JPH06105909A - 抗血小板抗体吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 特定のアミノ酸配列を含有するペプチドある
いはこれを修飾した有機化合物を用いることにより、抗
血小板抗体と結合させてこれを除去する方法および上記
ペプチドまたは有機化合物を水不溶性担体に固定化した
抗血小板抗体吸着材を提供する。 【構成】 抗血小板抗体との結合性を有するアミノ酸配
列のペプチドまたはそのペプチドの両端あるいは片端が
１ないし６０個のアミノ酸または式−Ａ−（ＣＨ ₂ ）_n
−Ｂ−（Ａ，ＢはＮＨまたはＣＯ，ｎは１ないし２０の
整数）で示される側鎖がペプチド結合により結合してい
る修飾ペプチドのうち、少なくとも１種類を水不溶性担
体に固定化したことを特徴とする抗血小板抗体吸着材お
よびその製法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は何らかの原因により血液
中に産生された自己抗体である抗血小板抗体を、特定の
アミノ酸配列を含有しているペプチドまたは該ペプチド
領域を含む有機化合物を利用して、抗血小板抗体と結合
させることを特徴とする抗血小板抗体の除去方法および
該ペプチドあるいは有機化合物を担体に固定化したこと
を特徴とする抗血小板抗体吸着材に関するものである。
本発明は特に抗血小板抗体の存在による血小板数の減少
に起因して、出血，紫斑などの諸症状をもたらす特発性
血小板減少性紫斑病（以下ＩＴＰと言う）のような疾患
に関する治療において非常に有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】ＩＴＰは自己免疫疾患の一種であり、血
小板寿命の短縮，血小板結合免疫グロブリンである抗血
小板抗体の増加を特徴とし、骨髄では巨核球数は正常あ
るいは増加を示し、他の血液疾患の存在を示唆する所見
を認めない免疫性の血小板減少症のうち膠原病，リンパ
増殖性疾患，薬剤アレルギーなどの原因疾患の認められ
ないものを指す。

【０００３】ＩＴＰは急性型と慢性型に分けられる。急
性型は小児に多く見られ、出血症状は激しいが比較的治
癒はしやすい。発症３週間以前に上気道感染，ウイルス
感染などの先行感染が認められることが多い。感染の回
復期に血小板減少を認めることから、形成された免疫複
合体が血小板膜Ｆｃ受容器に結合し、血小板が非特異的
に破壊される免疫複合病の可能性が強い。一方慢性型は
出血症状は弱いが長期間持続し、成人で特に２０才代の
女性に多く、抗血小板抗体による自己免疫病と考えられ
ているものである。

【０００４】抗血小板抗体による血小板数の減少により
見られる症状には個人差があるが、一般的には血小板数
５００００個／μｌ以上では通常出血症状は見られず、
３００００ないし５００００個／μｌでは外傷時の易出
血性，斑状出血，１００００ないし３００００個／μｌ
では露出部への紫斑の出現，月経過多，１００００個／
μｌ以下では血尿，不正性器出血，鼻出血，歯肉出血が
認められ、頭蓋内出血，消化管出血がしばしば直接の死
因となっている。

【０００５】ＩＴＰの治療に際してはその症状の程度に
応じて副腎皮質ホルモン剤の投与，脾臓の摘出，免疫抑
制剤の投与などが適用される。しかしこうした薬物療法
や摘脾手術では血小板数が効果的には回復しないような
症例も多く存在している。ＩＴＰをはじめ種々の自己免
疫疾患の発生に関するメカニズムはまだ十分には解明さ
れておらず、こうした患者に対する治療方法についても
絶対的なものは確立されていないのが現状であり対策が
急がれている。

【０００６】こうした自己免疫疾患の治療方法として、
免疫吸着カラムを用いた血液の体外循環による自己抗体
の吸着除去も種々試みられている。たとえば免疫グロブ
リンと結合性を有するプロテインＡを担体に固定化した
カラムの適用も検討されている。しかしプロテインＡは
高価であり、吸着特異性の点で優れず、さらには副作用
の問題も有しておりあまり有用なものではない。また除
去対象物質に対する抗体の固定化カラムも種々検討され
ているが、安全性，保存安定性の問題，抗体が有効に反
応できるような固定化が困難なこと，滅菌方法が限定さ
れるなどの理由から医用機材として用いるには多くの課
題がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は絶対的な治療
方法が確立されていないＩＴＰの効果的な治癒を可能に
する目的で、血液中の抗血小板抗体を認識して結合性を
有するような比較的低分子量のペプチドあるいは修飾ペ
プチドにより結合させ除去しようとするものである。ま
た上記ペプチドまたは修飾ペプチドを水不溶性担体に固
定化した吸着材を提供し、さらにはこれを充填したカラ
ムを用いて体外循環などによる血液浄化療法に適用しよ
うとするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成した本発
明は抗血小板抗体の抗原決定基となりうるアミノ酸配列
を含有しているペプチドあるいは修飾ペプチドによる抗
血小板抗体の除去を要旨とするものである。上記ペプチ
ドあるいは修飾ペプチドを水不溶性担体に固定化するこ
とにより抗血小板抗体吸着材が得られ、これを充填した
カラムを用いて体外循環などによる血液浄化治療が可能
である。

【０００９】一般にＩＴＰ患者における抗血小板抗体は
血小板膜表面に存在する糖タンパク質の複合体であるＧ
Ｐ２ｂ／３ａやＧＰ１ｂ／９に対する抗体であること多
いことが知られている。本発明におけるペプチドあるい
は修飾ペプチドとはこれらの糖タンパク質の一次構造か
ら種々の方法により抗原決定基となりうる領域を予測お
よびスクリーニングすることにより決定されたアミノ酸
配列を有するもの、あるいは得られたペプチドを１ない
し６０個までの他のアミノ酸または−ＮＨ（ＣＨ₂ ）_n
ＣＯ−（ｎは１ないし２０の整数）で示される側鎖がペ
プチド結合により結合した修飾ペプチドのことである。

【００１０】ＧＰ３ａは分子量約１０５キロダルトンの
１本のポリペプチドから成る糖タンパク質であり、すで
にｃＤＮＡがクローニングされている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６２，３９３９，１９８７）。７６２個
のアミノ酸残基から構成されており、Ｎ末端部には２６
アミノ酸残基から成るシグナルペプチドが存在する。細
胞外の部分は６８９個，膜貫通ドメインは２９個，細胞
質内は４１個のアミノ酸が存在する。４６０ないし６２
７番目のアミノ酸残基から成る領域には３３ないし３８
個のアミノ酸より成るシステインリッチなドメインの繰
返しが４ヵ所存在する。

【００１１】ＧＰ２ｂは分子量が約１４０キロダルトン
であり、約１２５キロダルトンのＨ鎖と約２５キロダル
トンのＬ鎖から構成されておりこれらがＳＳ結合により
結合している。１０３９個のアミノ酸残基から成りその
配列が決定されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２
６２，８４７６，１９８７）。Ｈ鎖には８７１個、Ｌ鎖
には１３７個およびＮ末端部には３０アミノ酸残基から
成るシグナルペプチドが存在する。膜貫通ドメインはＬ
鎖内に存在し２６個の疎水性アミノ酸より構成される。

【００１２】ＧＰ３ａとＧＰ２ｂは骨髄中の骨髄巨核球
またはその前駆細胞において複合体を形成する。血小板
膜表面においてＧＰ２ｂとＧＰ３ａは非共有結合により
１：１の複合体を形成している。ＧＰ２ｂにおける５５
８ないし７４７番目のアミノ酸残基の部分とＧＰ３ａに
おける１１４ないし３０３番目のアミノ酸残基の部分と
で会合していることが推定されている（医学のあゆみ，
１６０，６８１，１９９２）。本分子上にはフィブリノ
ーゲンなどの粘着性タンパク質に対する受容体が潜在す
る。ＧＰ２ｂ／３ａは血小板膜表面上に最も多く存在し
ている糖タンパク質である。

【００１３】ＧＰ１ｂ／９はＧＰ１ｂα鎖，β鎖，ＧＰ
９の３つのサブユニットから構成され、非活性化状態の
血小板が内皮下組織に存在するｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒ
ａｎｄ因子を認識する際の膜受容体であり血小板血栓形
成のごく初期段階を制御する分子として重要と考えられ
ている。α鎖とβ鎖はＳＳ結合で結ばれており、分子量
はそれぞれ１４０キロダルトンと２４キロダルトンであ
る。ＧＰ９は１７ないし１８キロダルトンであり、非共
有結合的にＧＰ１ｂに結合していると考えられる（医学
のあゆみ，１６０，６７７，１９９２）。いずれについ
てもアミノ酸配列が決定されており、α鎖は６１０個
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
４，５６１５，１９８７）、β鎖は１８１個（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２１
３５，１９８８）、ＧＰ９は１６０個（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，６７７３，１
９８９）のアミノ酸残基から成る。

【００１４】上記の各糖タンパク質に関する抗血小板抗
体に対する免疫原性を有するペプチドとしては、最も多
く存在しているＧＰ２ｂ／３ａを例にするとＧＰ３ａの
アミノ酸配列中において、６８ないし７８番目に相当す
るＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ，３４９ない
し３６４番目のＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｓｅ
ｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ，４７５な
いし４９０番目のＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ，６１９
ないし６２３番目のＬｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−
Ｇｌｕ，７４１ないし７４４番目のＴｈｒ−Ａｌａ−Ａ
ｓｎ−Ａｓｎの５つの領域がエンザイムイムノアッセイ
（以下ＥＬＩＳＡ法と言う）により確認された領域であ
る。これらの領域はいずれも親水性の比較的強い領域で
あり、ＧＰ３ａ分子表面に存在している領域であること
が推定される。またＧＰ２ｂに関してはＧｌｕ−Ｔｈｒ
−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（１０６な
いし１１２番目），Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（１４８ない
し１５６番目），Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（８９６ないし９０３番
目）の３つの領域が抗血小板抗体に対して免疫原性を有
している。これらも親水性の強い領域であり分子表面に
存在することが推定される。またＧＰ１ｂ／９に関して
も数種のペプチドについて抗血小板抗体に対する免疫原
性が確認されている。

【００１５】上記に示した領域は抗血小板抗体との結合
に最小限必要な領域であると考えられる。実際にこうし
たペプチドを用いて抗血小板抗体を除去することを行な
う場合には、血液中に存在する抗血小板抗体との反応様
式に近い状態を再現する必要がある。また血液中に存在
する場合の構造の安定性や、あるいは担体に固定化する
場合には水系溶媒に対する溶解性を大きくしたりするこ
とを考慮する必要があることが多い。

【００１６】そこで上記に示したペプチド領域の一方の
末端または両末端の領域を各タンパク質のアミノ酸配列
に従って領域を延長したり、たとえばリジンのような水
溶性を大きくするようなアミノ酸を数個末端に結合させ
たり、システインのようなアミノ酸を末端に結合させて
担体に固定化しやすくするなどすることが好ましい。実
際に用いるペプチドまたは修飾ペプチドの全アミノ酸残
基数としては６０個以内であることが好ましいが、合成
の困難さやコスト，安定性などを考慮すると３０個以内
がより好ましい。さらに免疫原性を発現するのに要する
高次構造の形成しやすさなども考慮すると１０ないし２
５個までが最適であると言える。

【００１７】また固定化反応や安定性などを考慮して、
たとえばＮ末端をアミド化したり、末端に適当な官能基
を導入したりして上記ペプチドを修飾した有機化合物を
用いることも好ましい。また複数のペプチドを−Ａ−
（ＣＨ₂ ）_n −Ｂ−（Ａ，ＢはＮＨまたはＣＯを示す）
で示されるような側鎖を用いて結合させたものも抗血小
板抗体との結合性をより高めることが可能である。この
場合のｎの値は１ないし２０が好ましく３ないし１０が
より好ましい。

【００１８】ペプチド合成の方法については特に限定さ
れるものではないが、液相合成法よりも固相合成法を適
用する方が操作が簡単である。この場合有機溶媒に不溶
性である支持体に合成するペプチドのＣ末端に対応する
アミノ酸を結合させ、Ｎ末端方向にαカルボキシル基以
外のαアミノ基などの官能基を保護した対応するアミノ
酸を順に縮合反応により結合させた後、結合した後その
保護基を脱離させる反応を交互に繰返すことによりペプ
チド鎖を延長させる。

【００１９】目的とするペプチドが得た後、ペプチド鎖
を支持体から切断および脱保護基を行なう。これにはフ
ッ化水素がしばしば用いられるが、安全性，取扱いやす
さの点からトリフルオロメタンスルホン酸（以下ＴＦＭ
ＳＡと言う）を用いるのが適当である。チオアニソー
ル，１，２−エタンジオールとＴＦＭＳＡ中で反応させ
脱保護基を行なった後、トリフルオロ酢酸（以下ＴＦＡ
と言う）により支持体からの切断を行ないペプチドを回
収する。これを凍結乾燥することによりクルードペプチ
ドが得られる。

【００２０】上記クルードペプチドは逆相系カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィ（以下ＨＰＬＣと言う）
に供することにより分取，精製を行なう。ＨＰＬＣ条件
は通常タンパク質の精製に用いる系を基本として最適化
を行なうのがよい。得られたクロマトピークに相当する
画分を分取しこれを凍結乾燥する。得られた精製ペプチ
ド画分についてマススペクトル分析による分子量解析，
アミノ酸組成分析あるいはアミノ酸配列解析などにより
同定を行なう。

【００２１】上記ペプチドあるいは有機化合物を固定化
する場合に用いる水不溶性担体としては特に限定される
ものではないが、血液浄化に用いる場合には血液中成分
と接触した際の補体系や凝固系などへの影響を考慮する
必要性があることから、セルロース，ポリスチレン，ポ
リビニルアルコール，ポリアクリル酸エステルあるいは
これらの誘導体の多孔質担体を用いるのが好ましい。平
均細孔径は２０ないし３０００ｎｍのものが好ましく、
３０ないし１０００ｎｍのものがより好ましい。また担
体の形態としてはビーズ状，繊維状，膜状（中空糸も含
む）などいずれも可能である。

【００２２】またリガンドの導入の際には立体障害を小
さくすることにより吸着効率の向上させ、非特異的吸着
を抑えることを目的として、親水性スペーサーを介して
固定化することがより好ましい。親水性スペーサーとし
てはたとえば両末端をカルボキシル基，アミノ基，アル
デヒド基，エポキシ基などで置換されたポリアルキレン
オキサイドの誘導体を用いるのが好ましく、その重合度
は１０ないし１０００のものが好ましく、１００ないし
５００のものがより好ましい。

【００２３】上記のリガンドに用いるペプチドや有機化
合物は比較的安定で低分子量の物質であり、たとえば酵
素や抗体のようなタンパク質を固定化する場合と比較し
てその固定化反応条件は制約が少なくなることも有利な
要因の一つである。したがって固定化方法については特
に限定されるものではないが、酵素や抗体を固定化する
場合にしばしば用いられるシッフ塩基反応，エポキシ反
応，カルボジイミド試薬などを用いた縮合反応などによ
る固定化方法を適用することが好ましい。

【００２４】

【実施例】本発明におけるペプチド系物質の水不溶性担
体への導入方法は上記に述べたものを基本とすれば特に
限定されるものではない。以下に実施例を用いて本発明
を説明する。

【００２５】＜実施例１＞ Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒのセルロースへの固定化 （１）ペプチドの合成 ＧＰ３ａにおいて免疫原性を有する６８ないし７８番目
までの領域のＮ末端にリジン残基を２個結合させたＬｙ
ｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒの
配列を有するペプチドの合成をペプチドシンセサイザー
Ｍｏｄｅｌ４３０Ａ（アプライドバイオシステムズ社
製）を用いて固相合成法により行なった。Ｃ末端のセリ
ンの結合した支持体であるＰＡＭセリン（ｔ−Ｂｏｃ−
Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ））０．５ｍｍｏｌ（アプライドバ
イオシステムズ社製）を用いて、Ｎ末端の方向に順に上
記ペプチドシンセサイザーに掲載されている合成プログ
ラムにより脱保護基反応および縮合反応を繰返してペプ
チド鎖を延長した。すなわちＴＦＡおよびジクロロメタ
ン（以下ＤＣＣと言う）により保護基であるｔ−ブトキ
シカルボニル基の除去を行ない、ジクロロメタン（以下
ＤＣＭと言う）で洗浄し、ジイソプロピルエチルアミン
およびＤＣＣで中和した後、ジメチルホルムアミド（以
下ＤＭＦと言う）で洗浄し、ＤＭＦで縮合反応を行な
い、ＤＣＭで洗浄する操作を繰返した。アミノ酸はｔ−
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓ
ｅｒ（Ｂｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚ
ｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅ
ｕ・Ｈ₂Ｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ（いずれもアプラ
イドバイオシステムズ社製）の２．０ｍｍｏｌのカート
リッジを用いた。

【００２６】（２）脱保護基，ペプチド鎖の切断 上記の反応が終了した支持体１ｇにチオアニソール１ｍ
ｌ，１，２−エタンジオール０．５ｍｌを加えて１０分
間攪拌した後、氷水で冷やしながらＴＦＡ１０ｍｌを加
えて１０分間攪拌した。さらにＴＦＭＳＡ１ｍｌを加え
て室温で３０分間攪拌した。これにあらかじめ冷やして
おいたジエチルエーテルを沈殿が現れなくなるまで加え
て攪拌し、ミディアム孔のガラスフィルターを用いてジ
エチルエーテルで共洗いしながら濾過し、ＴＦＡを加え
てペプチドを溶解してエーテル中に補集した。エーテル
中のペプチドをファイン孔のガラスフィルターで濾過
し、ガラスフィルター上のペプチドを２Ｎ酢酸に溶解し
て、凍結乾燥を行ないクルードペプチドを得た。

【００２７】（３）ペプチドの精製 上記クルードペプチドを再度２Ｎ酢酸に溶解して、０．
２μｍのメンブレンフィルターで濾過した溶液をＨＰＬ
Ｃに供した。ＨＰＬＣはＭｏｄｅｌ１３０Ａシステム
（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、カラムは
逆相系のＡｑｕａｐｏｒｅ Ｐｒｅｐ−１０，Ｃ８（ア
プライドバイオシステムズ社製）を用いた。移動相は
０．１％ＴＦＡを含む水をＡ液，０．１％ＴＦＡを含む
７０％アセトニトリル／水（ｖ／ｖ）をＢ液として、Ａ
液からＢ液への濃度直線勾配により溶出した。クロマト
ピークはほぼ単一なものが得られ、相当画分を分取し
た。分取を数回繰返し、これを凍結乾燥することにより
精製ペプチドを得た。得られたペプチドはＢＩＯＩＯＮ
２０マスアナライザー（アプライドバイオシステムズ社
製）により解析して目的ペプチドが得られていることを
確認した。

【００２８】（４）ペプチドの免疫原性 得られたペプチドの免疫原性を赤血球凝集反応により確
認した。Ａｌｓｅｖｅｒ液保存ヒツジ赤血球（セダレー
ン社製）を２．５％濃度（ｖ／ｖ）になるようにＰＢＳ
（ｐＨ７．２）に浮遊させた。浮遊液１０ｍｌに０．０
０５％タンニン酸溶液を加えて３７℃で１５分間攪拌し
て反応させ、上記ＰＢＳで１５００ｒｐｍ，１０分の遠
心分離により洗浄した後１０ｍｌの生理食塩水に再度浮
遊させた。一方上記精製ペプチドを２ｍｇ／ｍｌになる
ように０．１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）に溶解
し、上記浮遊液に当量混合した。３７℃で１５分間攪拌
処理を行ない、上記ＰＢＳで２回洗浄後に再度同じＰＢ
Ｓに浮遊させた。９６穴マイクロプレートに０．０１Ｍ
のＥＤＴＡ添加ベロナール緩衝液２５μｌずつを入れ、
当量のＩＴＰ患者（５種類）の血清を加えて混合し、２
倍系列で段階希釈を行なう。上記赤血球浮遊液を１滴ず
つ添加して混合し、３７℃で２時間反応させた後凝集性
を確認した。結果は表１に示す通りであり、凝集性の確
認された最大希釈倍率を表示した。

【００２９】

【表１】 表１において、Ｎ．Ｄ．は反応しなかったものを示す。

【００３０】（５）ペプチドのセルロースへの固定化 上記ペプチドを多孔質セルロースへの固定化を行なっ
た。セルロースにはセルロファインシリーズＧＣＬ−１
０００ｍ（チッソ製）を用いた。過ヨウ素酸ナトリウム
３．５ｇを１Ｎ硫酸３００ｍｌに溶解して、ＧＣＬ−１
０００ｍ１００ｇを添加し、室温で２０時間攪拌により
反応させた。反応生成物を回収し、十分に洗浄して［ア
ルデヒド］−［セルロース］を得た。アルデヒド含量は
オキシム法により定量を行ない０．６１ｍｅｑ／ｇであ
った。

【００３１】次に分子量５０００の両末端にアミノ基を
有するポリアルキレンオキサイド（以下ＰＥＯアミンと
言う）１５ｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液３００ｍｌに溶
解し、上記［アルデヒド］−［セルロース］を加えて室
温で２４時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して［ＰＥＯアミン］−［セルロース］
を得た。アミノ基含量は塩酸による電位差滴定をＣＯＭ
ＴＩＴＥ１０１（平沼産業製）を用いて行ない、０．５
４ｍｅｑ／ｇであった。

【００３２】上記［ＰＥＯアミン］−［セルロース］を
ｐＨ９．５の炭酸緩衝液３００ｍｌに懸濁し、２５％グ
ルタルアルデヒド溶液３０ｍｌを加えて室温で２４時間
攪拌により反応させた。反応生成物を回収し、十分に洗
浄して［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］を得た。
アルデヒド含量はオキシム法により定量を行ない０．４
９ｍｅｑ／ｇであった。

【００３３】一方上記精製ペプチド２５ｍｇをｐＨ９．
５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、上記［ＰＥＯアルデ
ヒド］−［セルロース］５ｇを加えて、室温で２４時間
攪拌により反応させた。反応生成物を回収し、十分に洗
浄して［ペプチド］−［セルロース］を得た。ペプチド
固定化率は反応残液中の窒素含量をマイクロケルダール
法により定量することにより算出し、８５％が固定化さ
れていた。上記［ペプチド］−［セルロース］をｐＨ
９．０の炭酸緩衝液５０ｍｌに懸濁して水素化ホウ素ナ
トリウム１ｇを加えて、室温で２０時間攪拌により反応
させた。反応生成物を回収し、十分に洗浄して目的であ
る吸着材を得た。

【００３４】 （６）ペプチド固定化吸着材の吸着性能評価 上記吸着材における上記のＩＴＰ患者の血清を用いて抗
血小板抗体の吸着性能を評価した。上記吸着材を１ｍｌ
バイヤル中に採取し、上記ＩＴＰ患者の血清（５種類）
３ｍｌを加えて３７℃で３０分間振盪しながらインキュ
ベートした。懸濁液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離を行ない、上清の抗血小板抗体量をＥＬＩＳＡ法によ
り定量した（Ａｃｔａ．ｈａｅｍａｔ．，６６，２５
１，１９８１）。結果は表２に示す通りであり、インキ
ュベート前の血清での値から算出した吸着率［％］で示
した。またアルブミンの非特異的吸着に関しても、アル
ブミンＢーテストワコー（和光純薬工業製）を用いて定
量した。結果は表３に示す通りであり、表２と同様に吸
着率［％］で示した。

【００３５】

【表２】

【００３６】

【表３】

【００３７】＜実施例２＞ Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−
Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａ
ｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｕのセルロースへの固定化 ＧＰ３ａにおける４７５ないし４９０番目の領域に相当
するＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−
Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕの配列を有するペプチ
ドの合成に関してもＰＡＭグルタミン酸（ｔ−Ｂｏｃ−
Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ））（アプライドバイオシステム
ズ社製）およびｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ），ｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚ
ｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（４−ＣＨ₃ＯＢｚ
ｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ），ｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌ
ｎ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）（いずれもア
プライドバイオシステムズ社製）を用いて実施例１と同
様にして実施した。合成の終了した支持体の脱保護基，
ペプチド鎖の切断，逆相系ＨＰＬＣによる精製および同
定についても実施例１と同様にして行なった。

【００３８】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８８％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００３９】＜実施例３＞ Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕのセルロースへ
の固定化 ＧＰ３ａにおける７４１ないし７４４番目のＴｈｒ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎの配列の両端を５残基ずつ延長さ
せたＡｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ
−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−
Ｌｙｓ−Ｇｌｕの配列を有するペプチドの合成に関して
もＰＡＭグルタミン酸（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢ
ｚｌ））（アプライドバイオシステムズ社製）およびｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−
Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ・Ｈ
₂Ｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓ
ｎ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｌａ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ
（Ｂｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），ｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａ
ｒｇ（Ｔｏｓ）（いずれもアプライドバイオシステムズ
社製）を用いて実施例１と同様にして実施した。合成の
終了した支持体の脱保護基については配列中にｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）を含んでいるので、先に１ｇ
の合成を終えた支持体に１，２−エタンジオール０．２
ｍｌ，ｍ−クレゾール０．８ｍｌ，ジメチルスルフィド
３ｍｌ，ＴＦＡ５ｍｌ，ＴＦＭＳＡ１ｍｌを加えて、氷
水で冷やしながら３時間攪拌して反応させた。反応物を
あらかじめ冷やしておいたジエチルエーテルで洗浄しな
がらガラスフィルター（ミディアム孔）で濾過し後に実
施例１で行なった脱保護基反応を行なった。以下ペプチ
ド鎖の切断，逆相系ＨＰＬＣによる精製および同定につ
いては実施例１と同様にして行なった。

【００４０】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８４％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００４１】＜実施例４＞ Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−
Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕのセルロースへ
の固定化 実施例３により得られたＡｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｔｒ
ｐ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕをヘキサメチレンジ
アミン（Ｈ₂ Ｎ（ＣＨ₂ ）₆ ＮＨ₂ ）を介した固定化を
実施例１と同様にして検討した。１００ｇのヘキサメチ
レンジアミンをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解
し、実施例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロー
ス］５ｇを加えて、室温で２４時間攪拌により反応させ
た。反応生成物を回収し、十分に洗浄してｐＨ９．０の
炭酸緩衝液５０ｍｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム
１ｇを加えて、室温で２０時間攪拌により反応させた。
反応生成物を回収し、十分に洗浄して［ＰＥＯアミン
２］−［セルロース］を得た。次に上記ペプチド２５ｍ
ｇをｐＨ４．５のクエン酸緩衝液５０ｍｌに溶解した後
氷冷を行ない、水溶性カルボジイミド試薬であるＥＤＣ
（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド）１０ｍｇを加え、氷冷しながら３０分間
攪拌した。さらに上記［ＰＥＯアミン２］−［セルロー
ス］を加えて室温において２４時間攪拌して反応させ
た。反応生成物を回収し、十分に洗浄して目的である吸
着材を得た。ペプチドの固定化率は実施例１と同様にし
て求め、７９％が固定化されていた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００４２】

【比較例】

＜比較例１＞ Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
のセルロースへの固定化 ＧＰ３ａにおける１１８ないし１２８番目の領域に相当
するＭｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ
−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕの配列を有
するペプチドの合成に関して、ＰＡＭロイシン（ｔ−Ｂ
ｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ）（アプライドバイオシステムズ社
製）およびｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），ｔ−
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｍ
ｅｔ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ
−Ｌ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ），（いずれもアプライドバイ
オシステムズ社製）を用いて実施例１と同様にして実施
した。このペプチド領域も親水性の比較的大きな領域で
ある。合成の終了した支持体の脱保護基，ペプチド鎖の
切断，逆相系ＨＰＬＣによる精製および同定についても
実施例１と同様にして行なった。

【００４３】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８５％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００４４】＜比較例２＞ Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−
Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓ
ｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕのセルロースへの固定化 ＧＰ３ａにおける５６１ないし６７３番目の領域に相当
するＴｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ
−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕの配列を有するペプチドの合成に関して、ＰＡＭ
ロイシン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ）（アプライドバイ
オシステムズ社製）およびｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ，ｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚ
ｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙ
ｓ（４−ＣＨ₃ＯＢｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ
（Ｂｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），ｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）（いずれもアプライド
バイオシステムズ社製）を用いて実施例１と同様にして
実施した。このペプチド領域も親水性の比較的大きな領
域である。合成の終了した支持体の脱保護基，ペプチド
鎖の切断，逆相系ＨＰＬＣによる精製および同定につい
ても実施例１と同様にして行なった。

【００４５】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８９％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００４６】

【発明の効果】本発明により血液中の抗血小板抗体と効
果的に結合させることが可能であり、重症なＩＴＰ患者
の治療に適用が可能である。本発明における抗血小板抗
体吸着材を用いた血液浄化療法は副作用もなく安全であ
り、保存による安定性の面でも優れている。またオート
クレーブ処理による蒸気滅菌を行なってもリガンドとし
ての活性が低下することがほとんどない点も医療機材と
して有利である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年９月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血小板膜を形成している糖タンパク質で
   あるＧＰ３ａ，ＧＰ２ｂ，ＧＰ１ｂα鎖，ＧＰ１ｂβ
   鎖，ＧＰ９のうちのいずれかに存在しており、４ないし
   ４０個のアミノ酸残基より成る、抗血小板抗体との結合
   性を有しているペプチドを少なくとも１種類を水不溶性
   担体に固定化したことを特徴とする抗血小板抗体吸着
   材。
2. 【請求項２】 請求項１記載のペプチドの両端あるいは
   片端に、アミノ酸、Ｂ−（Ａ，ＢはＮＨまたはＣＯ，ｎ
   は１ないし２０の整数）で示されるもののいずれかがペ
   プチド結合により結合した全アミノ酸残基数が７０個以
   内の修飾ペプチドを少なくとも１種類を水不溶性担体に
   固定化したことを特徴とする抗血小板抗体吸着材。