JPH0625287A - ポリペプチドおよびそれを用いた抗血小板抗体吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 特定のアミノ酸配列を含有するペプチドある
いはこれを修飾した有機化合物を用いることにより、抗
血小板抗体と結合させてこれを除去する方法および上記
ペプチドまたは有機化合物を水不溶性担体に固定化した
抗血小板抗体吸着材を提供する。 【構成】 （１）ＰＬＳＤＫＧＳＧＤＳＳ，（２）ＧＫ
ＩＲＳＫＶＥＬＥＶＲＤＬＰＥ，（３）ＥＥＤＹＲＰＳ
ＱＱＤＥＣＳＰＲＥ，（４）ＫＦＤＲＥ，（５）ＴＡＮ
Ｎのいずれかのアミノ酸配列から成るペプチド領域を含
有するような７０以下のアミノ酸残基により構成される
ポリペプチドおよび該ペプチド領域を含む修飾ポリペプ
チドおよびこれらのペプチド類のうち少なくとも１種類
を水不溶性担体に固定化した抗血小板抗体吸着材。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は何らかの原因により血液
中に産生された自己抗体である抗血小板抗体を、特定の
アミノ酸配列を含有しているポリペプチドまたは修飾ポ
リペプチドを利用して、抗血小板抗体と結合させること
を特徴とする抗血小板抗体の除去方法および該ペプチド
を担体に固定化したことを特徴とする抗血小板抗体吸着
材に関するものである。本発明は特に抗血小板抗体の存
在による血小板数の減少に起因して、出血，紫斑などの
諸症状をもたらす特発性血小板減少性紫斑病（以下ＩＴ
Ｐと言う）のような疾患に関する治療において非常に有
用なものである。

【０００２】

【従来の技術】ＩＴＰは自己免疫疾患の一種であり、血
小板寿命の短縮，血小板結合免疫グロブリンである抗血
小板抗体の増加を特徴とし、骨髄では巨核球数は正常あ
るいは増加を示し、他の血液疾患の存在を示唆する所見
を認めない免疫性の血小板減少症のうち膠原病，リンパ
増殖性疾患，薬剤アレルギーなどの原因疾患の認められ
ないものを指す。

【０００３】ＩＴＰは急性型と慢性型に分けられる。急
性型は小児に多く見られ、出血症状は激しいが比較的治
癒はしやすい。発症３週間以前に上気道感染，ウイルス
感染などの先行感染が認められることが多い。感染の回
復期に血小板減少を認めることから、形成された免疫複
合体が血小板膜Ｆｃ受容器に結合し、血小板が非特異的
に破壊される免疫複合病の可能性が強い。一方慢性型は
出血症状は弱いが長期間持続し、成人で特に２０才代の
女性に多く、抗血小板抗体による自己免疫病と考えられ
ているものである。

【０００４】抗血小板抗体による血小板数の減少により
見られる症状には個人差があるが、一般的には血小板数
５００００個／μｌ以上では通常出血症状は見られず、
３００００ないし５００００個／μｌでは外傷時の易出
血性，斑状出血，１００００ないし３００００個／μｌ
では露出部への紫斑の出現，月経過多，１００００個／
μｌ以下では血尿，不正性器出血，鼻出血，歯肉出血が
認められ、頭蓋内出血，消化管出血がしばしば直接の死
因となっている。

【０００５】ＩＴＰの治療に際してはその症状の程度に
応じて副腎皮質ホルモン剤の投与，脾臓の摘出，ステロ
イド系免疫抑制剤の投与などが適用される。しかしこう
した薬物療法や摘脾手術では血小板数が効果的には回復
しないような症例も多く存在している。ＩＴＰをはじめ
種々の自己免疫疾患の発生に関するメカニズムはまだ十
分には解明されておらず、こうした患者に対する治療方
法についても絶対的なものは確立されていないのが現状
であり対策が急がれている。

【０００６】こうした自己免疫疾患の治療方法として、
免疫吸着カラムを用いた血液の体外循環による自己抗体
の吸着除去も種々試みられている。たとえば免疫グロブ
リンと結合性を有するプロテインＡを担体に固定化した
カラムの適用も検討されている。しかしプロテインＡは
高価であり、吸着特異性の点で優れず、さらには副作用
の問題も有しておりあまり有用なものではない。また除
去対象物質に対する抗体の固定化カラムも種々検討され
ているが、安全性，保存安定性の問題，抗体が有効に反
応できるような固定化が困難なこと，滅菌方法が限定さ
れるなどの理由から医用機材として用いるには多くの課
題がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は血液中の抗血
小板抗体を認識して結合性を有するような比較的低分子
量のポリペプチドあるいはそれを修飾したポリペプチド
により結合させ除去しようとするものである。また上記
ペプチドを水不溶性担体に固定化した吸着材を提供し、
さらにはこれを充填したカラムを用いて体外循環などに
よる治療に適用しようとするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成した本発
明は抗血小板抗体の抗原決定基となりうるアミノ酸配列
を含有しているポリペプチドあるいはこれを修飾したポ
リペプチドによる抗血小板抗体の除去を要旨とするもの
である。上記ポリペプチドあるいは修飾ポリペプチドを
水不溶性担体に固定化することにより抗血小板抗体吸着
材が得られ、これを充填したカラムを用いて体外循環な
どによる血液浄化治療が可能である。

【０００９】一般にＩＴＰ患者における抗血小板抗体は
血小板膜表面に存在する糖タンパク質の複合体であるＧ
Ｐ２ｂ／３ａ（ＧＰIIｂ／IIIａを示す。以下同）やＧ
Ｐ１ｂ／９に対する抗体であること多いことが知られて
いる。本発明における請求項１記載の（１）〜（５）の
５種類のペプチド領域はＧＰ３ａの一次構造から種々の
方法により抗原決定基となりうる領域を予測およびスク
リーニングすることにより得られたものである。

【００１０】ＧＰ３ａは分子量約１０５キロダルトンの
１本のポリペプチドから成る糖タンパク質であり、すで
にｃＤＮＡがクローニングされている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６２，３９３９，１９８７）。７６２個
のアミノ酸残基から構成されており、Ｎ末端部には２６
アミノ酸残基から成るシグナルペプチドが存在する。細
胞外の部分は６８９個，膜貫通ドメインは２９個，細胞
質内は４１個のアミノ酸が存在する。４６０ないし６２
７番目のアミノ酸残基から成る領域には３３ないし３８
個のアミノ酸より成るシステインリッチなドメインの繰
返しが４ヵ所存在する。

【００１１】ＧＰ３ａはＧＰ２ｂと骨髄中の骨髄巨核球
またはその前駆細胞において複合体を形成する。血小板
膜表面においてＧＰ２ｂとＧＰ３ａは非共有結合により
図１に示すような１：１の複合体を形成している。ＧＰ
２ｂにおける５５８ないし７４７番目のアミノ酸残基の
部分とＧＰ３ａにおける１１４ないし３０３番目のアミ
ノ酸残基の部分とで会合していることが推定されている
（医学のあゆみ，１６０，６８１，１９９２）。ＧＰ２
ｂ／３ａは血小板膜表面上に最も多く存在している糖タ
ンパク質である。

【００１２】ＧＰ３ａに関するアミノ酸配列中におい
て、６８ないし７８番目に相当するＰＬＳＤＫＧＳＧＤ
ＳＳ（請求項１の（１）），３４９ないし３６４番目の
ＧＫＩＲＳＫＶＥＬＥＶＲＤＬＰＥ（請求項１の
（２）），４７５ないし４９０番目のＥＥＤＹＲＰＳＱ
ＱＤＥＣＳＰＲＥ（請求項１の（３）），６１９ないし
６２３番目のＫＦＤＲＥ（請求項１の（４）），７４１
ないし７４４番目のＴＡＮＮ（請求項１の（５））の５
つの領域（特定アミノ酸配列）が抗血小板抗体に対する
免疫原性がエンザイムイムノアッセイ（以下ＥＬＩＳＡ
法と言う）により確認された領域である。これらの領域
は図２に示すようにいずれも親水性の比較的強い領域で
あり、ＧＰ３ａ分子表面に存在している領域であること
が推定される。（Kyte & Dookittleのデータを用いた６
残基ごとの平均：図２）

【００１３】上記の領域は抗血小板抗体との結合に最小
限必要な領域であると考えられる。実際にこうしたペプ
チド領域を用いて抗血小板抗体を除去することを行なう
場合には、血液中に存在する抗血小板抗体との反応様式
に近い状態を再現する必要がある。また血液中に存在す
る場合の構造の安定性や、あるいは担体に固定化する場
合には水系溶媒に対する溶解性を大きくしたりすること
を考慮する必要があることが多い。

【００１４】そこで上記に示したペプチド領域の一方の
末端または両末端をＧＰ３ａの構造に従って領域を延長
したり、たとえばリジン（Ｋ）のような水溶性を大きく
するようなアミノ酸を数個末端に結合させたり、システ
イン（Ｃ）のようなアミノ酸を末端に結合させて担体に
固定化しやすくするなどすることが好ましい。こうした
点から実際に用いるポリペプチドのアミノ酸残基数とし
ては７０以下であることが好ましく、４ないし３０個が
より好ましいがさらには１０ないし２０個が合成に関わ
るコスト，安定性，取扱いやすさなどの点からより好ま
しい。また固定化反応や安定性などを考慮して、たとえ
ばＮ末端をアミド化したり、末端に適当な官能基を導入
した上記ポリペプチドの修飾したポリペプチドを用いる
ことも好ましい。すなわち本発明においては、領域その
ものまたは領域を修飾したものも本発明のポリペプチド
または修飾ポリペプチドである。

【００１５】ペプチド領域、またはそれを結合させたポ
リペプチドまたはそれを修飾したポリペプチド（これを
ペプチド類と総称する）の合成については特に限定され
ないが、液相合成法よりも固相合成法を適用する方が操
作が簡単である。この場合有機溶媒に不溶性である支持
体に合成する領域のＣ末端に対応するアミノ酸を結合さ
せ、Ｎ末端方向にαカルボキシル基以外のαアミノ基な
どの官能基を保護した対応するアミノ酸を順に縮合反応
により結合させた後、結合した後その保護基を脱離させ
る反応を交互に繰返すことによりペプチド鎖を延長させ
る。

【００１６】目的とする領域が得られた後、該ペプチド
鎖を支持体から切断および脱保護基を行なう。これには
フッ化水素がしばしば用いられるが、安全性，取扱いや
すさの点からトリフルオロメタンスルホン酸（以下ＴＦ
ＭＳＡと言う）を用いるのが適当である。チオアニソー
ル，１，２−エタンジオールとＴＦＭＳＡ中で反応させ
脱保護基を行なった後、トリフルオロ酢酸（以下ＴＦＡ
と言う）により支持体からの切断を行ないペプチドを回
収する。これを凍結乾燥することによりクルードペプチ
ド領域が得られる。

【００１７】本発明においては領域そのものが、ポリペ
プチドとして本発明の目的物であることは勿論のことで
あり、この複数領域を他のアミノ酸で結合したものでも
よく、また末端を特定化合物で修飾したりしたものでも
よい。また、本発明のアミノ酸の総和とは領域のアミノ
酸と、この領域を結合させるためのアミノ酸をも含むも
のである。

【００１８】上記クルードペプチド領域は逆相系カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィ（以下ＨＰＬＣと言
う）に供することにより分取，精製を行なう。ＨＰＬＣ
条件は通常タンパク質の精製に用いる系を基本として最
適化を行なうのがよい。得られたクロマトピークに相当
する画分を分取しこれを凍結乾燥する。得られた精製ペ
プチド領域画分についてマススペクトル分析による分子
量解析，アミノ酸組成分析あるいはアミノ酸配列解析な
どにより同定を行なう。

【００１９】本発明のペプチド類を固定化する場合に用
いる水不溶性担体としては特に限定されるものではない
が、血液浄化に用いる場合には血液中成分と接触した際
の補体系や凝固系などへの影響を考慮する必要性がある
ことから、セルロース，ポリスチレン，ポリビニルアル
コール，ポリアクリル酸エステルあるいはこれらの誘導
体の多孔質担体を用いるのが好ましい。平均細孔径は２
００ないし３００００Åのものが好ましく、３００ない
し１００００Åのものがより好ましい。また担体の形態
としてはビーズ状，繊維状，膜状（中空糸も含む）など
いずれも可能である。

【００２０】またリガンドの導入の際には立体障害を小
さくすることにより吸着効率の向上させ、非特異的吸着
を抑えることを目的として、親水性スペーサーを介して
固定化することがより好ましい。親水性スペーサーとし
てはたとえば両末端をカルボキシル基，アミノ基，アル
デヒド基，エポキシ基などで置換されたポリアルキレン
オキサイドの誘導体を用いるのが好ましく、その重合度
は１０ないし１０００のものが好ましく、１００ないし
５００のものがより好ましい。

【００２１】上記のリガンドに用いるペプチド類は比較
的安定で低分子量の物質であり、たとえば酵素や抗体の
ようなタンパク質を固定化する場合と比較してその固定
化反応条件は制約が少なくなることも有利な要因の一つ
である。したがって固定化方法については特に限定され
るものではないが、酵素や抗体を固定化する場合にしば
しば用いられるシッフ塩基反応，エポキシ反応，カルボ
ジイミド試薬などを用いた縮合反応などによる固定化方
法を適用することが好ましい。

【００２２】

【実施例】本発明におけるペプチド類の水不溶性担体へ
の導入方法は上記に述べたものを基本とすれば特に限定
されるものではない。以下に実施例を用いて本発明を説
明する。

【００２３】＜実施例１＞ ＰＬＳＤＫＧＳＧＤＳＳの
セルロースへの固定化 （ペプチドの合成）ＰＬＳＤＫＧＳＧＤＳＳの配列を有
するペプチドの合成をペプチドシンセサイザーＭｏｄｅ
ｌ４３０Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い
て固相合成法により行なった。Ｃ末端のセリンの結合し
た支持体であるＰＡＭセリン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ
（Ｂｚｌ））０．５ｍｍｏｌ（アプライドバイオシステ
ムズ社製）を用いて、Ｎ末端の方向に順に上記ペプチド
シンセサイザーに掲載されている合成プログラムにより
脱保護基反応および縮合反応を繰返してペプチド鎖を延
長した。すなわちＴＦＡおよびジクロロメタン（以下Ｄ
ＣＣと言う）により保護基であるｔ−ブトキシカルボニ
ル基の除去を行ない、ジクロロメタン（以下ＤＣＭと言
う）で洗浄し、ジイソプロピルエチルアミンおよびＤＣ
Ｃで中和した後、ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦと
言う）で洗浄し、ＤＭＦで縮合反応を行ない、ＤＣＭで
洗浄する操作を繰返した。アミノ酸はｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−
Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚ
ｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙ
ｓ（Ｃｌ−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ・Ｈ₂Ｏ，ｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ（いずれもアプライドバイオシス
テムズ社製）の２．０ｍｍｏｌのカートリッジを用い
た。

【００２４】（脱保護基，ペプチド鎖の切断）上記の反
応が終了した支持体１ｇにチオアニソール１ｍｌ，１，
２−エタンジオール０．５ｍｌを加えて１０分間攪拌し
た後、氷水で冷やしながらＴＦＡ１０ｍｌを加えて１０
分間攪拌した。さらにＴＦＭＳＡ１ｍｌを加えて室温で
３０分間攪拌した。これにあらかじめ冷やしておいたジ
エチルエーテルを沈殿が現れなくなるまで加えて攪拌
し、ミディアム孔のガラスフィルターを用いてジエチル
エーテルで共洗いしながら濾過し、ＴＦＡを加えてペプ
チドを溶解してエーテル中に補集した。エーテル中のペ
プチドをファイン孔のガラスフィルターで濾過し、ガラ
スフィルター上のペプチドを２Ｎ酢酸に溶解して、凍結
乾燥を行ないクルードペプチドを得た。

【００２５】（ペプチドの精製）上記クルードペプチド
を再度２Ｎ酢酸に溶解して、０．２μｍのメンブレンフ
ィルターで濾過した溶液をＨＰＬＣに供した。ＨＰＬＣ
はＭｏｄｅｌ１３０Ａシステム（アプライドバイオシス
テムズ社製）を用い、カラムは逆相系のＡｑｕａｐｏｒ
ｅ Ｐｒｅｐ−１０，Ｃ８（アプライドバイオシステム
ズ社製）を用いた。移動相は０．１％ＴＦＡを含む水を
Ａ液，０．１％ＴＦＡを含む７０％アセトニトリル／水
（ｖ／ｖ）をＢ液として、Ａ液からＢ液への濃度直線勾
配により溶出した。クロマトピークはほぼ単一なものが
得られ、相当画分を分取した。分取を数回繰返し、これ
を凍結乾燥することにより精製ペプチドを得た。得られ
たペプチドはＢＩＯＩＯＮ２０マスアナライザー（アプ
ライドバイオシステムズ社製）により解析して目的ペプ
チドが得られていることを確認した。

【００２６】（ペプチドの免疫原性）得られたペプチド
の免疫原性を赤血球凝集反応により確認した。Ａｌｓｅ
ｖｅｒ液保存ヒツジ赤血球（セダレーン社製）を２．５
％濃度（ｖ／ｖ）になるようにＰＢＳ（ｐＨ７．２）に
浮遊させた。浮遊液１０ｍｌに０．００５％タンニン酸
溶液を加えて３７℃で１５分間攪拌して反応させ、上記
ＰＢＳで１５００ｒｐｍ，１０分の遠心分離により洗浄
した後１０ｍｌの生理食塩水に再度浮遊させた。一方上
記精製ペプチドを２ｍｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．４）に溶解し、上記浮遊液に当
量混合した。３７℃で１５分間攪拌処理を行ない、上記
ＰＢＳで２回洗浄後に再度同じＰＢＳに浮遊させた。９
６穴マイクロプレートに０．０１ＭのＥＤＴＡ添加ベロ
ナール緩衝液２５μｌずつを入れ、当量のＩＴＰ患者
（５種類）の血清を加えて混合し、２倍系列で段階希釈
を行なう。上記赤血球浮遊液を１滴ずつ添加して混合
し、３７℃で２時間反応させた後凝集性を確認した。結
果は表１に示す通りであり、凝集性の確認された最大希
釈倍率を表示した。Ｎ．Ｄ．（表１中）は反応しなかっ
たものを示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】（ペプチドのセルロースへの固定化）上記
ペプチドを多孔質セルロースへの固定化を行なった。セ
ルロースにはセルロファインシリーズＧＣＬー１０００
ｍ（チッソ製）を用いた。過ヨウ素酸ナトリウム３．５
ｇを１Ｎ硫酸３００ｍｌに溶解して、ＧＣＬー１０００
ｍ１００ｇを添加し、室温で２０時間攪拌により反応さ
せた。反応生成物を回収し、十分に洗浄して［アルデヒ
ド］−［セルロース］を得た。アルデヒド含量はオキシ
ム法により定量を行ない０．６０ｍｅｑ／ｇであった。

【００２９】次に分子量５０００の両末端にアミノ基を
有するポリアルキレンオキサイド（以下ＰＥＯアミンと
言う）１５ｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液３００ｍｌに溶
解し、上記［アルデヒド］−［セルロース］を加えて室
温で２４時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して［ＰＥＯアミン］−［セルロース］
を得た。アミノ基含量は塩酸による電位差滴定をＣＯＭ
ＴＩＴＥ１０１（平沼産業製）を用いて行ない、０．５
２ｍｅｑ／ｇであった。

【００３０】上記［ＰＥＯアミン］−［セルロース］を
ｐＨ９．５の炭酸緩衝液３００ｍｌに懸濁し、２５％グ
ルタルアルデヒド溶液３０ｍｌを加えて室温で２４時間
攪拌により反応させた。反応生成物を回収し、十分に洗
浄して［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］を得た。
アルデヒド含量はオキシム法により定量を行ない０．４
７ｍｅｑ／ｇであった。

【００３１】一方上記精製ペプチド２５ｍｇをｐＨ９．
５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、上記［ＰＥＯアルデ
ヒド］−［セルロース］５ｇを加えて、室温で２４時間
攪拌により反応させた。反応生成物を回収し、十分に洗
浄して［ペプチド］−［セルロース］を得た。ペプチド
固定化率は反応残液中の窒素含量をマイクロケルダール
法により定量することにより算出し、８４％が固定化さ
れていた。上記［ペプチド］−［セルロース］をｐＨ
９．０の炭酸緩衝液５０ｍｌに懸濁して水素化ホウ素ナ
トリウム１ｇを加えて、室温で２０時間攪拌により反応
させた。反応生成物を回収し、十分に洗浄して目的であ
る吸着材を得た。

【００３２】（ペプチド固定化吸着材の吸着性能評価）
上記吸着材における上記のＩＴＰ患者の血清を用いて抗
血小板抗体の吸着性能を評価した。上記吸着材を１ｍｌ
バイヤル中に採取し、上記ＩＴＰ患者の血清（５種類）
３ｍｌを加えて３７℃で３０分間振盪しながらインキュ
ベートした。懸濁液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分
離を行ない、上清の抗血小板抗体量をＥＬＩＳＡ法によ
り定量した（Ａｃｔａ．ｈａｅｍａｔ．，６６，２５
１，１９８１）。結果は表２に示す通りであり、インキ
ュベート前の血清での値から算出した吸着率［％］で示
した。またアルブミンの非特異的吸着に関しても、アル
ブミンＢーテストワコー（和光純薬工業製）を用いて定
量した。結果は表３に示す通りであり、表２と同様に吸
着率［％］で示した。

【００３３】

【表２】

【００３４】

【表３】

【００３５】＜実施例２＞ ＧＫＩＲＳＫＶＥＬＥＶＲ
ＤＬＰＥのセルロースへの固定化 ＧＫＩＲＳＫＶＥＬＥＶＲＤＬＰＥの配列を有するペプ
チドの合成に関してもＰＡＭグルタミン酸（ｔ−Ｂｏｃ
−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ））（アプライドバイオシステ
ムズ社製）およびｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ
−Ｌ−Ｌｅｕ・Ｈ₂Ｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢ
ｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ），ｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｌ−Ｖａｌ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚ
ｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），ｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ・
１／２Ｈ₂Ｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ（いずれもアプ
ライドバイオシステムズ社製）を用いて実施例１と同様
にして実施した。合成の終了した支持体の脱保護基，ペ
プチド鎖の切断，逆相系ＨＰＬＣによる精製および同定
についても実施例１と同様にして行なった。

【００３６】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８０％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００３７】＜実施例３＞ ＥＥＤＹＲＰＳＱＱＤＥＣ
ＳＰＲＥのセルロースへの固定化 ＥＥＤＹＲＰＳＱＱＤＥＣＳＰＲＥの配列を有するペプ
チドの合成に関してもＰＡＭグルタミン酸（ｔ−Ｂｏｃ
−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ））（アプライドバイオシステ
ムズ社製）およびｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ），
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂ
ｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（４−ＣＨ₃ＯＢｚ
ｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ），ｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌ
ｎ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）（いずれもア
プライドバイオシステムズ社製）を用いて実施例１と同
様にして実施した。合成の終了した支持体の脱保護基，
ペプチド鎖の切断，逆相系ＨＰＬＣによる精製および同
定についても実施例１と同様にして行なった。

【００３８】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８８％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００３９】＜実施例４＞ ＶＥＣＫＫＦＤＲＥＰＹＭ
Ｔのセルロースへの固定化 ＶＥＣＫＫＦＤＲＥＰＹＭＴの配列を有するペプチドの
合成に関してもＰＡＭトレオニン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔ
ｈｒ（Ｂｚｌ））（アプライドバイオシステムズ社製）
およびｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｙ
ｒ（Ｂｒ−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ
−Ｌ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ
（Ｔｏｓ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），ｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｈｅ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｃｌ
−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ（いずれもアプライド
バイオシステムズ社製）を用いて実施例１と同様にして
実施した。合成の終了した支持体の脱保護基，ペプチド
鎖の切断，逆相系ＨＰＬＣによる精製および同定につい
ても実施例１と同様にして行なった。

【００４０】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、７８％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００４１】＜実施例５＞ ＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹ
ＫＥのセルロースへの固定化 ＲＡＫＷＤＴＡＮＮＰＬＹＫＥの配列を有するペプチド
の合成に関してもＰＡＭグルタミン酸（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ
−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ））（アプライドバイオシステムズ
社製）およびｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ），ｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−
Ｌｅｕ・Ｈ₂Ｏ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ，ｔ−Ｂｏｃ
−Ｌ−Ａｓｎ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｌａ，ｔ−Ｂｏｃ−
Ｌ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢ
ｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ），ｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）（いずれもアプライドバイオ
システムズ社製）を用いて実施例１と同様にして実施し
た。合成の終了した支持体の脱保護基については配列中
にｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）を含んでいるの
で、先に１ｇの合成を終えた支持体に１，２−エタンジ
オール０．２ｍｌ，ｍ−クレゾール０．８ｍｌ，ジメチ
ルスルフィド３ｍｌ，ＴＦＡ５ｍｌ，ＴＦＭＳＡ１ｍｌ
を加えて、氷水で冷やしながら３時間攪拌して反応させ
た。反応物をあらかじめ冷やしておいたジエチルエーテ
ルで洗浄しながらガラスフィルター（ミディアム孔）で
濾過し後に実施例１で行なった脱保護基反応を行なっ
た。以下ペプチド鎖の切断，逆相系ＨＰＬＣによる精製
および同定については実施例１と同様にして行なった。

【００４２】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８６％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００４３】

【比較例】

＜比較例１＞ ＭＤＬＳＹＳＭＫＤＤＬのセルロースへ
の固定化 図１における１１８ないし１２８番目の領域に相当する
ＭＤＬＳＹＳＭＫＤＤＬの配列を有するペプチドの合成
に関して、ＰＡＭロイシン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ）
（アプライドバイオシステムズ社製）およびｔ−Ｂｏｃ
−Ｌ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ
（Ｃｌ−Ｚ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ，ｔ−Ｂｏｃ−
Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｙｒ（Ｂｒ
−Ｚ），（いずれもアプライドバイオシステムズ社製）
を用いて実施例１と同様にして実施した。このペプチド
領域も親水性の比較的大きな領域である。合成の終了し
た支持体の脱保護基，ペプチド鎖の切断，逆相系ＨＰＬ
Ｃによる精製および同定についても実施例１と同様にし
て行なった。

【００４４】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８５％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００４５】＜比較例２＞ ＴＴＲＴＤＴＣＭＳＳＮＧ
Ｌのセルロースへの固定化 図１における５６１ないし６７３番目の領域に相当する
ＴＴＲＴＤＴＣＭＳＳＮＧＬの配列を有するペプチドの
合成に関して、ＰＡＭロイシン（ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｅ
ｕ）（アプライドバイオシステムズ社製）およびｔ−Ｂ
ｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ，ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ，ｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ，
ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（４−ＣＨ₃ＯＢｚｌ），ｔ−
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｓ
ｐ（ＯＢｚｌ），ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）
（いずれもアプライドバイオシステムズ社製）を用いて
実施例１と同様にして実施した。このペプチド領域も親
水性の比較的大きな領域である。合成の終了した支持体
の脱保護基，ペプチド鎖の切断，逆相系ＨＰＬＣによる
精製および同定についても実施例１と同様にして行なっ
た。

【００４６】得られた精製ペプチドの免疫原性について
も実施例１と同様にして行なった。結果は表１に示す通
りで、凝集性の確認された最大希釈倍率を表示した。上
記ペプチドに関しても実施例１と同様にしてセルロース
への固定化を行なった。すなわち上記精製ペプチド２５
ｍｇをｐＨ９．５の炭酸緩衝液５０ｍｌに溶解し、実施
例１で得た［ＰＥＯアルデヒド］−［セルロース］５ｇ
を加えて、室温で２４時間攪拌により反応させた。反応
生成物を回収し、十分に洗浄して［ペプチド］−［セル
ロース］を得た。ペプチド固定化率は実施例１と同様に
して求め、８９％が固定化されていた。上記［ペプチ
ド］−［セルロース］をｐＨ９．０の炭酸緩衝液５０ｍ
ｌに懸濁して水素化ホウ素ナトリウム１ｇを加えて、室
温で２０時間攪拌により反応させた。反応生成物を回収
し、十分に洗浄して目的である吸着材を得た。得られた
吸着材の性能評価に関しても実施例１と同様にして行な
った。すなわち５人のＩＴＰ患者の血清における抗血小
板抗体およびアルブミンの吸着性能を評価した。それぞ
れの吸着率を表２および表３に示した。

【００４７】

【発明の効果】本発明により血液中の抗血小板抗体と効
果的に結合させることが可能であり、重症なＩＴＰ患者
の治療に適用が可能である。本発明における抗血小板抗
体吸着材を用いた血液浄化療法は副作用もなく安全であ
り、保存による安定性の面でも優れている。またオート
クレーブ処理による蒸気滅菌を行なってもリガンドとし
ての活性が低下することがほとんどない点も医療機材と
して有利である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＧＰ２ｂとＧＰ３ａの複合模式図。

【図２】図２は、ＧＰ３ａの親水性プロフィールを示す
図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｚ 8318−4Ｈ // Ｃ０７Ｋ 5/10 8018−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 田中 昌和 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のいずれかの特定アミノ酸配列のう
   ち少なくとも１種類をその連鎖の中に含有し、かつ連鎖
   のうちアミノ酸（アミノ酸残基）の総和が７０以下であ
   ることを特徴とする修飾ポリペプチドまたはポリペプチ
   ド。 （１）Pro Leu Ser Asp Lys Gly Ser Gly Asp Ser Ser （２）Gly Lys Ile Arg Ser Lys Val Glu Leu Glu Val
   Arg Asp Leu Pro Glu （３）Glu Glu Asp Tyr Arg Pro Ser Gln Gln Asp Glu
   Cys Ser Pro Arg Glu （４）Lys Phe Asp Arg Glu （５）Thr Ala Asn Asn
2. 【請求項２】 請求項１記載の修飾ペプチドおよびまた
   はポリペプチドのうち少なくとも１種類を水不溶性担体
   に固定化したことを特徴とする抗血小板抗体吸着材。