JPH06165698A - 核酸の検出方法 - Google Patents
核酸の検出方法Info
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- JPH06165698A JPH06165698A JP17674993A JP17674993A JPH06165698A JP H06165698 A JPH06165698 A JP H06165698A JP 17674993 A JP17674993 A JP 17674993A JP 17674993 A JP17674993 A JP 17674993A JP H06165698 A JPH06165698 A JP H06165698A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】目的核酸の有無を電気泳動を行わずに高感度
に、簡便にしかも短時間で行う。 【構成】ＰＣＲ又はＬＣＲなどの方法で生成した後のＤ
ＮＡに、変性と同時に生成に用いたプライマーのうちの
１つの配列をもつ標識プライマーを作用させた後、生成
した反応物を生成遺伝子の一部の配列に相補的な配列を
もつ標識オリゴヌクレオチドおよび前記標識プライマー
を認識する固相に同時に反応させ、標識オリゴヌクレオ
チドより生じる信号の測定を行うことで目的核酸の有無
を検出することを特徴とする。
に、簡便にしかも短時間で行う。 【構成】ＰＣＲ又はＬＣＲなどの方法で生成した後のＤ
ＮＡに、変性と同時に生成に用いたプライマーのうちの
１つの配列をもつ標識プライマーを作用させた後、生成
した反応物を生成遺伝子の一部の配列に相補的な配列を
もつ標識オリゴヌクレオチドおよび前記標識プライマー
を認識する固相に同時に反応させ、標識オリゴヌクレオ
チドより生じる信号の測定を行うことで目的核酸の有無
を検出することを特徴とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は特定の塩基配列を持つＤ
ＮＡあるいはＲＮＡを検出する方法でありウイルスや細
菌による疾患、遺伝病の診断、あるいは種の同定、親子
鑑別などに用いられる方法である。
ＮＡあるいはＲＮＡを検出する方法でありウイルスや細
菌による疾患、遺伝病の診断、あるいは種の同定、親子
鑑別などに用いられる方法である。
【０００２】
【従来の技術】ハイブリダイゼーション法は遺伝子の変
異により生じる疾患やウイルスによる病気の診断に有効
である。
異により生じる疾患やウイルスによる病気の診断に有効
である。
【０００３】従来、検出の際には目的ＤＮＡやＲＮＡを
菌、ウイルス、白血球などから超音波破砕、などの物理
学的方法、プロテネースＫのような酵素やＳＤＳのよう
な界面活性剤を用いて化学的な方法で抽出する。その後
フェノール、クロロホルム処理、エタノール沈澱でＤＮ
Ａ（ＲＮＡ）を精製した後，ＮａＯＨのようなアルカリ
で変性させて１本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）にする。そしてこ
の目的の１本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）をメンブランフィルタ
ー（ニトロセルロース、ナイロン）上に固定する方法が
よく知られたフィルターハイブリダイゼーション法であ
る。
菌、ウイルス、白血球などから超音波破砕、などの物理
学的方法、プロテネースＫのような酵素やＳＤＳのよう
な界面活性剤を用いて化学的な方法で抽出する。その後
フェノール、クロロホルム処理、エタノール沈澱でＤＮ
Ａ（ＲＮＡ）を精製した後，ＮａＯＨのようなアルカリ
で変性させて１本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）にする。そしてこ
の目的の１本鎖ＤＮＡ（ＲＮＡ）をメンブランフィルタ
ー（ニトロセルロース、ナイロン）上に固定する方法が
よく知られたフィルターハイブリダイゼーション法であ
る。
【０００４】このＤＮＡ（ＲＮＡ）を固定したフィルタ
ーに放射性同位元素、酵素、ビオチン、蛍光物質などで
ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを加えると、オ
リゴヌクレオチドが対象ＤＮＡ（ＲＮＡ）と相補的配列
を持つと両者の間に水素結合が生じて２本鎖を形成す
る。相補鎖を持たなっかたり過剰のオリゴヌクレオチド
プローブは洗浄によってフィルターから除去される。そ
の後放射活性、酵素活性、蛍光強度測定によって目的Ｄ
ＮＡ（ＲＮＡ）の検出を行う。
ーに放射性同位元素、酵素、ビオチン、蛍光物質などで
ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブを加えると、オ
リゴヌクレオチドが対象ＤＮＡ（ＲＮＡ）と相補的配列
を持つと両者の間に水素結合が生じて２本鎖を形成す
る。相補鎖を持たなっかたり過剰のオリゴヌクレオチド
プローブは洗浄によってフィルターから除去される。そ
の後放射活性、酵素活性、蛍光強度測定によって目的Ｄ
ＮＡ（ＲＮＡ）の検出を行う。
【０００５】また最近よく用いられる微量ＤＮＡを増や
す方法にポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ
（Saiki,R.K.et al,Science 239 487-491 (1988)) があ
る。この方法は、ごく微量の遺伝子（ＤＮＡ）から目的
とするＤＮＡ領域だけを数時間のうちに約１００万倍に
増幅させることができる。すなわち、増幅させたい遺伝
子領域を挟んで＋鎖、−鎖に対するＤＮＡプライマー
（１８〜３０ヌクレオチド）を合成しＤＮＡポリメラー
ゼによりＤＮＡ断片の合成を繰り返し行うと、１サイク
ルごとにＤＮＡは２倍に増幅されｎサイクル後には、２
n 倍に増幅される。この際ＤＮＡプライマーとして、目
的遺伝子に特異的な配列を選ぶことで選択性の高いポリ
メラーゼ反応が起こり２つのプライマーにはさまれた２
本鎖ＤＮＡ断片が生成する。この２本鎖断片の検出法で
は、ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡ（増幅ＤＮＡ）を先に
述べたフィルターハイブリダイゼーション法に持ち込む
のが一般的な方法である。
す方法にポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ
（Saiki,R.K.et al,Science 239 487-491 (1988)) があ
る。この方法は、ごく微量の遺伝子（ＤＮＡ）から目的
とするＤＮＡ領域だけを数時間のうちに約１００万倍に
増幅させることができる。すなわち、増幅させたい遺伝
子領域を挟んで＋鎖、−鎖に対するＤＮＡプライマー
（１８〜３０ヌクレオチド）を合成しＤＮＡポリメラー
ゼによりＤＮＡ断片の合成を繰り返し行うと、１サイク
ルごとにＤＮＡは２倍に増幅されｎサイクル後には、２
n 倍に増幅される。この際ＤＮＡプライマーとして、目
的遺伝子に特異的な配列を選ぶことで選択性の高いポリ
メラーゼ反応が起こり２つのプライマーにはさまれた２
本鎖ＤＮＡ断片が生成する。この２本鎖断片の検出法で
は、ＰＣＲ反応で増幅したＤＮＡ（増幅ＤＮＡ）を先に
述べたフィルターハイブリダイゼーション法に持ち込む
のが一般的な方法である。
【０００６】その他の方法としては、あらかじめ各々
のプライマーにビオチンをラベルしてＰＣＲ反応を行っ
た後放射性物質を標識したＤＮＡプロ−ブと液相でハイ
ブリダイゼーションを行なった後アビジンを固定したア
フィニティマトリックスを用いて検出する方法(Ann-Chr
istine Syvanen et al,Nucl. Acids Res.16 (1988)113
27-38 )、ＰＣＲを行った後２種のＤＮＡプローブと
ハイブリダイゼーションを行った後に固相に吸着し検出
する方法（Patrik,O.Dahlen et al,J.clin. Microbiol.
(1991) 798-804)、あるいは、アドラーら特開平3-5041
99号などがある。
のプライマーにビオチンをラベルしてＰＣＲ反応を行っ
た後放射性物質を標識したＤＮＡプロ−ブと液相でハイ
ブリダイゼーションを行なった後アビジンを固定したア
フィニティマトリックスを用いて検出する方法(Ann-Chr
istine Syvanen et al,Nucl. Acids Res.16 (1988)113
27-38 )、ＰＣＲを行った後２種のＤＮＡプローブと
ハイブリダイゼーションを行った後に固相に吸着し検出
する方法（Patrik,O.Dahlen et al,J.clin. Microbiol.
(1991) 798-804)、あるいは、アドラーら特開平3-5041
99号などがある。
【０００７】また、増幅ＤＮＡを直接、電気泳動法で分
析する方法が知られている。この方法は、アクリルアミ
ドゲル担体中で、ラジオアイソトープでラベルした、あ
るいはラベルしていないＤＮＡ断片を泳動させ、そのゲ
ルのオートラジオグラフィーをとる、あるいは、薄層シ
リカゲルプレート上におき、ＵＶランプでゲルを照らし
写真をとる。または、アガロースゲル担体中でＤＮＡ断
片を泳動し、その後、エチジウムブロマイドでＤＮＡを
染色し、泳動漕からゲルをトランスイルミネーター（紫
外光を発する）上におき、写真をとる方法である(T.Man
iatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbo
ur(1982)) 。
析する方法が知られている。この方法は、アクリルアミ
ドゲル担体中で、ラジオアイソトープでラベルした、あ
るいはラベルしていないＤＮＡ断片を泳動させ、そのゲ
ルのオートラジオグラフィーをとる、あるいは、薄層シ
リカゲルプレート上におき、ＵＶランプでゲルを照らし
写真をとる。または、アガロースゲル担体中でＤＮＡ断
片を泳動し、その後、エチジウムブロマイドでＤＮＡを
染色し、泳動漕からゲルをトランスイルミネーター（紫
外光を発する）上におき、写真をとる方法である(T.Man
iatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbo
ur(1982)) 。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、フィル
ターを用いる方法では、フィルターにＤＮＡ（ＲＮＡ）
を固定するための操作、ＤＮＡ（ＲＮＡ）を熱や紫外線
によって固定する操作、及び相補鎖を形成しなかったオ
リゴヌクレオチドプロ−ブの洗浄の煩雑な操作がつきま
とう。さらにＤＮＡプロ−ブがフィルター表面に非特異
的に吸着して検出感度の低下やバックグランドの上昇を
招くという不都合もあった。
ターを用いる方法では、フィルターにＤＮＡ（ＲＮＡ）
を固定するための操作、ＤＮＡ（ＲＮＡ）を熱や紫外線
によって固定する操作、及び相補鎖を形成しなかったオ
リゴヌクレオチドプロ−ブの洗浄の煩雑な操作がつきま
とう。さらにＤＮＡプロ−ブがフィルター表面に非特異
的に吸着して検出感度の低下やバックグランドの上昇を
招くという不都合もあった。
【０００９】また、上記のあらかじめ各々のプライマ
ーにビオチンをラベルしてＰＣＲ反応を行った後、放射
性物質を標識したＤＮＡプロ−ブと液相でハイブリダイ
ゼーションを行った後アビジンを固定したアフィニティ
マトリックスを用いて検出する方法では、ハイブリダイ
ゼーションを行った後に担体に固定するため操作が煩雑
になるとともに、プライマーにラベルを施すため、通常
のＰＣＲ反応の条件を変更する必要があった。更にラベ
ルプライマーをＰＣＲの際多量に用いるためコストがか
かった。
ーにビオチンをラベルしてＰＣＲ反応を行った後、放射
性物質を標識したＤＮＡプロ−ブと液相でハイブリダイ
ゼーションを行った後アビジンを固定したアフィニティ
マトリックスを用いて検出する方法では、ハイブリダイ
ゼーションを行った後に担体に固定するため操作が煩雑
になるとともに、プライマーにラベルを施すため、通常
のＰＣＲ反応の条件を変更する必要があった。更にラベ
ルプライマーをＰＣＲの際多量に用いるためコストがか
かった。
【００１０】また、上記のの方法では、プライマー２
種、ＤＮＡプローブ２種の計４種の特異的配列が必要と
なり、配列の選択や合成が非常に繁雑となった。
種、ＤＮＡプローブ２種の計４種の特異的配列が必要と
なり、配列の選択や合成が非常に繁雑となった。
【００１１】更に、とも反応の過程が多段階であ
り、遠心操作なども必要であった。
り、遠心操作なども必要であった。
【００１２】また、電気泳動法では放射性物質を用いる
場合は特殊な施設を必要とし、ゲルの長期保存ができな
いため随時作成を要しかつ高価となる。またＰＣＲ終了
後１時間半以上の時間を要する。
場合は特殊な施設を必要とし、ゲルの長期保存ができな
いため随時作成を要しかつ高価となる。またＰＣＲ終了
後１時間半以上の時間を要する。
【００１３】そこで、本発明はこれら課題を克服し、短
時間に高感度な多検体処理を可能とし、手間をかけずに
客観的な出力結果を出す核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）の検出
方法を提供することを目的とする。
時間に高感度な多検体処理を可能とし、手間をかけずに
客観的な出力結果を出す核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ）の検出
方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決するため、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを鎖
長反応プライマーとして機能させ標的ＤＮＡ中の特定の
ＤＮＡをＤＮＡ合成酵素を用いて選択的に生成させる工
程（第１反応）、ＤＮＡ合成酵素を失活させる試薬ある
いは温度と、生成を行った際に用いたプライマーのうち
の１つの配列をもつ標識プライマーを作用させて生成遺
伝子を変性させると同時に生成遺伝子に標識プライマー
を付着させる工程（第２反応）、第２反応で生成した反
応物を、生成遺伝子の一部の配列に相補的な配列をもつ
標識オリゴヌクレオチドおよび第２反応で作用させた標
識プライマーを認識する固相に同時に反応させる工程
（第３反応）、第３反応に用いた標識オリゴヌクレオチ
ドより生じる信号の測定を行うことで目的核酸の有無を
検出する工程（第４反応）とからなる。
決するため、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを鎖
長反応プライマーとして機能させ標的ＤＮＡ中の特定の
ＤＮＡをＤＮＡ合成酵素を用いて選択的に生成させる工
程（第１反応）、ＤＮＡ合成酵素を失活させる試薬ある
いは温度と、生成を行った際に用いたプライマーのうち
の１つの配列をもつ標識プライマーを作用させて生成遺
伝子を変性させると同時に生成遺伝子に標識プライマー
を付着させる工程（第２反応）、第２反応で生成した反
応物を、生成遺伝子の一部の配列に相補的な配列をもつ
標識オリゴヌクレオチドおよび第２反応で作用させた標
識プライマーを認識する固相に同時に反応させる工程
（第３反応）、第３反応に用いた標識オリゴヌクレオチ
ドより生じる信号の測定を行うことで目的核酸の有無を
検出する工程（第４反応）とからなる。
【００１５】ここで、第１反応は、遺伝子増幅法、例え
ばＰＣＲ反応(Saikiら、Science(230) 1350-4)、ＬＣＲ
（Baranyら、Proc,Natl.Acad.Sci.USA(88) (89-93)）、
あるいはＤＮＡ酵素によるプライマーイクステンション
法等で、公知の手法により行われるが、ＰＣＲ反応を用
いる場合は一種のプライマーを他方に比べて多量に用い
る方法（Asymmetric PCR) が好ましい。ＰＣＲ反応に用
いられるプライマーとしては、例えば、当社出願人によ
る特願平３−５９８２０号のものを挙げることができる
が、これに限定されない。２種のオリゴヌクレオチドの
組み合わせは、例えば、腸炎ビブリオ菌耐熱性溶血遺伝
子（tdh 遺伝子）を検出するときは、 （ａ）５´ｄＧＧＴＡＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴ
Ｃ（配列番号１）及び （ｂ）５´ｄＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＧ
Ｃ（配列番号２）を用い、コレラ毒素遺伝子を検出する
ときは、 （ｅ）５´ｄＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣ
Ｃ （配列番号５）及び （ｆ）５´ｄＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧ
ＧＡＧ（配列番号６）を用いる。
ばＰＣＲ反応(Saikiら、Science(230) 1350-4)、ＬＣＲ
（Baranyら、Proc,Natl.Acad.Sci.USA(88) (89-93)）、
あるいはＤＮＡ酵素によるプライマーイクステンション
法等で、公知の手法により行われるが、ＰＣＲ反応を用
いる場合は一種のプライマーを他方に比べて多量に用い
る方法（Asymmetric PCR) が好ましい。ＰＣＲ反応に用
いられるプライマーとしては、例えば、当社出願人によ
る特願平３−５９８２０号のものを挙げることができる
が、これに限定されない。２種のオリゴヌクレオチドの
組み合わせは、例えば、腸炎ビブリオ菌耐熱性溶血遺伝
子（tdh 遺伝子）を検出するときは、 （ａ）５´ｄＧＧＴＡＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴ
Ｃ（配列番号１）及び （ｂ）５´ｄＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＧ
Ｃ（配列番号２）を用い、コレラ毒素遺伝子を検出する
ときは、 （ｅ）５´ｄＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣ
Ｃ （配列番号５）及び （ｆ）５´ｄＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧ
ＧＡＧ（配列番号６）を用いる。
【００１６】また、第２反応で用いられるＤＮＡ合成酵
素を失活させる試薬とは、例えば、ＥＤＴＡを挙げるこ
とができ、標識プライマーの標識体としては、ビオチン
を挙げることができるが、これらには限定されない。
素を失活させる試薬とは、例えば、ＥＤＴＡを挙げるこ
とができ、標識プライマーの標識体としては、ビオチン
を挙げることができるが、これらには限定されない。
【００１７】なお、増幅遺伝子を変性させるには、増幅
遺伝子溶液の温度を９０℃〜９５℃に上げること，ある
いはＮａＯＨのようなアルカリ溶液を用いることにより
成される。
遺伝子溶液の温度を９０℃〜９５℃に上げること，ある
いはＮａＯＨのようなアルカリ溶液を用いることにより
成される。
【００１８】第３反応で用いられる標識オリゴヌクレオ
チドの塩基配列は、例えば、腸炎ビブリオ菌耐熱性溶血
遺伝子（tdh 遺伝子）を検出するときは、第２反応で
（ｂ）を用いる際は （ｃ）５´ｄＣＣＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧ
Ａ（配列番号３）に結合する配列を、第２反応で（ａ）
を用いる際は （ｄ）５´ｄＴＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧ
Ｇ（配列番号４）に結合する配列のものを用いることが
でき、コレラ毒素遺伝子を検出するときは、第２反応で
（ｆ）を用いる際は （ｈ）５´ｄＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧ
ＡＧＡＡ（配列番号７）に結合する配列を、第２反応で
（ｅ）を用いる際は（ｈ）の相補鎖と結合する配列を用
いることができる。
チドの塩基配列は、例えば、腸炎ビブリオ菌耐熱性溶血
遺伝子（tdh 遺伝子）を検出するときは、第２反応で
（ｂ）を用いる際は （ｃ）５´ｄＣＣＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧ
Ａ（配列番号３）に結合する配列を、第２反応で（ａ）
を用いる際は （ｄ）５´ｄＴＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧ
Ｇ（配列番号４）に結合する配列のものを用いることが
でき、コレラ毒素遺伝子を検出するときは、第２反応で
（ｆ）を用いる際は （ｈ）５´ｄＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧ
ＡＧＡＡ（配列番号７）に結合する配列を、第２反応で
（ｅ）を用いる際は（ｈ）の相補鎖と結合する配列を用
いることができる。
【００１９】また、標識オリゴヌクレオチドの標識体と
しては、酵素あるいは蛍光色素を用いることができ、酵
素としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペル
オキシダーゼを挙げることができるが、これらに限定さ
れない。また、蛍光色素としては、例えば、ＦＩＴＣ、
ローダミンを挙げることができる。
しては、酵素あるいは蛍光色素を用いることができ、酵
素としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペル
オキシダーゼを挙げることができるが、これらに限定さ
れない。また、蛍光色素としては、例えば、ＦＩＴＣ、
ローダミンを挙げることができる。
【００２０】標識プライマーを認識する固相は、例え
ば、ストレプトアビジンあるいはアビジンが固定されて
いる９６穴マイクロプレートを用いる。
ば、ストレプトアビジンあるいはアビジンが固定されて
いる９６穴マイクロプレートを用いる。
【００２１】第４反応における測定は、第３反応におけ
る標識オリゴヌクレオチドの標識体が酵素の場合は酵素
基質を用いて行う。酵素基質は、酵素がアルカリフォス
ファターゼの場合には、例えば、４−メチルウンベリフ
ェリル燐酸あるいはｐ−ニトロフェニル燐酸を、ペルオ
キシダーゼの場合はパラヒドロキシフェニルプロピオン
酸あるいは3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン、Ｏ−フ
ェニレンジアミンを用いる。
る標識オリゴヌクレオチドの標識体が酵素の場合は酵素
基質を用いて行う。酵素基質は、酵素がアルカリフォス
ファターゼの場合には、例えば、４−メチルウンベリフ
ェリル燐酸あるいはｐ−ニトロフェニル燐酸を、ペルオ
キシダーゼの場合はパラヒドロキシフェニルプロピオン
酸あるいは3,3',5,5'-テトラメチルベンチジン、Ｏ−フ
ェニレンジアミンを用いる。
【００２２】また、標識体が蛍光色素の場合は、レーザ
光を照射して発生する蛍光を測定する。なお、標的核酸
がＲＮＡのときは、逆転写酵素を用いＤＮＡに転写して
前記反応を行う。
光を照射して発生する蛍光を測定する。なお、標的核酸
がＲＮＡのときは、逆転写酵素を用いＤＮＡに転写して
前記反応を行う。
【００２３】
【作用】本発明によれば、目的核酸の有無を電気泳動を
行わずに高感度に、しかも放射性同位元素を用いずに短
時間でできるようになる。また多穴マイクロプレートの
ような一度に大量のサンプルを処理できる道具を用いる
と、対象となる核酸の検出を自動装置化することが可能
となる。
行わずに高感度に、しかも放射性同位元素を用いずに短
時間でできるようになる。また多穴マイクロプレートの
ような一度に大量のサンプルを処理できる道具を用いる
と、対象となる核酸の検出を自動装置化することが可能
となる。
【００２４】
（実施例１）第１反応 神奈川現象陽性株であるビブリオ・パラヘモリティカス
WP1 株を液体培養しフェノール、クロロホルムを用いる
常法でトータルＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡを紫外可
視吸光光度計を用いて260nm の値からＤＮＡ量を定量し
た。この溶液を段階希釈し4fg,40fg,400fg,4000fg/3ul
ＴＥ溶液（1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液、pH
8.0）にしてＰＣＲに用いた。なお、染色体ＤＮＡ 4fg
を１コピーとして以下の実験に用いた。
WP1 株を液体培養しフェノール、クロロホルムを用いる
常法でトータルＤＮＡを抽出した。そのＤＮＡを紫外可
視吸光光度計を用いて260nm の値からＤＮＡ量を定量し
た。この溶液を段階希釈し4fg,40fg,400fg,4000fg/3ul
ＴＥ溶液（1mM EDTAを含む10mMトリス塩酸緩衝液、pH
8.0）にしてＰＣＲに用いた。なお、染色体ＤＮＡ 4fg
を１コピーとして以下の実験に用いた。
【００２５】ＰＣＲ反応条件は，１０ｘバッファー 3μ
l 、ｄＮＴＰ4.8 μl （各1.25mM）、ビブリオ・パラヘ
モリティカスtdh 遺伝子特異的な配列をもつプライマー
（ａ）0.75μl(25nmol/ml)、（ｂ）0.75μl(2.5nmol/m
l) ノニデットP-40、ツイーン20各0.5 ％3ul 、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼ 0.15μl( 5unit/ul)を加えて反応
液30μl を調製した。
l 、ｄＮＴＰ4.8 μl （各1.25mM）、ビブリオ・パラヘ
モリティカスtdh 遺伝子特異的な配列をもつプライマー
（ａ）0.75μl(25nmol/ml)、（ｂ）0.75μl(2.5nmol/m
l) ノニデットP-40、ツイーン20各0.5 ％3ul 、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼ 0.15μl( 5unit/ul)を加えて反応
液30μl を調製した。
【００２６】この反応液の入った容器に、ミネラルオイ
ル（SIGMA 社）を50μl 加えて反応液を調製した。各バ
ッファーの組成を次に示す。
ル（SIGMA 社）を50μl 加えて反応液を調製した。各バ
ッファーの組成を次に示す。
【００２７】１０ｘバッファー： 500mM KCl 100mM Tr
is HC1 (pH9.0) 15mM MgCl2 、0.1％ゼラチン、 ｄＮＴＰ溶液：ｄＡＴＰ ｄＣＴＰ ｄＧＴＰ ｄＴＴ
Ｐの混合物をさす。
is HC1 (pH9.0) 15mM MgCl2 、0.1％ゼラチン、 ｄＮＴＰ溶液：ｄＡＴＰ ｄＣＴＰ ｄＧＴＰ ｄＴＴ
Ｐの混合物をさす。
【００２８】反応条件は、以下に示す通りである。
【００２９】熱変性 ９４℃ １分 アニーリング ５５℃ １分 重合反応 ７２℃ １分 とし３５サイクルおこなった。
【００３０】各プライマーの配列は第６４回日本細菌学
会( 多田他 J.J.Bacteriol 199146 281) に報告した配
列である。配列はプライマー(a)5'dGGTACTAAATGGCTGACA
TC3' (b)5'dCCACTACCACTCTCATATGC3'でありビブリオ・
パラヘモリティカスtdh 遺伝子を特異的に検出できるプ
ライマーでありM.Nishibuchi et al. (1990) Mol.Micro
biology 4 87-99 に記載されているtdh2遺伝子の配列中
の配列を用いている。 プライマー(a)(b)ともミリジェ
ン社製ＤＮＡ合成装置で作製し、逆相高速液体クロマト
グラフィーで精製してＰＣＲに用いた。
会( 多田他 J.J.Bacteriol 199146 281) に報告した配
列である。配列はプライマー(a)5'dGGTACTAAATGGCTGACA
TC3' (b)5'dCCACTACCACTCTCATATGC3'でありビブリオ・
パラヘモリティカスtdh 遺伝子を特異的に検出できるプ
ライマーでありM.Nishibuchi et al. (1990) Mol.Micro
biology 4 87-99 に記載されているtdh2遺伝子の配列中
の配列を用いている。 プライマー(a)(b)ともミリジェ
ン社製ＤＮＡ合成装置で作製し、逆相高速液体クロマト
グラフィーで精製してＰＣＲに用いた。
【００３１】第２反応 プライマー(b) の配列の５' 末端にビオチンをラベルし
た標識プライマーを作成した。これは、プライマー(b)
にモノメトキシトリチルアミンリンカーを反応させて
５' 末端にヘキサノールアミン（アミノ基）を結合させ
た後、１ＸＰＢＳ(PH7.4) に溶解したオリゴヌクレオチ
ド（25nmol,100 ul )15mM N-ヒドロキシスクシンイミド
ビオチン(DMF溶液)150 ul と反応させることにより行っ
た。精製は、PD-10 カラム（ファルマシア社）でゲルろ
過法で行った。
た標識プライマーを作成した。これは、プライマー(b)
にモノメトキシトリチルアミンリンカーを反応させて
５' 末端にヘキサノールアミン（アミノ基）を結合させ
た後、１ＸＰＢＳ(PH7.4) に溶解したオリゴヌクレオチ
ド（25nmol,100 ul )15mM N-ヒドロキシスクシンイミド
ビオチン(DMF溶液)150 ul と反応させることにより行っ
た。精製は、PD-10 カラム（ファルマシア社）でゲルろ
過法で行った。
【００３２】プライマー(b) の配列の５' 末端にビオチ
ンをラベルした標識プライマー 3.8p mol 含む 50mM Ｅ
ＤＴＡ溶液30 ul をＰＣＲ反応後の溶液30 ul の入った
各チューブに添加し、95℃５分加熱後、25℃にした。
ンをラベルした標識プライマー 3.8p mol 含む 50mM Ｅ
ＤＴＡ溶液30 ul をＰＣＲ反応後の溶液30 ul の入った
各チューブに添加し、95℃５分加熱後、25℃にした。
【００３３】なお、第１、第２反応の操作は、ＰＣＲ用
サーマルサイクラーで行い、同じ１本のチューブで行っ
た。
サーマルサイクラーで行い、同じ１本のチューブで行っ
た。
【００３４】第３反応 ストレプトアビジンを固定した９６穴マイクロプレート
(Nunc 社）のウエルにペルオキシダーゼを標識したオリ
ゴヌクレオチド(c) 5'dCCAAATCACTTTTACTTGG3'100pmol/
ml を20ulを含む、２ＸＳＳＣ（ＸＳＳＣは0.15M,NaCl,
0.015M クエン酸 -3-ナトリウム）、1 ％ツイーン溶液3
0ulに蒸留水 75 ul, ＴＡ溶液75 ul を添加した溶液を
入れておき、第２反応のサンプル４ulを添加し、室温で
１時間保持後マイクロプレートを洗浄した。
(Nunc 社）のウエルにペルオキシダーゼを標識したオリ
ゴヌクレオチド(c) 5'dCCAAATCACTTTTACTTGG3'100pmol/
ml を20ulを含む、２ＸＳＳＣ（ＸＳＳＣは0.15M,NaCl,
0.015M クエン酸 -3-ナトリウム）、1 ％ツイーン溶液3
0ulに蒸留水 75 ul, ＴＡ溶液75 ul を添加した溶液を
入れておき、第２反応のサンプル４ulを添加し、室温で
１時間保持後マイクロプレートを洗浄した。
【００３５】ここで用いたオリゴヌクレオチド(c) の配
列がtdh 遺伝子特異的であることは、J,Tadaら Mol.Cel
l.Probe.1992.5477 に記載した。
列がtdh 遺伝子特異的であることは、J,Tadaら Mol.Cel
l.Probe.1992.5477 に記載した。
【００３６】反応に用いたペルオキシダーゼを標識した
オリゴヌクレオチドの作製方法はMurakami,A.et al,Nuc
l.Acid Res.1989.17.5587-5595) の方法を基に行った。
すなわち、５' 位をチオール化したオリゴヌクレオチド
(c) 22nmolと西洋わさびペルオキシダーゼ（ベーリンガ
ー社）にＳＰＤＰを作用させたＳＰＤＰ化ペルオキシダ
ーゼ(17nmol)を最終的に１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）200
ulにして室温で１晩反応させた。その後 0.5×ＰＢＳで
膨潤させたバイオゲルp-60（バイオラッド）カラム(1.0
x45cm)にアプライし、 0.5×ＰＢＳで溶出した。その
後、403nm と260nm の吸光度を測定しＤＮＡ、ペルオキ
シダーゼのモル比が１：１の分画を集めた。 この時ペ
ルオキシダーゼのε403(単位ｌ・cm-1・mol -1 )＝91,0
00、ε260= 28,000, ＤＮＡのε260 ＝200,000 ε403
＝０を用いた（εはモル分光吸光係数）。分画後終濃度
0.01% ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Sigma 社フラクシ
ョンＶ）を含む１×ＰＢＳ溶液になるようにして使用時
まで４℃で保存した。
オリゴヌクレオチドの作製方法はMurakami,A.et al,Nuc
l.Acid Res.1989.17.5587-5595) の方法を基に行った。
すなわち、５' 位をチオール化したオリゴヌクレオチド
(c) 22nmolと西洋わさびペルオキシダーゼ（ベーリンガ
ー社）にＳＰＤＰを作用させたＳＰＤＰ化ペルオキシダ
ーゼ(17nmol)を最終的に１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）200
ulにして室温で１晩反応させた。その後 0.5×ＰＢＳで
膨潤させたバイオゲルp-60（バイオラッド）カラム(1.0
x45cm)にアプライし、 0.5×ＰＢＳで溶出した。その
後、403nm と260nm の吸光度を測定しＤＮＡ、ペルオキ
シダーゼのモル比が１：１の分画を集めた。 この時ペ
ルオキシダーゼのε403(単位ｌ・cm-1・mol -1 )＝91,0
00、ε260= 28,000, ＤＮＡのε260 ＝200,000 ε403
＝０を用いた（εはモル分光吸光係数）。分画後終濃度
0.01% ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Sigma 社フラクシ
ョンＶ）を含む１×ＰＢＳ溶液になるようにして使用時
まで４℃で保存した。
【００３７】またストレプトアビジン固定化９６穴マイ
クロプレートの作製は次のように行った。すなわち牛血
清アルブミン（ＢＳＡ、フラクショＶ、Sigma 社）700n
molを1XPBS,500ul に溶解し4.6mg のビオチンアミドカ
プロンサン（BRL 社、ジメチルアミド溶液）を加え室温
で2-3 時間反応させた。
クロプレートの作製は次のように行った。すなわち牛血
清アルブミン（ＢＳＡ、フラクショＶ、Sigma 社）700n
molを1XPBS,500ul に溶解し4.6mg のビオチンアミドカ
プロンサン（BRL 社、ジメチルアミド溶液）を加え室温
で2-3 時間反応させた。
【００３８】反応溶液をG-25ゲルろかカラム(PD-10、フ
ァルマシア）で精製した。その溶液を1XPBS 溶解に溶解
し280nm の吸光度が1.0 OD/ml になるように溶解し９６
穴マイクロプレートに200ul ずつ添加した。４℃で１晩
放置したのち溶液を捨て去り１％ＢＳＡ、200 ulを各ウ
エルに添加しブロッキングを４℃で１晩行った。溶液を
捨て去り、0.1%ツイーン20を含む1XPBS で２回ウエルを
洗浄した後20ug/ml のストレプトアビジン（BRL 社）を
各ウエルに添加し室温で２−３時間放置させた。その後
４℃で使用時まで保存し、使用直前に0.5%ツイーン20を
含む1XPBS で２回ウエルを洗浄して調整したものを用い
た。
ァルマシア）で精製した。その溶液を1XPBS 溶解に溶解
し280nm の吸光度が1.0 OD/ml になるように溶解し９６
穴マイクロプレートに200ul ずつ添加した。４℃で１晩
放置したのち溶液を捨て去り１％ＢＳＡ、200 ulを各ウ
エルに添加しブロッキングを４℃で１晩行った。溶液を
捨て去り、0.1%ツイーン20を含む1XPBS で２回ウエルを
洗浄した後20ug/ml のストレプトアビジン（BRL 社）を
各ウエルに添加し室温で２−３時間放置させた。その後
４℃で使用時まで保存し、使用直前に0.5%ツイーン20を
含む1XPBS で２回ウエルを洗浄して調整したものを用い
た。
【００３９】ウエル中の溶液を捨て去りその後プレート
を0.5 ％ツィーン20を含む１ＸＰＢＳ 200ulで室温で１
分間２回、予め４０℃に暖めた0.5 ％ツィーン20を含む
１ＸＰＢＳ 200ulで１分間１回、再び室温で１分間１回
洗浄した。
を0.5 ％ツィーン20を含む１ＸＰＢＳ 200ulで室温で１
分間２回、予め４０℃に暖めた0.5 ％ツィーン20を含む
１ＸＰＢＳ 200ulで１分間１回、再び室温で１分間１回
洗浄した。
【００４０】第４反応 0.56mM 3,3',5,5'- テトラメチルベンチジンを含む 0.1
M 酢酸緩衝液(PH5.5)150ul,0.02% 過酸化水素水50ulを
添加し、室温で30分保持後１M 硫酸25ulを添加し反応を
停止させた。そのマイクロプレート中の溶液をイムノリ
ーダーNJ-2000（インターメッド社）で450nm の吸光度
を測定した。
M 酢酸緩衝液(PH5.5)150ul,0.02% 過酸化水素水50ulを
添加し、室温で30分保持後１M 硫酸25ulを添加し反応を
停止させた。そのマイクロプレート中の溶液をイムノリ
ーダーNJ-2000（インターメッド社）で450nm の吸光度
を測定した。
【００４１】その結果、図１に示す如く１０コピーの腸
炎ビブリオWP-1株tdh 遺伝子が検出できた。
炎ビブリオWP-1株tdh 遺伝子が検出できた。
【００４２】（実施例２）この方法の感度をしらべるた
めに従来法のアガロース電気泳動法と比較した。まず、
反応条件は94℃ 10 秒、55℃ 10 秒、72℃15秒の35サイ
クルでＰＣＲ反応を行った。その他の条件は実施例１と
同様の方法で行った後、ＰＣＲ反応に用いたプライマー
の一方と同じ配列を持つプライマーの５' 位に実施例１
と同様の方法でビオチンを標識したプライマー2.6 pmol
を含む50mM EDTA 溶液20ulをＰＣＲ反応後のチューブ
（この中にはアガロース電気泳動に用いる溶液を除いた
20ulが入っている）に入れ、95℃で２分加熱後25℃に冷
却した。
めに従来法のアガロース電気泳動法と比較した。まず、
反応条件は94℃ 10 秒、55℃ 10 秒、72℃15秒の35サイ
クルでＰＣＲ反応を行った。その他の条件は実施例１と
同様の方法で行った後、ＰＣＲ反応に用いたプライマー
の一方と同じ配列を持つプライマーの５' 位に実施例１
と同様の方法でビオチンを標識したプライマー2.6 pmol
を含む50mM EDTA 溶液20ulをＰＣＲ反応後のチューブ
（この中にはアガロース電気泳動に用いる溶液を除いた
20ulが入っている）に入れ、95℃で２分加熱後25℃に冷
却した。
【００４３】チューブより 4ulを、予めストレプトアビ
ジンを固定し、下記溶液を含む96穴マイクロプレートに
添加した。
ジンを固定し、下記溶液を含む96穴マイクロプレートに
添加した。
【００４４】96穴マイクロプレートに含まれる溶液：20
pmol/ml のペルオキシダーゼ標識オリゴヌクレオチドを
含む0.3xSSC,O.15% ツイーン20を含む溶液 計200 ul 96穴マイクロプレートへのＤＮＡの固定及びハイブリダ
イゼージョンを60分間、洗浄１(1xPBS, O.5%ツイーン20
200ul）を１分、洗浄２(1xPBS, O.5%ツイーン20 200ul
（40℃に加温した溶液））を１分間、洗浄３(1xPBS, O.
5%ツイーン20 200ul）を１分間行った後、0.56mM 3,3',
5,5'−テトラメチルベンチジンを含む0.1M酢酸緩衝液(p
H5.5)150ul、及び0.02％過酸化水素50ulを添加して、酵
素反応を室温で30分間行った。
pmol/ml のペルオキシダーゼ標識オリゴヌクレオチドを
含む0.3xSSC,O.15% ツイーン20を含む溶液 計200 ul 96穴マイクロプレートへのＤＮＡの固定及びハイブリダ
イゼージョンを60分間、洗浄１(1xPBS, O.5%ツイーン20
200ul）を１分、洗浄２(1xPBS, O.5%ツイーン20 200ul
（40℃に加温した溶液））を１分間、洗浄３(1xPBS, O.
5%ツイーン20 200ul）を１分間行った後、0.56mM 3,3',
5,5'−テトラメチルベンチジンを含む0.1M酢酸緩衝液(p
H5.5)150ul、及び0.02％過酸化水素50ulを添加して、酵
素反応を室温で30分間行った。
【００４５】上記反応後 0.2N 硫酸 25 ulを添加して反
応を停止した後イムノリーダーで450nm の吸光度を測定
した。この結果を図２（ａ）に示す。図２（ａ）より本
発明によれば、ＰＣＲ反応時間約1.5 時間、それ以降の
時間（ＤＮＡ検出の時間）1.5 時間という短時間で10コ
ピー程度の腸炎ビブリオWP-1株 tdh遺伝子が検出できる
ことがわかる（図２（ａ）の番号３）。
応を停止した後イムノリーダーで450nm の吸光度を測定
した。この結果を図２（ａ）に示す。図２（ａ）より本
発明によれば、ＰＣＲ反応時間約1.5 時間、それ以降の
時間（ＤＮＡ検出の時間）1.5 時間という短時間で10コ
ピー程度の腸炎ビブリオWP-1株 tdh遺伝子が検出できる
ことがわかる（図２（ａ）の番号３）。
【００４６】比較のためＰＣＲ後のＤＮＡをアガロース
電気泳動法で検出した結果を図２（ｂ）に示す。なお、
図２（ｂ）の番号と図２（ａ）の番号が同じものは同じ
ＰＣＲ増幅ＤＮＡをそれぞれの方法で検出した結果であ
る。また、図２（ｂ）中ＭはφX174Hinc II DNA マーカ
ー、矢印の位置がＰＣＲで増幅したＤＮＡの位置（250
塩基対）を示す。
電気泳動法で検出した結果を図２（ｂ）に示す。なお、
図２（ｂ）の番号と図２（ａ）の番号が同じものは同じ
ＰＣＲ増幅ＤＮＡをそれぞれの方法で検出した結果であ
る。また、図２（ｂ）中ＭはφX174Hinc II DNA マーカ
ー、矢印の位置がＰＣＲで増幅したＤＮＡの位置（250
塩基対）を示す。
【００４７】これらの図より、本発明の方法は、アガロ
ース電気泳動法より１〜２桁高感度なことがわかる。
ース電気泳動法より１〜２桁高感度なことがわかる。
【００４８】（実施例３）ＰＣＲ反応後に加える（第２
反応で加える）オリゴヌクレオチド（プライマー）の量
を変えて実験を行った。なお、ＰＣＲ反応には100 コピ
ーの腸炎ビブリオWP株ＤＮＡを用いた。
反応で加える）オリゴヌクレオチド（プライマー）の量
を変えて実験を行った。なお、ＰＣＲ反応には100 コピ
ーの腸炎ビブリオWP株ＤＮＡを用いた。
【００４９】なお、ＰＣＲ反応後に加えるオリゴヌクレ
オチド（プライマー）の量以外は、実施例１と同様の方
法で行い、用いた量は、50mM EDTA 溶液15ulにサンプル
１；1.9 pmol サンプル２；1.0pmol 、サンプル３；0.
5 pmolのビオチンプライマーを用いた。なお、ＰＣＲ反
応後の液15ulを用いた。
オチド（プライマー）の量以外は、実施例１と同様の方
法で行い、用いた量は、50mM EDTA 溶液15ulにサンプル
１；1.9 pmol サンプル２；1.0pmol 、サンプル３；0.
5 pmolのビオチンプライマーを用いた。なお、ＰＣＲ反
応後の液15ulを用いた。
【００５０】図３（ａ）に示すようにオリゴヌクレオチ
ド（プライマー）の量を減らすと反応液１ulあたりのシ
グナルは減少することがわかった。
ド（プライマー）の量を減らすと反応液１ulあたりのシ
グナルは減少することがわかった。
【００５１】しかし、マイクロタイタープレートアッセ
イに用いる溶液量を、サンプル１；3 ul、サンプル２；
6ul、サンプル３；12ulのように増やすことでオリゴヌ
クレオチドの量が減ってもシグナルは減少しなかった
（図３（ｂ））。
イに用いる溶液量を、サンプル１；3 ul、サンプル２；
6ul、サンプル３；12ulのように増やすことでオリゴヌ
クレオチドの量が減ってもシグナルは減少しなかった
（図３（ｂ））。
【００５２】これより、本発明によれば、用いる標識プ
ライマーの量を非常に少なく（通常のＰＣＲ反応に用い
る量の約20分の１量）にしても感度を損なう事なく目的
とするＤＮＡを検出することができる。
ライマーの量を非常に少なく（通常のＰＣＲ反応に用い
る量の約20分の１量）にしても感度を損なう事なく目的
とするＤＮＡを検出することができる。
【００５３】（実施例４）実験に用いる菌株数を増やし
て本法の特異性を調べた（実験で用いた菌株は表１に示
す４３株である）。
て本法の特異性を調べた（実験で用いた菌株は表１に示
す４３株である）。
【００５４】なお、ＰＣＲに用いたサンプルは菌株をＬ
Ｂ培地中で振とう培養した菌体液10ulをとりＴＥ緩衝液
（10mMトリス、1mM EDTA,pH8.0）90ulを加え、９５℃、
５分加熱後 5000rpm １分遠心した上清３ulで、第２反
応における標識プライマーを0.1pmol の50mM EDTA 溶液
20ulとＰＣＲ反応後の液20ulを混合してうち30ul用い、
第３反応におけるマイクロプレートへのＤＮＡ固定・ハ
イブリダイゼーションを室温で１５分、酵素反応を３０
℃で１５分行った以外は実施例１と同様の方法で行っ
た。
Ｂ培地中で振とう培養した菌体液10ulをとりＴＥ緩衝液
（10mMトリス、1mM EDTA,pH8.0）90ulを加え、９５℃、
５分加熱後 5000rpm １分遠心した上清３ulで、第２反
応における標識プライマーを0.1pmol の50mM EDTA 溶液
20ulとＰＣＲ反応後の液20ulを混合してうち30ul用い、
第３反応におけるマイクロプレートへのＤＮＡ固定・ハ
イブリダイゼーションを室温で１５分、酵素反応を３０
℃で１５分行った以外は実施例１と同様の方法で行っ
た。
【００５５】実験の結果表１に示す通り、対象とするtd
h 遺伝子を有している株でのみ大きい測定値が得られ
（１．１７９〜１．９０８）、他のビブリオ属菌( V.mi
micus, V.furnissii, V.cholerae ）では小さい値が得
られた（−０．００６〜０．０２３）。これより、本法
ではtdh 遺伝子を特異的に検出できることがわかる。
h 遺伝子を有している株でのみ大きい測定値が得られ
（１．１７９〜１．９０８）、他のビブリオ属菌( V.mi
micus, V.furnissii, V.cholerae ）では小さい値が得
られた（−０．００６〜０．０２３）。これより、本法
ではtdh 遺伝子を特異的に検出できることがわかる。
【００５６】
【表１】 （実施例５）本法によりコレラ毒素遺伝子の検出を行っ
た。用いた菌株は、V.cholerae O1 eltor 小川 ctx（コ
レラ毒素遺伝子） +（９株）、V.cholerae O1 eltor 稲
葉 ctx + （７株）、V.cholerae O1 classical 稲葉 c
tx + （３株）、V.cholerae O1 classical 小川 ctx +
（２株）、V.chol erae O1 eltor 小川 ctx - （２
株）、V.cholerae O1 eltor 稲葉 ctx - （３株）、V.
cholerae non O1 ctx + （１４３株）、V.cholerae n
on O1 ctx -（１６株）、E.coli(LT+) （６株）の計１
９１株である。
た。用いた菌株は、V.cholerae O1 eltor 小川 ctx（コ
レラ毒素遺伝子） +（９株）、V.cholerae O1 eltor 稲
葉 ctx + （７株）、V.cholerae O1 classical 稲葉 c
tx + （３株）、V.cholerae O1 classical 小川 ctx +
（２株）、V.chol erae O1 eltor 小川 ctx - （２
株）、V.cholerae O1 eltor 稲葉 ctx - （３株）、V.
cholerae non O1 ctx + （１４３株）、V.cholerae n
on O1 ctx -（１６株）、E.coli(LT+) （６株）の計１
９１株である。
【００５７】本実験では、第１反応のＰＣＲ反応のプラ
イマーとして５´ｄＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴ
ＧＡＣＣ（配列番号５）及び５´ｄＡＴＡＣＣＡＴＣＣ
ＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＣ（配列番号６）の配列のも
のを用い、第２反応の標識プライマーとして、配列番号
６のものを用い、第３反応の標識オリゴヌクレオチドと
して、５´ｄＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧ
ＡＧＡＡ（配列番号７）と相補的な配列のものを用いた
以外は、実施例１と同様の方法で実験を行った（但し、
マイクロプレートへのＤＮＡ固定・ハイブリダイゼーシ
ョンは実施例３と同じ）。また、上記配列は、Mekalano
s,J.J らNature(1983.306.550)の配列を用いた。
イマーとして５´ｄＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴ
ＧＡＣＣ（配列番号５）及び５´ｄＡＴＡＣＣＡＴＣＣ
ＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＣ（配列番号６）の配列のも
のを用い、第２反応の標識プライマーとして、配列番号
６のものを用い、第３反応の標識オリゴヌクレオチドと
して、５´ｄＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧ
ＡＧＡＡ（配列番号７）と相補的な配列のものを用いた
以外は、実施例１と同様の方法で実験を行った（但し、
マイクロプレートへのＤＮＡ固定・ハイブリダイゼーシ
ョンは実施例３と同じ）。また、上記配列は、Mekalano
s,J.J らNature(1983.306.550)の配列を用いた。
【００５８】実験結果を図４に示す。この図より、コレ
ラ毒素遺伝子陽性株では、吸光度０．５５〜１．７３
で、陰性株では０．０００〜０．０４２であることがわ
かる。従って、この結果より、本法がコレラ毒素遺伝子
に特異的であることがわかる。
ラ毒素遺伝子陽性株では、吸光度０．５５〜１．７３
で、陰性株では０．０００〜０．０４２であることがわ
かる。従って、この結果より、本法がコレラ毒素遺伝子
に特異的であることがわかる。
【００５９】
【発明の効果】本発明によれば、ＰＣＲの際に標識化プ
ライマーを用いないので、既存のプライマーを条件変更
なしに使用できるとともに、標識オリゴヌクレオチドの
ハイブリダイゼーションと固相固定を同時に行うので、
反応時間及び検出までの操作ステップの短縮が図れる。
ライマーを用いないので、既存のプライマーを条件変更
なしに使用できるとともに、標識オリゴヌクレオチドの
ハイブリダイゼーションと固相固定を同時に行うので、
反応時間及び検出までの操作ステップの短縮が図れる。
【００６０】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio parahaemolyticus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＧＴＡＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡ
ＣＡＴＣ
ＣＡＴＣ
【００６１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio parahaemolyticus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＴ
ＡＴＧＣ
ＡＴＧＣ
【００６２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio parahaemolyticus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＣＣＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴ
ＴＧＧＡ
ＴＧＧＡ
【００６３】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio parahaemolyticus 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣ
ＴＴＧＧ
ＴＴＧＧ
【００６４】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 V.cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴ
ＧＡＣＣ
ＧＡＣＣ
【００６５】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；６ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 V.cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴ
ＴＧＧＧＡＧ
ＴＧＧＧＡＧ
【００６６】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；７ 配列の長さ ２３塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 V.cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴ
ＴＴＧＡＧＡＡ
ＴＴＧＡＧＡＡ
【図１】腸炎ビブリオWP-1株 tdh遺伝子のＤＮＡを本発
明により検出した図
明により検出した図
【図２】（ａ）はＰＣＲ後のＤＮＡを本発明により検出
した図、（ｂ）はＰＣＲ後のＤＮＡをアガロース電気泳
動法で検出した図
した図、（ｂ）はＰＣＲ後のＤＮＡをアガロース電気泳
動法で検出した図
【図３】（ａ）はＰＣＲ反応後に加える（第２反応で加
える）オリゴヌクレオチド（プライマー）の量を変えて
実験を行った図、（ｂ）はマイクロタイタープレートア
ッセイに用いる溶液量を増やして検出した図
える）オリゴヌクレオチド（プライマー）の量を変えて
実験を行った図、（ｂ）はマイクロタイタープレートア
ッセイに用いる溶液量を増やして検出した図
【図４】コレラ毒素遺伝子のＤＮＡを本発明により検出
した図
した図
Claims (5)
- 【請求項１】 少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを
鎖長反応プライマーとして機能させ標的ＤＮＡ中の特定
のＤＮＡをＤＮＡ合成酵素を用いて選択的に生成させる
工程（第１反応）、 ＤＮＡ合成酵素を失活させる試薬あるいは温度と、生成
を行った際に用いたプライマーのうちの１つの配列をも
つ標識プライマーを作用させて生成遺伝子を変性させる
と同時に生成遺伝子に標識プライマーを付着させる工程
（第２反応）、 第２反応で生成した反応物を、生成遺伝子の一部の配列
に相補的な配列をもつ標識オリゴヌクレオチドおよび第
２反応で作用させた標識プライマーを認識する固相に同
時に反応させる工程（第３反応）、 第３反応に用いた標識オリゴヌクレオチドより生じる信
号の測定を行うことで目的核酸の有無を検出する工程
（第４反応）とからなる核酸の検出方法。 - 【請求項２】バクテリア、ウイルス等の天然に存在する
核酸あるいは人工核酸を標的遺伝子として用いて、その
配列が一部相補的な標識プライマーを作用させて、標識
遺伝子を変性させると同時に標識プライマーを付着させ
る工程（第１反応）、 第１反応で生成した反応物を、標的遺伝子の一部の配列
に相補的な配列をもち、かつ標識プライマーと同じ方向
をもつ標識オリゴヌクレオチドおよび第１反応で作用さ
せた標識プライマーを認識する固相に同時に反応させる
工程（第２反応）、 第２反応に用いた標識オリゴヌクレオチドより生じる信
号の測定を行うことで目的核酸の有無を検出する工程
（第３反応）とからなる核酸の検出方法。 - 【請求項３】 請求項１の第１反応の際の鎖長伸長の際
のオリゴヌクレオチドの配列が （ａ）５´ｄＧＧＴＡＣＴＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＡＴ
Ｃ 及び （ｂ）５´ｄＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡＴＧ
Ｃ あるいは上記の内の一方で、 （ａ）、（ｂ）両方を用いる際は第２反応の際の標識プ
ライマーがヌクレオチド（ｂ）と同じ配列を持ち、第３
反応では下記の（ｃ）の塩基配列を有する標識ヌクレオ
チドと結合し、 （ｃ）５´ｄＣＣＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＧ
Ａ 第１反応で上記（ａ）、（ｂ）のいずれか一方を用いる
ときは第２反応では第１反応の際のヌクレオチドと同じ
配列を持ち、第１反応で（ｂ）を用いたときは、第３反
応では上記（ｃ）のものと結合し、第１反応で（ｂ）を
用いたときは、第３反応の上記（ｃ）と相補的な配列の
ものと結合することからなる請求項１記載の腸炎ビブリ
オ菌耐熱性溶血遺伝子（tdh 遺伝子）の検出方法。 - 【請求項４】 請求項１の第２反応の際の標識プライマ
ーが請求項２のヌクレオチド（ａ）と同じ配列をもち、
第３反応の標識オリゴヌクレオチドの塩基配列がヌクレ
オチド （ｄ）５´ｄＴＣＣＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＴＴＧ
Ｇ に結合することからなる請求項１記載の腸炎ビブリオ菌
耐熱性溶血遺伝子（tdh遺伝子）の検出方法。 - 【請求項５】請求項１の第１反応の際の鎖長伸長の際の
オリゴヌクレオチドの配列が （ｅ）５´ｄＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣ
Ｃ 及び （ｆ）５´ｄＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧ
ＧＡＧ あるいは上記の内の一方で、 （ｅ），（ｆ）両方を用いる際は第２反応の際の標識プ
ライマーがヌクレオチド（ｆ）と同じ配列を持ち、第３
反応では下記の（ｈ）の塩基配列を有する標識ヌクレオ
チドと結合し、 （ｈ）５´ｄＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧ
ＡＧＡＡ 第２反応で（ｅ）を用いると、第３反応で上記（ｈ）の
相補鎖と結合し、 第１反応で上記（ｅ）、（ｆ）のいずれか一方を用いる
ときは、第２反応では第１反応の際のヌクレオチドと同
じ配列を持ち、第１反応で（ｅ）を用いたときは、上記
（ｈ）と相補的な配列のものと結合し、第１反応で
（ｆ）を用いたときは、上記（ｈ）の配列のものと結合
することからなる請求項１記載のコレラ毒素遺伝子の検
出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5176749A JP2715851B2 (ja) | 1992-09-30 | 1993-07-16 | 核酸の検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26189992 | 1992-09-30 | ||
| JP4-261899 | 1992-09-30 | ||
| JP5176749A JP2715851B2 (ja) | 1992-09-30 | 1993-07-16 | 核酸の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06165698A true JPH06165698A (ja) | 1994-06-14 |
| JP2715851B2 JP2715851B2 (ja) | 1998-02-18 |
Family
ID=26497538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5176749A Expired - Fee Related JP2715851B2 (ja) | 1992-09-30 | 1993-07-16 | 核酸の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2715851B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0669399A3 (en) * | 1994-02-28 | 1996-05-22 | Shimadzu Corp | Oligonucleotides and methods for the detection of bacteria. |
| US7438165B2 (en) | 2004-03-16 | 2008-10-21 | George Nerubenko | Torsional vibration damper of a rotating shaft |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61195699A (ja) * | 1985-02-22 | 1986-08-29 | モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド | ポリヌクレオチド配列を検出するための溶液相二重交雑アツセイ |
-
1993
- 1993-07-16 JP JP5176749A patent/JP2715851B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS61195699A (ja) * | 1985-02-22 | 1986-08-29 | モレキユラー・ダイアグノステイツクス・インコーポレーテツド | ポリヌクレオチド配列を検出するための溶液相二重交雑アツセイ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US6218110B1 (en) | 1994-02-28 | 2001-04-17 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting verotoxin-producing E. coli and detection process |
| US7438165B2 (en) | 2004-03-16 | 2008-10-21 | George Nerubenko | Torsional vibration damper of a rotating shaft |
| US7464800B2 (en) | 2004-03-16 | 2008-12-16 | George Nerubenko | Torisonal vibration damper of a rotating shaft |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2715851B2 (ja) | 1998-02-18 |
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