JPH06157419A - 化合物ｐｓ−９９０ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 神経突起伸展作用を有する新規生理活性物質
を提供する。 【構成】 式（Ｉ）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アクレモニウム(Acrem
onium)属に属する微生物により生産され、神経突起伸展
作用を有する化合物ＰＳ−９９０に関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明化合物ＰＳ−９９０に類似した構
造を有する物質としては、式（II）

【０００３】

【化２】

【０００４】で表され、プロスタグランジン生合成阻害
作用を有する化合物〔ジャーナル・オブ・アンチビオチ
ックス（Journal of Antibiotics）、36巻、599〜600
頁、1983年〕および式（III）

【０００５】

【化３】

【０００６】（式中、Ｒ¹およびＲ²は、互いに異なって
ＨまたはＣＨ₃を表す）で表され、フォスフォリパーゼ
Ａ₂阻害作用を有する化合物（特開平４−１５９２５２
号公報）などが知られている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、神経
突起伸展作用を有する新規生理活性物質を提供すること
にある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、式
（Ｉ）

【０００９】

【化４】

【００１０】で表される化合物ＰＳ−９９０またはその
薬理学的に許容される塩を提供することができる。該化
合物はアクレモニウム属に属する微生物を培養すること
により得ることができる。以下に本発明を詳細に説明す
る。薬理学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、
カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カ
ルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウムな
どの塩があげられる。

【００１１】ＰＳ−９９０の理化学的性質を以下に示
す。 性状 ： 無色粉末 分子量 ： 580 分子式 ： Ｃ₃₂Ｈ₃₆Ｏ₁₀ 質量分析（FABMS法、マトリックスにグリセロール使
用）： m/z ： 579（M-H) ^- 高分解能FABMSスペクトル ： 実測値 579.2230 計算値 579.2230（Ｃ₃₂Ｈ₃₆Ｏ₁₀） 融点 ： 183〜185℃ 紫外吸収スペクトル（メタノ−ル中）： λmax ： 21
5nm（ε＝55,000），257nm（ε＝17,000），323nm（ε
＝2,900） 赤外吸収スペクトル（KBr法）： ν（cm^-1）： 3452,
2931,1734,1716,1701,1662,1576,1464,1313,1151,1095,
1074

【００１２】¹H NMRスペクトル（400MHz , ＣＤ₃ＯＤ,
内部標準TMS）： δ(ppm)： 2.15(3H,s),2.17(3H,s),
2.18(3H,s),2.20(3H,s),2.22(3H,s),2.25(3H,s),2.27(3
H,s),2.32(3H,s),2.60(3H,s),3.78(3H,s),3.80(3H,s)¹³ C NMRスペクトル（100MHz ,ＣＤ₃ＯＤ , 内部標準TM
S、観測された炭素シグナルのみ記載）： δ(ppm) ：
9.82(q),10.28(q),10.51(q),12.33(q),13.29(q),13.4
8(q),16.83(q),17.43(q),18.89(q),62.50(q),62.54(q),
115.20(s),116.95(s),118.26(s),120.75(s),121.35(s),
122.98(s),123.19(s),126.65(s),133.20(s),134.23(s),
137.38(s),150.28(s),153.53(s),154.52(s),156.14(s),
157.24(s),158.18(s),168.54(s),170.36(s) 呈色反応 ： 50％硫酸、ヨード、アニスアルデヒドに
陽性

【００１３】実験１〜３に示す条件で、ＰＳ−９９０を
薄層クロマトグラフィーに付した。その結果得られるＲ
ｆ値を第１表に示す。検出はヨウ素反応および２５３.
７nmの紫外線照射法により行った。 実験１ 薄層：キーゼルゲル６０Ｆ254 （メルク社製、Art.562
8） 展開溶媒：クロロホルム：メタノール＝９：１ 展開方法：室温、上昇法、１５〜３０分 実験２ 薄層：キーゼルゲル６０Ｆ254 （メルク社製、Art.562
8） 展開溶媒：クロロホルム：メタノール：エタノール：水
＝１０：４：４：２ 展開方法：室温、上昇法、１５〜３０分 実験３ 薄層：ＲＰ−１８Ｆ254ｓ（メルク社製、Art.13724） 展開溶媒：７０％メタノール／水 展開方法：室温、上昇法、１５〜６０分

【００１４】

【表１】

【００１５】なお、理化学的データは以下の機器により
測定した。 マススペクトル： 日立製作所 M - 80B質量分析装置 紫外線吸収スペクトル： 島津製作所 UV - 2200分光
光度計 赤外線吸収スペクトル： 日本電子 JIR - RFX3001赤
外線分光光度計 ＮＭＲスペクトル： ブルカー AM400 核磁気共鳴装置 融点： 柳本製作所 ミクロ融点測定装置 以上のデータよりＰＳ−９９０は新規化合物であること
が判明した。

【００１６】つぎに、ＰＳ−９９０の神経突起伸展作用
を試験例で説明する。 試験例１ 株化神経細胞Neuro2Aにおける神経突起伸
展作用 株化神経細胞Neuro2Aを滅菌済み細胞培養用プレート上
で１０％牛胎児血清、１％非必須アミノ酸溶液（フロー
・ラボラトリーズ社製）を含むミニマム・エッセンシャ
ル・メディウム（minimum essential medium、日水製薬
社製）を用いて１日ないし２日間培養し、新たに培地を
交換した。メタノールに溶解したＰＳ−９９０を培地に
添加し、さらに１２時間培養した。培養後、細胞を位相
差顕微鏡を用いて観察し、神経突起を有する細胞の数を
測定した。なお、ＰＳ−９９０のかわりに１％メタノー
ルを添加して神経突起形成度を測定したものを対照とし
た。神経突起形成度は、神経突起を有する細胞数の全体
の細胞数に対する割合としてGurwitzらの方法〔プロシ
ーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス・ユー・エスー・エー（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A.）、85巻、3440〜3444頁、１９８８
年〕に従って測定、算出した。ＰＳ−９９０を添加した
ときの神経突起形成度を第２表に示す。

【００１７】

【表２】

【００１８】ＰＳ−９９０は、アクレモニウム属に属
し、ＰＳ−９９０生産能を有する微生物を培地に培養
し、培養物中にＰＳ−９９０を生成蓄積させ、該培養物
からＰＳ−９９０を採取することによって得ることがで
きる。ＰＳ−９９０生産性微生物としてはアクレモニウ
ム属に属し、ＰＳ−９９０生産能を有するものであれば
いずれの微生物でも用いることができる。また、これら
の菌株を人工的変異方法、たとえば紫外線照射、Ｘ線照
射、変異誘発剤処理などによって変異させた変異株ある
いは自然的に変異した変異株などでもＰＳ−９９０生産
能を有していれば本発明に用いることができる。具体的
に好適な例としては、土壌より新たに分離したアクレモ
ニウム・エスピー(Acremonium sp.)Ｐ−９９０株があげ
られる。

【００１９】アクレモニウム・エスピー(Acremonium s
p.)Ｐ−９９０株の形態、培養性状、生理的性質におけ
る特徴は次の通りである。 肉眼的観察 麦芽エキス寒天培地を用いて、２５℃で培養したとき、
集落の直径は培養７日目で約１５ｍｍ、培養１４日目で
約３０ｍｍに達する。集落の表面は白色を呈する。集落
裏面は、肌色を呈し、裏面中央部はやや赤身をおびた淡
褐色を呈する。

【００２０】バレイショ・ブドウ糖寒天培地を用いて、
２５℃で培養したとき、集落の直径は培養７日目で約１
５ｍｍ、培養１４日目で約３０ｍｍに達する。集落の表
面は、白色を呈する。集落裏面は、クリーム色を呈し、
裏面中央部は淡褐色を呈する。本菌の至適生育温度は、
１０〜２８℃で、２５℃付近で最も良好に生育する。生
育し得るｐＨは、２〜９.５で、ｐＨ６前後で最も良好
に生育する。

【００２１】 光学顕微鏡的観察 麦芽エキス寒天培地を用いて、２５℃で２週間培養した
ときの本菌の光学顕微鏡による観察結果は以下の通りで
ある。菌糸は隔壁を有し、平滑でよく分岐する。分生子
は、菌糸から側生あるいは頂生するフィアライドから形
成される。フィアライドは菌糸から単生し、無色、平滑
で、基部は幅０.７〜２μｍ、先端に向かうに従い徐々
に細くなり、先端部の幅は約０.３μｍを呈する。フィ
アライドの長さは、１１.５〜２０μｍで、その基部に
隔壁を有する。フィアライド先端部からは、分生子が内
生出芽的、フィアロ型に形成され、フィアライド先端部
には分生子の小さい粘球が形成されることもある。分生
子の形態は変化に富み、楕円形、長楕円形、紡錘形、棍
棒形、三日月形、腎臓形等を呈する。分生子は、無色、
平滑で、長さ１.５〜７μｍ、幅は最も広いところで０.
７〜１.８μｍを呈する。本菌株は、上述したアナモル
フのみ観察され、テレオモルフは観察されない。

【００２２】以上の菌学的性質から、本菌の分類学上の
位置を「ザ・ジェネラ・オブ・ファンジャイ・スポルレ
イティング・イン・ピュア・カルチャー 第２版 （Th
e Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture, 2nd
ed. Cramer. Vaduz, J. A.von Arx, １９７４年）」に
従って検索した結果、本菌株は糸状不完全菌類のアクレ
モニウム（Acremonium）属に属することが明らかとなっ
た。

【００２３】本発明者らは、本菌株をアクレモニウム・
エスピー Ｐ−９９０（Acremoniumsp. P-990）と命名
し、ブダペスト条約の条件下、微工研条寄第４０１９号
として、工業技術院微生物工業技術研究所に平成４年１
０月１日付けで寄託した。なお、アクレモニウム属菌に
関しては、ウォルター・ガムス（Walter Gams）著の
「セファロスポリウム−アールティゲ・シメルピルツェ
（ヒフォミセテス）（Cephalosporium-artige Schimmel
pilze （Hyphomycetes））」（Gustav Fischer Verlag,
Stuttgart, １９７１年）に詳しく述べられている。

【００２４】微生物の培養に際しては放線菌の培養に用
いられる通常の培養方法が適用される。用いられる培地
は菌の資化し得る炭素源、窒素源、無機物などを程よく
含有する培地であれば天然培地、合成培地いずれでも用
いられる。炭素源としては、グルコース、シュークロー
ス、スタビロース、澱粉、デキストリン、マンノース、
マルトース、糖蜜などの炭水化物、クエン酸、リンゴ
酸、酢酸、フマール酸などの有機酸、メタノール、エタ
ノール、グリセロールなどのアルコール、メタン、エタ
ン、プロパン、ｎ−パラフィンなどの炭化水素、グルタ
ミン酸などのアミノ酸などが用いられる。

【００２５】窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムな
どのアンモニウム塩、アスパラギン酸、グルタミン、シ
スチン、アラニンなどのアミノ酸、尿素、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン・スチープ・リ
カー、大豆粉、ソルブル・ベジタブル・プロテイン、綿
実粕、大豆カゼイン、カザミノ酸、ファーマメディアな
どが用いられる。

【００２６】無機物としてはリン酸一水素カリウム、リ
ン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸
マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マ
ンガン、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、パントテン
酸カルシウム、モリブデン酸アンモニウム、硫酸アルミ
ニウムカリウム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム、塩化
コバルト、食塩などが用いられる。

【００２７】その他必要に応じて培地にビタミン、例え
ばサイアミンなど菌体の増殖あるいはＰＳ−９９０の生
産を促進する物質を加えることもできる。用いられる微
生物が特定の物質を要求する場合は、生育に必要なもの
を加えることが必要である。培養は振盪培養法、通気攪
拌培養法などにより、温度は１５〜３５℃、ｐＨは中性
付近で行われる。

【００２８】通常、３〜１５日の培養によって、ＰＳ−
９９０の蓄積は最大に達する。培養物中に、蓄積したＰ
Ｓ−９９０を培養物から単離採取するに際しては、通常
の生理活性物質を培養物から採取する方法が適用され
る。すなわち、アセトン、メタノールなどの有機溶媒に
よる菌体成分の抽出、ろ過、遠心分離などによる菌体除
去、吸着樹脂、シリカゲル、シラナイズドシリカゲル、
逆層シリカゲル、アルミニウム、セルロース、ケイ藻
土、ケイ酸マグネシウム、ゲルろ過剤、イオン交換樹脂
などを用いるカラムクロマトグラフィーもしくは薄層ク
ロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、適当な
溶媒系による分配などによってＰＳ−９９０は単離され
る。

【００２９】培養物からＰＳ−９９０を単離する一例は
次の通りである。培養物をろ過もしくは遠心分離するこ
とによって菌体を得る。得られた菌体をメタノール、ア
セトンなどの適当な有機溶媒で抽出し、菌体抽出液を得
る。得られた菌体抽出液を減圧下で濃縮することにより
有機溶媒を除去し水溶液とする。ついで、この水溶液を
水と混和しない溶媒、例えば酢酸エチル、酢酸ブチルな
どで抽出する。抽出液を減圧下で濃縮した後、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーを繰り返して行い、活性物
質を精製する。溶出溶媒としては、クロロホルム、酢酸
エチル、メタノール、アセトンなどを単独あるいは混合
して用いる。活性物質を含む溶出液を減圧下で濃縮し、
次に、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り
返して行うことにより活性物質をさらに精製する。溶出
溶媒として、アセトン、メタノール、水などを単独ある
いは混合して用いることにより、ＰＳ−９９０が得られ
る。

【００３０】上記精製工程中のＰＳ−９９０の検出は、
蛍光剤入りシリカゲル（キーゲルゼルＦ254 、メルク社
製）を用いた薄層クロマトグラフィーに付し、ヨウ素反
応または２５３.７nmの紫外線照射法により行う。以下
に本発明の実施例を示す。

【００３１】

【実施例】実施例１ 種菌として、アクレモニウム・エスピー（Acremonium s
p.)Ｐ−９９０を用いた。種菌１白金耳を太型試験管に
入れた第一種培地〔Ｖ８野菜ジュ−ス（キャンベル社
製）２０ml／dl、デキストリン３g／dl、（ｐＨ６.
４）〕１０mlに植菌し、２５℃で５日間振盪培養した
（第一種培養）。

【００３２】第一種培養により得られた培養液（第一種
培養液）１０mlを３００ml容三角フラスコに入った５０
mlの第二種培地に植菌した。第二種培地の組成は第一種
培地と同じである。第二種培養は２８℃で２日間行っ
た。得られた第二種培養液５０mlを２リットル容三角フ
ラスコに入った５００mlの主発酵培地に植菌した。主発
酵培地として、グルコース ２g／dl、 マッシュポテト
の素（雪印社製）２g／dl、ペプトン０．５g／dl、リン
酸二水素カリウム０．０５g／dl、リン酸マグネシウム
・８水塩０．０５g／dl（ｐＨ６．５）の組成からなる
培地を用いた。主発酵培養は２５℃で７日間振盪培養に
より行った。

【００３３】得られた発酵終了液５リットルに２５ｇの
ケイ藻土を添加し濾過することにより菌体を得た。分別
した菌体に５リットルのメタノールを加え攪拌後ろ過し
た。ろ液を減圧下で濃縮し、水溶液とした後に、２,５
００mlの酢酸エチルを５００ｍｌずつ加えて５回抽出を
行った。酢酸エチル層を減圧下で濃縮して得られる黄色
油状物質（１.７５g ）を少量のメタノールに溶解し、
少量のケイ藻土を加えて減圧乾固したものを１０％メタ
ノールを含むクロロホルムを用いて充填した７００リッ
トルのシリカゲルカラム（メルクＡｒｔ．７７３４、メ
ルク社製）の上端にのせた。１０％メタノールを含むク
ロロホルム（２.１リットル）でカラムを洗浄後、５０
％メタノールを含むクロロホルム（２.１リットル）で
活性物質を溶出した。溶出液をすべて集め、減圧下で濃
縮乾固すると６０９ｍｇの黄色固体が得られた。

【００３４】この物質を少量のメタノールに溶解し、Ｙ
ＭＣ−ＯＤＳゲル（ＯＤＳ−Ａ ６０−２３０／７０、
山村化学研究所社製）を加えて減圧乾固したものを０.
１Ｎ塩酸を含む５０％アセトニトリル水溶液を用いて充
填したＹＭＣ−ＯＤＳゲル（６０ml）の上端にのせた。
１Ｎ塩酸を含む５０％アセトニトリル水溶液（１８０ｍ
ｌ）を用いてカラムを洗浄後、０.１Ｎ塩酸を含む７０
％アセトニトリル水溶液（１８０ｍｌ）で活性物質を溶
出した。溶出液を６ｍｌずつ分取するとＰＳ−９９０は
画分番号５から１７に溶出された。これらの画分を集め
た後、減圧下で濃縮乾固し黄色物質３０１ｍｇを得た。
この物質を、９０％メタノール水溶液（３０ｍｌ）に溶
解し、Ｈ⁺型に前処理した５ｇの陽イオン交換樹脂（Ｓ
Ｋ−１ＢＳ、三菱化成社製）を添加し、攪拌後濾過し
た。ろ液を減圧下で濃縮乾固し、黄色物質を１３０ｍｇ
得た。これを、少量のメタノールに溶解し、少量のＹＭ
Ｃ−ＯＤＳゲル（ＯＤＳ−ＡＭ １２０−４００／２３
０、山村化学研究所社製）を加えて減圧乾固したものを
０.１Ｎ塩酸を含む５０％アセトニトリル水溶液を用い
て充填したＹＭＣ−ＯＤＳゲル（１００ml）の上端にの
せた。１Ｎ塩酸を含む５０％アセトニトリル水溶液（３
００ｍｌ）を用いてカラムを洗浄後、０.１Ｎ塩酸を含
む７０％アセトニトリル水溶液（３００ｍｌ）で活性物
質を溶出した。溶出液を２ｍｌずつ分取するとＰＳ−９
９０は画分番号２２から５５に溶出された。これらの画
分を集めた後、減圧下で濃縮乾固し、淡黄色粉末１０９
ｍｇを得た。これを、少量のメタノールに溶解し、−２
０℃で１日間静置すると無色の結晶が析出した。この結
晶をろ別し、減圧下で乾燥することにより無色結晶のＰ
Ｓ−９９０が５４ｍｇ得られた。

【００３５】

【発明の効果】本発明によれば、神経突起伸展作用を有
する化合物ＰＳ−９９０を提供することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 で表される化合物ＰＳ−９９０またはその薬理学的に許
   容される塩。