JPH06135996A - アンジオジェニンの単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 アンジオジェニンを含有する試料溶液から同
物質を単離する方法であって、下記(1)〜(4)の工程：
(1)試料溶液を硫酸化多糖体担体に接触させ、得られた
吸着画分を水溶液または緩衝液により溶出し、次いで脱
塩処理することによりアンジオジェニンを含有する画分
を得、(2)上記(1)で得られた画分をチオシアン酸ナトリ
ウムを含有する緩衝液に溶解して不溶解物を除去し、
(3)上記(2)で得られた溶液にアルコールを添加して、ア
ンジオジェニン以外のタンパク質を沈殿させることによ
って除去し、次いで、(4)上記(3)で得られた溶液を脱塩
処理する、を含むことを特徴とするアンジオジェニンの
単離方法。 【効果】 アンジオジェニンを容易に、高回収率及び高
純度で単離することができる。また大量処理も可能であ
り、生産コストの低減化を図ることもできる。本発明の
方法により高純度で単離されたアンジオジェニンは、食
品、飼料、試薬、医薬品の成分としての使用が期待され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料溶液からアンジオ
ジェニンを単離する方法に関する。さらに詳しく言う
と、本発明は、ヒトや哺乳動物の乳からアンジオジェニ
ンを単離する方法に関する。本発明の方法によって単離
されるアンジオジェニンは、血液増殖因子として、食
品、飼料、試薬、医薬品等の分野における広範な利用が
可能である。

【０００２】

【従来の技術】アンジオジェニンは、ヒト及び動物等の
腫瘍の増殖に関わる物質として従来から知られた物質で
ある（ゴールドマン、(1907)等）。フェットらは、ヒト
の癌性の細胞からアンジオジェニンを分離しており、そ
れが分子量14400のタンパク質であることを確認してい
る（フェットら、Biochem.、(1984)、24、5480-548
6）。アンジオジェニンはまた、血管形成因子の一つで
あることも知られており、その全アミノ酸配列が決定さ
れている（ストリドムら、Biochem.、(1985)、24、5486
-5494）。アンジオジェニンはヒトや哺乳動物の血液や
乳中にも存在しており、ボンドらは、ウシの血液からウ
シアンジオジェニンを分離し（ボンドら、Biochem.、(1
988)、27、6282-6287）、さらに、スピクらは、ウシの
乳から得たアンジオジェニンのアミノ酸配列を決定して
いる(スピクら、FEBS LETTERS、(1988)、241、41-4
5）。

【０００３】特開平２−２９７０００号公報（発明者：
スピク）には、ウシの乳からアンジオジェニンを抽出す
る方法が開示されており、その方法は、アンジオジェニ
ンを含む物質を陽イオン交換クロマトグラフィーに吸着
させた後、弱有機酸のアルカリ金属塩水溶液でそれを溶
出し、その溶出液を再度、陽イオン交換クロマトグラフ
ィーとゲル濾過クロマトグラフィーにより処理すること
からなる。同公報に記載のこの方法は操作やその条件が
煩雑である上、回収率が低く、得られるアンジオジェニ
ンの純度も低いという欠点を有している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、上
記の従来技術の問題点を解決した、即ち、操作が簡単
で、高回収率で、しかも高純度のアンジオジェニンを得
ることができるアンジオジェニンの単離方法を提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するべく、鋭意研究した結果、ヒト及び哺乳動
物の乳を硫酸化多糖類の担体に接触させて、ラクトパー
オキシダーゼ及び／またはラクトフェリンを吸着させる
際に（特開平３−１０９４００号公報）、意外にも、ア
ンジオジェニンが同時に吸着されることを見出し、さら
に、その吸着画分からアンジオジェニンのみを容易に、
高回収率及び高純度で回収する方法を見出し、本発明を
完成させた。即ち、本発明は、アンジオジェニンを含有
する試料溶液から同物質を単離する方法であって、下記
(1)〜(4)の工程： (1)試料溶液を硫酸化多糖類担体に接触させ、得られた
吸着画分を水溶液または緩衝液により溶出し、次いで脱
塩処理することによりアンジオジェニンを含有する画分
を得、(2)上記(1)で得られた画分をチオシアン酸ナトリ
ウムを含有する緩衝液に溶解して、次いで、不溶解物を
除去し、(3)上記(2)で得られた溶液にアルコールを添加
して、アンジオジェニン以外のタンパク質を沈殿させる
ことによって除去し、次いで、(4)上記(3)で得られた溶
液を脱塩処理する、を含むことを特徴とするアンジオジ
ェニンの単離方法からなる。

【０００６】本発明において、アンジオジェニンを含有
する試料溶液は、いかなる種類のものであってもよく、
ヒト及び哺乳動物の乳や血液を例として挙げることがで
きる。ヒト及び哺乳動物の乳は、通常の泌乳期の乳を使
用することができるが、分娩後１〜７日以内、特に、１
〜５日以内の初乳はアンジオジェニンを高濃度で含有し
ているので、好ましい。また、哺乳動物は、いかなる種
類のものであってもよく、ウシ、ヤギ、ヒツジ等を例と
して挙げることができる。血液を試料溶液とする場合
は、予め血球を除去した血漿として使用することが好ま
しい。また、遺伝子組み換えにより作成されたアンジオ
ジェニン生産分泌細胞の培養液または細胞ライゼートを
試料溶液とすることもできる。

【０００７】本発明の単離方法を、乳を試料溶液とする
場合について、説明する。最初に、これらの乳を脱脂処
理した後、特開平３−１０９４００号公報に記載の方法
と同様に、ラクトパーオキシダーゼ及び／又はラクトフ
ェリンに特異的親和性を有する硫酸化多糖類担体と接触
させると、アンジオジェニンがラクトパーオキシダーゼ
及び／又はラクトフェリンとともに、硫酸化多糖類担体
に吸着される。

【０００８】この硫酸化多糖類担体は、スルホン基を導
入した多糖類アフィニティー担体であり、スルフォン化
アルギネート、スルフォン化セルロース、スルフォン化
デキストラン、スルフォン化キトサン等を例として挙げ
ることができるが、スルフォン化キトサンは特に好まし
い。スルフォン化キトサンは「スルフォン化キトパー
ル」の名称で富士紡績（株）より市販されており、容易
に入手することができる。多糖類担体に導入されたスル
フォン基の量は、担体１ml当たり10〜50μeq、特に担体
１ml当たり27〜40μeqであることが好ましい。使用され
る硫酸化多糖類担体の量は、脱脂処理された乳の約0.5
〜５％容量であることが好ましい。

【０００９】吸着操作は、公知のいかなる方法により行
ってもよく、例えば、バッチ処理や担体を充填したカラ
ムに脱脂乳を通液する方法等を例として挙げることがで
きるが、特開平３−１０９４００号公報に開示された回
転型カラムを用いる循環法により吸着操作によれば吸着
効率も高く、特に好ましい。その後、担体をイオン強度
0.2以下でpH５以下の水溶液又は緩衝液を用いて洗浄
し、担体の間に詰った不純物を除去することが好まし
い。ここで使用される水溶液及び緩衝液は、特に限定さ
れるものではないが、温湯、食塩水溶液、酢酸緩衝液、
クエン酸緩衝液、ジメチルグルタル酸緩衝液等を例とし
て挙げることができる。

【００１０】洗浄後、吸着画分を、水溶液または緩衝液
で溶出する。ここで使用される水溶液または緩衝液は、
イオン強度0.5以上でpH５以上、好ましくはイオン強度
0.7〜2.0でpH６〜８であることが好ましい。ここで使用
される水溶液及び緩衝液もまた、特に限定されるもので
はないが、温湯、食塩水溶液、クエン酸緩衝液、酢酸緩
衝液、マレイン酸緩衝液、イミダゾール緩衝液等、重炭
酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液等を
例として挙げることができる。

【００１１】尚、この吸着画分には、溶出に使用した水
溶液または緩衝液中の塩が含まれているため、ここで脱
塩処理を行うことが好ましい。脱塩処理としては、透
析、イオン交換、分子篩等のいずれの方法を採用するこ
ともできるが、50kD以下の分子量画分を限外濾過膜によ
り除去する方法を採用すると、脱塩、濃縮、アンジオジ
ェニンの精製を同時に行うことができるので好ましい。
さらに、限外濾過によれば、電気伝導度、硫酸イオン濃
度を指標とすることにより、脱塩効果を判定することが
でき、電気伝導度400μS/cm、硫酸イオン濃度0.29％
（全固形分当たり）以下となった段階で限外濾過を終了
させることが好ましい。以上の操作により、アンジオジ
ェニンを含有する吸着画分を回収することができる。
尚、この画分は、乾燥処理して粉末化すると、以下の工
程において好都合であるが、アンジオジェニンの失活を
防止するためには、可能な限り低温条件での乾燥、例え
ば凍結乾燥等の処理を行うことが望ましい。

【００１２】次に、このようにして得た吸着画分を１〜
５Ｍ、好ましくは２〜３Ｍのチオシアン酸ナトリウムを
含む少量のTris-HCl緩衝液（pH 7.O）中に、溶解する。
この処理により、本発明の目的物であるアンジオジェニ
ンが同緩衝液中に溶解されラクトフェリンとアンジオジ
ェニンとの結合が解離される。不溶解物は、遠心分離ま
たは濾過等により除去する。このようにして得られた溶
液に、最終濃度が50〜80％になるように、冷エタノール
を添加する。この溶液を−20℃以下において１時間放置
するか、または５℃以下において１昼夜放置することに
より、沈殿を生じさせる。得られた沈殿相に、アンジオ
ジェニンと挙動をともにしたラクトパーオキシダーゼ及
び／またはラクトフェリンが移行し、アンジオジェニン
のみがエタノール相に残存する。このエタノール相を濃
縮した後、脱塩処理を行って、アンジオジェニンを高含
量に含む画分を回収する。この脱塩処理は、透析、イオ
ン交換、分子篩、限外濾過膜を使用する方法等のいずれ
の方法をも採用することもできる。

【００１３】回収した画分がアンジオジェニンであるこ
との確認は、ボンドの方法（ボンド、Anal. Biochem.、
(1988)、173、166-173）によるリボヌクレアーゼインヒ
ビターに対する阻害活性を確認することで行うことがで
きる。また必要により、得られた画分のＮ末端アミノ酸
配列をアミノ酸シーケンサーを用いて分析し、アミノ酸
配列により確認することもできる。

【００１４】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。 実施例１ ウシ脱脂乳からのアンジオジェニンの回収 (1) 通常の雌牛から搾乳して集めた生乳を遠心分離によ
って脱脂処理した。得られた脱脂乳200Ｌ（14℃に冷
却）を、スルフォン基導入量が38.9μeq/ml担体のスル
フォン化キトパールSU-3（富士紡績(株)製）を882ml充
填した内容積1474mlの回転型吸着装置に通液した。通液
速度は25kg／時間とし、２回繰り返して通液した。回転
型反応装置の回転数は、30rpmとした。 (2) 次いで、30〜35℃の温湯40Ｌを上記(1)と同様に通
液し、洗浄を行った。洗浄は280nmの吸光度を測定し、
吸光度が光路長１cmのセルを用いて測定した場合に、0.
01以下になることを確認し、洗浄を終了させた。

【００１５】(3) 洗浄後、0.7M食塩水（0.5mMNaHCO₃、p
H7.0に溶解して調製）約67.5Ｌを上記(1)と同様の条件
で通液し、溶出を行った。溶出は280nmの吸光度を測定
し、吸光度が光路長1cm のセルを用いて測定した場合、
0.015 〜0.020になることを確認した。溶出液66.5kgを
回収した。この回収液の電気伝導度は26.5mS/cmであっ
た。(4) この工程で得た溶液を、50kDの限外濾過膜をセ
ットした限外濾過装置を用いて限外濾過濃縮を行った。
濃縮液の電気伝導度及び硫酸イオン濃度を測定し、電気
伝導度400μS/cm、硫酸イオン濃度0.29％（全固形分当
たり）になった時点で濃縮操作を終了し、アンジオジェ
ニンを含む画分を回収した。次いで、この画分を凍結乾
燥して、乾燥粉末9.11g を得た。

【００１６】(5) 上記(4)で得たアンジオジェニンを含
む画分720mgを、３Ｍチオシアン酸ナトリウムを含む10m
MTris-HCl緩衝液（pH7.0）100ml中に溶解させた。溶解
後、1000r.p.m.で30分間遠心分離を行い、不溶解物を除
去した。 (6) 次いでこの上清に、エタノール濃度が80％になるよ
うに冷エタノールを添加した。約−40℃において１時間
放置後遠心分離を行い、沈殿を除去した。 (7) この沈殿を除去したのち、上清をロータリーエバポ
レーターに移し、液量が80mlになるまで濃縮し、濃縮液
を透析チューブに移し、蒸留水に対し１晩透析を行い、
ついで凍結乾燥を行った。このようにしてアンジオジェ
ニン約９mgを回収した。 この工程により得られたアンジオジェニンの濃縮度及び
回収量を下記表１に示す。

【００１７】

【表1 】 回収工程 アンジオジェニン濃度 全液量 全アンジオジェニン量 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− スルホン化キトハ゜ール 処理 7.2mg/ml 100ml 720mg エタノール処理 112 μg/ml 80ml 9mg −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００１８】実施例２ ウシ初乳からのアンジオジェニンの回収 分娩後５日以内のウシから集めた牛乳を遠心分離により
脱脂処理して、脱脂乳100Ｌを得た。それ以降の操作
は、実施例１の工程(1)〜(7)と同様に行い、アンジオジ
ェニンを約200mgを得た。

【００１９】参考例１ 実施例１で得たアンジオジェニンの生物活性及びＮ末端
アミノ酸配列及び純度を測定、調査した。 (1) 生物活性の測定 ボンドの方法（ボンド、Anal.Biochem.、(1988)、173、
166-173）に従って、リボヌクレアーゼ阻害活性を測定
し、アンジオジェニンの確認を行った。実施例１で得ら
れた物質は、リボヌクレアーゼ阻害活性を有していた。 (2) Ｎ末端アミノ酸配列の分析 アミノ酸シーケンサーを用いる自動分析により、実施例
１で得られた物質のＮ末端アミノ酸20個までの配列を確
認した。確認されたアミノ酸配列は下記配列表配列番号
１に示す通りであり、上記スピックらの報告によるアミ
ノ酸配列と一致した。従って、本方法によって、純粋な
アンジオジェニンが単離されたことが確認された。 (3) アンジオジェニンの精製純度 実施例で得られた物質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル
電気泳動に付し、アンジオジェニンの精製純度及び分子
量を測定した。結果を図１に示す。図１に示す電気泳動
パターンにおいて、アンジオジェニンの分子量である14
400付近に単一バンドとして検出された。即ち、本発明
により純粋なアンジオジェニンが単離されたことが確認
された。

【００２０】比較例１ 特開平２−２９６０００号公報に開示されたイオン交換
クロマトグラフィーによるウシアンジオジェニンを分離
する方法に従って、牛乳50Ｌからアンジオジェニン画分
を、タンパク質として25mg回収した。得られたアンジオ
ジェニン画分を、参考例１と同じ条件でＳＤＳ-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動に付すことにより、精製純度
及び分子量を測定した。その結果、電気泳動パターンに
少なくとも３本のバンドが検出され、精製が不十分なこ
とが明らかであった。

【００２１】

【発明の効果】本発明の方法によれば、活性アンジオジ
ェニンを容易に、高回収率及び高純度で単離することが
できる。また、大量処理も可能であり、生産コストの低
減化を図ることもできる。本発明の方法により高純度で
単離されたアンジオジェニンは、食品、飼料、試薬、医
薬品の成分としての使用が期待される。

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：20 トポロジー: 不明 配列の種類: ペプチド 配列 Ala Gln Asp Asp Tyr Arg Tyr Ile His Phe Leu Thr Gln His Tyr Asp Ala 5 10 15 Lys Pro Lys 20

【図面の簡単な説明】

【図 1】本発の方法により単離されたアンジオジェニン
のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 15/06 8517−4Ｈ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アンジオジェニンを含有する試料溶液か
   ら同物質を単離する方法であって、下記(1)〜(4)の工
   程： (1)試料溶液を硫酸化多糖類担体に接触させ、得られた
   吸着画分を水溶液または緩衝液により溶出し、次いで脱
   塩処理することによりアンジオジェニンを含有する画分
   を得、 (2)上記(1)で得られた画分をチオシアン酸ナトリウムを
   含有する緩衝液に溶解し、次いで、不溶解物を除去し、 (3)上記(2)で得られた溶液にアルコールを添加して、ア
   ンジオジェニン以外のタンパク質を沈殿させることによ
   って除去し、次いで、 (4)上記(3)で得られた溶液を脱塩処理する、 を含むことを特徴とするアンジオジェニンの単離方法。
2. 【請求項２】 アンジオジェニンを含有する試料溶液
   が、ヒトまたは哺乳動物の乳である請求項１に記載の方
   法。
3. 【請求項３】 硫酸化多糖類担体がスルフォン化キトサ
   ンである請求項１または２に記載の方法。