胞が十分な滴定量（力価）
で、IFNを生成したらすぐに、細胞は採取し、そして更
に下記載のように処理する。IFN活性はたとえばアーム
ストロング（29）によって考案された色素‐吸収法によ
って測定する。
ｂ）誘発細胞の破壊 核酸分離における第一段階は、細胞破壊物からなる成分
からの分離、混合している蛋白を除去することである。
細胞破壊に用いられる方法は、くり返して凍結および解
凍することおよび、機械的な破壊、たとえばガラス‐ホ
モゲナイザーでモーターつきのテフロン棒でホモゲナイ
ズすること、浸透圧によって破壊させること、超音波に
よる破壊、およびアニオン浄化剤のような溶菌化できる
化学剤、たとえば硫酸ドデシルナトリウム（SDS）硫酸
ドデシルリチウム、4-アミノサリチル酸ナトリウム、サ
ルコシンドデシルナトリウム、またはトリ‐イソプロピ
ルナフタレンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。ある
場合には、アニオン浄化剤の適用は蛋白‐複合体から核
酸を部分的に遊離するおよび部分的にRNAse活性を抑制
する結果となり得る。好ましくは、操作は高濃度の浄化
剤でおよび、核酸特に最小限度の分解であるRNAの完全
な遊離を達成するために簡単な露出期間で行なう。
好都合に、誘発細胞は適当なアニオン浄化剤（例、硫酸
ドデシルナトリウム）を慣例的な緩衝液（例、TNE）中
で、作用させ溶菌化する。簡単な露出期間後、懸濁液
は、ｃ項記載のように脱蛋白剤と処理する。
ｃ）蛋白、リポ蛋白、DNAsおよび異種のRNAsの混同物か
らのリンパ芽球ポリ（Ａ）RNAの分離 得られた核酸混合物の脱蛋白は、化学剤、たとえば１−
４％1-ペンタノールを含むクロロホルム、または特にフ
ェノール、の作用によって達成し得る。蛋白はたとえば
プロナーゼもしくはプロテアーゼｐ、いかなる蛋白もア
ミノ酸にほとんど分解しうるプロテアーゼによる分解に
よっても除去し得る。蛋白を完全に除去するために２つ
の化学脱蛋白剤、フェノールとクロロホルム、もしくは
プロテアーゼ処理後、続いて化学脱蛋白剤、（例、フェ
ノール）で処理するような組み合わせで行なっても良
い。
特に、核酸混合物の脱蛋白は、プロテアーゼ（例、プロ
ナーゼ）と培養し、得られた混合物をフェノールで、次
いでクロロホルムで抽出をくり返す。フェノール系を適
用すると、すべての変性した、かつ分解した蛋白はフェ
ノール相および中間相に移る。
ポリ（Ａ）RNA回収のためにこの段階および続く次の段
階は放射能活性のあるラベルしたマーカーmRNA（例、
125I‐グロビンmRNA）の少量を加えることによってmRNA
分解のための制御することができる。
精製したデオキシリボヌクレアーゼ（RNAaseを含まな
い）は混同したDNAを分解するために用いられる。
必要に応じて、RNAはCsClグラジエントにおける平衡遠
心によって、DNAと混同することなく得られる。更に、R
NAはクロマトグラフィー（例、ヒドロキシ燐灰石カラム
クロマトグラフィ）によってDNAから分離することがで
きる。
純粋な溶液中に存在しているmRNAは、他のRNA種、
（例、tRNAもくはrRNA）から、その３′‐末端でアデノ
シンヌクレチドの長い非‐中断排列（100−200残基長
さ）によって異なる。ポリ（Ａ）鎖は、常法、たとえば
オリゴ（dT）セルロースもしくは（Ｕ）セファロースへ
のくり返しのバッチ吸収、によって、mRNAを選択するこ
とが利用される。結合したポリ（Ａ）RNAは、次いで、
弱いイオン強度で溶液（例、水）の数回の洗浄で溶出さ
れる。
たとえば誘発細胞（段階1b）のプロテアーゼ溶解化後、
得られた核酸混合物からなるポリ（Ａ）RNAの分離の好
ましい具体化は、変性した、および分解した蛋白を除去
のために、フェノール次いでクロロホルムで抽出し、得
られた溶液をオリゴ（dT）セルロースクロマトグラフィ
ーにかけ、結合したポリ（Ａ）RNAを水で溶出する。所
望ならばまたは必要に応じて、オリゴ（dT）セルロース
への吸収を数回くり返す。
この段階でポリ（Ａ）RNAは、イン．ビドロ．翻訳系
（例、レティキュロサイト翻訳系、セツプスラエビス）
におけるHuIFN活性を示すポリペプチドの合成効力を直
接に測定することができる。IFN特異性ポリペプチドは
放射線免疫検査または特に細胞病理生物検査を用いて同
定できる。この目的のために、回収したポリ（Ａ）RNA
を適当な溶媒、たとえば水、希釈した（例1mM）EDTA溶
液または慣例上の緩衝液に溶解し、コルマンら、（30）
に従って、アフリカン．クロー．トード（ゼノプスラエ
ビス）の卵母細胞にマイクロー注入をする。卵母細胞に
おいて生成したIFNは細胞病理生物検査たとえばアーム
ストロング（29）による色素‐結合分析の使用によって
またはスチュワートら、（31）による適する攻撃ウイル
スたとえば小水疱性口内炎ウイルス（VSV）をヒト細胞
系統、たとえばCCL-23細胞またはHep-2細胞への適用に
基づく細胞病理効果の減少を用いて測定する。所望なら
ばここで記載の操作のいかなる段階でも、いかなる精製
形態で分離されたもしくは対応するDNAから誘導された
（例、二重鎖cDNA）RNAのHuIFmRNA活性は、上記載のい
ずれかの検査方法によって測定できる。
（ｄ）LyIFN特異性mRNAのための濃縮 他と混同しているRNA種、たとえばtRNA,rRNAまたはDNA
（1c項参照）の除去後、0.5mM−1mMEDTA中のポリ（Ａ）
RNA溶液は、フェノールでの付加的抽出によっておよび
二価カチオンを除去するためにキレックス（Chelex）カ
ラムを通すことによって精製する。
リンパ芽球HuIFNmRNAのためのポリ（Ａ）RNA画分の濃縮
は、文献から知られているいろいろの方法によって達成
し得る。本質的に合体した単一mRNA種の異なる分子量の
大きさに基づく。
大きさに基づくポリ（Ａ）RNAの画分は、たとえばデキ
ストラン誘導体またはポリアクリルアミドのカラムゲル
ろ過、その場合、ゲル粒子中により小さい分子はいろい
ろの程度で入りこみ、大きい分子はとどまることなく容
易に通過することによって得ることができる。更にポリ
（Ａ）RNA種の混合物は、ポリアクリルアミド、澱粉ま
たはアガロースゲルのゾーン電気泳動によって分画する
ことができる。ポリ（Ａ）RNAは５−23％のシュクロー
ス溶液をグレディエントとしてのシュクースデンシティ
グレディエント（糖密度勾配）を用いての遠心によって
沈降速度に基づいて分離する。
たとえば、ポリ（Ａ）RNA混合物の画分は、次のように
して得られる。他の混同したDNAおよびRNA種から遊離し
たポリ（Ａ）RNA溶液は、ごく少量のEDTAを含む慣例上
の緩衝液中のシュクロース、デンシティグレディエント
（例、５−23％）を用いての遠心によって、大きさに基
づいて分画する。画分は集め、前記載（1c項）のように
IFNmRNA活性の測定をする。最も高いIFNmRNA活性を示す
画分は、合わせてオリゴ（dT）セルロースまたはポリ
（Ｕ）セファロースカラムにかける。HuLyIFNmRNAのた
めにかなり濃厚である結合したポリ（Ａ）RNAは水で溶
出され、そしてエタノールで沈澱する。
この段階で、HuLyIFNmRNA活性を、再度、前気載の方法
（1c項参照）によって測定する。一般的に、シュクロー
ス、グレディエント遠心でHuLyIFNmRNA10−20倍濃縮し
た結果を得ることができる。
2.HuLyIFNdscDNAを含むリンパ芽球二重鎖cDNAの製造 前記載（1d項）のように得られたHuLyIFNmRNAのために
濃縮されたポリ（Ａ）RNAは、二重鎖cDNAを得るための
テンプレートとして用いることができる。この転換は、
単一鎖cDNAの製造第二のDNA鎖の合成および第一段階で
生じた終末端の“ヘアーピンhair pin"構造の分解を含
む。
a.単一鎖cDNAの製造 前記載（1d項）のポリ（Ａ）RNAに相補性を示す（Ａ）
一本鎖DNAは、該RNAの送転写によって製造することがで
きる。合成はRNA-依存性DNAポリメラーゼ（リバースト
ランスクリプターゼ）、たとえば鳥類の骨髄芽球ウイル
ス（AMV）によって触媒される。AMVリバーストランスク
リプターゼは一本鎖RNA上のDNA合成を開始しない。RNA
テンプレート鎖をもつ塩基‐対合である遊離３′‐水酸
基をもつプライマーを必要とするDNAポリメラーゼと同
様である。というのはポリ（Ａ）末端はmRNAsの３′‐
終末に付着し、好ましくは、たとえばプライマーとして
オリゴデオキシチミジレート〔オリゴ（dT）〕またはポ
リ（Ｕ）を用いる。排列情報が役に立つ場合、興味ある
遺伝子のために選択的にcDNA合成を前もって行なうこと
が可能である。
たとえば、一本鎖cDNAの合成は次のように行なわれる。
前記載のように分離され、精製されたポリ（Ａ）RNA
は、慣例上の緩衝液中でプライマー、たとえばオリゴ
（dT）、マグネシウム塩（例、塩化マグネシウム）、メ
ルカプトン、ジチオスレイトール（DTT）、dATP、dGT
P、dCTP、dTTPおよびAMVリバーストランスクリプターゼ
と混合し、反応させる。好ましくは、デオキシヌクレオ
シドトリホスフェートの高濃度は、実物大模写の合成を
うながすために選択される。続いての一本鎖cDNAの精製
段階は、用いられる４つのデオキシヌクレオシドトリホ
スフェートの１つが32Pでラベルされている場合、容易
に行なうことができる。反応はたとえばEDTAおよびSDS
を含む阻害の混合物の添加によって停止する。反応の停
止後、生成物はたとえば、フェノールおよびクロロホル
ムでの溶液の抽出によって脱タンパクし、次いで、塩お
よび取り込まれないデオキシヌクレオシドトリホスフェ
ートを除くためにセファデックスカラムでクロマト処理
する。合成されたcDNA（デオキシヌクレオシドトリホス
フェートの一つが32Pでラベルされたのが提供され、用
いられる画分の同定は、容易にセレンコフ放射線によっ
て達成できる）を含む画分はプールし、核酸（RNAおよ
びcDNA）は、たとえばエタノールによる沈澱によって分
離する。テンプレートRNAはリボヌクレアーゼたとえばR
NAseAまたはRNAseT1もしくは好ましくは、たとえば水酸
化ナトリウムのようなアルカリ加水分解によって、除去
する。残りのcDNAの大きさは、アルカリアガロースゲル
もしくは知られた長さのマーカーDNAs（例、32）を用い
て適切なポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動移動
度から測定できる。
ｂ）二重鎖cDNAの製造 前記載のように製造された一本鎖cDNAは３′‐終末端
“ヘアーピン”構造を有する。この“ヘアーピン”構造
は、続いての第二のDNA鎖の合成のために、cDNAセルフ
‐プライミング（self-priming）をする短二重鎖領域を
構成する。従って付加的なプライマーは必要としない。
二重鎖cDNAは、RNA-依存性DNA-ポリメラーゼ（例、AMV
リバース、トランスクリプターゼ）によって、一本鎖cD
NAの合成における前記載と同様の操作で（ポリ（Ａ）RN
Aを一本鎖cDNAによって置換しおよびプライマーを省く
ことを除いて）合成することができる。任意に、デオキ
シリボヌクレオチド前駆物質からDNAの合成を触媒する
他の酵素も同様に用いることができ、例としてT4DNAポ
リメラーゼ、E.coliDNAポリメラーゼ（クレノゥ断片）
または好ましくは、E.coliDNAポリメラーゼＩが挙げら
れる。
第二鎖の合成は、一本鎖cDNA、マグネシウム塩（例、塩
化マグネシウム）、メルカプタン．ジチオスレイトール
（DDT）、４つのデオキシヌクレオシドトリホスフェー
ト、（そのなかの１つは放射能的に、たとえば3Hでラベ
ルされた）、およびDNAポリメラーゼ（例、E.coliDNAポ
リメラーゼＩ）を含む緩衝液を用いて行なう。反応の停
止後、混合物の脱タンパク（2a項参照）し、DNAはエタ
ノールで沈澱させる。
得られたdsDNAは、２つのDNA鎖に関連する“ヘアーピ
ン”ループを含む。ループは、S1ヌクレアーゼで切断し
塩基‐対合終末端をもつds cDNAを得る。分解は緩衝混
合液中で、亜鉛塩（例、硫酸亜鉛）の存在下に、第二鎖
合成の生成物をS1ヌクレアーゼで処理することで行なわ
れる。分解はSDSおよびEDTAの添加によって停止するこ
とができる。フェノールで脱タンパク後、溶液はセファ
デックスカラムでクロマト処理する。ds cDNAを含む画
分（たとえば各々の画分をセレンコフ放射線を測定する
ことによって決定できる）はプールし、cDNAはエタノー
ルで沈澱させる。
好都合なことに、まだ多くの異種からなる合成されたds
cDNAは、更に、この段階で、実物大ds cDNAのために濃
縮化される。この目的のために適する方法としては、ゲ
ルろ過、ポリアクリルアミドもしくはアガロースゲルで
の電気泳動、またはシュクロース、グレディエントを用
いての遠心が挙げられる。既知分子量のDNA分子の補助
的電気泳動または遠心を行ない、期待されるIFNds cDNA
s（先に出版されたデータ:14,16,18,33によると、700−
1200塩基‐対合である）の分子量を所有するds cDNA分
子の局在化を可能にする。
たとえば、慣例上の緩衝溶媒中に溶解したds cDNAをシ
ュクロースグレディエント（例、５−23％）を用いての
遠心にかける。適するマーカーDNAより早く沈降するDNA
種を平行してグレディエント（例、700−800塩基対台マ
ーカー）にかけ、分離する。
3.HuLyIFNds cDNAのために濃縮したds cDNAのクローニ
ング a.一般的な考慮 前記載のように（2b項）得られたds cDNAのクローニン
グは、既知の方法によってできる。操作には、ds cDNA
を適当なベクトルDNAに会合させ、および複製すること
ができる適当なホスト細胞中に得られる組み換えDNAを
転移する（形質転換）ことを含む。
ベクトルDNAは、ホスト細胞に転移する場合、その自己
複製を確実にする遺伝的機能を含むDNA分子である。更
に、プラスミド‐運搬ホスト細胞（形質転換体）を細胞
の大集団、その大部分はプラスミドを含まない細胞から
選択されることによる遺伝子を含むベクトルDNAが望ま
しい。遺伝子工学で通常用いられるベクトルDNAsの例
は、実験的にds cDNAが付着しうるバクテリオファージ
の環状プラスミドDNAおよびDNAであり、例として、バク
テリオファージ入の誘導体、特にプラスミドcolE1また
はその誘導体、たとえばpMB9,pSF2124,pBR317および特
にpBR322が挙げられる。記載のプラスミドはアンピシリ
ン抵抗性（不応性）および部分的にテトラサイクリン抵
抗性に対する遺伝子を有する。従ってこのようなプラス
ミドを含むホスト細胞は、親（ｐ）ホストから形質転換
体を分離できうる表現型を示す。
たとえば組み換えDNA分子を得るために、好適なプラス
ミド（例、pBR322）を開裂し、ds cDNAを線状プラスミ
ド中に挿入し、環を再閉して挿入したds cDNA断片から
なる増補した組み換えプラスミド分子形成する。好都合
なことに、プラスミドDNAは限定された位置で開裂す
る。この目的のために、制限エンドヌクレアーゼの多数
は、有効であり、それには特異性DNA排列を認めること
ができる。いくつかの制限エンドヌクレアーゼは、両DN
A鎖を同一点で開裂し、“ブラント”終末端を生ずる。
他の制限エンドヌクレアーゼは、二、三のヌクレオチド
によって、お互いから分離される結合の開裂を触媒し、
開裂された遊離の一本鎖領域で分子の各々の終末端
（“スタガード”末端）を生ずる。
DNA断片は、通常一本鎖結合力のある終末端で会合し、D
NAリガーゼ（例、T4DNAリガーゼ）によって、共有結合
的に閉じられる。相補性末端は、二つの限定した方法に
おいて：“スタガード”切断をするおよび結合力のある
末端生成する制限酵素による開裂または制限された一本
鎖排列の添加（例、ホモポリメリック末端）によって行
なわれる。任意に、十分に塩基‐対合したDNA-重複、ブ
ラント‐終末端は、T4リガーゼによって会合され得る。
たとえばプラスミド（例、pBR322）は適する制限エンド
ヌクレアーゼ（例、Pst1）によって開裂され、線状プラ
スミドおよび挿入されうるds cDNAは、各々適当な酵素
（例、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラー
ゼ）の存在下に、一本鎖ホモポリメリック末端ともに延
長する。たとえばポリ（dC）末端は、１方のDNA製造に
加えることができ、ポリ（dG）末端は他（任意にdAおよ
びdT末端は同じく選択できる）に加えることができる。
DNAの二つの型はそれらの相補性末端を通じて会合され
うる。
有用なホストとして、たとえば酵母、特に形質転換に可
能な細菌、および制限酵素および修復（修正）酵素を欠
く細菌たとえば大腸菌株（例、E.coliX1776,E.coliHB10
1）または枯草菌系統〔例、バシルスステアロサーモフ
ィラス（Bacillus stearothermophilus）、プソイドモ
ナス（Pseudomonas）、ヘモフィルス（Haemophilus）、
ストレプコッカス（Streptococcus）および他の細菌〕
およびその突然変異体が挙げられる。
前記載のように製造された組み換えDNA分子は、通常の
たとえばホスト細胞のCa++前処理を含む形質転換操作に
よって、適するホスト細胞に転移することができる。ホ
スト細胞への表現型特性〔例、テトラサイクリン抵抗性
（不応性）〕を授けられている組み換えプラスミドDNA
を含む細胞は、アガロースプレート上の選択的（例、テ
トラサイクリン‐含有）栄養培地における平板培養によ
って選択される。
本発明において、好ましいベクトルDNAはプラスミドpBR
322であり、それは適当な制限エンドヌクレアーゼ、と
くにPstIによる開裂後、相補性ホモポリメリック末端、
特にdG:dC-末端を経てds cDNAに結鎖する。得られた組
み換えDNAは、E.ColiHB101に転移する。
前記載に基づくds cDNA合成経路を経て製造されたIFN遺
伝子のかわりに、対応するクロマトゾームDNAは、同様
にIFN活性をもつポリペプチド生成可能なクローンの製
造のために用いられる。
クロマトゾームDNAは、ナマルワ細胞のようなヒトリン
パ芽球細胞から、当該分野において既知の方法、たとえ
ば全クロマトゾームDNAのAlu Iによる部分的な開裂およ
び得られた断片のλカロン4Aアーム（λCharon 4A arm
s）に連結するEcoRIによる会合するかまたは制限酵素
（例.Kpn IまたはHind III）によるクロマトゾームDNA
の開裂によっておよび得られた断片をプラスミドpBR322
またはコスミド（cosmid）DNAのようなベクトルDNAに連
結することによって得られる。組み換えベクトルDNAは
E.coliのようなホストに形質転換することができる。ク
ロマトゾームIFNαおよびβ遺伝子を含むコロニーはコ
ロニー交雑によって、（4a章参照）放射能でラベルした
合成オリゴデオキシヌクレオチドもしくは放射能でラベ
ルしたαおよびβ特異性IFN cDNAを試験材料として、使
用することによって同定される。サブ‐フラグメント
（断片）は、適当なエンドヌクレアーゼによる同定され
た断片を制限することによってもしくはそれらを適当な
エキソヌクレアーゼで分解することによって得られる。
従って、本発明は、ヒトリンパ芽球細胞もしくは断片か
ら誘導されたDNA配列を含むDNA変種または、インターフ
ェロン‐様ポリペプチドのためのコード化の該配列の突
然変異体まやは該DNAに交雑するDNAの製造方法に関する
ものであり、次の過程を含む。
（１）HuLyIFN-mRNAから一本鎖相補性DNAを製造する、
必要に応じてそこから二本鎖cDNAまたは （２）ヒトリンパ芽球細胞のクロマトゾームDNAの部分
的開裂、およびクロマトゾームLyIFN遺伝子を含む断片
の選択、該配列の断片が必要な場合、該DNAを適当なエ
ンドヌクレアーゼで限定し、または該DNAを適当なエキ
ソヌクレアーゼで部分的に分解しまたは組み換えDNAが
必要な場合、適当なベクトルDNAに該DNAを導入する。
b.線状（棒状）、デオキシヌクレオチド‐延長したpBR3
22の製造 本発明に係る好ましいベクトル、プラスミドpBR322は43
61塩基一対からなる小さなプラスミドである。細菌受容
体細胞で各々アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗
性（不応性）を授けられる２つの遺伝子（ampr，terr）
を含む、そしてそれは形質転換した細胞の選択および同
定のために用いられる。pBR322内には、いくつかの限定
位置が存在する。単一Pst I位置はampr遺伝子内にな
り、一方sole BamH I,Hind IIIおよびSal I位置はterr
遺伝子内にある。単一EcoRI位置はどこにでも存在する
（34）。異名ん制限エンドヌクレアーゼの一つを適当す
る場合、ampr遺伝子またはterr遺伝子のどちらかまたは
両方の遺伝子はそのまま残る。従って例証された酵素の
どちらかが開裂およびpBR322の線状化に適する。
プラスミドpBR322を線状化の後、デオキシヌクレオチド
鎖は終末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
の存在下に両３′‐末端に加えられ得る。好ましくは、
約20-50デオキシヌクレオチド残余体を相補性デオキシ
ヌクレオチド鎖によって延長したds cDNAに、安定な結
合を確実にするために加える。
たとえばプラスミドpBR322を、塩化マグネシウム、メル
カプタン（例.2-メルカプトエタノール）および担体タ
ンパク源（牛血清アルブミン、ゲラチン）を含む適当に
緩衝化した水溶液で、付加的に制限エンドヌクレアーゼ
（例.Pst I）とともに処理する。分解が終了した後、溶
液は、たとえばフェノールで脱タンパクする。デオキシ
ヌクレオチジル残余体の最終的な添加を、塩化マグネシ
ウム、カコジルナトリウムおよび担体タンパク（例．牛
血清アルブミン）を含む慣例上の緩衝液系において、デ
オキシヌクレオシドトリホスフェートの十分な量（例、
dGTP）および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェ
ラーゼとともに処理する。
c.デオキシヌクレオチド‐延長したds cDNAの製造 前記載のように（2b項）得られたds cDNAの延長は、相
補性デオキシヌクレオシドトリホスフェート（例、dGTP
の代りにdCTP）を用いて、好ましくは塩化マグネシウム
の代りに塩化コバルトを用いての線状のデオキシヌクレ
オチド‐延長したプラスミドpBR322（3b項参照）の合成
のように同様の方法で行なう。
たとえばds cDNAはカコジルナトリウム、塩化コバル
ト、タンパク（例、牛血清アルブミン）、対応するデオ
キシヌクレオシドトリホスフェート（例、dCTP）および
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む
緩衝液で培養する。
d.線項の、鎖‐延長したpBR322および鎖‐延長したds c
DNAのアニール化 線状の、鎖‐延長したプラスミドpBR322および鎖‐延長
したds cDNAはアニール化でき、常法で、すなわち相補
性デオキシヌクレオチド鎖の塩基‐対合によって再環状
化できる。
環生成の促進およびコンカトマー（concatomers）を妨
げる（異なる線状交雑プラスミドの結合）ために、反応
は両鎖‐延長したds cDNAおよび線状pBR322分子の低濃
度で行なわなければならない。
たとえば、デオキシヌクレオチド‐延長した（例、dCMP
-延長した）ds cDNAおよび線状のデオキシヌクレオチド
‐延長した（例.dGMP-延長した）pBR322の混合物は、４
連続1h段階で異なった温度（例.65℃,46℃,37℃および2
0℃）で培養する。アニール化したDNAは、適合した細菌
（例.E.coliHB101）への形質転換のために直接用いるこ
とができる。
この点において、アニール化操作（方法）による生成物
は、組み換えDNA分子を含み、その中でごく2,3がHuLyIF
Nに関連しており、なぜならば組み換えの大部分がLyIFN
mRNAよりも他のmRNAから誘導されたcDNA挿入体を含む。
e.アニール化した交雑プラスミドを用いてのE.coliHB10
1の形質転換 得られたアニール化交雑プラスミドは、E.coliHB101の
形質転換に用いることができる。プラスミドは細胞内で
複製され、プラスミド複製体は、細胞分裂の際娘‐細胞
に配分される。アニール化交雑プラスミドでのE.coliHB
101の形質転換は、文献に記載の既知の方法で行なう。
この操作にはDNAの利用（摂取）（DNA uptake）をさせ
る〔例．（35）〕と同様に細胞のCa++‐前処理および交
雑プラスミドとの培養を含む。次いで細胞は、親細胞か
ら形質転換した細胞の分離をする選択的増殖培地へ転移
する。なぜなら、交雑プラスミドはterr遺伝子を含み、
成長阻害物質として、テトラサイクリンを含むアガール
（寒天）培地は好都合に選択される。たとえば交雑プラ
スミドおよびCa++で前処理したE.coliHB101細胞をCa++
塩（例．塩化カルシウム）およびMg++塩（例．塩化マグ
ネシウム）を含む緩衝液で培養する。十分な培養時間
（例.10−40分）後、細菌を熱‐パルス（35-42℃）に、
短時間（1-5分）かけ、細胞は冷却し、たとえばトリプ
トン・アガール、またはマックコンケイ・アガールで、
テトラサイクリンの十分量で補足した寒天培地で平板培
養する。このような培地で生き残った細胞は再環状プラ
スミドもしくは交雑プラスミドDNAを含む。従って増殖
したコロニーは、通常なクローンのためにスクリーンす
るために用いられる。
4.リンパ芽球IFNcDNAを含むクローンの同定 a.LyIFNcDNAを含むクローンの同定のために適する方法 特異遺伝子を含むコロニーはいろいろの方法によって同
定することができ、たとえば一方ではRNA選択交雑、特
異交雑、合成検体での交雑によって同定することがで
き、または他方では特別な遺伝生成物を生成するクロー
ンは、免疫学的または生物学的（分析）検査によって同
定できる。
一方免疫学的または生物学的アプローチは、免疫学的ま
たは生物学的に検出不可能な遺伝生成物の生成により、
初めの一連の方法は、基本的に、非−特異性交雑生成を
妨げるために、十分に精製された条件下にある適当な検
体の入手可能性に依存している。適する検体は望ましい
もしくは対応するcDNAに相補的なmRNAである。
ヒト白血球および線維芽細胞IFNを含む細菌クローンの
ためのスクリーニングに関するいくつかのアプローチは
知られている。たとえばゴエデルら、（13）およびスガ
ノら、（16）は、IFN遺伝子を二つの交雑セットの視覚
的比較によって同定する。第一のセットは、プライマー
として合成デオキシアンデカヌクレオチド（ゴエダル）
またはオリゴ（dT）（スガノ）およびラベル剤として32
P−ラベルしたCTPを用いて、誘発細胞から得られたmRNA
混合物の逆転写によって合成された放射性cDNAと交雑化
する。第二のセットは、未誘発細胞から得られたmRNA混
合物から同様の操作で生成された放射能cDNAと交雑化す
る。この操作は、示めされたデータからは明らかなよう
に、特異性および再現性を欠くことに特徴がある。ワイ
スマンによって報告された他のアプローチは、RNA選択
交雑操作を用いており、望ましいクーロンのために、根
気のいる、困難な、多くの段階の探索からなる。
記載の方法は、LyIFN−αおよびLyIFN−β遺伝子の分離
のための本発明の目的に適用することはできない、理由
はIFN−βの濃度はヒトLyIFNにおけるIFN−αの約10％
に相当するからである。この少量はそれらの方法の検出
限界下にある。
この発明に関する当該分野の不満足なアプローチの結果
として、新規の方法が開発され、IFN−αおよびIFN−β
mRNAsに相補的な５′−末端ラベル化したオリゴデオキ
シヌクレオチドの合成、プライマーとして、該オリゴデ
オキシヌクレオチドを用いてLyIFNmRNAのために濃縮さ
れたポリ（Ａ）RNAの逆転写およびイン・シトウでのラ
ベルしたcDNA検体を用いてのフィルター−結合プラスミ
ドDNAsのコロニー交雑化からなる。このアプローチは、
合成されたプライマーオリゴデオキシヌクレオチドの塩
基配列を含むIFN−αおよび−β遺伝子の特異的、迅速
なおよび直接の検出を可能にし、先行当該分野記載のよ
うに、更に厄介な交雑−翻訳分析（検査）をする必要が
ない。イン・シトウでのコロニー交雑は、グルンスタイ
ンとホッグネス（36）によって報告された方法もしくは
その変形に基づいている。この操作において、コロニー
は増殖し、またはニトロセルロースフィルターに転移
し、アルカリ処理によって溶菌化し、イン・シトウでフ
ィルターに固定する。望ましい遺伝子に相補的な放射能
ラベルした核酸の検体を、順次にフィルター結合DNAに
交雑化する。交雑化した検体はオートラジオグラフで検
出することができ、交雑化されうるDNAを含む対応する
コロニーは、ニトロセルロースフィルターの参照セット
から分離することができる。
クローン化したヒトIFN−αおよびIFN−βのcDNAsの伸
長コード化の比較は、両方cDNAs（および、自明に対応
するmRNAs）は共通である13ヌクレオチドの伸長を示め
す（23）。従って、上記載の隣接塩基配列をもつ合成、
13−merオリゴデオキシヌクレオチドは、ヒトリンパ芽
球IFN−αおよびIFN−βmRNAからcDNA合成のプライム化
のために用いることができる。
b.32P−ラベル化したヒトIFN−αおよびIFN−β特異性c
DNA検体の製造 与えられた構造のオリゴデオキシヌクレオチド（37）を
合成するために、いくつかの証明されたアプローチがあ
る。たとえばオリゴデオキシヌクレオチド合成は化学的
方法、たとえばジエステルまたはトリエステル法によっ
て影響される。ジエステル法の基礎的な段階はホスホジ
エステル結合を含むジデオキシヌクレオチド生成のため
に、二つの適する保護されたジオキシヌクレオチドの連
結をすることである。トリエステル法はトリエステル法
から区別され、有機溶媒にデオキシヌクレオチドおよび
オリゴデオキシヌクレオチドを可溶にするリン酸基から
生ずる付加的有機保護基の存在下に行なう。任意に、合
成はポリヌクレオチドホスホリラーゼを用いて酵素的に
行ない、その際、制御された条件下に、優位に単一デオ
キシヌクレオチドを短オリゴデオキシヌクレオチドに加
える。反応は溶液中または最近、高度に完成された固体
相技術（手段）で行なうことができる。
たとえば式５′−CCTTCTGGAACTG−３′ のヒトIFN−αおよびIFN−βmRAに相補的な、13−merオ
リゴデオキシヌクレオチドの合成は、出発物質として保
護されたモノ−，ジ−，およびトリデオキシヌクレオチ
ドを用いるイタクラ（38）およびデロ−イジイ（39）に
よって報告されたように、トリエステル−法によって行
なうことができる。操作（方法）の単一段階はジヌクレ
オチドの合成を示めした次の図式 （式中、R1，R2およびR3は保護基であり、dNおよびdN′
はプリンもしくはピリミジン塩基であり、condは縮合剤
である） で表わされる。
本合成に用いられる出発物質（保護されたまたは部分的
に保護されたモノ−、ジ−、またはトリデオキシヌクレ
オチド）は文献記載から知られている。好都合に、ヌク
レオチド３′−５′−連結の開裂なしに緩和な条件下に
継続的に除去することができるような保護基を選択す
る。適する保護基R1は、たとえばモノメトキシトリチル
基またはジメトキシトリチル基であり、R2は、たとえば
２−クロロフェニル基、およびR3は、たとえば２−シア
ノエチル基である。
アデニン、グアニンおよびシトシン残基における環外の
アミノ機能は、特にアシル基、たとえばベンゾイル基ま
たはイソブチリル基によって保護される。縮合剤とし
て、たとえば2,4,6−トリイソプロピルベンゼンスルフ
ォン酸が用いられる。中間化合物における単一保護基
（例R3，R1およびR2）の特別の除去および十分に保護さ
れた13−merオリゴデオキシヌクレオチドの脱解離（脱
遮断）は、既知の方法によって行なわれる。たとえば２
−シアノエチル基R3はアルカリ処理によって除去でき、
モノメトキシトリチル基R1は80％酢酸処理によって除去
でき、２−クロロフェニル基R2はテトラブチルアンモニ
ウムフルオライド処理によって除去できる。当該分野で
知られている他の方法も、同じく用いることができる。
合成の各各の段階は図２で示めす。
製造された13−merオリゴデオキシヌクレオチドプライ
マーは、常法のクロマトグラフイ法たとえばDEAE−セフ
ァデックスクロマトグラフイまたは／および高度液体ク
ロマトグラフイー（HPLC）によって精製する。プライマ
ーは継続の交雑操作における交雑検体の検出を可能にせ
しめる５′−32P−ラベル化されている。ラベル化は、
ラベル化したリン酸化剤、たとえば〔ｒ−32P〕で合成
されたプライマーと常法で用いられる緩衝混合液におけ
るT4ポリヌクレオチドキナーゼと反応させることによっ
てなされる。32P−ラベルしたプライマーを含む得られ
た溶液は脱タンパク（例．フェノール）、クロマト処理
（例．セファデックスクロマトグラフイーまたはポリア
クリルアミドゲル電気泳動）によって精製する。
LyIFNmRNAのために濃縮したポリ（Ａ）RNA（段階1d参
照）は次のようにIFN−αおよびIFN−β特異性cDNA検体
の合成のためにテンプレートとして用いる:cDNA合成
は、５′−ラベルした合成オリゴデオキシヌクレオチド
をオリゴ（dT）の代りにプライマーとして用いることを
のぞいて、前記載（段階2a）のように同様の操作でもた
らされる。ラベルしたcDNA生成物は、たとえばフェノー
ルで脱タンパクし、エタノールでの沈澱によって集め
る。更に精製は、たとえばcDNA生成物のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって行なうことができる。生成物
は、オートラジオグラフで目に見えるようにすることが
できる。
誘発細胞からのポリ（Ａ）RNAに特異的でありおよび非
誘発細胞からのポリ（Ａ）RNAの使用によって得られた
生成物に存在しない単一DNA帯は、ゲルから抽出され
る。その大きさは、たとえば既知の長さのラベルしたマ
ーカーDNAsとの関係における相対的移動度から決定す
る。生成物は、32P−ラベルしたヒトLyIFN−αおよび−
β特異cDNA実験材料（検体）である。
c.リンパ芽球IFNcDNAを含むクローンのためのスクリー
ニング テトラサイクリンで補足した寒天培地（3e項参照）で生
き残りそして増殖したコロニーを、リンパ芽球IFNcDNA
を含むクローンのためにスクリーンする（ふるい分け
る）。この目的のために、イン・シトウでコロニー交雑
操作は、前記載のように選択する（4a項）。形質転換コ
ロニーは、ニトロセルロースフィルターに転移し、およ
びそれらのコロニーの引例のセットは、付加的寒天プレ
ートにレプリカ平板培養によって得られる。フィルター
上のコロニーは、溶菌化され、DNAは変性し、イン・シ
トウでフィルターに固定する（36）。
交雑操作前に、フィルター上に変性DNAは、低いバック
グラントを得、および非−特異性交雑位置を飽和するた
めに、たとえば異由来のDNAを含む混合物で、有利に前
−交雑化する。続いて、前記載のように製造した（4b
項）放射能ラベルしたcDNA検体を鉱油でカバーしたフィ
ルター結合DNAに交雑化する。フィルターから鉱油およ
び他の混合物（汚染物質）を除いた後、交雑化の結果
は、Ｘ−線フィルム上のオートラジオグラフ分析によっ
てモニターすることができる。コロニーは、Ｘ線露出に
陽性（＋）反応を示めし、引例セットから見分けること
ができ、更に研究のために用いることができる。
好ましくは、形質転換コロニーの１部分はニトロセルロ
ースフィルターに転移する。残りのコロニーは、更に下
記に詳細に記載のスクリーンニング操作に用いられる
（4d項）。たとえば、ニトロセルロースフィルターに固
定したDNAは、変性DNA、たとえば変性こうし−胸腺DN
A、牛血清アルブミン、フィコールおよびポリビニルピ
ロリドンを含む常法の前−交雑混合液で処理し、次いで
標準交雑操作を用いてのパラフィン油のもとで放射能ラ
ベルしたcDNA検体（4b項参照）で交雑化する（36）。交
雑が終了した後、フィルターは、連続的にパラフィン油
および未−交雑cDNAを除去するために、クロロホルムお
よびSDSおよび低い塩を含む緩衝液で洗浄する。フィル
ターは、オートラジオグラフィーのためにＸ線フィルム
に露光させる。交雑コロニーは、陽性（＋）反応を示め
し引例セットから見分けることができる。
同定したコロニーは、cDNA検体に相補的な挿入体を有す
る組み換えDNAsすなわち、ヒトリンパ芽球遺伝子または
その断片に対応するDNA断片を含む。時折一種以上の組
み換えDNA分子、交雑プラスミドDNAを含む形質転換した
細胞の第一のクローンは、陽性に交雑化したクローンか
ら分離され、前記載（3e項）のようにE.coli HB 101の
再形質転換のために用いる。交雑プラスミドDNAsは、た
とえば、次の方法によって分離される。初めに、同定さ
れた各々のコロニーは適当な栄養培地、たとえばトリプ
トン培地、いかなるプラスミドも含まない混同（汚染）
細胞を除去するためにテトラサイクリンの存在下に培養
する。生き残りの細胞を採収し、慣例上の緩衝系に溶解
し、細胞外膜内にクロモゾゾームが残るように緩和な条
件で破壊する。この過程には、たとえばリゾチーム、ED
TAおよび非イオン性浄化剤（例．トリトン）の連続的添
加が含まれる。細胞破片物、およびクロマトゾームDNA
は遠心によって分離される。上澄液は脱タンパクし
（例．フェノール）、RNAはRNAse（例.RNAseA）で分解
する。交雑プラスミドDNAは、ポリエチレングリコール
による沈澱によってRNA断片から分離され、エタノール
による再沈澱によって精製される。
この段階で、各々分離された交雑DNAの開裂パターン
は、適当な制限エンドヌクレアーゼによる開裂によって
決定することができ、この酵素は特にds cDNAが挿入（3
b項参照）される位置で、pBR 322を線状化するために用
いる。制限断片の大きさは、たとえば既知の長さのマー
カーDNAsに関連して、アガロースゲルにおける電気泳動
移動度から測定される。
分離された交雑DNAsの各々は、E.coli HB 101へ再形質
転換し、テトラサイクリンを含む適当な寒天培地（3e項
参照）で増殖される。各々の再形質転換から、いくつか
のクローンを見分け、各々のクローンの交雑プラスミド
DNAsを再度、制限分析をし、cDNA挿入体の完全なまたは
部分的なヌクレオチド排列分析を、更に進行（処置）の
ために適する交雑DNAsの選択のために行なう。更に、部
分的な排列分析は、挿入されたIFNcDNA断片がヒトリン
パ芽球IFN−αまたは−β遺伝子に対応するかどうか明
らかにする。
現在までに、いくつかの迅速法は、DNA分子配列化のた
めに有効である。主要な合成法で、特にサンガー（40）
によって開発された方法は、プライマーとして、制限エ
ンドヌクレアーゼ分解によって生成した放射能でラベル
したDNA断片を用いて、一本鎖DNAテンプレートの相補性
模写を正確に合成するDNAポリメラーゼの効力（能力）
を使用するものである。マックサムおよびジルバートら
（41）によって開発された任意の化学的DNA配列化法を
選択することも可能である。この方法において、配列化
されるDNAは、末端−ラベル化、特に４つの異なった反
応において４つの塩基の各々で開裂化し、生成物は、大
きさによって、たとえば変性する条件下でのゲル電気泳
動の手段で分画する。DNA配列は、放射性帯のパターン
から解読することができる。DNAの選択された伸長の完
全なヌクレオチド排列を決定するために、この領域のDN
Aを切断する制限エンドヌクレアーゼを必要とする。
マックサムとジルバートの方法により、切断から同方向
における100−150塩基までの配列は、一つの実験で解決
することができ得る。
たとえば、分離された交雑DNAsは、適する制限エンドヌ
クレアーゼ（例.Pst I,EcoR I,Bgl II,Pvu IIまたはAlu
I）で、cDNA挿入体内に起こる位置で、分解される。得
られたDNA断片は末端にたとえば〔ｒ−32P〕−ATPで、
ポリヌクレオチドキナーゼの存在下でラベルし、dsDNA
の一本鎖だけが末端にラベルされて残るように、第二の
制限エンドヌクレアーゼで開裂する。適当なDNA断片
は、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分離される。次いで、DNA断片をマックサムとジルバー
ト（41）によって報告された塩基−特異性開裂反応に処
する。生成物を電気泳動（例．ポリアクリルアミドゲ
ル）によって、変性する条件下に（例7M尿素）分画し、
DNA断片をオートラジオグラフで目で見分けることがで
きる。
d.リンパ芽球IFN cDNAを含む付加的クローンの同定前記
載のように（4c項）、形質転換コロニーの一部はニトロ
セルロースフィルターに転移し、その固定されたDNA
は、イン・シトゥで、検体として放射能でラベルしたcD
NA（例.IFN特異cDNA検体）を用いてのコロニー交雑化を
行なう。陽性の交雑化コロニーの組み換えDNAsは、同じ
くもしくは関連したDNA挿入体（例.IFNに関連した排
列）をもつ組み換えDNA分子を含む付加的なクローンの
ためのスクリーンに用いることができる。
この目的のために、最初のスクリーン操作（4c項）にお
いて得られた同定されたコロニーの各々のプラスミドDN
As（異なったIFN遺伝子または遺伝子断片に対応して）
は、前記載のように分離され、IFN cDNA挿入体もしくは
その一部分を含むプラスミド断片が得られるように制限
エンドヌクレアーゼで開裂する。これらのプラスミド断
片を５′−末端にラベルした後、適当なDNA断片（例．
放射能でラベルしたIFN挿入体もしくはその一部分）
を、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分離し、それらを単一にもしくは任意に、混合物として
用いることができる。交雑化のために、形質転換コロニ
ー（前記載）は、ニトロセルロースフィルターに転移
し、溶菌化する。それらのDNAは変性化し、イン・シト
ゥでフィルターに固定しグルンスタインとホッグネス
（36）の報告に基づいて、IFN特異性、放射能でラベル
したDNA断片と交雑する。交雑コロニーはオートラジオ
グラフィーで目で見ることができ引例セットから見分け
ることができる。
検体として、同一のもしくは類似のcDNA挿入体をもつ組
み換えDNA分子を含む同一コロニーを用いる。このスク
リーン操作によって、付加的クローンがリンパ芽球IFN
−αもしくは−βIFN遺伝子またはその断片を含むこと
を同定できる。各々同定したコロニーのプラスミドDNA
は分離でき、前記載（4c項）のように制限分析および部
分的排列分析によって特徴づけることができる。
5.HuLy IFN−特異性組み換えDNAsを含むE.coliによるHu
Ly IFN−様活性をもつポリペプチドの合成、 本発明に係るHuLy IFN cDNA挿入体は、pBR 322のPst I
位置に交雑を経て挿入される（前記載）。なぜならpBR
322のPst I位置は、β−ラクトア（ラクタ）マーゼ遺伝
子内にあり、cDNA挿入体を転写に関する特有な配向にお
ける位置、および翻訳に関する特有解読のフレームにお
ける位置に連結（開裂と、共役して結合）する際、癒合
（合着）したタンパクとなりうる。もし挿入されるcDNA
はそれ自体開始信号および／または停止信号をβ−ラク
トア（ラクタ）マーゼ配列をもつ相において有する場
合、開始および／または再開始は第二の開始信号で起こ
り、非−癒合（合着）タンパクが得られる。それにもか
かわらず、それらのクローンは重要であり、HuLy IFN c
DNAは存在するけれども、いかなるIFN活性も示さない。
この場合、cDNA挿入体は、分離され、望ましいポリペプ
チドの発現の高レベルを得るために、適当な様式で（７
項参照）発現対照領域に連結される。HuLy IFN cDNA挿
入体をもつ組み換えDNAを含むクローンは、常法によっ
てIFN活性のためのテストをすることができる。たとえ
ば、培養は十分な細胞密度に増殖されうる。細胞は採取
し、再懸濁し、溶菌化する（1b項参照）。無細胞抽出物
はたとえば細胞病理バイオアッセイを用いて分析でき
る。
十分な程度にHuLy IFN活性をもつポリペプチドを合成す
るクローンは、大規模生産に適合する。クローンは培養
され、ポリペプチドは７章および８章に記載のように回
収することができる。
6.HuLy IFN活性をもつポリペプチドの高レベルを発現す
ることができる組み換えプラスミドの構成、 十分に発現させるために、遺伝子は正しく転写の開始体
（プロモーター）および翻訳（リボゾーム結合位置）を
含む対照領域に関して局在化（集積化）されねばならな
い。
前記載のように（3d項）、プラスミドpBR 322は、適当
な制限エンドヌクレアーゼで開裂し、HuLy cDNAと連結
する。得られた組み換えプラスミドDNAは、E.coli HB 1
01を形質転換するために用いられる。たとえば、もしPs
t Iを制限エンドヌクレアーゼとして使用する場合、HuL
y cDNAの挿入はpBR 322のβ−ラクトア（ラクタ）マー
ゼ内に起こる。更に連結が、特有の配向および特有の解
読フレームで行なわれるならば、癒合（合着）したタン
パクは、HuLy IFNアミノ酸配列に従うβ−ラクトアマー
ゼ鎖の部分からなる結果になる。cDNAが特有の解読フレ
ームおよび／または配向に挿入されない場合は、得られ
るタンパクは、いかなるIFN活性も示さない。不適当な
配向の場合、プラスミドは適する制限エンドヌクレアー
ゼ（本発明においてすべての挿入体は、Pst Iによって
切断される）でcDNA挿入体を切断することによって再配
向できおよびcDNAと線状プラスミドの再連結（開裂と共
役して結合）することができる。得られた交雑プラスミ
ドは、E.coli HB 101に形質転換でき、そして順次に通
常IFN活性の検査（分析）ができる。
HuLy IFN cDNA挿入発現の効率を高めるために、過剰で
ないヌクレオチド（および従ってアミノ酸）が先の遺伝
子（および従ってHuLy IFN活性をもつポリペプチド）で
あるように前記載の発現コントロール配列の付近で、Hu
Ly IFN cDNAを局在化することが必要である。更にHuLy
IFNsの場合において、第一の翻訳生成物は、成熟インタ
ーフェロンのＮ−末端に付着した信号ペプチドからなる
プレ−インターフェロンである。信号ペプチド排列は、
ポスト−翻訳的に初めのプロゲニター細胞に移す。しか
しながらE.coliは蛋白質融解的にプレ−排列を移すこと
はできない。従って、プレ−排列は、好都合にcDNA挿入
から、第一の翻訳生成物が成熟IFN−様ポリペプチドで
あり得るように適当な方法（下記参照）によって除去で
きる。この目的のために、成熟HuLy IFN−のためのコー
ド化遺伝子は、イン・ビトロで再構成され、発現コント
ロール配列に付着した（操作的に連結した）プラスミド
（例．β−ラクトアメーゼ遺伝子の発現コントロール配
列）に再挿入する。他の発現コントロール配列、プロモ
ーターおよびリボゾーム結合位置も同様に用いることが
でき、たとえばラクトースオペロンの発現コントロール
配列、トリプトファンオペロン、アラビノースオペロン
その他対応するファージλＮ−遺伝子の排列およびファ
ージfdコートタンパク遺伝子、または当該分野で知られ
ている他の排列のようなものを挙げることができる。発
現コントロール配列は、すでにcDNA挿入体を含むプラス
ミドに挿入でき、または両DNA断片を継続的にプラスミ
ドに挿入できる。
たとえば成熟HuLy IFN cDNAは、β−ラクトアマーゼ発
現コントロール配列の制御下におくことができる。
なぜなら成熟HuLy IFN−様ポリペプチドのためのコード
化成熟cDNA挿入は、翻訳開始のために必要である暗号
（コドン）ATGで開始されず、ATG−トリプレットは、合
成的に入れなければならない。たとえば知られているヌ
クレオチド塩基配列およびその結果として、pBR 322お
よびHuLy IFN cDNAの制限ヌクレアーゼパターンは、次
のアプローチに用いることができる。プラスミドpBR 32
2をβ−ラクトアマーゼ遺伝子内Pst Iで開裂し、エキソ
ヌクレアーゼ、たとえばBal31で分解し、β−ラクトア
マーゼコード化配列を短くする。任意に、E.coliからの
λ−エキソヌクレアーゼ（５′−エキソヌクレアーゼ）
もしくは３′−エキソヌクレアーゼおよびS1ヌクレアー
ゼの併用は、同じく用いることができる。制限されたプ
ラスミドは、合成されることのできる、（たとえば前記
載（4b項）のトリエステルアプローチによって）ds DNA
リンカー（Linker）と連結させる。リンカーは、適当な
制限エンドヌクレアーゼ、たとえばBc1 I（Sau 3A）の
認知配列を含む。得られたプラスミド断片は、アニール
化したリンカー（例Bc1 I）へ特徴のある制限エンドヌ
クレアーゼで、および次いでEcoR I（β−ラクトアマー
ゼ発現コントロール配列の付近に局在化するpBR 322内
にEcoR I位置が存在する）で開裂する。得られたDNA断
片（例.EcoR I−Bc1 I DNA断片）は本質的にβ−ラクト
アマーゼ（ApPr）の発現コントロール配列およびアニー
ル化リンカーからなり、ポリアクリルアミド電気泳動に
よって分離することができる。
一方において、HuLy IFN cDNA挿入は、それを含む組み
換えDNA分子から（4d項）、たとえば制限エンドヌクレ
アーゼPst Iによる分解によって、切断する。単離され
たHuLy IFN cDNA挿入は、信号ペプチドのためのコード
化するDNA排列を移すために更に他の制限エンドヌクレ
アーゼで（必要ならば、二つの他の制限エンドヌクレア
ーゼおよび部分的再連結された）開裂される。得られた
成熟HuLy IFN cDNAは、前記載のApPrDNA断片（例Sau 3A
“ステッキィ”終末端）に相補的な“ステッキィ”終末
端をもつ。成熟HuLy IFN cDNAおよびApPr DNA断片は、
通常リガーゼによってアニール化される（3d項参照）。
アニール化は、特有の解読フレームを確立するために、
成熟cDNAの第一暗号に先んずるATG暗号の生成の結果に
ならねばならない。得られる交雑DNAはβ−ラクトアマ
ーゼ発現コントロール配列、ATG翻訳開始暗号、完全なH
uLy IFNのためのコード化DNA配列、および開裂されたプ
ラスミドpBR 322における交雑DNAを挿入するために適す
る二つの制限エンドヌクレアーゼ−終末端（例.EcoR I
およびPst I終末端）を含む。
得られた交雑プラスミドは、E.coli HB 101の形質転換
およびHuLy IFN活性をもつポリペプチドの高レベルの合
成に導くために用いられる。
7.HuLy IFN−特異性組み換えDNAsを含むクローンの培
養、 本発明に係る形質転換したホストは、HuLy IFN活性をも
つポリペプチド生成のために用いることができる。該ポ
リペプチドを生成する方法は、形質転換ホスト、特に形
質転換したE.coli株（系統）は炭素，窒素および無機塩
の同化できる源を含む液体栄養培地で培養することを特
徴とする。
いろいろの炭素源を用いることができる。たとえば好ま
しい炭素源として、グルコース，マルトース，マンニッ
トールまたはラクトースまたはアセテートのような同化
できる炭化水素であり、単一もしくは適する混合物で使
用することができる。好適な窒素源として、たとえばカ
スアミノ酸（casamino acid）のようなアミノ酸、ペプ
チドおよびタンパク質およびその分解生成物（例トリプ
トン，ペプトン）または肉抽出物更に酵母抽出物、麦芽
抽出物、コーン浸液、塩化アンモニウム、硫酸アンモニ
ウムまたは硝酸アンモニウムのようなアンモニウム塩が
挙げられ、単一もしくは適する混合物で使用することが
できる、使用される無機塩としては、たとえば硫酸塩，
塩化物，リン酸塩およびナトリウム，カリウム，マグネ
シウム，およびカルシウム塩が挙げられる。
任意に、栄養培地は、増殖を助長する物質および／また
はHuLy IFN−特異性組み換えDNAのロスを妨げるために
選択的圧力を加える物質を含む。増殖を助長する物質に
は、たとえば鉄，亜鉛，マンガン，その他の微量元素お
よび特有のアミノ酸がある。HuLy IFN活性をもつポリペ
プチドのためのコード化遺伝子は別として、本発明に係
る組み換えDNAsは、好ましくは、抗生抵抗性（不応性）
たとえばアンピシリンおよび／またはテトラサイクリン
に対する抵抗性（不応性）を授けられる遺伝子を含む。
このような抗生物質を培地に加える場合、組み換えDNA
を含む細胞は、生き残り、増殖し、一方該組み換えDNA
または培地に混同する外来抗生−感受性微生物を含まな
い細胞は、生き残ることはない。
培養は常法による手段で行なう、温度，培地のpHおよび
発酵時間のような培養条件は、IFN−様ポリペプチドの
最大値を得られるようなやり方で選択する。好ましくは
選択されたE.coli株は、好気的条件下に、約20−40℃の
温度で好ましくは30℃でpH4−９で、好ましくはpH7で、
約４−20時間、好ましくは８−12時間、撹拌しながらま
たは振りながら深部培養する。培養の結果として、IFN
−様ポリペプチドは、細胞内に集積する。
8.IFN活性をもつポリペプチドの分離および精製 本発明に係るヒトリンパ芽球インターフェロンは、形質
転換したホスト細胞から該ポリペプチドの遊離および精
製の段階を含んでなる培養肉汁からの回収である。
形質転換したE.coli細胞を満足すべき細胞密度に増殖し
た後、発現された（表現）ポリペプチドの回収のための
第一段階は細胞内部からそれの遊離を含む。この目的の
ために細胞は、SDSまたはトリトンのような浄化剤によ
って溶菌化する。任意に、剪断力のような機械力、（例
Ｘ−プレス、フレンチプレス）またはガラスビーズまた
はアルミナと振り回りことによって、細胞を破壊する。
得られたポリペプチド混合物は、常法によって、すなわ
ち硫酸アンモニウムまたはトリクロロ酢酸による沈澱，
ゲル電気泳動，透析，クロマトグラフィー（例．イオン
交換クロマトグラフイー，サイズ−排除（排他）クロマ
トグラフィー，または反転相HPLCおよびその他）を用い
て、ヒトLy IFNを濃縮する。最終的な精製前の精製は、
たとえば、抗体親和性クロマトグラフィーによってなさ
れる。主に精製段階は、ヒト白血球インターフェロンの
精製のために開発したステェフェリンら（51）の方法に
よって行なわれる。
たとえば、ヒトLy IFNの精製および分離は、次の段階を
経て行なう： （１）E.coli細胞の溶菌化 （２）ポリエチレンイミン処理による非−蛋白質分解物
質の一部の除去 （３）硫酸アンモニウムでの溶液飽和によるポリペプチ
ドの沈澱 （４）適当な緩衝混合液における透析 （５）DEAE−セルロースのカラムクロマトグラフィー （６）親和性モノクロナル抗体のカラムクロマトグラフ
ィー （７）適合するセファデックス の分子サイズのカラム
クロマトグラフィー 十分な精製生成物を得るために、付加的な精製段階が、
必要とされる、たとえばカチオン，またはアニオン交換
クロマトグラフィー，水酸化燐灰石への吸収，反転相HP
LCなどがある。一方前記の段階の１つもしくはそれ以
上、可能ならば、削除することができるし、または段階
の順序を変えることもできる。
本発明は、本発明に係るポリペプチドの誘導体および断
片を含んでなり、たとえば蛋白質融解的に開裂したポリ
ペプチド、十分にもしくは部分的に保護された、たとえ
ばアシル化，シリル化および特にグリコシル化ポリペプ
チド、およびその塩およびそれらの製造のための常法に
よる過程を含む。
本発明は、特に本発明の結果として精製された形態での
DNAsおよびポリペプチド、および特別にDNAs、形質転換
したホスト，ポリペプチド、および実施例で記載のよう
にその製造過程に関するものである。
本発明のポリペプチドおよび適するその誘導体、たとえ
ばグリコシル化した生成物は、ヒトの癌，腫瘍，および
ウィルス感染の治療のために知られているインターフェ
ロンと類似して用いられ、必要に応じて他の抗ウィルス
性，抗癌性，または抗腫瘍性剤と併用して用いられ、好
ましくは、活性成分とともにまたは、有機もしくは無機
の固体または液体、好ましくは非経口投与に適する医薬
として許容され得る担体と混合して、効果量含む医薬製
剤の形である。
本発明に係る医薬として活性のある化合物は、好ましく
は製剤でまたは非経口（例．筋肉注射，静脈注射）のた
めの注入溶液の形態である。このような溶液は、好まし
くは使用前に製造された等張性水溶液または懸濁液であ
り、それは活性成分のみまたは医薬として許容されうる
担体を含む凍結乾燥（親液性化）した調合物から製造す
る。医薬製剤は、殺菌しおよび／または補助薬、たとえ
ば保存剤，安定剤，潤滑剤および／または乳化剤，可溶
化剤，浸透圧を調整するための塩、および／または緩衝
液を含む。本医薬製剤は、所望ならば、更に医薬的に価
値のある物質を含むこともでき、既知の方法によって生
産され、たとえば、常法によって溶解したり、凍結乾燥
（親液性化）によって行ない、活性成分は約0.1−100
％、特に約１−50％、凍結乾燥（親液性化）の場合は10
0％まで含むことができる。
本発明は、医薬として活性ある化合物を、医薬として許
容されうる担体と混合することを特徴とする医薬組成分
を生成する方法に関するものである。
病症の本質（特性）、および患者の容態に依存して、製
剤は、たとえば筋肉内に一日に三回約106−107ユニット
の投与量で投与する。
次の実施例は、本発明を図示しており、その限界として
解釈するものではない。
実施例 次の略語は、実施例において用いられる。
EtBr: エチジウムブロマイド BSA: 牛血清アルブミン DTT: 1,4−ジチオスレイトール（1,4−ジメルカフト−2,3−ブタン
ジオル） EDTA: エチレンジアミン四酢酸 SDS: ドデシイル硫酸ナトリウム TNE: 100mM NaCl,50mMトリス・塩酸（pH7.5），および5mM EDTAを含
む溶液 Tris（Trizma）：トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン Tris・HCl: トリス１塩酸 1.HuIFNmRNAのために濃縮されたポリ（Ａ）RNAの分離
（図１） ａ）ナマルワ細胞の誘発 ナマルワ細胞は、胎子牛血清10％を含む培養培地RPMI 1
640で37℃のもとで増殖させる。細胞の密度が、３・706
細胞/mlに到達した時、懸濁液を室温で800×ｇで10分間
遠心する。集められた細胞は、グルタミン（0.027％／
容積）、ペニシリン（200ユニット/ml）およびストレプ
トマイシン（50μg/ml）を含む培地（200ml）に再懸濁
する。細胞は、90分間37℃でニューカッスル病ウィルス
（NDV110）を190HAU/106細胞（HAU:血球凝集ユニット）
の割合で培養する。新しい培地を添加することによっ
て、細胞の密度を１・３・106細胞/mlに調整し、細胞懸
濁液を34℃で100r・ｐ・ｍ・で振り回す。12時間後、６
・109細胞は、採収し、リン酸−緩衝化した塩水（50m
l）〔“PBS";11PBSは、塩化ナトリウム（80g）、塩化カ
リウム（2g）、リン酸水素ナトリウム（14.4g）および
リン酸２水素カリウム（2g）を含む〕に再懸濁する。細
胞を採収する前に、サンプルを移し、インターフェロン
活性を、チャレンジウィルスとして、小水泡性口内炎ウ
ィルスおよびCCL−23細胞を用いて、アームストロング
（29）の方法に基づいて測定する。4300IFNユニット/ml
が検出される。
ｂ）細胞の破壊および脱タンパク化 細胞懸濁液（６・109細胞/50mlPBS）を、室温で、0.05M
トリス塩酸（pH7.5）、0.1M塩化ナトリウム、5mM EDTA
および２％SDS（結晶、研究用、セルバ）からなる溶菌
緩衝液（800ml）を加える。溶菌化したものは、前培養
した（37℃で２時間）プロテアーゼ（プロテアーゼｐ、
VI型、シグマ）（0.2mg/ml）加えて、室温のもとで撹拌
しながら１時間分解する。溶液をTNE飽和−フェノール
（500ml×３）およびクロロホルム（500ml×３）で抽出
することによって脱タンパク化する。260nmの吸収によ
って測定されるように核酸（500mg）が得られる。
ｃ）混合しているDNAおよびRNAの除去 前記載のように得られたかすかにビスコース状水溶液
（段階1b）は、0.3M塩化ナトリウムで調整し、オリゴ
（dT）セルロース（1g）（７型、Ｐ−Ｌ生化学）を加え
る。懸濁液を室温で30分間撹拌した後、室温でソルバル
RC−３遠心機を用いて１ソルバル管で、4000rpmで10
分間遠心し、得られたオリゴ（dT）セルロース−スラリ
イを、0.5％SDSを含むTNE（40ml×２）洗浄する。結合
したポリ（Ａ）RNAは、水（2.5ml）で、５回連続的洗浄
によって溶出する。ポリ（Ａ）RNA（720μｇ）の収量
は、光学的濃度を測定することによって決定する。初め
の吸着からの上澄RNA溶液は、二回目にオリゴ（dT）セ
ルロース（1g）に吸着させ、前記載のように溶出し、ポ
リ（Ａ）RNA（320μｇ）が得られる。溶出液はプールし
TNEで調整し、ポリ（Ａ）RNAを67％エタノールで−20℃
のもとで10時間で沈澱させる。RNAはソルバルRC−5B遠
心機を用いて、10分間０℃のもとで10000rpmで遠心する
ことによって、集めることができる。沈澱物（1mg）
は、1mM EDTA（1ml）に溶解する。
RNAは、次のようにゼノプルラエビスの卵母細胞への注
入によって、HuIFNmRNA活性のための分析をすることが
できる:RNA溶液（50nl）を20卵母細胞の各々に注入す
る。卵母細胞は、ゴルドン（42）、バース（43）および
コルマンら（30）によるベース培地（2mMトリス88mM塩
化ナトリウム、1mM塩化カリウム、0.33mM硝酸カルシウ
ム、１結晶水、0.82mM硫酸マグネシウム・７結晶水、2.
4mM炭酸水素ナトリウム、0.01mg/mlペニシリン、0.01mg
/mlストレプトマイシンを含む溶液を塩酸でpH7.6に調整
する）で培養する。注入した卵母細胞は、42−48時間培
養し、培地を除去し、エッペンドルフ遠心機で５分間遠
心し、上澄みは分析に使用するまで−20℃または−80℃
で貯蔵する。IFN活性は、本質的にアームストロング（2
9）に基づいて、〔VSVをチャレンジウィルスとしてHep
−２細胞（フローラボラトリイー）に用いることを除い
て〕分析する。卵母細胞抽出物は、注入されたRNAμｇ
につき600IUインターフェロンの特異活性をもつ。
ｄ）HuIFN mRNAのためのポリ（Ａ）RNA濃縮 ポリ（Ａ）RNAを、0.5mlベット−容積のキレックス−10
0カラム（200−400メッシュ、ビオーラド）に通過させ
る。カラムは1mM EDTA（1ml）でリンスする。
溶出液（ポリ（Ａ）RNA1mg/EDTA2ml）を２分間100℃で
加熱し、シュクロースデンシティグレディエント〔6 50
mMトリス−塩酸（pH7.5）、0.2M塩化ナトリウムおよび1
mM EDTAを含む14mlシュクロース溶液を５％から23％
（m/V）まで濃度を増加させる〕を用いて遠心する。遠
心は、TST41ローター（コントロンAG）を用いて、35000
rpmで16時間、５℃のもとで行なう。0.3mlずつの画分
は、ISCOグレディエントコレクターで集める。各々の画
分にエタノール２容量加えて、溶液を10時間−20℃で放
置する。沈澱したmRNAは遠心（ソルバル、HB−４ロータ
を用いて、10000rpmで10分間０℃のもとで）をする。各
々の画分の沈澱物は、1 mM EDTA（25μｌ）に再溶解し
て、前記載（段階1c）のように（20のかわりに、RNAサ
ンプルにつき10卵母細胞に注入されることを除いて）ヒ
トIFN mRNA活性のために分析する。結果は、表１に示め
す。
画分23−29をプールし、ポリ（Ａ）RNAは、次のように
精製する： ポリ（Ａ）RNA溶液は、0.5％SDSを含む２×TNEで調整
し、オリゴ（dT）セルロースカラム（200μｌ）にかけ
る。カラムを0.5％SDSを含む２×TNEで洗浄し、ポリ
（Ａ）RNAは水（0.5ml×５）で溶出する。溶出液は、TN
Eで調整し、同容量のTNE飽和−フェノールで２回抽出
し、更に同容量のクロロホルムで２回抽出する。ポリ
（Ａ）RNAをエタノール（２容量）で−20℃のもとで、1
0時間沈澱させ、前記載のようにHB−４ローターを用い
ての遠心によって沈澱を得る。
ポリ（Ａ）RNAは、0.5mM EDTA（100μｌ）に溶解する。
収量は（40μｇ）光学的濃度を測定することによって決
定される。
ポリ（Ａ）RNAの部分は、前記載のように、分析につき2
0卵母細胞を用いて、ヒトIFN活性のための分析を行な
う。ポリ（Ａ）RNA製剤はRNA（μｇ）につき8100IUイン
ターフェロンの特異活性をもつ。
2.二重一鎖cDNAの製造（図１） HulFNmRNAのために濃縮されたポリ（Ａ）RNA（段階1d参
照）は、本質的にエフストラテアデスら（44）、マニア
テスら（45）およびホエイジマーカーら（46）によって
報告されているように、二重鎖cDNAを製造するためのテ
ンプレートとして用いる。
ａ）第一鎖の合成 40mMトリス．塩酸（pH7.5）、30mM塩化ナトリウム、5mM
塩化マグネシウム、0.5mM DDT（カルビオケミ）、1mM d
GTP,dCTP,dTTP（Ｐ−Ｌ生化学）および1 mM32P-dATP
（アマースハム比活性50000cpm/nmole）,20μg/μｌオ
リゴ（dT）12-18（Ｐ−Ｌ生化学）、40μg/mlポリ
（Ａ）RNAおよび鳥類骨髄芽球症ウィルス（AMV）リバー
ストランスクリプターゼ（ライフ、サイエンス、Inc.,S
tペータースブルグ，フロリダ）を含む反応混合物（250
μｌ）を80分間37℃で培養する。反応は、溶液を10mM E
DTAおよび0.1％SDSで調整することによって停止する。
反応混合物をフェノールの１容量で一回抽出する。水相
をクロロホルム（１容量）で再抽出し、セファデックス
Ｇ−50（ファーマシア、ファイン）カラム（3ml）にか
ける。各画分（0.1ml）を集める。各々の画分の放射能
活性は、セレンコフ放射線を測定することによって決定
する。放射能画分は、プールし、核酸はエタノール（２
容量）で、−20℃のもとで10時間沈澱させる。この画分
を、HB−４ローターを用いて10,000rpmで０℃のもとで2
0分間遠心する。沈澱を水（95μｌ）に溶解する。10N水
酸化ナトリウム（５μｌ）を加えて混合物を25℃のもと
で40分間培養する。5M酢酸中和後、水（50μｌ）および
エタノール（２容量）を加え、−20℃のもとで10時間放
置する。沈澱は、前記載のように遠心によって集め、0.
1 mM EDTA（200μｌ）に再溶解する。一本鎖cDNAの収量
は3.7μｇである。cDNAのサイズは、既知の長さのマー
カーDNAaに関連して（32）、7M尿素を含むトリス−ホウ
酸−EDTA〔トリス（108g）、EDTA 2ナトリウム塩（9.3
g）、ホウ酸（55g）を含むpH8.3である１溶液〕 における６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動の移動
度から測定されるように700−1500ヌクレオチドの長さ
である。
ｂ）第二の鎖の合成およびS1エンドヌクレアーゼ分解 得られたcDNA溶液は100℃で90秒間加熱し、冷却し、0.1
Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.9）、10mM塩化マグネシウ
ム、10mM DTT（カルバイオケミ）1mMdATP,1mM dCTP,1mM
dTTP（Ｐ−L,生化学）、1 mM3H-dGTP（アマースハム、
比活性の4000cpm/nmole）およびE.coli DNAポリメラー
ゼＩ（バイオラボ、ニューイングランド）（165ユニッ
ト/ml）からなる反応混合物（400μｌ）で15℃のもとで
８時間培養する。反応は、EDTAおよびSDSを加えて、最
終濃度各々10mMおよび0.1％になるようにして停止す
る。混合物はフェノールおよびクロロホルムで抽出し、
セファデックスＧ−50（ファーマシア、ファイン、ベッ
ト容量2ml）でクロムト処理し、前記載（段階2a）のよ
うにエタノールで沈澱させる。
得られたDNAは、0.25M塩化ナトリウム、50mM酢酸ナトリ
ウム（pH4.5）およびS1エンドヌクレアーゼ（Ｐ−Ｌ生
化学）の６ユニットを含む1mM硫酸亜鉛を含む培養溶媒
（50μｌ）で37℃のもとで30分間培養する。反応は0.1
％SDSおよび10mM EDTAで停止する。反応混合物はフェノ
ール（50mM酢酸ナトリウムで飽和した、pH4.5）および
クロロホルムの１容量で脱タンパク化する。水相は、セ
ファデックスＧ−50（ファーマシア、ファイン）（2m
l）カラムでTNE中でクロマト処理する。100μｌ画分は
集められ、各々の画分におけるセレンコフ放射線を測定
する。除外された画分はプールし、DNAは、エタノール
（２容量）で前記載のように−20℃のもとで10時間沈澱
させる。沈澱は、HB−４ローター（下記参照）を用いて
遠心し、集められた沈澱は、10mMトリス・塩酸（pH7.
5）および0.5 mM EDTAを含む100μｌに溶解する。DNA
（４μｇ）が得られる。DNAは50mMトリス・塩酸（pH7.
5）および1mM EDTAでのシュクロース、デンシティ、グ
レディエント（５−23％）でTST−60ローター（コント
ロンAG）を用いて分画化する。遠心は、55000rpmで５時
間15℃のもとで行なう。800塩基対マーカーDNAより速く
沈降するDNAをパラレルグレディエントで行ない、プー
ルし、TNEで調整し、67％エタノールで−20℃のもとで1
0時間沈澱させる。二重鎖cDNA（0.4μｇ）が得られる。
3.pBR 322−連結したcDNAの製造（図１） ａ）ｄ−CMP−延長したcDNAの製造 得られたds cDNA（0.1μｇ）の３′−末端は、100mMカ
コデレートナトリウム（pH7.2）、2.5mM塩化コバルト、
BSA（カルバイオケミ）（50μg/ml）、1mMdCTPおよび末
端デオキシヌクレチオジルトランスフェラーゼ（Ｐ−Ｌ
生化学）（10ユニット/ds cDNA μｇ）を含む反応容積
（10μｌ）中でポリ（dC）末端（尾）に提供（反応）す
る。培養後（27℃で20分間）、EDTAは10mMになるように
加え、使用するまで−20℃で保存する。
ｂ）Pst I開裂したdGMP延長したpBR 322の製造 pBR 322プラスミドDNA（10μｇ）を50mM塩化ナトリウ
ム、6mMトリス・塩酸（pH7.5）、6mM塩化マグネシウ
ム、6mM2−メルカプトエタノールおよび100μg/mlゲラ
チンを含む溶液（100μｌ）にPst Iエンドヌクレアーゼ
（バイオラボ）の10ユニットで１時間37℃で分解する。
溶液は、フェノールおよびクロロホルムの１容量で抽出
する。溶液をTNEで調整し、線状（棒状）DNAはエタノー
ル（２容量）で−20℃のもとで５時間沈澱させる。
線状（棒状）プラスミドDNAは、100mMカコデレートナト
リウム（pH7.2）、5mM塩化マグネシウム、20mMリン酸二
水素ナトリウム、BSA（50μg/ml）、1mM dGTP、末端デ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｐ−Ｌ生化
学）（100ユニット）を含む反応容量（200μｌ）におけ
るdGMPで延長する。37℃で20分間培養後、EDTAを10mMに
なるように加え、反応混合物を使用するまで−20℃で凍
結する。
ｃ）dGMP−延長したpBR 322のdCMP−延長したds cDNAへ
のアニール化 TNE緩衝液におけるdCMP−延長した二重鎖cDNA（0.1μ
ｇ）およびdGMP−終末端線状化したpBR 322（0.5μｇ）
の混合物を65℃で１時間、46℃で１時間、37℃で１時
間、20℃で１時間培養する。PBR 322−連結したcDNAを
含む溶液を氷上に置き、形質転換のために直ちに使用す
る。
4.アニール化した交雑（雑種）プラスミドをもつE.coli
HB 101の形質転換 カルシウム処理したE.coli HB 101は、マンデルら（3
5）の方法によって形質転換のために準備する。
前記載（段階3c）のように製造されたアニール化したpB
R 322交雑プラスミドDNAsを含む反応混合物（10μｌ）
を、10mM塩化マグネシウムにおけるカルシウム処理した
E.coli HB 101（150μｌ）、10mM塩化カルシウムおよび
10mMトリス・塩酸（pH7.5）を含む混合物（全量200μ
ｌ）に加える。
混合物を氷上で20分間冷却し、42℃で１分間加熱し、20
℃で10分間培養する。トリプトン培地〔トリプトン培地
は、蒸留水（１）中にバクト−トリプトン（10g）
（デフコ）、酵母抽出液（1g）（デフコ）、グルコース
（1g）、塩化ナトリウム（8g）および塩化カルシウム、
２結晶水を含む〕（1ml）を加え、混合物を30分間37℃
で300rpmで振り回しながら培養する。混合物をテトラサ
イクリン（10μg/ml）（シグマ）で補足した２寒天プレ
ート（マックコンケイアガール，デフコ;0.6ml/プレー
ト）にかける。プレートは、37℃のもとで12−17時間培
養する。形質転換したE.coli HB 101の約5600テトラサ
イクリン抵抗性コロニーが製造される。
5.HuIFNcDNAを含むクローンの同定 ａ）13−merオリゴデオキシヌクレオチドプライマーの
合成（図２） HuIFN−α１およびHuIFN−βmRNAを共有する13ヌクレオ
チドの伸長に相補的オリゴデオキシヌクレオチドは、ホ
スホトリエステル法〔イタクラら（38），ローイジら
（39）〕によって、化学的に合成される。合成の個々の
段階は、図２に概略してある。図２のライン１で示され
た出発物質（保護基を運ぶモノおよびジデオキシヌクレ
オチド）は、文献から知ることができる。保護基は、イ
タクラらによって報告されたような方法で開裂（解離）
させることができる：水酸基を置換した５′−モノメト
キシトリチル基（Ｍ）もしくはジメトキシトリチル基
（Ｄ）の脱解離は、室温で酢酸（80％）で行なわれ、お
よびβ−シアノエチルリン酸基は、室温でジオキサン−
水（4:1）における0.1N水酸化ナトリウムで行なわれ
る。生成ブロックの縮合は、活性化剤としてトリイソプ
ロピルベンゼンスルフォニルクロライドを用いて、図２
のライン７に表示した十分に保護した13−merプライマ
ーまでのオリゴデオキシヌクレオチドを得るために行な
う。最終段階（すべての保護基の完全な除去）は次のよ
うに行なう： ジオキサン（3ml）およびアセトニトリル（1ml）中に十
分保護された13−merオリゴデオキシヌクレオチド（64.
6mg）を含む溶液は、シン−ｐ−ニトロベンツアルドキ
シン（200mg）およびN1，N1，N3，N3−テトラメチルグ
アニジン（124mg）と反応させ、27時間放置する。25％
アンモニア（10ml）を加え、溶液は、50℃で24時間保持
する。溶媒を、真空下に蒸発させた後、残留物は、水に
溶解し、酢酸でpH4に調整し、溶液をクロロホルムで20
回抽出する。水溶液は、真空下で蒸発させ、残留物は80
％酢酸（1ml）に溶解する。溶液を一時間放置し、水（6
ml）で希釈し、クロロホルムで３回抽出し、凍結乾燥す
る。得られた粗生成物の1/3はDEAE−セファデックスA25
のクロマトグラフィー（カラムサイズ:10・１・3cm）を
用いて、0.2−1.2Mトリエチルアンモニウム２カルボン
酸塩グレディエント（200ml）を通して精製する。主な
画分の溶出は、グレディエント濃度が0.87Mで起こる。
主画分は、HPLCテストによって示されているように純粋
な生成物からなり、３倍に濃縮し、ダウエックス50W
（アンモニウム塩）（10ml）でろ過し、凍結乾燥する。
HPLC（パーマフェースAAX.カラムサイズ90・0.3cm,60
℃,2ml/分；グレディエント:A＝0.005Mリン酸二水素カ
リウム,B＝0.5Mリン酸二水素カリウム,0.5M塩化カリウ
ム、pH4.5;20％Ａ→100％B30分間）：tR11.8分。
ｂ）32P−ラベルヒトIFN−αおよびIFN−β特異性cDNA
（実験材料検体）の製造（図３） 合成13−merオリゴデオキシヌクレオチドプライマー
（段階5a）（40pmol）および〔ｒ−32P〕−ATP（5700Ci
・mmol-1，アマースハム）（40pmol）を10mM塩化マグネ
シウムおよび5mM DTTを含む50mMトリス・塩酸（pH9.5）
（100μｌ）中で結合させる。T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（Ｐ−Ｌ生化学）（50ユニット）を加え、37℃で30
分後、更に酵素の20ユニットを加えて、培養は更に37℃
のもとで15分間続ける。32P−ラベルしたプライヤーを
含む水溶液は、フェノール抽出によって精製する。更に
精製は、4mlセファデックスＧ−50カラム（ファーマシ
ア，ファイン）のクロマトグラフィを用いて1mMトリス
・塩酸（pH8.0）で処理する。各画分（0.1ml）を集め
る。各々の画分の放射能は、セレンコフ放射線の測定に
よって決定する。４・106セレンコフcpm/オリゴデオキ
シヌクレオチドpmoleの比活性が得られる。32P−ラベル
プライマー（40pmol）は凍結乾燥し、ポリ（Ａ）RNA
（段階１で記載のように誘発ナマルワ細胞から製造され
た）（14μｇ）を含む水（95μｌ）に再懸濁し、100℃
で60秒間加熱する。4M塩化カリウム（９μｌ）を加え、
混合物を25℃で60分間培養する。リバーストランスクリ
プターゼミックス（450μｌ）を40μＭトリス・塩酸（p
H8）,4μＭ塩化マグネシウム,1mM DTT（カルバイオケミ
・Inc）,74mM塩化カリウム,1mM dATP,1mM dGTP,1mM dCT
P,1mM dTTP（Ｐ−Ｌ生化学）および鳥類骨髄芽球症ウィ
ルスの90ユニットからなる反応容量にするように加え
る。培養は、37℃で１時間続ける。溶液はフェノール
（TNEで飽和した）（１容量）で抽出し、核酸は、エタ
ノール（２容量）で、−20℃のもとで10時間沈澱させ
る。沈澱は、遠心（HB−４ローター,20分間,10000rpm,0
℃）で集め、90％（容量／容量）ホルムアミド（メル
ク．プロアナリシス）,1mM EDTA,0.05％ブロモ・フェノ
ールブルーおよび0.05％キシレンシアノールブルーを含
む色素混合液（20μｌ）に溶解する。サンプルを90℃の
もとで２分間加熱し、トリス−ホウ酸−EDTA〔ピーコッ
クら（32）〕における５％ポリアクリルアミドゲルにか
ける。単一体は、プラスミドpBR 322のHae III分解から
得られた267 bpと435 bp 32P−ラベルしたマーカーDNA
断片の間に移動するオートラジオグラム上で見ることが
できる。32P−ラベルcDNA断片は、ゲルから抽出し、ミ
ューラーらによって市報告されたように（47）精製す
る。32P−ラベルしたヒトIFN−αおよびIFN−β特異性c
DNA検体の20000セレンコフcpmが得られる。
ｃ）HuIFN cDNAを含むコロニーのためのスクリーン化
（図３） 前記載（段階４）のように製造した形質転換コロニーの
1650は、ニトロセルロースフィルターBA85（シュライヒ
ル＆シューエル,8cm直径）に移す。細胞は、溶菌化し、
されらのDNAは変性させ、グルンスタインおよびホック
ネス（36）に基づいてインシトウで、フィルターに固定
する。コロニーのついたフィルターは、４×SET〔0.15M
塩化ナトリウム,30mMトリス・塩酸（pH8.0）,1mM EDTA
を含む溶液〕,0.1％（重量／容量）フィコール400（フ
ァーマシア）,0.1％（重量／容量）ポリビニールピロリ
ドン（PVP−360,シグマ）,0.1％（容量／容量）BSA,0.5
％SDS,および50μg/ml変性牛−胸腺DNA〔次のように製
造される:5mg牛−胸腺DNA（C1型，シグマ）を10分間,0.
5M水酸化ナトリウム中でDNAを剪断変形するために煮沸
し、5M酢酸で中和し、エタノール（２容量）で−20℃の
もとで沈澱させる。沈澱は、HB−４ローターを用いて、
10分間０℃のもとで遠心して集め、0.5mM EDTA（500μ
ｌ）に再溶解する〕を含むフィルターにつき20μｌの混
合溶液で、65℃のもとで、４時間前交雑（雑種）化し、
ニトロセルロースフィルターにつき32P−ラベルした検
体の103セレンコフcpmで、５×SET,0.02％（重量／容
量）フィコール,0.01％ポリビニールピロリドン,0.02％
（容量／容量）BSA,0.2％SDSおよび50μg/ml変性牛−胸
腺DNAを含む溶液において交雑化する。交雑化は、65℃
のもとで36時間行なう。
フィルターは一回クロロホルムで、二回SET,0.5％SDSで
室温のもとでリンスし、60℃のもとで二回SET,0.5％SDS
で１時間，および室温のもとで一回3mMトリズマ塩基で
リンスする。フィルターを、3MM−ペーパー（ホワトマ
ン）で吸い取ることによって乾燥し、Ｘ−線フィルム
（フジ）で、スクリーン（イルフォード増強スクリー
ン）を用いて、−80℃のもとで72時間フィルターに露出
させる。
９つの陽性（＋）コロニーが、オートラジオグラム上で
同定され、更に研究に用いられる。
形質転換した細胞の第一クローンは、しばしば組み換え
DNA分子の１種以上を含み、交雑プラスミドDNAsは、９
つ陽性の交雑クローンから分離され、前記載のように再
形質転換E.coliのために用いられる。
交雑プラスミドDNAは、次のように分離する:1コロニー
はエルレンマイヤーフラスコ（25ml）内に前記載のよう
にテトラサイクリン（10μg/ml）で補足したトリプトン
培地（10ml）に、接種する。培養は、37℃で15−18時間
300rpmで振り回しながら行なう。細胞は、遠心によって
（ソルバル,HS−４ローター,400rpmで10分間,4℃）採収
する。約1gの細胞が得られ、50mMトリス・塩酸（pH8.
0）（1ml）に再懸濁する。リゾチーム溶液（0.25ml）、
〔リゾチーム10mg/50mMトリス・塩酸（pH8.0），リゾチ
ームはシグマから得られた〕を加え、０℃で10分間培養
後、0.5M EDTA（pH7.5）（0.15ml）加える。更に０℃で
10分間培養後、２％トリトンＸ−100（メルク）（60μ
ｌ）を加える。０℃で30分間保持した後、サンプルは、
15000rpmで30分間４℃のもとで、ソルバルSA−600ロー
ターを用いて遠心する。上澄みは、フェノール（TNEで
飽和した）（１容量）で脱タンパク化する。相を遠心
（ソルバルHB−４ローター）によって、5000rpmで４℃
のもとで、分離する。上相は、クロロホルム（１容量）
で２回抽出する。膵臓のRNAseA（シグマ;85℃で10分前
−加熱したTNE 1mlに10mg溶解する）を最終濃度25μg/m
lになるように加え、混合物を37℃で40分間培養する。
溶液を1M塩化ナトリウムおよび10％ポリエチレングリコ
ール6000（フルカ,120℃で20分間圧熱滅菌する）で調整
した後、−10℃で２時間培養する。沈澱は、ソルバルHB
−４ローター（０℃のもとで10000rpmで20分間）を用い
ての遠心によって集め、TNE（100μｌ）に再溶解する。
DNA溶液は、フェノール（１容量）で抽出し、DNAは、エ
タノール（２容量）で、−80℃のもとで10分間沈澱させ
るる。沈澱物は、エッペンドルフ遠心機を用いての遠心
によって集める。DNAは、0.5mMEDTAを含む10mMトリス・
塩酸（pH7.5）（20μｌ）に再溶解する。交雑プラスミ
ドDNA（８−10μｇ）は培養液（10ml）から回収され
る。
E.coli HB 101は、９つの分離された交雑DNAsの各々で
形質転換され、形質転換した細胞は、前記載のように、
（段階４）テトラサイクリンを含む寒天プレートに平板
培養する。各々の形質転換から、抵抗性クローンをとり
あげ、10ml培養を製造し、前記載のように培養から交雑
DNAsを分離する。
再形質転換前および後のDNAサンプルのすべてはPst Iエ
ンドヌクレアーゼによる開裂および1mM EDTAを含む50mM
トリス−酢酸塩（pH7.8）における電気泳動によって分
析する。すべてのサンプルは、再形質転換前および後
に、同一の開裂パターンを示す。
再クローン化した組み換えDNA分子の１つは、２つの帯
を示し、一方はPst I−開裂したpBR 322の移動度をもち
他方は、約1000bpに対応する移動度をもつ。それはCG−
pBR 322/HLycIFN−１′ｂを意味する。
他の組み換えDNAは３つの帯を示し、一つは、Pst I−開
裂したpBR 322の移動度をもち、一つは約600bPの移動度
をもち、一つは約150bpの移動度をもつ。このクローン
における組み換えDNA分子は、CG−pBR 322/HLycIFN−β
１を示す。
ｄ）クローンCG−pBR 322/HLycIFN−１′ｂおよびCG−p
BR 322/HLycIFN−β１の特徴 クローンCG−pBR 322/HLycIFN−１′ｂおよびCG−pBR 3
22/HLycIFN−β１の組み換えプラスミドDNAsは、前記載
のように（段階5c）培養から分離され、マックサムとジ
ルバート（41）によって報告された方法を用いて、cDNA
挿入のヌクレオチド配列を確立することによって特徴づ
けられる。基本的には、次のアプローチが用いられる： 分離された組み換えプラスミドDNAは、種々の制限エン
ドヌクレアーゼで分解される。酵素は、本質的に供給源
（ニューイングランドバイオラボ）によって記載されて
いるように（酵素緩衝液において、BSAをゲラチンによ
って置き換えることを除いて）適用する。制限されたDN
Aを含む溶液を、フェノール（TNEで飽和した）で脱タン
パクする。DNAはエタノールで沈澱させ、50mMトリス・
塩酸（pH8.0）に、50μg/mlの濃度で再溶解し、牛腸ア
ルカリホスファターゼ（ベーリンガー）0.1ユニット/DN
A5′末端pmoleを用いて、37℃で30分間培養する。酵素
は、溶液を65℃で60分間加熱することによって不活性化
させる。DNAを、ミューラーら（47）によって報告され
ているようにDEAE−セルロースクロマトグラフィーによ
って精製し、エタノールで沈澱させる。次いでDNAを
５′−末端に〔ｒ32P〕−ATP（＞5000Ci/m moleアマー
スハム）でラベルし、マックサムとジルバートによって
報告されているように（41）T4ポリヌクレオチドキナー
ゼ（Ｐ−Ｌ生化学）（DNAをキナーゼ反応前に変性させ
ないことを除いて）と反応させる。一般的に、比活性は
１−３・106cpm/p mole 5′−末端になる。
ラベルしたDNA断片を、第二の制限エンドヌクレアーゼ
で、開裂し、トリス−ホウ酸−EDTA緩衝液における６
％,8％または10％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に
よって生成物を分離する。DNA断片をゲルから抽出し、
ミューラーらによって報告された（47）ように精製す
る。ヌクレオチド配列の決定のために、DNA断片を、化
学的に分解し、生成物をマックサムとジルバートによっ
て報告された（41）ようにポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって分離する。
特に、クローンCG−pBR 322/HLyc IFN−１′ｂの単離さ
れたプラスミドDNAsは、次のように処理する。一方にお
いて、プラスミドDNA（５μｇ）を５′末端でラベルし
たBg1 IIで分解し、Pvu IIで開裂させる。Pvu II−Bg1
II＊（＊ラベルされた位置を示す）およびBg1 II−Pvu
II＊DNA断片は、６％ポリアクリルアミドゲルで分離す
る。他方において、プラスミド（５μｇ）を５′−末端
でラベルしたAlu Iで分解し、Pst Iで開裂させる。Pst
I−Alu I＊DNA断片を８％ポリアクリルアミドゲルで分
離する。個々の断片は、順次に分解し、マックサムとジ
ルバートの報告に基づいて、連鎖させる。
得られたヌクレオチド配列は、図４に示されている。約
25−35デオキシグアノシン残基の伸長は、cDNA挿入の
５′−終末端で先に起こる。示されているヌクレオチド
配列は、いくぶんかゴエテルら〔（14），バイスマン
（３）〕によって報告されたIFN−α（Ｆ型）cDNAに類
似しており、それにもかかわらず、得られるアミノ酸
（図４）に影響する多くの明らかな偏位（一点の突然変
異）を示す。
クローンCG−pBR 322/HLycIFN−β１の分離されたプラ
スミドDNAを同様の方法で処理する。プラスミド（５μ
ｇ）をPvu IIで分解し、５′−末端でラベル化する。混
合物の半分をPst Iで開裂し、残りはBg1 IIで開裂す
る。Pst I−Pst II＊およびBg1 II−Pvu II＊断片は、
６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって、分離
され、前記載のように分離する。ヌクレオチド配列（Ｎ
−末端配列）は、図５に示されており、cPNA挿入が、タ
ニグチら（17）によって報告されているようにIFN−β
１ cDNAのヌクレオチド信号102で開始することを示して
いる。従って、cDNA挿入は、Ｎ−末端で、11アミノ酸を
欠くヒトIFN−β１のためにコード化する力をもつ。cDN
A挿入は、約20−25デオキシグアノシン残基のストレッ
チ（伸張）によって５′−終末端で攻撃され、位置153
で一点の突然変異を示し、得られるアミノ酸に影響をす
ることなくＣをＴ残基に転換する。
ｅ）CG−pBR 322/HLycIFN−１′ｂおよびCG−pBR 322/H
LycIFN−β１の挿入体に交叉−交雑化（交雑−雑種化）
する組み換えDNA分子を含むクローンの同定 クローンCG−pBR 322/HLycIFN−１′ｂおよびCG−pBR 3
22/HLycIFN−β１の組み換えプラスミドDNAsを、前記載
（段階5C）のように培養から分離する。CG−pBR 322/HL
ycIFN−１′ｂプラスミドDNA（５μｇ）を、５′−末端
でラベルされたBg1 IIで分解し、Pvu IIで開裂させる。
一方において、分離したCG−pBR 322/HLycIFN−βプラ
スミド（５μｇ）を、５′−末端でラベルしたPvu IIで
分解し、Bg1 IIで開裂させる。Pvu II−Bg1 II＊（351b
p）DNA断片（検体Ａ）およびPvu II＊−Bg1 II（368b
p）DNA断片（検体Ｂ）は、前記載のように（段階5d）８
％ポリアクリルアミドゲルで分離し、イン・シトウでコ
ロニーの交雑化（雑種化）（下記参照）のために用い
る。プラスミドDNAsの制限、DNA断片のラベル化および
精製化は、前記載（段階5d）のように同様の方法で行な
う。
前記載のように（段階４）製造した形質転換コロニー
（4000）をニトロセルロースフィルターBA85（シュライ
ヒル＆シューエル、8cm直径）に移す。細胞を溶菌化
し、それらのDNAを変性させ、グルンスタインとホッグ
ネース（36）の方法に基づいて、イン・シトウでフィル
ターに固定する。検体ＡおよびＢ（両方の検体を混合す
る）への交雑化（雑種化）は、前記載のように（段階5
c）行なう。６つの陽性コロニーは、オートラジオグラ
フィーによって固定され、それら３つは次のようであ
り：E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−41，E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−51およびE.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−8′1更に研究の
ために用いられる。それらのクローンのプラスミドDNAs
は、分離され、再形質転換され、前記載のように（段階
5c,5d）のように再分離する。
組み換えDNAsの挿入の特性を確立するために、DNA挿入
のヌクレオチド配列（部分的もしくは完全に）は、前記
載（段階5d）のように一般的アプローチを用いることに
よって明らかにすることができる。
特に、分離されたプラスミドDNAs CG−pBR 322/HLycIFN
−41（５μｇ）およびCG−pBR 322/HLycIFN−８′1（５
μｇ）を、各々５′−未満でラベルしたPvu IIで分解
し、Pst Iで開裂する。DNA断片を、８％ポリアクリルア
ミドゲル上で分画し、８′1DNAからPst I−Pvu II
＊（〜120pb）および41DNAからPst I−Pvu II＊（82p
b）を例のとおりに分離する。
分離されたプラスミドDNA CG−pBR 322/HLycIFN−5
1を、次のように処理する。一方においてプラスミドDNA
（５μｇ）を５′−未満でラベルしたHae IIIで分解
し、Pst Iで開裂させる。Pst I−Hae III＊（57bp）DNA
断片は、10％ポリアクリルアミドゲルで分離する。他方
において、プラスミド（５μｇ）を５′−未満でラベル
したEcoR・Ｉで分解し、Pst Iで開裂させる。Pst I−Ec
oRI＊（235bp）およびEcoRI＊−PstI（〜700bp）DNA
は、８％ポリアクリルアミドゲルで分離する。いろいろ
のDNA断片を、マッキサムとジルベルト（41）による配
列分析をする。cDNA挿入ヌクレオチド配列を、図６−８
に示めす。図６において、CG−pBR 322/HLycIFN−41のc
DNAの挿入の配列を示めす。挿入は、23−デオキシグア
ノシン残基のストレッチによって５′−終未満で攻撃さ
れ、ストロイリら（12）によって報告されたIFN−α２
（Le）cDNAの部分からなる。３′−エクストラシストロ
ニック領域（extra cistronic region）において、いく
つかの少ない偏位（一点の突然変異）および付加的318
ヌクレオチドのストレッチがある。CG−pBR 322/HLycIF
N−８′1のcDNA挿入のヌクレオチド配列は、図７に示め
す。挿入は20−23デオキシグアノシン残基のストレッチ
によって５′−終末端で攻撃され、ゴエデルら〔（1
4）、マンタイら（11）参照〕によって報告されたIFN−
α（Ｄ型）cDNAに類似しているが、同一ではない。前述
のcDNA領域における相違とは別に、ひき続いてのIFNコ
ード化配列、GTCおよびGTGのかわりにアラニンのために
コード化するおよびバリンのためにコード化する28−30
GCGトリプレットおよび409−411GCGトリプレットの位置
にIFN遺伝子を含む。結局、CG−pBR 322/HLycIFN−51の
cDNA挿入のヌクレオチド配列（図８）は、５′−終末端
で、17デオキシグアノシンのストレッチを示めす。ヌク
レオチド配列は、ゴエデルら（14）によって報告された
IFN−α（Ｂ型）cDNAの配列に関係がある。しかしなが
ら、HLycIFN−51の５′−終未満に付加的なヌクレオチ
ドがあり、エクストラシストロニック領域において、一
点の突然変異、除去、挿入およびIFNコード化配列にお
いて、特に22および361−372の位置に、同様に存在す
る。
6.ヒトIFN−特異性組み換えDNA分子を含むE.coliによる
ヒトインターフェロンの合成 ヒトIFN特異性組み換えDNA分子を含むことを示めす５つ
のクローン、すなわちE.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−１′ｂE.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−41， E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−51 E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−８′1，および E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−β１，は、IFN活
性をテストし、各々は次のような方法で行なう：対応す
るE.coliクローン（30ml懸濁液）の培養は、トリプトン
培地で光学的濃度（OD650）１に増殖させる。細胞を採
収し、30mM塩化ナトリウムおよび50mMトリス・塩酸（pH
8.0）を含む水溶液（0.5ml）に再懸濁する。リゾチーム
（1mg/ml）（シグマ）を加える。０℃で30分間保持した
後、凍結（液体窒素）させ、５回解凍（37℃で）させ、
４℃のもとで、SS34ソルバルローターを用いて20000rpm
で20分間遠心する。上澄みを、段階1cで記載のようにア
ームストロング（29）の方法に基づいて、サイトパテッ
クバイオアッセイ（細胞病理的生物活性法）を用いてTF
N活性を測定する。次の活性が検出される： 抽出材料 IFN活性 組み換えDNAを含むE.coli HB 101 （IU/ml） CG−pBR 322/HLycIFN−１′ｂ 0;0 CG−pBR 322/HLycIFN−41 0;0 CG−pBR 322/HLycIFN−51 10000;10000 CG−pBR 322/HLycIFN−８′1 100;100 CG−pBR 322/HLycIFN−β１ 0;0 測定できないIFN活性を示めすクローンは、HuCyIFN−cD
NA挿入が、転写の方向等関連して不適当な配向にある組
み換えDNAsを含む可能性もある。従って、実物大cDNA挿
入を含むこのようなクローン（CG−pBR 322/HLycIFN−
１′ｂ）の組み換えDNAは、次のように再配向される： クローンE.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−１′ｂ
の１プラスミドDNAを、前記載（段階5c）のように分離
し、Pst Iで開裂する。開裂したDNA（0.5μｇ）を20mM
トリス・塩酸（pH7.8）、10mM塩化マグネシウム、10mM
DTT、25mM塩化ナトリウムおよび50μg/mlゲラチンを含
む緩衝液（20μｌ）中で、T 4 DNAリガーゼ（バイオラ
ボ）（0.2ユニット）および0.5mM ATPで、15℃のもとで
２時間反応させる。E.coli HB 101は、前記載のように
（段階４）cDNA混合物で形質転換される。形質転換され
たコロニーは、テトラサイクリンで補足したマック・コ
ンケイ寒天プレートで選択し、ニトロセルロースフィル
ターに、レプリカ−平板化する。組み換えDNA CG−pBR
322/HLycIFN−１′ｂ（段階5e）の32P−ラベルPvu II−
Bg1 II＊断片（351pb）に交雑化（雑種化）する４−バ
クテリア、コロニーは、E.coli HB 101 CG−pBR 322/HL
ycIFN−１′b1−１′b4に示めされる。４・クローンの
抽出物は、前記載のように、IFN活性のために準備さ
れ、テストされる。次の活性が検出される： 抽出材料 IFN活性 組み換えDNAを含むE.coil HB 101 （IU/ml） CG−pBR 322/HLycIFN−１′b1 0;0 CG−pBR 322/HLycIFN−１′b2 0;0 CG−pBR 322/HLycIFN−１′b3 0;0 CG−pBR 322/HLycIFN−１′b4 30;30 プラスミドCG−pBR 322/HLycIFN−１′b4は、IFN活性を
もつポリペプチドの合成を方向づけることのできるcDNA
挿入を含む。
7.IFN活性をもつポリペプチドの高レベル生成のできる
組み換えプラスミドの構成およびそれらのプラスミドを
もつE.coli HB 101の形質転換 A.CG−pBR （AP）/LycIFN−α−１組み換えプラスミド
の構成 クローンE.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−１′b,
のIFN特異性タンパク収量を改良するために、図９に系
統的に示めしたように次の作成が行なわれる。
ａ cDNA挿入の製造 クローンE.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−１′ｂ
の組み換えプラスミドDNA（150μｇ）を標準法（段階5
d）を用いてPst I（バイオラボ）で開裂させる。次いで
フェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、除去され
た挿入は、50mMトリス・塩酸（pH8.0）および1mM EDTA
を含むシュクロース、デンシティグレディエント遠心
（５−23％）によって分離する。遠心は、15℃のもとで
TST 41ローター（コントロンAG）を用いて、35000rpmで
16時間行なう。各々の画分（0.3ml）をISCOグレディエ
ントコレクターを用いて1ml/分の速度で集める。小さい
断片を含む画分（例．挿入体）は、プールする。DNAを
エタノールで、例のように沈澱させ、沈澱物は０℃のも
とで、HB−４ローター（ソルバル）を用いて、10000rpm
で10分間遠心することによって集める。沈澱物は、10mM
トリス・塩酸（pH7.5）および0.05mM EDTAを含む緩衝液
（60μｌ）に再溶解する。DNA（30μｇ）は、光学的濃
度を測定することによって決定され、回収される。
挿入DNA（10μｇ）を、Hae III（バイオラボ）で分解
し、断片は50mMトリス、50mMホウ酸、1mM EDTAおよび0.
5μg/mlエチジウムブロマイドを含む溶液における２％
アガロースゲル上で分画化する。最も大きいDNA断片、H
ae III−Pst I（869bp）およびHae III−Hae III（82b
p、図９参照、断片３および４）は各々ゲルから切り取
り、0.15M塩化ナトリウム、50mMトリス・塩酸（pH8.
0）、1mM EDTAを含む溶液（5ml）中に注射器のついた細
い針を通じて墳出させ、一夜振とうすることによって溶
出する。溶出液は、DNAを吸着させるために100μlDE−5
2（ホワトマン）パスツールピペットカラムを通過させ
る。カラムを同じ緩衝液（2ml）で洗浄し、DNAを1.5M塩
化ナトリウム、50mMトリス（pH8.0）および1mM EDTAを
含む溶液（400μｌ）で溶出する。DNAは、エタノール
（２容量）で−20℃のもとで一夜沈澱させる。沈澱物
を、エッペンドルフ遠心機での遠心によって集める。
Hae III−Hae III DNA断片（86pb）は、再溶解し、Sau
3A（バイオラボ）で分解する。酸素は65℃もと30分間で
熱−不活性化する。Hae III−Pst I DNA断片（869bp）
（１μｇ）を加え、溶液を10mM塩化ナトリウム、10mM D
TTおよび0.5mMATPで調整し、T 4 DNAリガーゼ（バイオ
ラボ）（30ユニット／μｌ）、反応容器に加える。溶液
を、15℃のもとで10時間培養する。次いでフェノールお
よびクロロホルムで抽出し、混合物を、エチジウムブロ
マイドの存在下に、トリス−ホウ酸−EDTAにおける２％
アガロースゲル上で分画化する。Sau 3A−Pst I DNA断
片（図９参照、断片５）は前記載のように抽出され、エ
タノールで沈澱させ、10mMトリス・塩酸（pH7.5）およ
び0.05mM EDTAを含む溶液（10μｌ）に再溶解する。
b.pBR 322のβ−ラクトア（ラクタ）アマーゼ調整領域
（ApPr）を含むDNA断片の製造 プラスミドpBR 322をPst I（段階3b）で開裂し、エキソ
ヌクレアーゼBal 31（ベネスダ、リサーチ、ラボ）（４
ユニット/ml）で30℃のもとで４−10分間、β−ラクト
アマーゼコード化断片を除去するために処理する。
式５′−ATGTGTGATCACACAT−３′の化学的DNAリンカー
は、前記載（段階5a）の方法を用いて合成される。リン
カーは、好都合に連結することによってBal 31処理した
pBR 322 DNAに加える。得られる交雑（雑種）分子を、
制限エンドヌクレアーゼBc I（バイオラボ）およびEcoR
Iで開裂させる。分解した生成物は前記載のように（段
階2a）トリス−ホウ酸−EDTAにおける８％ポリアクリル
アミドゲルで分画する。DNA断片（ApPr DNA断片）は184
bpおよび234bpマーカーDNAsの間に移動し、前記載のよ
うに（段階7a）分離され、例のようにエタノールで沈澱
させる。沈澱物は10mMトリス・塩酸（pH7.5）および0.0
5mM EDTAを含む溶液に再溶解する。
c.ApPr DNA断片のcDNA挿入への連結およびプラスミドCG
−pBR（AP）/LyIFN−α−１の製造 ApPr DNA断片およびcDNA挿入を含む溶液をプールする。
混合物を10mM塩化マグネシウム、10mM DTTおよび0.5mM
ATPで調整し、T 4 DNAリガーゼ（バイオラボ）（30ユニ
ット／μｌ）で、15℃のもとで12時間培養する。次いで
フェノールおよびクロロホルムで抽出し、混合物を0.1
％低融解するアガロースゲル（バイオラド）で分画化す
る。得られたApPr DNA断片を、Pst I（バイオラボ）お
よびEcoR（バイオラボ）で次の操作で開裂した大きな断
片に加える。ApPr cDNA断片（約20μｌ）を含むゲル部
分を、pBR 322のPst I−EcoR I断片と混合し、65℃のも
とで２分間融解し、37℃に冷却し、0.5mM ATP、10mM DT
T、および10mM塩化マグネシウムで調整し、組み換えプ
ラスミドCG−pBR（AP）LyIFN−α−１を含む溶液を得る
ために、12時間、15℃のもとでT 4 DNAリガーゼ（バイ
オラボ）（30ユニット／μｌ）で培養する。
d.プラスミドCG−pBR（AP）LyIFN−α−１をもつE.coli
HB 101の形質転換 100mMトリス・塩酸（pH7.5）、100mM塩化カルシウム、
および100mM塩化マグネシウムを含む溶液1/10に、プラ
スミドCG−pBR（AP）/LyIFN−α−１を含む溶液に加え
る。合わせた溶液を、10分間、65℃で、リパーゼで不活
性化し、37°のもとで冷却する。溶液を、前記載（段階
４）のようにCa++処理したE.coli HB 101に形質転換す
るためにとり、テトラサイクリン10μg/mlで補足したマ
ックコンケイ寒天プレートに平板化する。形質転換した
コロニーは、IFN活性（段階６）のためにスクリーンす
る。IFN活性の最も高いレベルを生成するクローンを選
択し、E.coli HB 101 CG−pBR（AP）/LyIFN−α−１を
企図する。原クローンE.coli HB 101 CG−pBR 322/HLyc
IFN−１′ｂに比して、1300倍刺激を示めす、40000（IU
/ml）の活性が、検出される。
クローンCG−pBR（AP）/LyIFN−α−１の組み換えプラ
スミドDNAは、前記載のように（段階3c）培養から分離
し、cDNA挿入（IFN遺伝子）のヌクレオチド配列および
β−ラクトアマーゼ調節領域を確立することによって特
徴づけられる。結果を図10にまとめて示めす。
B.組み換えプラスミドGC−pBR（AP）LyIFN−α−３ クローンE.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−81′のI
FN特異性タンパク収量は、次のように改良される（図.1
1）： a.CG−pBR（AP）/LyIFN−α−１からβ−ラクトアマー
ゼ調節領域を含むDNA断片の製造 CG−pBR（AP）/LyIFN−α−1 DNA（100μｇ）を、Hind
III（バイオラボ）およびBg 1（II）（バイオラボ）で
開裂させる。次いでフェノール抽出およびエタノール沈
澱、切断除去したDNA断片を、50mMトリス・塩酸pH8.0お
よび1mM EDTAを含むシュクロースデンシティグレディエ
ント遠心（５−23％）によって分離する。遠心は、TST
60ローター（コントロンAG）を用いて58000rpmで15℃の
もとで４時間行なう。各画分（0.2ml）を前記載のよう
に集める。小さな断片（Hind III−Bg1 II）を含む画分
は、プールし、DNAを、エタノールで例のように沈澱さ
せる。沈澱物を10mMトリス・塩酸（pH7.5）および0.05m
M EDTAを含む20μｌに再溶解する。
b.cDNA挿入の製造 cDNA挿入は、前記載のように（7a章）Pst Iで、組み換
えプラスミドCG−pBR 322/HLycIFN−８′1から切断除去
する。
cDNA挿入（２μｇ）をSau 3A（バイオラボ）（2.5ユニ
ット）、臭化エチル（10mM/ml）中で分解し、37℃で60
分間培養する。分解物（消化物）を、フェノールで抽出
し、DNAをエタノールで前記載のように沈澱させる。DNA
断片は、50mMトリス、50mMホウ酸、1mM EDTAおよび0.5
μg/mlエチジウム・ブロマイドの溶液における1.2％ア
ガロースゲルで分画化する。
第二の最も大きいDNA（Sau 3A−Pst I:693bp）をゲルか
ら抽出し、7a）章記載のように精製する。DNAを10mMト
リス−塩酸（pH7.5）および0.05mM EDTAを含む溶液（20
μｌ）に再溶解する。
c.cDNA挿入（Sau 3A−Pst I）へのHind III−Sau 3A DN
A断片の連結 両方のDNA断片（〜50ng）の等量を、10mM塩化マグネシ
ウム、10mM DTT、T4 DNAリガーゼ（バイオラボ）（30ユ
ニット／μｌ）を含む0.5mM ATPに加え３時間、15℃の
もとで、培養する。混合物を、80℃で15分間培養し、50
mM塩化ナトリウムで調整する。DNA混合物を、Pst I（バ
イオラボ）（0.5ユニット）およびHind III（バイオラ
ボ）（１ユニット）で20分間、37℃で分解させる。DNA
は、フェノール抽出し、エタノールで沈澱させ、10mMト
リス・塩酸（pH7.5）および0.05mM EDTAからなる液（20
μｌ）に再溶解する。
得られた混合物の1/2は、10mM塩化マグネシウム、10mM
DTT、T 4 DNAリカーゼ（バイオラボ）（30ユニット／μ
ｌ）を含むATPにおけるプラスミドpBR 322（〜100ng）
の大きいHind III−Pst I DNA断片に加え、２時間、15
℃のもとで、組み換えプラスミドCG−pBR（AP）/LyIFN
−α−３を含む溶液を得るまで、連結化させる。
d.プラスミドCG−pBR（AP）/LyIFN−α−３をもつE.col
i HB 101の形質転換 前記の1/10溶液は、段階４）に記載のようにE.coli HB
101を形質転換するために用いる。形質転換したコロニ
ーは、前記載のようにIFN活性のためのテストに用いら
れる。
IFN活性の最も高いレベルを生成するクローンを選択
し、E.coli HB 101 CG−pBR（AP）/LyIFN−α−３を企
図する。
IFN活性を、前記載のように（段階６）測定する。原ク
ローンE.coil HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−８′1に比
して700倍刺激を示めす。70000（IU/ml）の活性が検出
される。
クローンCG−pBR（AP）/LyIFN−α−３の組み換えプラ
スミドDNAは、前記載（段階3c）のように培養から分離
され、cDNA挿入のヌクレオチド配列およびβ−ラクトア
マーゼ調節領域の確率によって、特徴づけられる。結果
を図12にまとめて示めす。
プラスミドCG−pBR（AP）/LyIFN−α−３のための構成
（作成）プロトコールは、すべてのα−IFN cDNA遺伝子
に対して用いることができ、または適当に、一般的にク
ロマトゾームα−IFN遺伝子を切断することもできる。
たとえば、プラスミドCG−pBR 322/HLycIFN−51から開
始して、プラスミドCG−pBR（AP）/LyIFN−α−２が、
プラスミドCG−pBR（AP）/LyIFN−α−３に対して記載
されたと同様の方法で得られる。この新しいプラスミド
は、GC−pBR 322/HLycIFN−51のDNA挿入、およびCG−pB
R（AP）/LyIFN−α−１からのβ−ラクトアマーゼ調節
領域を含む。前記載のように、企図されたクローン、E.
coli HB 101 CG−pBR（AP）/LyIFN−α−２を選択す
る。原E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−51に比し
て、５倍刺激を示めす。50000（IU/ml）のIFN活性が検
出される。cDNA挿入のヌクレオチド配列およびプラスミ
ドCG−pBR（AP）/LyIFN−α−２のβ−ラクトアマーゼ
調節領域は、前記載のように確立され、図13に示めす。
8.E.coli HB 101 CG−pBR（AP）/LyIFN−α−３株の発
酵規模での培養 E.coli HB 101 CG−pBR（AP）/LyIFN−α−３株は、１
溶液につき次の成分を含む培地番号Ｘで培養する： リン酸１水素ナトリウム・７結晶水 13.25g リン酸２水素カリウム 3.0 塩化ナトリウム 0.5 塩化アンモニウム 1.0 塩化カルシウム・２結晶水 0.015 硫酸マグネシウム・７結晶水 0.25 クエン酸鉄（III） 0,006 カスアミノ酸 18,0 酵母抽出物 2,0 セレロース 8,0 テトラサイクリン 0,01 培地集団とは別に、セレロースおよびテトラサイクリン
は、加熱滅菌および殺菌ろ過で各々殺菌する。培地番号
Ｘの500mlを含む３つの2l−振とうフラスコ中に、良く
増殖した寒天プラントから細胞を接種する。振とうフラ
スコを４つのバッフル装置をし、30℃のもとで、11時間
回転振とう培養をする。この前培養の1.5lを培地番号Ｘ
の300lを含む500l発酵のバッフルに移し、次の条件下で
培養する：振とう350−500rpm（平板な翼タービン）通
気速度0.3−1.0l/1min、発酵上部圧0.3bar、温度30℃、
溶解した酸素のレベルは、通気速度を増加させることに
よって50％飽和以下に落ちることから妨げられ、必要に
応じて、振とう速度を最大値にすることができる。
pHは、水酸化ナトリウムを添加することによって6.8以
上に調整する。約10時間の培養後、培養は最大インター
フェロン滴定値に達し〔アームストロング（29）の方法
によって測定〕、採収する。
9.HLyIFN−α−３の分離および精製 ａ）モノクローン抗体カラムのためのポリペプチド製造 pH7.2の培養肉汁（280l）を10℃に冷却し、細胞をAlfa
−Laval BRPX−207 de−Sludgerを用いて分離する。上
澄みは、IFN−活性を示めさない。集める前に、細胞塊
は、de−Sludgerの固いボウル内に集積し、上澄みを、2
0l溶菌化（溶解化）緩衝液〔50mMトリス・塩酸、50mM E
DTA、0.2M塩化ナトリウム、1mM PMSF（フェニルメチル
スルホニルフルオライド）、1mML−システィンを含む液
を塩酸でpH8.2に調整する〕に移し、遠心ボウルの中味
（7l）を全−de−Sludgingで排出する。de−Sludger
を、３回溶菌化緩衝液Ａで洗浄する。得られた細胞塊
は、緩衝液Ａで調整して20lにし、pH6.9にする。５−10
℃に冷却後、懸濁液を、ポリウレタン振とうデスクおよ
び1170mlガラス球（直径0.5−0.75mm）を用いて、振と
う速度3350rpm、供給速度5l/hで、DYNO −ミル（型KDL
−Pilot,1.41）を通過させ、細胞を破壊する。溶菌化緩
衝液Ａ（800ml）（ポリエチレンイミン100gを加えて塩
酸でpH8.2で調整する）を破壊した細胞の懸濁液を２℃
もとでおだやかにかきまぜながら加える。約pH7.6の懸
濁液は、３時間−２℃に冷却し、遠心する。上澄み液
（17.2l）に硫酸アンモニウム（3028g）加える。かすか
に混濁した混合物を、６℃で一時間放置した後、遠心す
る。上澄み液を硫酸アンモニウム（4324g）加え、一夜
放置した後、3000rpmで遠心する。湿った遠心化物（約1
224g）は、緩衝液Ｂ（25mMトリス・塩酸に10μM PMSFを
加えて塩酸でpH8.5に調整する）に望ましいペプチドを
含む液（2800ml）を得るために溶解する。
ポリペプチド溶液700mlを、室温で緩衝液Ｂ（7l）を用
いて、アミコンDC−２ホローフィーバーシステム（Amic
on DC−2,Hollow Fibre System）によって、HIPIOホロ
ー・フィルター・カートリッジを通して分離ろ過する。
フィルターカートリッジ緩衝液Ｂで洗浄し、分離ろ過し
た液と洗浄液を合わせて（1440ml）、前もって緩衝液Ｂ
で平衡化した450mlのベッド容積のDEAEカラム（トリサ
イクル M DEAE,LKB2205−300）に、流速200ml/hで、通
過させる。280nmでUV吸収をもつ第１ポリペプチド画分
は捨てる。カラムを更に緩衝液Ｂで、少なくても５倍の
ベット容量が、280nmでベースライン吸収をもつまで洗
浄する吸着されたポリペプチドを、緩衝液Ｃ（0.2M塩化
ナトリウム、25mMトリス・塩酸、pH8.5）で溶出する。
カラムクロマトグラフィーは、４℃で行なう。溶出液は
アームストロング（29）の方法によって測定し、IFN活
性１・４・105IU/mgポリペプチドを示めす。溶出液は、
2M塩酸でpH7.4に調整し、液（100ml）は、モノクロナル
抗体カラムに使用するまで、−20℃もとで、凍結してお
く。
ｂ）モノクロナル抗体カラムでのヒトLyIFN−α−３の
精製 モノクロナル抗体カラム1K2−20（ベッド容積0.8ml下記
参照）をPBS（リン酸−緩衝化塩化ナトリウム:0.137M塩
化ナトリウム、0.0027M塩化カリウム、0.0077Mリン酸１
水素ナトリウム・12結晶水、0.0015Mリン酸２水素カリ
ウム、pH7.4）で平衡化し、前記ポリペプチド溶液（10m
l）をこのカラムに、室温のもとで、流速10ml/hで適用
する。吸収されないポリペプチドを含む最初の画分およ
びPBS洗浄液（3ml）を捨てる。更に非特異性結合ポリペ
プチドを、付加的0.5M塩化ナトリウムおよび0.2％トリ
トン×100を含むPBS（3ml）で溶出する。カラムをPBS
（3ml）で洗浄し、特異的に吸収したポリペプチドを、
緩衝液Ｄ（0.1Mクエン酸、0.3M塩化ナトリウム、pH2）
（3ml）で溶出する。この画分と続いてのPBS−洗浄液を
合わせて、2N水酸化ナトリウムでpH6.3に調整し、４℃
のもとで液浸用−CXTM分子分離器（ミリポレ ）を用い
て10倍に濃縮する。濃縮液を、0.025Mヒスチジン・塩酸
pH6.3で平衡化したセファデックスＧ−25ファインカラ
ム（2.6×34cm,200mlベット容積）に、適用する。４℃
のもとで、カラムは、流速42ml/hで、0.025Mヒスチジン
・塩酸pH6.3で溶出し、各々の画分（10.5ml）で20画分
を集める。ポリペプチドを含む画分を、280nmでの吸収
で検査する。画分７および８にアームストロング（29）
の方法によって検査されるようにIFN活性をもつポリペ
プチドが含まれる。LyIFN−α−３を含む活性画分を、
更に使用するまで−20℃で保存し、または氷浴におく。
画分のIFN活性は、１・８・108IU/mgポリペプチド（2
9）である。
前記画分を凍結乾燥することによって、1ml溶液からポ
リペプチド（20−40μｇ）が得られる。
得られたLyIFN−α−３のSDSポリアクリルアミドゲル電
気泳動〔（49）参照〕の結果は、分子量、約18kダルト
ンであることを示めす。
ポリアクリルアミドゲル（100μＭ）上でウルトラ薄層
等電性フォーカスでpH4.5−6.5の範囲内で、B.J.ラドラ
（50）に方法に基づいて行ない、純粋な活性ヒトLyIFN
−α−３の5.3−5.4pHユニットの等電点を示めす。
ｃ）モノクロナル抗体カラム1K2−20の製造 （Ａ）マウスの免疫法 Balblcマウス（８週目、シッセルン動物農場、スイス）
に、ヒト白血球IFNの（純度１％）の３×105ユニット
〔完全なフロイド野補助剤（デフコ）において、４フー
トパット（foot pads）に配分して〕を注入する。30日
目に、不完全なフロイド補助剤におけるIFNの同量を、
同様の方法で注入する。第三の注入は、85日目に行なわ
れ、塩化ナトリウムにおけるヒト白血球IFNの４×105ユ
ニットを腹腔内に注入する。四日後に、脾臓は融合のた
めにとり出される。
（Ｂ）ハイブリドマス（hydridomas）の製造X63−Ag8−
653ミエロマ系列（52）を用いてのすべての融合実験
は、ケーラーとミルスタイン（53）の方法に基づいて、
50％ポリエチレングリコール（PEG 1500,セルバ）の1ml
に108脾細胞と107ミエロマ（myeloma）細胞を混合する
ことによって（54）、本質的に行なわれる。洗浄後、細
胞を、標準ドルベコ（Dulbecco′ｓ）最小エキス倍地
（キブコGibco）48mlに再懸濁する。融合につき15％胎
子牛血清および正常マウス腹腔浸出細胞（３×106）を
供給細胞として加える。細胞を48×1mlコスター、ウイ
ル（costar wells）に分配する。培養に週に二回、標準
選択培地（53）を３−６週間供給する。雑種が増殖した
後、凍結し、上澄み液は下記載のように抗−IFN活性の
検査をする。雑種細胞（hybridoma cells）のクローニ
ングは、ミクロ−滴定（microtiter）プレートにおける
希釈の限界によってなされる。
（Ｃ）抗体分析（検査） IFN−α（最終10−20ユニットINE/ml）の上澄み（５μ
ｌ）の抗−IFN活性のテストのために、室温のもとで、
培養上澄み液（50μｌ）と培養し、30−60分後IFNの残
余活性を、標準IFN分析法によって、テストする。この
方法は、好都合な抗体のために、失敗したか、もしくは
ハイブリド又上澄み分析のために非再現性の結果を与え
るかにとって具合が良い。次の組み合わせ免疫−沈降
（沈澱）−生物検査は、この目的のために開発した。粗
IFN−α（104U/ml）50μｌを同量の培養上澄みと混合
（マイクロチューブ3810中で、エッペンドルフ）し、混
合物は、２−４時間37℃で培養する。次いで、先に滴定
したラビット抗−マウスIg抗体（ノルディク）50μｌを
加え、混合物を、はじめ37℃で１時間、次いで４℃のも
とで16時間免疫コンプレックスが生成するまで培養す
る。チューブは５分間冷室内で12,000rpmで遠心する。
上澄みをとり、沈澱は、一度緩衝化塩化ナトリウムpH7.
2（1ml）、で洗浄する。洗浄後、沈澱を塩化ナトリウム
液pH2.2（200μｌ）に再溶解する。IFN活性はアームス
トロング（29）の方法に基づいて測定する。
（Ｄ）腹水液から分離した抗−IFN活性の精製。
Balblcマウスに、前もって腹腔内にプリスタン0.4ml
（カールルス）を注入する。一週間後、マウスに腹腔内
にハイブリドマ細胞を注入する。腹水液をくり返し、各
々のマウスから採液する。液は、プールし、−80℃で凍
結する。上部の脂肪は吸い上げて捨てて、残破片物（デ
ブリス）のない上澄みは、とっておく。必要な場合、遠
心をくり返す。粗イムノグロブリン画分は、室温のもと
で腹水液を18％硫酸ナトリウム沈澱させることによって
得られる。次いで、この画分をセファアクリルG200（フ
ァーマシア）にかけファーマシアによる指示どおりに0.
1Mトリス・塩酸緩衝液pH8.2を用いて溶出する。活性画
分をプールし、アミコンXM50フィルター（アミコン）で
濃縮する。タンパクは、280nmで1cmのキュベットを使用
して、タンパク1mgで1.2吸収になるように調整して、OD
280で測定する。
（Ｅ）免疫吸収カラム1K2−20 安定させたアフィーゲル（Affi−Gel）10（バイオーラ
ド）1mlに、バイオーラドの指示に従って、モノクロナ
ル抗−IFN抗体のイムノグロブリン（15ing）とカップリ
ングさせる：アフィーゲル100は、ガラスで接続した漏
斗上で冷蒸留水、次いで0.1M炭酸水素ナトリウム液pH8.
0（カップリング緩衝液）で洗浄する。カップリング緩
衝液における50％ゲルを、プラスチックチューブに移
し、同量の精製した抗体溶液と混合し、４時間室温で回
転させる。カップリング後、ゲルをカップリング緩衝液
で洗浄し、未反応位置をしゃ断するために、ゲルmlのつ
き1Mエタノールアミン−塩酸（pH8.0）0.1mlと、室温の
もとで反応させる。ゲルは、10mM三窒化ナトリウムの存
在下で、リン酸−緩衝化塩化ナトリウムで洗浄し、４℃
で保つ。得られるゲル0.8mlは、ヒトLyIFN（上記参照）
の製造のために使用するモノクロナル抗体カラム（1K2
−20）製造のために用いる。
10.医薬用製造（非経口的投与） リンパ芽球インターフェロン（2mg）、たとえば、１・
８・108ユニット/mgの特異活性をもつクローンE.coli H
B 101 CG−PBR（AP）/LyIFN−α−３（例９参照）から
分離したLyIFN−α−３を5Nヒト血清アルブミン（30m
l）に溶解する。得られる溶液を細菌学で用いられるフ
イルターを通過させ、ろ液を無菌条件下に、精製したリ
ンパ芽球インターフェロン各々3.6×106ユニットを含む
100バイヤルに分ける。このバイヤルは非経口投与に適
しており、好ましくは冷暗所（例−20℃）に保存する。
同様の操作で、7.2×106もしくは1.0×107ユニットを含
むバイヤルを、各々上記のリンパ芽球インターフェロン
４もしくは6mgを用いて製造することも可能である。
準備された微生物の保管 ここで記載された方法によって製造された組み換えDNA
分子および微生物は、培養によって例示され、農学研究
培養コレクション（NRRL）（1981年９月14日）の培養コ
レクションにおいて保管されており、次の継承番号が割
り当てられている。E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−β１:NRRL B−12
528E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−41:NRRL B−1252
9E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−１′b:NRRL B−1
2530E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−51:NRRL B−1253
1E.coli HB 101 CG−pBR 322/HLycIFN−８′1:NRRL B−1
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するための遺伝子，誘導されたプラスミド組み換えおよ
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ミノ酸配列をもつ微生物学的に合成されたポリペプチ
ド,DNAおよびプラスミド，この配列のためにコード化し
た微生物，それはこの遺伝情報を含みおよびそれらの合
成方法”ヨーロッパ特許出願番号34306（ヒエーヒスト
アクチュンゲゼルシャフト） 23.T.タニグチら，“ヒト白血球および線維芽細胞イン
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ターフェロンの合成に関する改良法",ドイツ公開公開公
報番号2,946,275（トマエ） 29.アームストロング，“ラビットインターフェロンの
ためのセミ−ミクロ色素−結合分析",Appl.Microbiol.2
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【図面の簡単な説明】
第１図はナマルワds CDNAの合成プロセスおよび組み換
えDNA分子の構成の説明図であり、 第２図はα１およびβ IFN mRNAへの相補的なDNAプライ
マー（13mer）の合成プロセスの説明図であり、 第３図はHuIFN−βおよびHuIFN−α特異性検体の合成プ
ロセスおよびヒトリンパ芽球IFN−含有クローンの同定
のための使用の説明図であり、 第４図は組み換えプラスミドDNA CG−pBR 322/HLycIFN
−Ibのｃ−DNA挿入のヌクレオチド配列の説明図であ
り、 第５図は組み換えプラスミドDNA CG−pBR 322/HLycIFN
−β１ c−DNA挿入のヌクレオチド配列の説明図であ
り、 第６図は、組み換えプラスミドDNA CG−pBR 322/HLycIF
N−41のｃ−DNA挿入のヌクレオチド配列の説明であり、 第７図は組み換えプラスミドDNA CG−pBR 322/HLycIFN
−８′1のｃ−DNA挿入のヌクレオチド配列の説明図であ
り、 第８図は組み換えプラスミドDNA CG−pBR 322/HLycIFN
−51挿入のヌクレオチド配列の説明図であり、 第９図はCG−pBR（AP）/LyIFN−α−１組み換えDNAの構
成の説明図であり、 第10図はCG−pBR（AP）/LyIFN−α−１の配列の説明図
であり、 第11図は組み換えDNAプラスミドCG−pBR（AP）/LyIFN−
α−３の構成の説明図であり、 第12図はCG−pBR（AP）/LyIFN−α−３の配列の説明図
であり、 第13図はCG−pBR（AP）/LyIFN−α−２の配列の説明図
である。 第２図中Ｍはモノメトキシトリチル基である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１２５３０ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１２５３１ 微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１２５３２ (56)参考文献 Ｎａｔｕｖｅ，1980〔287〕Ｐ．408− 411 Ｎａｔｕｖｅ，1981〔290〕Ｐ．20−26 Ｓｃｉｅｎｃｅ，1980〔209〕Ｐ．1343 −1347 Ｎａｔｕｖｅ，1980〔287〕Ｐ．401− 408

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次のアミノ酸配列： を有するHLycIFN-51；及び 次のアミノ酸配列： を有するLyIFN−α−2; から成る群から選択されるヒトα−インターフェロン活
    性を有するポリペプチドをコードしているDNA配列を含
    有する組換えDNA。
  2. 【請求項２】前記DNA配列がHLycIFN-51をコードしてい
    る特許請求の範囲第１項に記載の組換えDNA。
  3. 【請求項３】前記DNA配列がLyIFN−α−２をコードして
    いる特許請求の範囲第１項に記載の組換えDNA。
  4. 【請求項４】CG-pBR322/HLycIFN-51である特許請求の範
    囲第１項に記載の組換えDNA。
  5. 【請求項５】β−ラクタマーゼ遺伝子の発現制御配列を
    含有する特許請求の範囲第１項に記載の組換えDNA。
  6. 【請求項６】CG-pBR（AP）/LyIFN−α−２である特許請
    求の範囲第１項に記載の組換えDNA。
  7. 【請求項７】次のアミノ酸配列： を有するHLycIFN-51；及び 次のアミノ酸配列： を有するLyIFN−α−2; から成る群から選択されたヒトα−インターフェロン活
    性を有するポリペプチドをコードするDNA配列を含有す
    る組換DNAの少なくとも１つにより形質転換された細
    菌。
  8. 【請求項８】大腸菌（Escherichia coli）の株である、
    特許請求の範囲第７項に記載の形質転換された細菌。
  9. 【請求項９】大腸菌（E. coli）HB101 CG-BR322/HLycIF
    N-51である、特許請求の範囲第７項に記載の形質転換さ
    れた細菌。
  10. 【請求項１０】大腸菌（E. coli）HB101 CG-pBR（AP）/
    LyIFN−α−２である、特許請求の範囲第７項に記載の
    形質転換された細菌。
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