JPH06167499A - 固相免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 非特異的吸着の無い固相免疫測定方法を提供
する。 【構成】 塩酸グアニジン、チオシアン酸塩または尿素
を含む液を、被測定抗原、被測定抗体および／または標
識体の未反応物の除去・洗浄液として用いることを特徴
とする、固相と被測定抗原に対する抗体または被測定抗
体に対する抗原とを結合させて固定化した抗原または抗
体の固相免疫測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は臨床検査診断薬等の分野
で使用される免疫測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等、固相と被
測定抗原に対する抗体または被測定抗体に対する抗原と
を結合させて固定化した抗体または抗原を測定する免疫
測定方法（固相免疫測定方法）においては、標識化した
被測定抗原に対する抗体、標識化した被測定抗体に対す
る抗原、被測定抗原または被測定抗体等が固相に対して
非特異的に吸着し、測定結果に誤差をもたらすだけでな
く、検出感度を低下させていることが知られている。固
相免疫測定方法は、一般に１．固相の作製工程、２．試
料中の被測定抗原または被測定抗体と固相の被測定抗原
に対する抗体または被測定抗体に対する抗原との反応工
程、３．前記２の反応の未反応物質の除去・洗浄工程、
４．標識体と、固相中の被測定抗原に対する抗体または
被測定抗体に対する抗原と結合した被測定抗体または被
測定抗原との反応工程、５．上記４の反応の未反応抗
原、抗体および標識体の除去・洗浄工程、６．標識体の
検出工程からなる（石川榮治ら編「酵素免疫測定法 第
３版」１９８７年 医学書院刊）。上記２および４の反
応工程中に生じる非特異吸着を減少させるために以下に
示す方法が知られている。（１）工程５の洗浄液に０．
０１％〜０．１％のツィーン２０を含むリン酸緩衝化生
理食塩水を用いる方法、（２）工程３および５の洗浄液
に両性界面活性剤を用いる方法（特開昭６４−１３４６
０号公報）、（３）工程１においてｐＨ９〜１０の条件
下で試料を添加する方法（特開平３−９２７６０号公
報）、（４）動物血清や乳性ホエー存在下で試料を添加
する方法、（５）工程３および５の洗浄液にｐＨ３〜
４．５の液を用いる方法が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、固相
に対する抗体等の非特異的吸着物質を完全に洗浄・除去
できる洗浄液を用いた固定化免疫測定法を提供すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、塩酸グアニジ
ン、チオシアン酸塩または尿素を含む液を、被測定抗
原、被測定抗体および／または標識体の未反応物の除去
・洗浄液として用いることを特徴とする、固相と被測定
抗原に対する抗体または被測定抗体に対する抗原とを結
合させて固定化した抗原または抗体の固相免疫測定方法
に関する。

【０００５】本発明における固相免疫測定法は固相と被
測定抗原に対する抗体または被測定抗体に対する抗原と
を結合させて固定化して用いる測定法であればどのよう
なものでもよく、例えば標識物質として西洋ワサビパー
オキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリフォスファターゼ、
βガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素
を用いる酵素免疫測定法、アクリジニウム化合物等の発
光物質を用いた発光免疫測定法、フルオレッセイン等の
蛍光物質を用いた蛍光免疫測定法、トリチウム等の放射
性化学物質を用いた放射免疫測定法等があげられる。

【０００６】本発明における除去・洗浄液は、固相免疫
測定方法において、工程中固相に固定化されていない抗
原、抗体または標識体を効率良く洗浄除去できるもので
あり、１Ｍ以上の塩酸グアニジン、チオシアン酸塩また
は尿素を、好ましくは界面活性剤の存在下、水、生理食
塩水、緩衝液等に溶解したものがあげられる。

【０００７】チオシアン酸塩の塩としては、例えばアン
モニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、
グアニジン塩等があげられる。

【０００８】界面活性剤としては酸性で溶解できるもの
であればいずれでも用いることができ、好ましくはＨＬ
Ｂ１６以上の非イオン性界面活性剤を用いる。酸化エチ
レン誘導体系の非イオン性界面活性剤においては酸化エ
チレン鎖（ＰＯＥ）数が大きくなると、ＨＬＢが大きく
なるので、通常ＰＯＥ数が大きなものを用いることが好
ましい。例えば（ＰＯＥ）２０ソルビタンモノラウレー
ト（一般名ツィーン２０）、（ＰＯＥ）２０グリセリン
モノオレエート、ポリエチレングリコールジステアレー
ト、（ＰＯＥ）２１ラウリルエーテル、（ＰＯＥ）２０
セチルエーテル、（ＰＯＥ）１５オレイルエーテル、
（ＰＯＥ）２０ベヘニルエーテル、（ＰＯＥ）２０ラノ
リンアルコール、グリセリン植物油脂肪酸エステル、
（ＰＯＥ）２５フィトステロール、（ＰＯＥ）１０ノニ
ルフェニルエーテルなどがあげられる。界面活性剤の濃
度は洗浄液中０．０１％〜１０％、好ましくは０．０１
％〜１．０％の範囲である。

【０００９】緩衝液としては、ｐＨ３〜４．５に緩衝能
を有する緩衝液ならいずれでもよく、特にｐＨ３．５〜
４の緩衝液が好ましい。例えばマレイン酸、リン酸、グ
リシン、アラニン、アコニット酸、クロロ酢酸、マロン
酸、ジグリコール酸、サリチル酸、フマル酸、コハク
酸、グリシルグリシン、マンデル酸、酢酸、クエン酸、
蟻酸、乳酸等から構成される緩衝液があげられる。緩衝
液の濃度は１０ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは２５ｍＭ〜１０
０ｍＭの範囲である。

【００１０】本発明における洗浄液は、固定化免疫測定
法のいずれの洗浄工程に用いてもよいが、該免疫測定法
の工程を、１．固相の作製工程、２．試料中の被測定抗
原または被測定抗体と固定化した被測定抗原に対する抗
体または被測定抗体に対する抗原との反応工程、３．前
記２の反応の未反応物質の除去・洗浄工程、４．標識体
と、固定化した被測定抗原に対する抗体または被測定抗
体に対する抗原と結合した被測定抗体または被測定抗原
との反応工程、５．上記４の反応の未反応抗原、抗体お
よび標識体の除去・洗浄工程、６．標識体の検出工程、
に分類した場合、第３工程および第５工程における未反
応物の除去・洗浄液として用いることが好ましい。

【００１１】本発明における固相とは一般に免疫測定法
において、被測定抗原に対する抗体または被測定抗体に
対する抗原を固定化させるために用いる固相であればど
のようなものでもよく、例えば、ポリスチレンプレー
ト、ビーズ、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース
膜等を用いることができる。

【００１２】被測定抗原に対する抗体としては例えば、
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ１）、ガン
胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファフェトプロテインまた
はヒト大腸ガンに対する特異的糖鎖抗原（ＣＡ１９−
９）等に対するポリクローナルまたはモノクローナルの
抗体があげられる。被測定抗体に対する抗原とは、抗体
に対する抗原であればどのようなものでも良いが、被測
定抗体が各種感染症の原因ウイルスに対するものである
場合、例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ１等の抗体結合
部位等があげられる。

【００１３】本発明における、固相と被測定抗原に対す
る抗体または被測定抗体に対する抗原との固定化方法は
どのようなものでもよく、物理的吸着法または化学的結
合法等により結合され、固定化されていればよい（石川
榮治ら編「酵素免疫測定法第３版」１９８７年 医学書
院刊）。

【００１４】本発明における標識体とは、標識物質を結
合した抗ヒトイムノグロブリン、被測定抗原に対する抗
体または被測定抗体に対する抗原を意味し、標識物質と
しては、西洋ワサビのペルオキシダ−ゼ（ＰＯＤ）、ア
ルカリフォスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ等の酵素、アクリジニウム化合物等の
発光物質、フルオレッセイン等の蛍光物質、トリチウム
等の放射性同位元素があげられる。

【００１５】以下に本発明の洗浄液を用いた固定化免疫
測定法を説明する。 （工程１）固定化した被測定抗原に対する抗体または被
測定抗体に対する抗原の作製 被測定抗原に対する抗体または被測定抗体に対する抗原
を緩衝液で０．１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌに希釈
し、マイクロプレート等の固相に５０μｌ／ウエル〜３
００μｌ／ウエル分注する。該プレートを４℃〜３０℃
で６０分〜２日間放置した後、緩衝液で洗浄する。得ら
れた固定化した被測定抗原に対する抗体または被測定抗
体に対する抗原は４℃〜５０℃で保存する。

【００１６】緩衝液としては１０ｍＭ〜１Ｍ、ｐＨ６〜
ｐＨ９のリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ほう酸緩衝
液、ピロリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、グッド（ｇｏ
ｏｄ）の緩衝液、ＨＥＰＥＳ〔Ｎ−（２−ヒドロキシエ
チル）ピペラジノ−Ｎ’−２−エタンスルホン酸〕の緩
衝液等を用いることができ、塩化ナトリウム、血清アル
ブミン（ＢＳＡ）、ブロックエース（雪印乳業製）等を
含んでいても良い。また、本発明の除去洗浄液を緩衝液
の代わりに用いてもよい。

【００１７】（工程２）工程１で作成し、保存してある
固定化した被測定抗原に対する抗体または被測定抗体に
対する抗原を測定操作前に、緩衝液で洗浄する。各マイ
クロプレートのウエル等の固相に工程１で用いた緩衝液
および試料中の被測定抗原または被測定抗体を添加し４
℃〜５０℃で１時間〜２０時間反応させる。

【００１８】（工程３）マイクロプレートのウエル等固
相中の反応液を除去した後、洗浄液で固相を１回以上洗
浄し、未反応の被測定抗原または被測定抗体を除去す
る。

【００１９】（工程４）標識体を緩衝液に希釈した後、
各マイクロプレートのウエル等の固相に添加する。４℃
〜５０℃で１時間〜２０時間反応させる。

【００２０】（工程５）マイクロプレートのウエル等固
相の反応液を除去した後、洗浄液で固相を１回以上洗浄
し、未反応の標識体を除去する。

【００２１】（工程６）固相に結合した標識体の標識物
質の定量を行う。標識物質の定量法としては、例えば酵
素免疫測定法の場合は、ｏ−フェニレンジアミン等標識
酵素の基質の変化量を分光光度法、蛍光光度法等により
定量する方法、発光免疫測定法においては、標識物質の
アクリジニウム化合物を発光分析測定法により測定する
方法、蛍光免疫測定法においてはフルオレッセイン等の
標識物質を蛍光光度法により測定する方法、また放射免
疫測定法においてはトリチウム等の標識物質を液体シン
チレーションカウンター等で測定する方法等があげられ
る。

【００２２】

【実施例】次に実施例を用いて本発明を説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【００２３】実施例１ ＨＴＬＶ−Ｉ抗体の測定 （１）各種試薬の調製

【００２４】固相：特開昭６２−４８６９９号公報に開
示されているｇａｇ−ｅｎｖ抗原を１０μｇ／ｍｌにな
るようにｐＨ７．４のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で希釈し、エヌユーエヌシー（ＮＵＮＣ）社製９６
穴マイクロプレートに１００μｌ／ウエルの量で分注し
た。一晩放置後、上清を吸引除去し、１％ＢＳＡ、０．
１５Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ８の５０ｍＭリン酸緩
衝液 ２００μｌを分注した。得られた固相を使用時ま
で冷室で保存した。

【００２５】試料：ＨＴＬＶ−Ｉ抗体陽性患者の血清か
ら採取した試料Ａ、ＨＴＬＶ−Ｉ抗体陰性患者の血清か
ら採取した試料Ｂ、非特異吸着を生じ易くさせるため５
６℃、３０分の非動化処理を行った陰性患者の血清から
採取した試料Ｃの３種の試料と標識体の非特異吸着を検
出するために用いる試料用希釈液〔１％ＢＳＡ、１０％
ブロックエース（雪印乳業）、０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含むｐＨ８の５０ｍＭリン酸緩衝液〕のみのブラン
クを検体として以下の測定法に用いた。

【００２６】標識体：市販のダコ（ＤＡＫＯ）社製ＰＯ
Ｄ標識抗ヒトイムノグロブリンを指示の通り試料用希釈
液で希釈して標識体とした。

【００２７】洗浄液：塩酸グアニジンを試料用希釈液で
希釈し０．２５、０．５、１．０、２．０および４．０
モルの溶液にした。

【００２８】（２）ＨＴＬＶ−Ｉ抗体の測定 （１）で調製した試薬を用いて以下のようにＨＴＬＶ−
Ｉ抗体量に比例するＰＯＤ活性を測定した。固相を洗浄
液で洗浄した後、試料用希釈液を１００μｌ添加し、さ
らにＡ，ＢまたはＣの試料各１０μｌを加えた後、３７
℃で１時間反応させた。該プレート中の反応液を吸引し
て除去した後、該プレートを洗浄液で洗浄した。洗浄後
のプレートに標識体１００μｌを加え、さらに３７℃で
１時間反応させた。反応液を吸引で除去した後、該プレ
ートを洗浄液で洗浄した。各ウエルにＰＯＤの基質であ
るｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）溶液１００μｌを
加え、３７℃で３０分反応させた後、０．１Ｎ硫酸１０
０μｌを各ウエルに加え、ＰＯＤ反応を停止した。マイ
クロプレートリーダーで波長４１２ｎｍの吸光度を測定
してＰＯＤ活性を定量した。結果を図１に示す。

【００２９】図１によれば、塩酸グアニジン０〜２Ｍの
範囲で特異的結合の指標である試料Ａの値は変わらない
が、非特異的吸着の指標である試料Ｃの値は塩酸グアニ
ジン濃度に比例して低下し、塩酸グアニジンが非特異的
吸着のみを抑制することを示した。

【００３０】

【発明の効果】本発明により、固相に対する非特異吸着
のない固定化免疫測定法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＴＬＶ−Ｉ抗体測定の定量に及ぼす塩酸アグ
アニジンの効果

【符号の説明】

−●− ＨＴＬＶ−Ｉ抗体陽性試料Ａ −□− ＨＴＬＶ−Ｉ抗体陰性試料Ｂ −○− 非動化ＨＴＬＶ−Ｉ抗体陰性試料Ｃ −Ｘ− ブランク

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 塩酸グアニジン、チオシアン酸塩または
   尿素を含む液を、被測定抗原、被測定抗体および／また
   は標識体の未反応物の除去・洗浄液として用いることを
   特徴とする、固相と被測定抗原に対する抗体または被測
   定抗体に対する抗原とを結合させて固定化した抗原また
   は抗体の固相免疫測定方法。