JPH06194367A - リウマチ疾患の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 関節液のＭ−ＣＳＦ含量を測定する際、その
阻害物質を除去し、簡便、かつ高感度にＭ−ＣＳＦの含
量を免疫学的に測定する方法を提供する。 【構成】 ヒト関節液に含まれるヒアルロン酸を除去
し、のちヒト関節液に含まれる単球マクロファージコロ
ニー刺激因子を、単球マクロファージコロニー刺激因子
に特異的に反応する抗体と反応させて免疫学的に測定す
るリウマチ疾患の診断方法。 【効果】 ヒト関節液のＭ−ＣＳＦを迅速、正確、高感
度で定量でき、リウマチ疾患を正確に診断し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、リウマチ疾患の診断
方法に関するものである。さらに詳しくは、この発明
は、免疫学的測定を用いたリウマチ疾患の簡便かつ高感
度の診断方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】日本における慢性関節リウマチ患者は、
人口１０００人当たり約３人の割合といわれており、特
に女性に多いことが知られている（検査と技術、第１１
巻、第４０２ペ−ジ、１９８３年）。この慢性関節リウ
マチは、自己免疫疾患の一つであるが、自己免疫疾患
は、生体の免疫機構のうち、自己に対する免疫寛容（im
munological torelance)が制御不能になった場合、産生
された自己抗体または自己反応性Ｔ細胞が関与して発症
する疾患であると定義されている（臨床検査、第３５
巻、第１４８ペ−ジ、１９９１年）。この自己免疫疾患
には、リウマチの他に全身性エリテマト−デス、橋本
病、甲状腺中毒症等が知られている。

【０００３】リウマチの定義は、「骨、関節、筋肉、腱
などの運動器官に痛みとこわばりを訴える疾患」であ
り、特に慢性関節リウマチは、多発性関節炎を主症状と
するが、内臓にも広範に病変を惹起するため、全身性疾
患であるとされている（検査と技術、第１１巻、第４０
２ペ−ジ、１９８３年）。リウマチの診断には、アメリ
カリウマチ学会（ＡＲＡ）により、１９５８年に作成さ
れた１１項目の診断基準[ ブレティン・オン・ザ・リウ
マティック・ディジ−ジズ（Bulletin on the Rheumati
c Diseases）第９巻、第１７５ペ−ジ、１９５８年] が
使用されていたが、１９８７年に改訂され[ ア−スリテ
ィス・アンド・リウマティズム（Arthitis and Rheumat
ism)、別冊、第４５ペ−ジ、１９８７年] 、診断基準が
次の７項目に削減された。 １）少なくとも１時間以上持続する朝のこわばり（６週
以上持続） ２）３個以上の関節の腫脹（６週以上持続） ３）手（WRIST)、中手指関節（MCP)、近位指関節（PIP)
の腫脹（６週以上持続） ４）対称性関節腫脹 ５）手、指のＸ線像の変化 ６）皮下結節（リウマチ結節） ７）リウマトイド因子の存在 そして、これら７項目のうち少なくとも４項目の病変が
認められれば、リウマチであると診断される。

【０００４】とくに、これらの規準のうち、リウマチの
客観的診断にはリウマトイド因子の測定を行うことが一
般的に行われているが、実際には、健常人でもリウマト
イド因子陽性の人が数〜１０％程度存在し、一方リウマ
チと診断された人でもリウマトイド因子の陽性率は４０
〜９０％である（検査と技術、第１６巻、第１４２２ペ
−ジ、１９８８年）。

【０００５】近年このリウマチの炎症性とサイトカイン
との関係が徐々に明らかになりつつある。特にインタ−
ロイキン１(IL-1)および腫瘍壊死因子（TNF)との関係に
ついては、その報告も多い[ ア−スリティス・アンド・
リウマティズム（Arthritisand Rheumatism）、第３０
巻、第５６２ペ−ジ、１９８７年、ア−スリティス・ア
ンド・リウマティズム（Arthritis and Rheumatism）、
第３１巻、第４８０ペ−ジ、１９８８年、日本整形外科
学会誌、第６３巻、第１３５３ペ−ジ、１９８９年、ブ
リティッシュ・ジャ−ナル・オブ・リウマトロジ−（Br
itish Journalof Rheumatology ）、第２８巻、第１０
４ペ−ジ、１９８９年およびアナルズ・オブ・ザ・リウ
マティック・ディジ−ズ（Annals of the Rheumatic Di
seases）、第４７巻、第７６８ペ−ジ、１９８８年] 。
これらの報告によれば、特にリウマチに関連してという
よりも、リウマチを炎症性の疾患の一つとしてとらえ、
局所炎症とサイトカインとの関係が論じられている。

【０００６】また、インタ−ロイキン６（IL-6）および
顆粒球／単球マクロファ−ジ刺激因子との関連も明らか
になりつつある「医学のあゆみ、第１６１巻、第５８０
ペ−ジ、１９９２年] が、この報告も、どちらかといえ
ばリウマチに限らず、炎症性の疾患としての関係が論じ
られている。単球マクロファージ刺激因子（Macrophage
Colony Stimulating Factor：以下、Ｍ−ＣＳＦと略記
することがある）は、白血球の機能を促進するため感染
症の予防および治療効果を有すること[ ジャ−ナル・オ
ブ・イムノロジ−（Journalof Immunology)、第１３１
巻、第２９８３ペ−ジ、１９８３年、ジャ−ナル・オブ
・イムノロジ−（Journal of Immunology)、第１２２
巻、第１１３４ペ−ジ、１９７９年およびジャ−ナル・
オブ・イムノロジ−（Journal of Immunology)、第１３
０巻、第７９５ペ−ジ、１９８３年] 、およびその分化
誘導活性により、骨髄性白血病の治療に有効であること
[ インタ−ナショナル・ジャ−ナル・オブ・カンサ−
（International Journal OF Cancer)、第３０巻、第７
７３ペ−ジ、１９８２年] 等が知られているが、この他
にも、近年その多彩な役割が明らかになってきている。
例えば、破骨細胞が極めて少ない骨大理石病のモデル動
物であるop/op マウスがＭ−ＣＳＦ欠損動物であること
[ ネイチャ−（Nature）、第３４５巻、第４４２ペ−
ジ、１９９０年] 、この破骨細胞減少が、Ｍ−ＣＳＦ投
与により改善されたこと[ ジャ−ナル・オブ・ボ−ン・
アンド・ミネラル・リサ−チ（Journal of Bone and Mi
neral Research）、第５巻（別冊２、要約）、第５３４
ペ−ジ、１９９０年] により、Ｍ−ＣＳＦは、生体内で
も破骨細胞形成に重要な役割を果たしていることが、推
定されている。

【０００７】炎症には、患部血管およびその隣接組織に
おける複雑な一連の細胞学的および組織学的反応が関与
しており、組織部分には血漿、蛋白質、およびマクロフ
ァ−ジ細胞の流入が惹起される。そのため、マクロファ
−ジを活性化する因子の存在は容易に推定され、またリ
ウマチによる炎症ではその初期において骨粗鬆様の症状
を呈することからも、IL-1およびTNF のみならず、Ｍ−
ＣＳＦの存在が当然のことながら予想される。ところ
が、リウマチとＭ−ＣＳＦの関係についての報告はほと
んどなく、次の２例が知られている。第１に、リウマチ
患者の関節液中にはインタ−ロイキン２（IL-2）および
インタ−ロイキン３（IL-3）が存在せず、Ｍ−ＣＳＦが
存在したという報告がある[ ジャ−ナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メディスン（Journal of Experimental
Medicine）第１６８巻、第１５７３ペ−ジ、１９８８
年] 。この論文中で著者らは、リウマチ患者より得た関
節液をゲルろ過クロマトグラフィ−にかけた後、マウス
骨髄を用いて軟寒天コロニ−形成法にてコロニ−を検出
し、そのゲルろ過における分子量の位置および形成され
たコロニ−からここに見られる因子がＭ−ＣＳＦである
ことを推定している。すなわち著者らは、検出される因
子がＭ−ＣＳＦであることを証明するために放射性免疫
測定法により試験し、この因子がＭ−ＣＳＦに特異的な
抗体を使用しても検出できることを示している。しかし
ながら、この方法は、前処理に操作が繁雑なゲル濾過を
行ったサンプルを測定しており、Ｍ−ＣＳＦがリウマチ
患者に存在することを推定したのみであり、この存在が
健常人にもあてはまるか否かは明らかでなく、また変形
性関節炎においても明らかにされていない。

【０００８】第２に、種々の関節液中のＭ−ＣＳＦを前
述のマウス骨髄を用いた軟寒天コロニ−形成法にて測定
し、リウマチ患者の関節液ではＭ−ＣＳＦレベルが、変
形性関節炎患者の関節液よりは高いことを推定した報告
[ リュ−マトロジ−・インタ−ナショナル（Rheumatolo
gy International）、第１０巻、第１３１ペ−ジ、１９
９０年] があるが、ここで使用している方法は、測定に
５〜１０日も要するマウス骨髄を用いた軟寒天コロニ−
形成法であり、例えば日常的な検査に応用することはで
きない。

【０００９】以上のようにＭ−ＣＳＦに関する報告例が
少ないのは、関節液中のＭ−ＣＳＦ含量を測定する場
合、従来使用されている感度の低い生物活性の測定では
検出できないか、または検出が難しいこと、さらに生物
活性の測定方法が繁雑で日数と手間が掛かることによる
ものである。また、免疫学的測定を行う場合は、関節液
に存在するいずれかの物質によりその測定が阻害される
ため、例えば前記のゲル濾過等の繁雑な前処理を行わな
ければならないことによる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、Ｍ−Ｃ
ＳＦはリウマチ患者の関節液に存在することが軟寒天コ
ロニ−形成法により明かにされてはいるが、免疫学的な
考察はほとんど行われていない。この免疫学的な考察が
行われていない原因は、関節液中に存在する物質により
その測定が阻害されるため、関節液を事前にクロマトグ
ラフィ−にかけるなどの前処理が必要であるが、このよ
うな操作は、一度に一検体しか処理できず、また多くの
解析に使用されている軟寒天骨髄培養法は熟練を要し、
さらに５〜10日程度の日数を要するという不利な条件が
多く重なったことによる。

【００１１】この発明は、以上のとおりの状況に鑑みて
なされたものであり、特に関節液のＭ−ＣＳＦ含量を測
定する際、その阻害物質を除去し、迅速、簡便、かつ高
感度にＭ−ＣＳＦの含量を免疫学的に測定する方法を提
供することを目的としている。さらにこの発明は、関節
液のＭ−ＣＳＦ含量を定量することにより、他の関節炎
［例えば変形性関節炎（O.A.）］患者とリウマチ患者と
を明確に識別する診断方法を提供することを目的として
もいる。

【００１２】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ヒアルロン酸を除去したヒト関
節液に含まれる単球マクロファージコロニー刺激因子
を、単球マクロファージコロニー刺激因子に特異的に反
応する抗体と反応させて免疫学的に測定するリウマチ疾
患の診断方法を提供する。

【００１３】また、この発明は、上記単球マクロファー
ジコロニー刺激因子に特異的に反応する抗体が、ハイブ
リドーマMO9106（微工研条寄第3662号）の産生するモノ
クロ−ナル抗体であること、およびヒアルロン酸の除去
が、ヒアルロニダーゼによる消化であることを望ましい
態様としてもいる。この発明の発明者等は、先にヒトＭ
−ＣＳＦβ型ダイマーに特異的に反応し、ヒトＭ−ＣＳ
Ｆβ型モノマー、ヒトＭ−ＣＳＦα型ダイマーおよびヒ
トＭ−ＣＳＦα型モノマーのいずれにも反応しないモノ
クローナル抗体、この抗体を産生するハイブリドーマ、
およびこの抗体の利用に関する発明を行い、特許出願し
た（特願平３−３３３６０７号。以下先願と記載す
る）。

【００１４】先願出願後、この発明の発明者等は、先願
の発明で得られたモノクローナル抗体の診断薬としての
利用について鋭意研究を行い、このモノクローナル抗体
がリウマチ疾患の診断に利用しうることを見出し、この
発明を完成した。以下、この発明についてさらに詳しく
説明する。関節液のＭ−ＣＳＦ含量を測定する際の阻害
物質として、関節液の粘凋性に関与している多量のヒア
ルロン酸がある。ヒアルロン酸を除去するためには、分
子量分画を行うことが最も簡便な方法であるが、ヒアル
ロン酸とＭ−ＣＳＦが複雑に絡まり合っている場合、ヒ
アルロン酸を除去する際にＭ−ＣＳＦも除去してしまう
可能性がある。そこで、例えばヒアルロン酸をヒアルロ
ニダ−ゼ（EC 4.2.2.1）で消化し、最終的にオリゴ糖に
分解することにより、関節液の粘凋性を低下させ、Ｍ−
ＣＳＦ含量の測定における阻害物質を除去することが可
能である。

【００１５】この発明の発明者らは、その可能性を検討
し、この方法により、阻害物質が除去されることを確認
した。この発明の方法において、ヒアルロン酸を除去す
る方法は、前記のヒアルロニダ−ゼ消化に限定されるも
のではなく、Ｍ−ＣＳＦに影響を与えずにヒアルロン酸
のみを消化、または除去する方法であれば、その他の方
法も利用することができる。

【００１６】この発明に使用する抗体の製造および免疫
学的測定方法は、先願の方法を採用できるが、特にこれ
に限定されるものではなく、同程度の感度を有する測定
法であれば、利用することが可能である。この発明に使
用する抗体の製造法を例示すれば、次のとおりである。 （１）ハイブリドーマの作出 この発明のハイブリド−マの作出は、免疫、細胞融合、
融合細胞選択、アッセイおよびクロ−ニングの各工程よ
りなる公知の方法［ネイチャー(Nature)、第２５６巻、
第４９５ページ、１９７５年］により次のようにして行
われる。 1)免疫 精製β型ダイマ−を抗原として用い、完全フロインドま
たは不完全フロインドのアジュバントと混和し、１週間
〜数か月の間隔でラットまたはマウス等に１〜４回注射
し、動物を感作する。なお、精製β型ダイマ−は、例え
ば特開昭64-22899号公報記載の方法により健康な人の尿
から分離、精製される。 2)細胞融合 前記の操作により免疫された動物から常法により摘出し
た脾臓細胞またはリンパ球Ｂ細胞と、骨髄腫細胞とを融
合し、融合細胞を得る。使用する骨髄腫細胞は、公知の
HGPRT(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transfer
ase)欠損マウスまたはラット骨髄腫細胞であり、ケーラ
ーおよびミルスタインの方法［ネイチャー(Nature)、第
２５６巻、第４９５ページ、１９７５年］により容易に
入手し得る。融合方法としてはHJV 法（センダイウイル
スを用いる方法）、ポリエチレングリコ−ル法（PEG
法）、電気融合法等の公知の方法が例示できる。 3)融合細胞の選択 次いで融合細胞のみが生育できる適当な選択培地中で２
〜４日毎に新鮮な選択培地と交換しながら10〜20日間培
養し、所望の融合細胞のみを選別する。HGPRT欠損骨髄
腫細胞を融合親細胞として用いた場合、選択培地として
はHAT(Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine）培地、
HAz(Hypoxanthine, Azaserine)培地等を例示することが
できる。 4)アッセイ アッセイ工程は、融合細胞の中から、目的とする特異抗
体産生細胞を選別する工程である。通常、選別は、培養
上清に含まれる抗体活性を固相または液相放射性同位元
素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫化学測定法（Ｅ
ＩＡ）、凝集法、蛍光抗体法等の公知の方法で行われ
る。 5)クロ−ニング クロ−ニング工程は、目的の特異抗体産生細胞を一つの
クロ−ンから由来した均一な細胞集団とする工程であ
る。公知の限外希釈法等によってモノクロ−ナルな細胞
から由来し、安定してＭ−ＣＳＦと反応する抗体を産生
する細胞株、いわゆるハイブリド−マを得る。

【００１７】以上の方法により得られたハイブリドーマ
は、Ｍ−ＣＳＦに特異的に反応するモノクロ−ナル抗体
を産生するという機能的特徴を有している。その代表的
な例としてラットのリンパ球Ｂ細胞とラットのミエロー
マ細胞とを融合して得たハイブリドーマを、ハイブリド
ーマMO9106と命名し、既に通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託し、微工研条寄第3662号(FERM BP
-3662)なる受託番号が付されている。

【００１８】このハイブリドーマMO9106は、次の性質を
有している。 ａ）由 来：ラット脾細胞（Lou ラット；実験動物
中央研究所より入手）とラットミエロ−マ細胞（Y3Ag1.
2.3 ）［ネイチャ−(Nature)、第２７７巻、第１３１ペ
−ジ、１９７９年］) との融合細胞であるハイブリド−
マ ｂ）形 態：非紡錘形であり、ほぼ球形を呈する ｃ）継代培養 ：可能 ｄ）機能的特徴：Ｍ−ＣＳＦβ型ダイマ−に特異的に反
応するモノクロ−ナル抗体の産生 ｅ）細胞増殖性：附着および浮遊の両者において良好 ｆ）保存条件 ：10%DMSO,90%FCS中にて−８０℃以下で
保存する ｇ）血清要求性：通常、10%FCS添加培地にて培養する （２）モノクロ−ナル抗体の取得 この発明の抗体は、前記ハイブリド−マを組織培養用フ
ラスコに接種し、公知の無血清培地、血清を含む公知の
動物細胞用培地等で培養し、得られた培養上清から、ま
たはプリスタン（2,6,10,14-Tetramethyl pentadecane)
を前投与したマウス等の動物にこのハイブリド−マを接
種し、生体内培養して得た生体浸出液から、公知の方法
により精製される。すなわち、得られた培養上清または
生体浸出液を通常の蛋白精製に用いられる生化学的方
法、例えば硫酸アンモニウムによる塩沈法、カラムクロ
マトグラフィ−等により精製される。得られたモノクロ
−ナル抗体はβ型ダイマ−と特異的に結合し、単一クロ
−ンに由来する均一な抗体であり、ラットまたはマウス
由来であることを特徴としている。

【００１９】以上のようにして得られたモノクロ−ナル
抗体は、次に示す理化学的性質を有している。 ラット由来のγグロブリンのIgG に属する。 IgG のIgG₁ サブクラスに属する。 Ｌ鎖として、κ鎖を有する。

【００２０】以上のようにして調製されたモノクロ−ナ
ル抗体はＭ−ＣＳＦβ型ダイマ−に特異的に反応する
が、この発明においてはβ型ダイマ−以外のＭ−ＣＳＦ
に反応する抗体を使用することもできる。この発明の方
法に使用する診断薬を例示すれば、次のとおりである。
この発明の方法に使用する診断薬としては、ＥＩＡ(Enz
yme-Immuno Assay）試薬が望ましく、各試薬を一組のセ
ット（いわゆるキット）とするのが使用上便利であるた
め、以下キット化された試薬を例示して説明する。

【００２１】この発明の方法に使用する診断薬は、固定
化抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（１次抗体）、抗Ｍ−ＣＳＦ抗体
（２次抗体）、酵素標識抗体（３次抗体）、活性測定用
基質、反応停止剤、検量線作成用標準品、および緩衝液
の７種の試薬から構成される。 固定化抗Ｍ−ＣＳＦ抗体 固定化抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、１次抗体として用いられる
抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を不溶性担体に固定化したものであ
る。不溶性担体としては、ビ−ズ、マイクロプレ−ト、
繊維等が例示できるが、マイクロプレ−トが望ましく、
特にポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の
透明な合成樹脂製の酵素免疫測定法用マイクロタイトレ
−ションプレ−トが好適である。

【００２２】抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（１次抗体）としては、
前記モノクロ−ナル抗体または公知の方法で得られたポ
リクロ−ナル抗体が使用できるが、ウサギ由来抗Ｍ−Ｃ
ＳＦ抗体が望ましい。公知の方法で得られるポリクロ−
ナル抗体は、具体的には精製Ｍ−ＣＳＦを適当な動物
（例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット
等）に免疫して得た抗血清から、通常の蛋白の精製法に
より精製される。

【００２３】固定化は次のようにして行われる。波長28
0nm で測定した吸光度により表わされる蛋白濃度が0.00
1 〜0.005 の範囲に抗体を溶解し、この溶液の適量、例
えば50〜100 μｌを容器に入れ、例えば０〜37℃で１〜
24時間静置し、希釈液を除去する。適量の洗浄液、例え
ば200 〜300 μｌを用い、望ましくは１〜３回洗浄す
る。洗浄液としては、蒸留水、生理食塩液、およびこれ
らに0.01〜1.0%のアルブミン、Tween-20を添加溶解した
液が使用できる。 抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（２次抗体） ２次抗体として用いられる抗Ｍ−ＣＳＦ抗体は、１次抗
体が前記のモノクロ−ナル抗体であれば、公知の方法に
より得られるポリクロ−ナル抗体であり、１次抗体が公
知の方法により得られるポリクロ−ナル抗体であれば、
そのモノクロ−ナル抗体を用いることができるが、前記
のモノクロ−ナル抗体を用いるのが望ましい。 酵素標識抗体 酵素標識抗体は３次抗体として用いられる抗体に酵素を
標識したものである。標識用酵素はＥＩＡ試薬で通常用
いられる酵素、例えばパ−オキシダ−ゼ、アルカリフォ
スファタ−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ等が使用でき
るが、パ−オキシダ−ゼを用いるのが望ましい。３次抗
体は、２次抗体である抗Ｍ−ＣＳＦ抗体に対する抗体と
しての役割を有している。具体的には２次抗体と同種動
物に由来するイムノグロブリンに対する抗体であり、例
えば、２次抗体が前記のモノクロ−ナル抗体である場
合、３次抗体はラット由来イムノグロブリンに対する抗
体（抗ラット由来イムノグロブリン抗体）である。この
３次抗体は、公知の方法により次のようにして調製され
る。２次抗体と同種動物由来のイムノグロブリンを適当
な動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモ
ット等。ただし、２次抗体とは由来が異なることが望ま
しい）に免疫し、得られた抗血清から精製されるが、ヤ
ギ由来のウサギイムノグロブリンに対する抗体を用いる
のが望ましい。標識方法は公知の方法であり、例えば、
Ｎ−サクシンイミジル３−（２´−ピリジルジチオ）プ
ロピオネ−トを用いる方法、グルタルアルデヒドを用い
る方法、Ｎ，Ｎ´−ο−フェニレンジマレイミドを用い
る方法等を例示することができる。 活性測定用基質 酵素活性測定用基質は、使用する標識用酵素の種類によ
って異なるが、当該酵素に適当した基質の粉末、錠剤ま
たは溶液であり、例えばパ−オキシダ−ゼにはＡＢＴＳ
と過酸化水素、ο−フェニレンジアミンと過酸化水素の
組合せ等、またアルカリフォスファタ−ゼにはフェニル
リン酸と４−アミノアンチピリンの組合せ等を例示する
ことができる。 反応停止剤 反応停止剤も使用する標識用酵素の種類により異なる
が、使用する酵素に適当した公知の反応停止剤を用いる
ことができる。 検量線作成用標準品 この発明の試薬に用いられる標準品は後述する検量線を
作成するために用いられるものであり、溶液または凍結
乾燥品からなっている。標準品は緩衝液に溶解して使用
し、測定する物質の濃度に合わせて４〜６段階の濃度に
小分けして検量線の作成に使用される。 緩衝液 この発明の試薬キットに使用される緩衝液は、抗原抗体
反応用、および標識用酵素の酵素活性測定用の２種類で
ある。抗原抗体反応用緩衝液は、特にｐＨが６〜９、塩
濃度が０. ０１〜０. ２Ｍ程度のものが好ましく、例え
ば０. １Ｍリン酸塩緩衝化生理食塩液、ｐＨ７. ０を例
示することができる。酵素活性測定用緩衝液は、標識用
酵素の種類により異なるが、通常前記の抗原抗体反応用
緩衝液を共用できる。標識用酵素の活性測定条件が、前
記の抗原抗体反応緩衝液の塩濃度、ｐＨと異なる場合に
限り、酵素活性測定用緩衝液を作成する。 ブロッキング剤 この発明の試薬キットには他にブロッキング剤として前
記の抗原抗体反応用緩衝液に０．２〜０．５％のＢＳ
Ａ等の蛋白質を溶解したものを用いる。ここにいう蛋白
質は、ＢＳＡ、ゼラチン等であり、特にＢＳＡに限定さ
れるものではない。

【００２４】この発明の方法に使用するリウマチ診断薬
の他の例を示せば次のとおりである。 ａ）固定化抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（１次抗体） 前記に準じて調製する。 ｂ）ビオチン化抗Ｍ−ＣＳＦ抗体（２次抗体） ２次抗体として用いる抗体は、１次抗体が前記のモノク
ローナル抗体である場合は公知の方法で得られるポリク
ロ−ナル抗体、または１次抗体が公知の方法で得られる
ポリクロ−ナル抗体である場合はそのモノクローナル抗
体であり、いずれの場合においても公知の方法でビオチ
ンを結合させる。具体的には、ＮＨＳ−ＬＣビオチン等
をＤＭＳＯ等を用いて反応させ、抗体に結合させる。 ｃ）酵素標識抗体 ビオチンと反応させるアビジンには、公知の方法で酵素
を標識する。標識する酵素は、パーオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ等を
例示することができ、特にパーオキシダーゼが望まし
い。 ｄ）活性測定用基質 前記に準じて調製する。 ｅ）反応停止液 前記に準じて調製する。 ｆ）検量線作成用標準品 前記に準じて調製する。 ｇ）緩衝液 この場合の診断薬に用いられる緩衝液は、抗原抗体反応
用、ビオチン・アビジン反応用、および標識酵素の酵素
活性測定用の３種類である。抗原抗体反応用、および標
識酵素の酵素活性測定用の緩衝液は、前記に準じて調
製される。ビオチン・アビジン反応用の緩衝液は、アビ
ジンが非特異的にビオチンと結合するため０. ０１〜
０. １％の蛋白質を含むｐＨ６〜９、０. ０１〜０. ２
Ｍの塩濃度が望ましく、例えば０. ０２％ＢＳＡを含む
０. １Ｍリン酸塩緩衝化生理食塩液（ｐＨ７. ０）を例
示することができる。緩衝液の蛋白質は、ＢＳＡ、ゼラ
チン等であり、特にＢＳＡに限定されるものではない。 ｈ）ブロッキング剤 前記に準じて作成する。

【００２５】以上のようにしてこの発明の方法に使用す
る診断薬は調製され、次に記載するように試料に含まれ
るＭ−ＣＳＦの定量に使用される。この発明の方法を具
体的に例示すれば、次のとおりである。関節炎を起こし
ている患者の関節から採取された関節液を、遠心分離
（たとえば２０００ｒｐｍで１５分間）し、細胞画分を
沈殿させて除去する。この検体は、Ｍ−ＣＳＦ含量測定
時まで−７０℃で保存することも可能である。−７０℃
で凍結保存した場合は関節液を融解し、凍結保存しない
場合はそのまま、検体にヒアルロニダ−ゼ（EC 4.2.2.
1）等のヒアルロン酸を消化することのできる酵素を、
使用する酵素の最適条件で作用させる。ヒアルロン酸を
消化することのできる酵素は、他には例えばコンドロイ
チナ−ゼACII等を例示できる。また、ヒアルロン酸の除
去には酵素的方法ばかりではなく、物理的な方法、例え
ば分子量分画、ｐＨ分画等、ヒアルロン酸のみを除去す
ることが可能な方法を適用することもできる。ヒアルロ
ン酸を除去した検体を、−７０℃で保存することも可能
である。

【００２６】以上の前処理を行った後、Ｍ−ＣＳＦ含量
を例えばＥＬＩＳＡ法等により次のようにして定量する
ことができる。抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を吸着させたプラスチ
ックプレ−トまたはプラスチックビ−ズに、ヒアルロン
酸を除去した検体を反応させる（１次反応）。ここで使
用する抗体は、Ｍ−ＣＳＦに特異的な抗体であれば、ポ
リクロ−ナル抗体でも、モノクロ−ナル抗体でもよい。

【００２７】検体のＭ−ＣＳＦと抗体を十分に反応させ
た後、１次反応とは異なる抗Ｍ−ＣＳＦ抗体を反応させ
る（２次反応）。ここで使用する抗体は、１次反応と同
様にＭ−ＣＳＦに特異的な抗体であれば、ポリクロ−ナ
ル抗体でもモノクロ−ナル抗体でもよい。次に、２次反
応で使用した抗体に対する標識抗体を反応させる。ここ
でいう標識抗体は、酵素標識、蛍光標識、放射性標識等
であり、２次反応で使用する抗体を直接標識することに
より、一層簡便な測定も可能である。最終的には、標識
を検出することにより、検体中のＭ−ＣＳＦを測定する
ことができる。たとえば標識が酵素であった場合は、そ
れに対応する基質を使用し、光学的に濃度を判定するこ
とが可能である。具体例を挙げれば、例えば標識酵素が
ホ−ス・ラディッシュ・ペルオキシダ−ゼ（Horse Radd
ish Peroxidase）であった場合は、この酵素に対する基
質としてオルト・フェニレン・ジアミン、２，２´−ア
ジノ・ビス−３−エチルベンズチアゾリン−６−サルフ
ォニック・アシッドを用いて発色させ、それぞれ492nm
および414nm の吸光値を測定することが可能である。

【００２８】他の標識酵素を例示すれば、アルカリフォ
スファタ−ゼ、βガラクトシダ−ゼ等があるが、これら
に限定されるものではない。また、抗体をビオチン標識
し、のちに酵素を結合させたアビジンを反応させること
も可能である。この場合は、アビジン・ビオチンの複合
体のスケ−ルを大きくすることにより、感度をさらに上
昇させることが可能である。

【００２９】また蛍光標識または放射性（同位元素）標
識の場合は、それに対応する機器を用いて、直接標識を
測定することが可能である。蛍光標識を例示すれば、フ
ルオレセイン・イソチオシアネ−ト（４９２ｎｍの吸収
極大と５２０ｎｍの蛍光発光）、テトラメチル・ロ−ダ
ミン・イソチオシアネ−ト（５５４ｎｍの吸収極大と５
７３ｎｍの蛍光発光）等があるが、これらに限定される
ものではない。放射性（同位元素）標識の例としては、
現在使用されているのは、ヨウ素（¹²⁵ Ｉ）が一般的で
あるが、水素（³ Ｈ）、炭素（¹⁴Ｃ）等を使用すること
も可能である。

【００３０】免疫学的な定量方法は前記ＥＬＩＳＡ法に
限定されるものではなく、この他にも例えばラテック
ス、金コロイドを用いた半定量的な抗原抗体反応等が適
用可能であり、予めラテックス粒子または金コロイド試
薬を一定量のＭ−ＣＳＦと反応する量の抗体で感作し、
未知量のＭ−ＣＳＦの含まれる検体を作用させて、一定
量以上のＭ−ＣＳＦがその検体中に含まれるか否かを検
出することもできる。

【００３１】次に試験例を示してこの発明の作用効果を
詳しく説明する。 試験例１ この試験は、ヒアルロニダ−ゼによる関節液の消化処理
の効果を調べるために行った。 １）試験方法 骨髄液中のヒアルロン酸の消化法（日本生化学会編、
「新生化学実験講座第３巻、糖質II：プロテオグリカン
とグリコサミノグリカン」、東京化学同人、第１７８ペ
−ジ、１９９１年）を参考として次のように関節液を処
理した。

【００３２】関節液５００μｌに５ＴＲＵのヒアルロニ
ダ−ゼ（生化学工業社製）を加え、ｐＨを調製するため
に酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５. ８２）２００μｌお
よび超純粋水２５０μｌ加え、被験試料の最終濃度を初
期濃度の１／２に調整し、５５℃で２時間反応させた。
ヒアルロニダ−ゼで消化した関節液を２分し（それぞれ
消化１および消化２と記載する）、人為的にヒトＭ−Ｃ
ＳＦ（森永乳業社製）０. ６３〜０. ５ｎｇ／ｍｌを添
加し、その液中のＭ−ＣＳＦをELISA 法を用いて定量し
た。なお、ヒアルロニダ−ゼ消化前の関節液も２分し
（それぞれ無処理１および無処理２と記載する）、同様
に定量し、ヒアルロニダ−ゼ消化による効果を試験し
た。 ２）結果 この試験の結果は表１に示したとおりである。この処理
により、肉眼的に関節液の粘凋性がほとんど認められな
くなった。さらに無処理１および無処理２の場合は、ヒ
トＭ−ＣＳＦの回収率が−２７〜２２％（重量。以下特
に断りのない限り同じ）であるのに対して、消化１およ
び消化２の場合には、その回収率は８３〜１１３％と顕
著に高い値を示した。従って、関節液のヒアルロニダ−
ゼ消化がＭ−ＣＳＦの定量に有効であることが判明し
た。

【００３３】

【表１】

【００３４】試験例２ この試験は、ヒアルロニダ−ゼによる消化がヒトＭ−Ｃ
ＳＦにあたえる影響を調べるために行った。酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５. ８２）にヒトＭ−ＣＳＦ（森永乳
業社製）を添加し、試験例１と同一の方法によりヒアル
ロニダ−ゼで消化し、ゲル濾過クロマトグラフィ−を行
い、さらにそれを抗原抗体反応を用いた方法にて検出し
た。

【００３５】その結果は図１に示したとおりである。図
１は、ヒアルロニダ−ゼで消化したヒトＭ−ＣＳＦのゲ
ル濾過クロマトグラフィ−による溶出曲線であり、図の
縦軸は吸光度、横軸はフラクション番号を示し、図中−
○−は、酵素処理を行ったＭ−ＣＳＦを、−●−は酵素
処理を行っていないＭ−ＣＳＦを示す。図１から明らか
なように、両曲線は実質的に一致しており、ヒアルロニ
ダ−ゼ消化がヒトＭ−ＣＳＦの分子量にも抗原性にも影
響を及ぼさないことが判明した。 試験例３ この試験は、ヒアルロニダ−ゼで消化した関節液の抗Ｍ
−ＣＳＦポリクロ−ナル抗体を利用したＭ−ＣＳＦ含量
の定量性を調べるために行った。 １）試料 リウマチ患者７例、変形性関節炎患者２例および健常人
１例の関節液を用いた。 ２）試験方法 関節液は、試験例１と同一の方法により処理した。家兎
に免疫して得られた抗Ｍ−ＣＳＦポリクロ−ナル抗体を
１μｇ／ｍｌの濃度に調整して抗原抗体反応用プラスチ
ックプレ−ト（ヌンク社製）に吸着させ、非特異反応を
避けるために０. ５％ゼラチン（バイオラッド社製）で
抗体が結合していない部分のプラスチック表面をコ−ト
した。次いで試験例１と同一の方法でヒアルロニダ−ゼ
消化した関節液を加え、第１次の抗原抗体反応を行っ
た。のちビオチンを標識した抗Ｍ−ＣＳＦポリクロ−ナ
ル抗体を加え、第２次の抗原抗体反応を行い、さらにホ
−ス・ラディッシュ・ペルオキシダ−ゼ（Horse Raddis
h Peroxidase）処理したストレプトアビジン（サイメド
社製）を反応させ、ホース・ラディッシ・ペルオキシダ
−ゼに対応する基質として２，２´−アジノ・ビス−３
−エチルベンズチアゾリン−６−サルフォニック・アシ
ッド（ケーピーエル社製）を加えて発色させ、その吸光
値をＥＩＡリ−ダ−（バイオ・ラッド社製。モデル２５
５０）を用いて測定した。

【００３６】これとは別に種々の濃度に調整したヒトＭ
−ＣＳＦ（森永乳業社製）を用いて同様の方法により検
量線を作成した。各検体から得られた吸光値から検量線
を用いて、関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ量を計算した。 ３）結果 この試験の結果、リウマチ患者の関節液のＭ−ＣＳＦ含
量の平均値は、１８５８ｐｇ／ｍｌであるのに対して、
変形性関節炎患者および健常人の関節液のＭ−ＣＳＦ含
量の平均値は、７８６ｐｇ／ｍｌであり、リウマチ患者
の関節液のＭ−ＣＳＦ含量は、変形性関節炎患者および
健常人の関節液のＭ−ＣＳＦ含量よりも顕著に高い値を
示した。従って、この発明の方法は、関節液のＭ−ＣＳ
Ｆ含量を正確、かつ迅速に定量することが可能であり、
リウマチ患者の診断に応用することができる。 試験例４ この試験は、ヒアルロニダ−ゼ消化した関節液の抗Ｍ−
ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を利用したＭ−ＣＳＦ含量の
定量性を調べるために行った。 １）試料 試験例３とは別のリウマチ患者１０例、変形性関節炎患
者２例および健常人１例の関節液を用いた。 ２）試験方法 関節液は、試験例１と同一の方法により処理した。前記
先願と同一の抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を１μｇ
／ｍｌの濃度に調整し、抗原抗体反応用プラスチックプ
レ−ト（ヌンク社製）に吸着させ、非特異反応を避ける
ために０. ５％ゼラチン（バイオラッド社製）で抗体が
結合していない部分のプラスチック表面をコ−トした。
次いで、ヒアルロニダ−ゼ処理した関節液を加え、第１
次の抗原抗体反応を行い、のち家兎から得た抗Ｍ−ＣＳ
Ｆポリクロ−ナル抗体を加え、第２次の抗原抗体反応を
行い、さらにホ−ス・ラディッシュ・ペルオキシダ−ゼ
（Horse Raddish Peroxidase）処理したポリクロ−ナル
抗体（生化学工業社製）に対する抗体を加え、ホ−ス・
ラディッシュ・ペルオキシダ−ゼに対応する基質として
Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチル・ベンチジン（ケー
ピーエル社製）を加えて発色させ、その吸光値をＥＩＡ
リ−ダ−（バイオ・ラッド社製。モデル２５５０）を用
いて測定した。

【００３７】これとは別に種々の濃度に調整したヒトＭ
−ＣＳＦ（森永乳業社製）を用いて同様の方法により検
量線を作成した。各検体から得られた吸光値から検量線
を用いて、関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ量を計算した。 ３）試験結果 この試験の結果は、図２に示したとおりである。図２は
ヒト関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ含量の定量値の分布で
あり、縦軸および横軸はＭ−ＣＳＦ濃度および試料群を
示し、図中○および●は、各々、リウマチ患者由来の関
節液、および変形性関節炎患者および正常人由来の関節
液のＭ−ＣＳＦ含量を示す。

【００３８】図２から明らかなようにリウマチ患者の関
節液のＭ−ＣＳＦ含量は、変形性関節炎患者および健常
人の関節のＭ−ＣＳＦ含量よりも顕著に高い値を示し
た。従って、この発明の方法は、関節液のＭ−ＣＳＦ含
量を正確、かつ迅速に定量することが可能であり、リウ
マチ患者の診断に応用することができる。次に実施例を
示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、
この発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【００３９】

【実施例】

実施例１ 関節炎患者１４名および健常人１名の膝関節から採取さ
れた関節液を、遠心分離（２，０００ｒｐｍで１０分
間）して細胞画分を沈殿除去し、−７０℃で凍結保存し
て検体とした（なお、検体は番号のみを付して採取源が
分からないようにした）。凍結保存した各検体を室温で
融解し、その一部について関節液１容量に１／１０容量
のヒアルロニダ−ゼ（生化学工業社製）溶液（１００Ｔ
ＲＵ／ｍｌ）を加え、さらにｐＨ調整のための２／５容
量の酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８２）および１／
２容量の超純水を加え、５５℃で２時間反応させ、のち
-70℃で保存した。

【００４０】ＥＬＩＳＡ用プラスチック・プレ−ト（ヌ
ンク社製。442404）に前記先願の方法と同一の方法によ
り製造した抗Ｍ−ＣＳＦモノクロ−ナル抗体を１μｇ／
ｍｌの濃度に調整して吸着させ、４℃で一晩放置した。
次に、非特異反応を防ぐために０．５％の濃度のゼラチ
ンをプラスチック・プレ−トの抗体が吸着していない部
分に吸着させた。この状態で、37℃で1 時間放置した。
このプラスチック・プレ−ト上に、前記各検体を生理食
塩水にて希釈して添加し、３７℃で２時間放置した。そ
の後、家兎にヒトＭ−ＣＳＦを免疫して得られた抗Ｍ−
ＣＳＦポリクロ−ナル抗体を１μｇ／ｍｌに調整し、３
７℃で１時間放置し、ホ−ス・ラディッシュ・ペルオキ
シダ−ゼ（Horse Raddish Peroxidase）の結合した抗ウ
サギＩｇＧ（生化学工業社製）を適宜希釈して、３７℃
で１時間放置した。ホース・ラディッシュ・ペルオキシ
ダ−ゼに反応させる基質としては、Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´
−テトラメチル・ベンチジン（ケーピーエル社製）を室
温で３０分作用させ、吸光値をＥＩＡリーダー（バイオ
ラッド社製。モデル２５５０）を用いて測定した。

【００４１】これとは別に種々の濃度に調整したヒトＭ
−ＣＳＦ（森永乳業社製）を用いて同様の方法により検
量線を作成した。各検体から得られた吸光値から検量線
を用いて、関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ量を計算した。
その結果、関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ量は、１１検体
において８７２〜２９９２ｐｇ／ｍｌ、３検体において
５８３〜８４６ｐｇ／ｍｌ、１検体において５１５ｐｇ
／ｍｌであり、１１検体がリウマチ患者、３検体が変形
性関節炎患者、１検体が健常人から採取された関節液で
あると推定された。

【００４２】この結果は、専門の医師による総合的診察
に基づく診断結果と一致していた。 実施例２ ＥＬＩＳＡ法による測定のためのプレートの調製後、実
施例１の残部の検体を用いて実施例１を反復した。その
結果、検体の前処理からＭ−ＣＳＦ含量の算出まで、１
５検体で約７時間を要し、迅速にＭ−ＣＳＦ含量を定量
することができた。 実施例３ ＥＬＩＳＡ法を次のように行ったことを除き、実施例１
と同一の方法により、実施例１とは別の１０検体のＭ−
ＣＳＦ含量を定量した。家兎に免疫して得られた抗Ｍ−
ＣＳＦポリクロ−ナル抗体を１μｇ／ｍｌの濃度に調整
して抗原抗体反応用プラスチックプレ−ト（ヌンク社
製）に吸着させ、非特異反応を避けるために０. ５％ゼ
ラチン（バイオラッド社製）で抗体が結合していない部
分のプラスチック表面をコ−トした。次いで試験例１と
同一の方法でヒアルロニダ−ゼ消化した関節液を加え、
第１次の抗原抗体反応を行った。のちビオチンを標識し
た抗Ｍ−ＣＳＦポリクロ−ナル抗体を加え、第２次の抗
原抗体反応を行い、さらにホ−ス・ラディッシュ・ペル
オキシダ−ゼ（Horse RaddishPeroxidase）処理したス
トレプトアビジン（サイメド社製）を反応させ、ホース
・ラディッシュ・ペルオキシダーゼに対応する基質とし
て２，２´−アジノ・ビス−３−エチルベンズチアゾリ
ン−６−サルフォニック・アシッド（ケーピーエル社
製）を加え、発色させた。

【００４３】その結果、関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ量
は、７検体において１２６１〜３１８６ｐｇ／ｍｌ、３
検体において７０８〜１０２６ｐｇ／ｍｌであり、７検
体がリウマチ患者、３検体が変形性関節炎患者から採取
された関節液であると推定された。この結果は、専門の
医師による総合的診察に基づく診断結果と一致してい
た。

【００４４】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、ヒト関節液のＭ−ＣＳＦを迅速、正確、高感度
で定量することのできる免疫学的測定法が提供され、そ
の結果、リウマチ疾患を客観的かつ正確に診断すること
が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒアルロニダ−ゼで消化したヒト関節液Ｍ−Ｃ
ＳＦのゲル濾過クロマトグラフィ−による溶出曲線であ
る。

【図２】ヒト関節液に含まれるＭ−ＣＳＦ含量の定量値
の分布である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 素本 友紀 神奈川県横浜市旭区中希望ケ丘50 ウェル ストンビレッジ204

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒアルロン酸を除去したヒト関節液に含
   まれる単球マクロファージコロニー刺激因子を、単球マ
   クロファージコロニー刺激因子に特異的に反応する抗体
   と反応させて免疫学的に測定するリウマチ疾患の診断方
   法。
2. 【請求項２】 単球マクロファージコロニー刺激因子に
   特異的に反応する抗体が、ハイブリドーマMO9106（微工
   研条寄第3662号）の産生するモノクロ−ナル抗体である
   請求項１のリウマチ疾患の診断方法。
3. 【請求項３】 ヒアルロン酸の除去が、ヒアルロニダー
   ゼによる消化である請求項１のリウマチ疾患の診断方
   法。