JPH06199797A - 窒素複素環式カルボン酸の微生物学的ヒドロキシル化方法 - Google Patents

窒素複素環式カルボン酸の微生物学的ヒドロキシル化方法

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JPH06199797A
JPH06199797A JP5043126A JP4312693A JPH06199797A JP H06199797 A JPH06199797 A JP H06199797A JP 5043126 A JP5043126 A JP 5043126A JP 4312693 A JP4312693 A JP 4312693A JP H06199797 A JPH06199797 A JP H06199797A
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hydroxy
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heterocyclic carboxylic
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キーナー アンドレアス
Andreas Tschech
チェッヒ アンドレアス
Andreas Tinschert
ティンシャート アンドレアス
Klaus Heinzmann
ハインツマン クラウス
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Lonza AG
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 対応する窒素複素環式カルボン酸から出発
し、一般式 【化９】 のヒドロキシ−窒素複素環式カルボン酸またはその可溶
性塩を製造する新規な方法を提供する。 ならびにその
方法に適した新規な微生物に関する。 【構成】 ６−メチルニコチン酸を利用する特殊なヒド
ロキシラーゼを有する微生物、代表的にはＤＳＭ６９２
０またはそれらの子孫および突然変異体を使用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、対応する窒素複素環式カルボン
酸から出発し、一般式
【０００２】
【化５】
【０００３】のヒドロキシ−窒素複素環式カルボン酸ま
たはその可溶性塩を製造するための新規な微生物学的方
法、ならびにその方法に適した新規な微生物に関する。
【０００４】以下、「窒素複素環式カルボン酸」とは、
ヒドロキシル化されていてもヒドロキシル化されていな
くても、それらの可溶性塩、たとえばそれらのアルカリ
またはアンモニウムの塩も含まれるものとする。
【０００５】２−ヒドロキシ−窒素複素環式カルボン酸
は、種々の有効成分の合成における重要な中間体であ
る。 例を挙げれば、２−ヒドロキシニコチン酸は２−
クロロニコチン酸製造用の原料として使用できる（ＵＳ
−ＰＳ４０８１４５１）が、この物質はたとえば医薬製
造用の重要な中間体になる（Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｆ
ｒ．，１９８０，３８（３），２４３〜２５２頁）。
【０００６】これまで、ヒドロキシ−窒素複素環式カル
ボン酸を製造するための微生物学的方法は知られていな
い。
【０００７】本発明の目的は、化学的に合成することが
困難な２−ヒドロキシ−窒素複素環式カルボン酸を製造
するための、簡単で生態学的な微生物学的方法を提供す
ることにある。
【０００８】この目的は、請求項１の本発明方法および
請求項６の新規な微生物により達成される。
【０００９】この方法では、本発明により、一般式
【００１０】
【化６】
【００１１】［式中、Ｒ1およびＲ2は、同一であるかま
たは異なるものであって、水素原子、ハロゲン原子また
はＣ1〜Ｃ4アルキル基を意味し、Ｘは窒素原子またはＣ
Ｒ3官能基を意味し、Ｒ3は水素原子またはハロゲン原子
を意味する。］の窒素複素環式カルボン酸を基質とし
て、６−メチルニコチン酸を利用する特殊なヒドロキシ
ラーゼを有する微生物により、一般式
【００１２】
【化７】
【００１３】［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＸは上記の意味を
有する。］のヒドロキシ−窒素複素環式カルボン酸に変
換する。
【００１４】「６−メチルニコチン酸を利用する特殊な
ヒドロキシラーゼを有する微生物」とは、下記のような
微生物である。
【００１５】たとえば接種物として浄化スラッジを使用
し、６−メチルニコチン酸によりバイオマスを培養し
て、６−メチルニコチン酸を利用する微生物、すなわち
６−メチルニコチン酸を唯一の炭素、窒素およびエネル
ギー供給源として成長する微生物を得る。 次に当業者
には一般的な方法により、６−メチルニコチン酸を、中
間体として２−ヒドロキシ−６−メチルニコチン酸を経
由して完全に分解する微生物を選別し、特殊なヒドロキ
シラーゼを有する微生物、すなわち酸官能基と窒素との
間にある唯一の炭素原子を特異的にヒドロキシル化する
微生物を得る。
【００１６】原則的に、本方法には、この原理に従っ
て、たとえば浄化スラッジまたは土壌から選択されたす
べての微生物が好適である。 これらの微生物は文献に
報告されていないものであって、本発明の構成要素であ
る。
【００１７】本発明の方法には、Ｋｉ１０１（ＤＳＭ６
９２０）の標識を有する微生物ならびにその子孫および
突然変異体を使用するのが有利である。 これらの微生
物は、１９９２年２月１０日にドイチェン・ザムルング
・フュア・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクル
トゥーレン・ＧｍｂＨ，マシェローデヴェーク１ｂ，Ｄ
−３３００，ブラウンシュバイクに寄託してある。
【００１８】Ｋｉ１０１（ＤＳＭ６９２０）の科学的説
明 細胞形態 小棒状 幅μｍ ０．４〜０．５ 長さμｍ １．０〜１．５ 移動性 − べん毛 − グラム反応 − ３％ ＫＯＨによる分解 ＋ アミノペプチダーゼ（セルニー） ＋ 胞子 − オキシダーゼ ＋ カタラーゼ ＋ １６Ｓ ｒＲＮＡ配列分析による属は決定できなかっ
た。
【００１９】これらの微生物の６−メチルニコチン酸に
よる選別および培養は、当業者には一般的な方法により
行なう。
【００２０】選別の際には、好気性条件下で微生物を
「スクリーニング」することが有利である。 好ましく
はそのスクリーニングの際に、微生物を静止（振とうせ
ずに）培養する。 ６−メチルニコチン酸の量は、選別
および培養の際に１重量％まで、好ましくは０．５重量
％にするのが有利である。
【００２１】選別および培養は、ｐＨ値５〜９、好まし
くは６〜８の条件下に行なうのが有利である。 選別お
よび培養の際の温度は、１５〜５０℃、好ましくは２５
〜４０℃が有利である。
【００２２】通常、選別および培養は鉱物塩培養基中、
好ましくは表１にその構成を示す鉱物塩培養基中で行な
う。
【００２３】６５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ650）
が好適な値０．５〜１００に達したら、微生物を当業者
には通常の方法により収穫するか、あるいは基質の窒素
複素環式カルボン酸を微生物に直接与えることにより、
本来の変換（生物変換）を行なうことができる。 本来
の生物変換は、当業者には通常の方法により、非成長細
胞で行なう。
【００２４】一般式ＩＩの基質としては、たとえばニコ
チン酸、ピラジンカルボン酸またはそれらのハロゲン化
された、またはＣ1〜Ｃ4アルキル化された誘導体を使用
することができる。
【００２５】ハロゲン化ニコチン酸誘導体またはピラジ
ンカルボン酸誘導体として、好ましくは６−クロロニコ
チン酸、５，６−ジクロロニコチン酸および５−クロロ
ピラジンカルボン酸をヒドロキシル化する。
【００２６】Ｃ1〜Ｃ4ピラジンカルボン酸誘導体として
は、好ましくは５−メチルピラジンカルボン酸をヒドロ
キシル化する。
【００２７】生物変換には、基質を連続的に、または一
度に加えることができる。 基質は、培養基中の基質の
濃度が１０重量％、好ましくは７重量％を超えないよう
に加えるのが有利である。
【００２８】生物変換用の培養基としては、当業者には
一般的な培養基を使用することができる。 好ましく
は、生物変換を低分子リン酸塩緩衝液中で行なう。
【００２９】通常、生物変換は６５０ｎｍにおける光学
密度（ＯＤ650）が０．５〜１００、好ましくは５〜５
０である微生物懸濁液で行なう。
【００３０】生物変換は、温度１５〜５０℃、好ましく
は２５〜３５℃、ｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６．５〜
７．５で行なう。
【００３１】５時間〜３日間の通常の変換期間の後、ヒ
ドロキシル化された式Ｉの生成物を当業者には一般的な
方法により、たとえば細胞を含まない上澄み液を酸性化
することにより分離することができる。
【００３２】この方法により製造された、一般式
【００３３】
【化８】
【００３４】［式中、Ｘが窒素原子を意味する場合、Ｒ
1およびＲ2は、同一であるかまたは異なるものであっ
て、水素原子、ハロゲン原子またはＣ1〜Ｃ4アルキル基
を意味するが、ただしＲ1およびＲ2が同時に水素原子を
意味することはなく、ＸがＣＨ官能基を意味する場合、
Ｒ1およびＲ2はハロゲン原子を意味する。］のヒドロキ
シ−窒素複素環式カルボン酸は、文献には報告されてい
ない。
【００３５】これらの新規な化合物の好ましい代表例
は、５，６−ジクロロ−２−ヒドロキシニコチン酸、３
−ヒドロキシ−５−メチルピラジンカルボン酸および３
−ヒドロキシ−５−クロロピラジンカルボン酸である。
【００３６】
【実施例１】６−メチルニコチン酸を利用する微生物の分離 ３００ｍｌの三角フラスコに６−メチルニコチン酸１ｍ
ｍｏｌを含む鉱物塩培養基（表１）１００ｍｌを入れ、
ロンザＡＧ，ヴィスプ，スイス．の浄化設備から得た浄
化スラッジ１０ｍｌ、またはロンザ・ヴェルク，ヴィス
プから得た土壌試料を加え、静止状態で３０℃で培養し
た。 １０日後、いくつかの培養基中に２−ヒドロキシ
−６−メチルニコチン酸が存在することが、分光分析に
より確認された。 これらの培養基を何回も新しい鉱物
塩培養基中に接種した。 その後、２−ヒドロキシ−６
−メチルニコチン酸を形成する細胞の懸濁液を、１．６
％（ｗ／ｖ）寒天を含む同じ培養基上に塗布した。 続
いてこれらの寒天皿を、３０℃で、４％Ｏ2および９６
％Ｎ2を含む雰囲気中で培養した。 その後、個々のコ
ロニーを液体培養基中に移し、静止培養した。 標識Ｋ
ｉ１０１（ＤＳＭ６９２０）を有する細菌種は、６−メ
チルニコチン酸で成長する際に２−ヒドロキシ−６−メ
チルニコチン酸を形成した。
【００３７】
【実施例２】ニコチン酸の、２−ヒドロキシニコチン酸への微生物酸
化 標識Ｋｉ１０１（ＤＳＭ６９２０）を有する微生物を、
鉱物塩培養基（表１）８００ｍｌ中、６−メチルニコチ
ン酸８ｍｍｏｌを加え、３０℃で、１リットルのフェル
ンバッハフラスコ中で、振とう装置上、１００ｒｐｍで
培養した。 接種物は５％（ｖ／ｖ）であった。 ５日
後、ＯＤ650は約０．５になった。 その後、細胞を収
穫し、５０Ｍ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０で１回洗浄
した。続いてそれらの細胞を、ニコチン酸ナトリウム塩
２００ｍｇ（１．３８ｍｍｏｌ）を含む５０ｍＭ−リン
酸塩緩衝液、ｐＨ７．０、２０ｍｌ中に再分散させた。
ＯＤ650は２０になった。 振とう装置上、３０℃で６
時間培養の後、薄層クロマトグラフィーによりニコチン
酸はもはや検出されなくなった。 その後バイオマスを
遠心分離し、上澄み液をｐＨ２．５に酸性化して２−ヒ
ドロキシニコチン酸を沈殿させた。 1Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ
ＭＳＯ）分析により、分離された生成物中に汚染物は全
く確認されなかった。 ニコチン酸に対して収率７２％
に相当する、合計１４０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の２−ヒド
ロキシニコチン酸を分離することができた。
【００３８】 表１鉱物塩培養基原液 原溶液１： ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ １５６．０ｇ ＮＨ4Ｃｌ １０．０ｇ Ｋ2ＳＯ4 １．２ｇ ＫＯＨでｐＨを ７．０に調節 蒸留水 ５００．０ｍｌ 原溶液２： ｐ−アミノ安息香酸 ８．０ｍｇ Ｄ−ビオチン ２．０ｍｇ ニコチン酸 ２０．０ｍｇ Ｃａ−Ｄ−パントテン酸塩 １０．０ｍｇ ピリドキサール塩酸塩 ３０．０ｍｇ 二塩化チアミン ２０．０ｍｇ シアノコバラミン １０．０ｍｇ 蒸留水 １００．０ｍｌ、滅菌濾過 原溶液３： ＨＣｌ（３７％） ７．０ｍｌ ＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏ １．５ｇ ＺｎＣｌ2 ０．０７ｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ０．１ｇ Ｈ3ＢＯ3 ０．００６ｇ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．１９ｇ ＣｕＣｌ2・７Ｈ2Ｏ ０．００２ｇ ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．０２４ｇ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．０３６ｇ 蒸留水 １０００．０ｍｌ、オートクレーブ処理 １２１°、２０分間 原溶液４： ＮａＯＨ ０．５ｇ Ｎａ2ＳｅＯ3・５Ｈ2Ｏ ０．００３ｇ Ｎａ2ＷＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．００４ｇ 蒸留水 １０００．０ｍｌ、オートクレーブ処理 １２１°、２０分間 原溶液５： ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ４０．０ｇ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ５．０ｇ 蒸留水 ２００．０ｍｌ、オートクレーブ処理 １２１°、２０分間 ６−メチルニコチン酸（５００ｍＭ） ６−メチルニコチン酸ナトリウム塩 ８０．０ｇ 蒸留水 １０００．０ｍｌ、オートクレーブ処理 １２１°、２０分間 成長培養基１０ｍＭ ６−メチルニコチン酸 溶液１ ２５．０ｍｌ ６−メチルニコチン酸 ２０．０ｍｌ 蒸留水 １０００．０ｍｌ、オートクレーブ処理 １２１°、２０分間 滅菌後、 溶液２ ０．５ｍｌ 溶液３ １．０ｍｌ 溶液４ １．０ｍｌ 溶液５ ０．５ｍｌを加えた。
【００３９】実施例３〜７ 実施例３〜７は実施例２と同様に行なった。 それらの
結果を表２に示す。
【００４０】 表２ 実施 出発物質 濃度 OD650 時間 生成物 収率例 nm [h] ３ 6-クロロニコチン酸 1%(w/v) 20 16 6-クロロ-2-ヒドロ 70% ナトリウム塩 キシニコチン酸 (分離) ４ 5,6-ジクロロニコ チン酸ナトリウム塩 1%(w/v) 20 16 5,6-ジクロロ-2- 20% ヒドロキシニコ (分析) チン酸 ５ ピラジンカルボン酸 0.3% 5 24 3-ヒドロキシピラ 70% ナトリウム塩 (w/v) ジンカルボン酸 (分析) ６ 5-メチル-ピラジン 0.3% 5 24 3-ヒドロキシ-5- 80% カルボン酸-ナトリ (w/v) メチル-ピラジン (分析) ウム塩 カルボン酸 ７ 5-クロロ-ピラジン 0.3% 5 24 3-ヒドロキシ-5- 50% カルボン酸ナトリ (w/v) クロロ-ピラジン (分析) ウム塩 カルボン酸 実施例６に対する分析データ （３−ヒドロキシ−５−メチル−ピラジンカルボン酸）1 Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ） ２．４，ｓ；２．６，ｓ；３．８，ｓ；７．８，ｓ13 Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，１００．５ＭＨｚ）δ（ｐｐ
ｍ） ２０，ｔ；４０，ｍ；１３０，ｓ；１３４，ｓ；１５
５，ｓ；１６４，ｓ；１７０，ｓ実施例７に対する分析データ （３−ヒドロキシ−５−クロロ−ピラジンカルボン酸）1 Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏおよびジオキサン，４００ＭＨｚ）
δ（ｐｐｍ） ３．８，ｓ；４．７，ｓ；８．０，ｓ13 Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ2Ｏおよびジオキサン，１００．５Ｍ
Ｈｚ）δ（ｐｐｍ） １３２，ｓ；１３３，ｓ；１４５，ｓ；１４９，ｓ；１
６４，ｓ；１７２，ｓ．
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 アンドレアス ティンシャート スイス国 カントン・ヴァリス ブリック クローネンガッセ ４ (72)発明者 クラウス ハインツマン スイス国 カントン・ヴァリス ヴィスパ ーターミネン ヴィーラシュトラーセ（番 地なし)

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式 【化１】 ［式中、Ｒ1およびＲ2は、同一であるかまたは異なるも
    のであって、水素原子、ハロゲン原子またはＣ1〜Ｃ4ア
    ルキル基を意味し、Ｘは窒素原子またはＣＲ3官能基を
    意味し、Ｒ3は水素原子またはハロゲン原子を意味す
    る。］のヒドロキシ−窒素複素環式カルボン酸またはそ
    れらの可溶性塩を製造するための微生物学的方法におい
    て、基質として、一般式 【化２】 ［式中、Ｒ1、Ｒ2およびＸは上記の意味を有する。］の
    窒素複素環式カルボン酸またはそれらの可溶性塩を、６
    −メチルニコチン酸を利用する特殊なヒドロキシラーゼ
    を有する微生物により、式Ｉの物質に変換することを特
    徴とする方法。
  2. 【請求項２】 基質として、一般式 【化３】 ［式中、Ｒ1およびＲ2は、同一のものであるかまたは異
    なるものであって、水素原子、塩素原子またはメチル基
    を意味し、Ｘは窒素原子またはＣＨ官能基を意味す
    る。］の窒素複素環式カルボン酸を使用することを特徴
    とする請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 変換を標識Ｋｉ１０１（ＤＳＭ６９２
    ０）の微生物またはそれらの子孫および突然変異体によ
    り行なうことを特徴とする請求項１または２の方法。
  4. 【請求項４】 培養基中の基質の濃度が１０重量％を超
    えないように、基質を連続的に、または一度に加えて変
    換を行なうことを特徴とする請求項１〜３のいずれかの
    方法。
  5. 【請求項５】 変換を、温度１５〜５０℃、ｐＨ５〜９
    で行なうことを特徴とする請求項１〜４のいずれかの方
    法。
  6. 【請求項６】 唯一の炭素、窒素およびエネルギー供給
    源として６−メチルニコチン酸を、２−ヒドロキシ−６
    −メチルニコチン酸を経由して利用するように選別され
    たことを特徴とする微生物。
  7. 【請求項７】 標識Ｋｉ１０１（ＤＳＭ６９２０）を有
    することを特徴とする請求項６の微生物ならびにそれら
    の子孫および突然変異体。
  8. 【請求項８】 一般式 【化４】 ［式中、Ｘが窒素原子を意味する場合、Ｒ1およびＲ
    2は、同一であるかまたは異なるものであって、水素原
    子、ハロゲン原子またはＣ1〜Ｃ4アルキル基を意味する
    が、ただしＲ1およびＲ2が同時に水素原子を意味するこ
    とはなく、ＸがＣＨ官能基を意味する場合、Ｒ1および
    Ｒ2はハロゲン原子を意味する。］のヒドロキシ−窒素
    複素環式カルボン酸。
  9. 【請求項９】 ５，６−ジクロロ−２−ヒドロキシニコ
    チン酸。
  10. 【請求項１０】 ３−ヒドロキシ−５−メチルピラジン
    カルボン酸。
  11. 【請求項１１】 ３−ヒドロキシ−５−クロロピラジン
    カルボン酸。
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