JPH06201671A - クロマトグラフィー用吸着担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 糖類の分離・精製に使用されるアフィニティ
クロマトグラフィー用吸着担体に望まれる性能（広範
囲のｐＨ領域及び温度領域で安定、粒子径が十分小さ
いにも拘らず機械的強度が高い、リガンドの結合が容
易で固定化可能容量が大きい、生物学的汚染に耐えら
れる）を十分に備え、しかもこれら糖類の良好な分離・
精製を行うことができる吸着担体を提供する。 【構成】 糖類の分離あるいは精製に使用されるクロマ
トグラフィー用吸着担体であって、吸着担体当たり、ア
ルコール性水酸基１．２〜１２．０ｍｍｏｌ／ｇ、含水
量０．５〜３．０ｇ／ｇ、比表面積１０〜８００ｍ^２／
ｇを有する架橋共重合体の、前記水酸基に結合基を介し
て共有結合されたレクチン０．００５〜２００μｍｏｌ
／ｇを含有する多孔性の架橋共重合体からなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、糖類の分離・精製に使
用される高速液体アフィニティクロマトグラフィーなど
のアフィニティクロマトグラフィー用吸着担体に関し、
リガンドとしてレクチンを用いた吸着担体に関する。

【０００２】

【従来の技術】クロマトグラフィーの一種であるアフィ
ニティクロマトグラフィーは、生体内で行われている一
般化学触媒の物理的あるいは化学的親和力のみによって
は到達しがたい生物学的親和力を有する親和性吸着担体
を利用したものであって、種々の化合物の混在下でも生
体物質の分離・精製を行うことができる。また、上記の
吸着担体を高速液体クロマトグラフィー用の充填剤に利
用したものが、高速液体アフィニティクロマトグラフィ
ーである。

【０００３】上記のアフィニティクロマトグラフィー用
吸着担体は、例えば、生物学的親和力を持ったリガンド
を、該リガンドの特性を失うことなしに、不溶性支持体
に結合基（スペーサー）を介して結合・固定化させたも
のであって、特定の化合物のみを選択的に取り出すこと
ができるという性質を有している。

【０００４】例えば、人体に起きる疾患の中には、ＤＮ
Ａに欠陥があるために引き起こされるものがあり、この
ような患者の生体物質には、健常者にはみられないもの
が存在する。一例として、細胞表面には無数の糖鎖があ
り、また生体のタンパク質の多くは糖タンパク質として
存在するが、癌患者は健常人にはみられない糖鎖を持
ち、また慢性リウマチ患者の免疫グロビンは健常者のそ
れとは大きく違っているなどが知られている。

【０００５】このような患者の臨床診断の方法として、
吸着担体（充填剤）のリガンドとしてレクチンを固定化
した高速液体アフィニティクロマトグラフィーを利用す
る方法が、近年増加している。レクチンは、糖鎖と特異
的な相互作用を持つことが知られている一群のタンパク
質の総称であり、上に述べたような診断機器としてレク
チンを利用した高速液体アフィニティクロマトグラフィ
ーは、非常に有効なものであると思われる。このとき、
クロマトグラフィー用充填剤の主成分である支持体に望
まれる性能として、広範囲のｐＨ領域および温度領域
で安定であること、粒子径が十分小さいにもかかわら
ず機械的強度が高いこと、リガンドの結合が容易で固
定化可能容量が大きいこと、生物学的汚染に耐えられ
ること、などが挙げられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来より、このような
性能をかなり満足するとされている支持体として、セル
ロース、アガロースなどが用いられてきた。しかし、こ
れらの支持体は、特に機械的強度が不足しているため
に、これらの支持体による吸着担体をカラムに充填した
場合、移動相を高速で流すことができず、分離に時間が
かかることや、寿命も短いなどの欠点がある。また、最
近用いられているシリカビーズは、機械的強度は十分満
足できるが、アルカリ条件下では使用できないことや、
カラム性能の目安である理論段数が低いため、リガンド
にレクチンなどを選び、分離・精製を行うにあたり、大
きな制約があるという問題があった。

【０００７】本発明は、前記した従来の支持体が有して
いる欠点を克服して、糖類の分離・精製に使用されるア
フィニティクロマトグラフィー用の支持体に望まれる性
能を十分に備え、しかもリガンドとしてレクチンを用い
たときに、これら糖類の良好な分離・精製を行うことが
できるクロマトグラフィー用吸着担体を提供することを
目的とする。

【０００８】

【目的を達成するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するために研究を重ねた結果、（１）特開昭６０−
２５７８３６号公報に開示されている全多孔性活性化担
体のうちの特定のものが、レクチンの支持体として有効
であること、（２）しかも、この特定の担体にレクチン
を固定化させたものを吸着担体とするアフィニティクロ
マトグラフィーによれば、従来以上に糖類、特に単糖類
の分離・精製が極めて効果的に進行すること、の知見を
得て、本発明を開発するに到った。

【０００９】すなわち、本発明の吸着担体は、糖類の分
離・精製に使用されるクロマトグラフィー用吸着担体で
あって、吸着担体当たり、アルコール性水酸基１．２〜
１２．０ｍｍｏｌ／ｇ、含水量０．５〜３．０ｇ／ｇ、
比表面積１０〜８００ｍ^２／ｇを有する架橋共重合体
の、上記水酸基に結合基を介して共有結合されたレクチ
ン０．００５〜２００μｍｏｌ／ｇを含有する多孔性の
架橋共重合体からなることを特徴とする。

【００１０】本発明の吸着担体は、上記した全多孔性活
性化担体のうち特定のもの（架橋共重合体）を支持体と
し、この支持体のアルコール性水酸基に、リガントとし
てのレクチンを、結合基を介して共有結合させたもので
ある。

【００１１】このような構成の本発明の吸着担体は、ア
ルコール性水酸基を吸着担体当たり１．２〜１２．０ｍ
ｍｏｌ／ｇの範囲で含むことにより、親水性を有し、充
填剤として用いたときに水中でほとんどの水溶性物質に
ついて疎水的な吸着および分配を示さない。アルコール
性水酸基が１．２ｍｍｏｌ／ｇ未満であると、物質の吸
着選択性が低下し、１２．０ｍｍｏｌ／ｇより多いと、
物質の吸着選択性が低下するとともに、機械的強度も低
下する。水酸基の量は、より好ましくは２．０〜１０．
０ｍｍｏｌ／ｇの範囲にあるものが適している。なお、
水酸基の量は、吸着担体をピリジン溶媒中で無水酢酸と
反応させ、水酸基と反応して消費した無水酢酸の量、ま
たは吸着担体の重量変化によって求めることができる。
このとき、吸着担体（乾燥重量）１ｇが、１ｍｏｌの無
水酢酸と反応したときの水酸基の量を１ｍｏｌ／ｇとす
る。

【００１２】前述した従来のセルロースやアルガロース
などを支持体とする吸着担体は、保水量が多く、機械的
強度が小さい。この傾向は、ポアサイズが大きくなるほ
ど顕著であったが、本発明の吸着担体では、ポアサイズ
によらず、含水量を０．５〜３．０ｇ／ｇの範囲にする
ことにより、十分な吸着性能と機械的強度を有すること
ができる。保水量が０．５ｇ／ｇ未満では、吸着性能が
低下し、３．０ｇ／ｇを超えると、機械的強度が低下す
る。吸着担体の保水量は、吸着担体を水中で十分膨潤さ
せたのち、遠沈管（遠心分離器用沈降管）で表面の付着
水を遠心分離後、乾燥し、乾燥前後の重量変化から求め
られる。

【００１３】吸着担体の比表面積は、１０〜８００ｍ^２
／ｇの範囲とする。１０ｍ^２／ｇ未満では、吸着性能が
低下し、８００ｍ^２／ｇを超えると、機械的強度が低下
してしまう。比表面積の測定は、吸着担体を充分乾燥し
た後、窒素ガスによるＢＥＴ法により求められる。

【００１４】本発明の吸着担体の平均粒径および形状
は、特に制限されないが、高速液体アフィニティクロマ
トグラフィー用充填剤として用いる場合は、平均粒径は
３〜３０μｍ、好ましくは６〜１８μｍであり、形状は
好ましくは球状である。平均粒径は、市販の粒径測定器
によって測定することができる。

【００１５】また、本発明の吸着担体に、結合基（スペ
ーサー）を介して共有結合により固定化するレクチン
は、０．００５〜２００μｍｏｌ／ｇの範囲の含有量と
する。０．００５μｍｏｌ／ｇ未満では、親和力を発揮
することが難しく、２００μｍｏｌ／ｇを超えると、レ
クチン同士の立体障害により吸着能の低下がみられる。

【００１６】本発明の吸着担体は、架橋共重合体よりな
り、この架橋構造は特に限定されない。また、吸着担体
を形成する全単量体単位中の架橋性単量体単位の割合
は、数１の式で表される範囲にあるのが好ましい。

【００１７】

【数１】０．２５≦ｎａ／（ｂ＋ｎａ）≦０．４

【００１８】数１の式において、ａは架橋性単量体単位
のモル分率、ｂは吸着担体中の架橋性単量体以外の単量
体単位のモル分率、ｎは架橋性単量体１分子が有する重
合可能な官能基の数を表す。

【００１９】次に、以上の構成からなる本発明の吸着担
体の製造法の一例を説明する。例えば、カルボン酸ビニ
ルエステルとトリアジン環を有する架橋性単量体とから
なる共重合体のエステル基を、ケン化反応またはエステ
ル交換反応させて、該エステル基の約１５〜７５％を水
酸基にする。この水酸基に、エピクロルヒドリンなどの
スペーサー分子を介して、コンカナバリンＡなどのレク
チンを、共有結合させればよい。

【００２０】ここで、カルボン酸ビニルエステルとは、
重合可能なカルボン酸ビニルエステル基を含む化合物を
言い、本発明では、炭素数４〜７の低級カルボン酸ビニ
ルエステルの１種または２種以上を用いることができ
る。これらのうち炭素数が少ないものが特に好ましく用
いられ、その例として酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル
などを挙げることができる。一方、トリアジン環を有す
る架橋性単量体としては、トリアリルイソシアヌレー
ト、トリアリルシアヌレートなどを用いることができ
る。

【００２１】これらの単量体から共重合体を得るための
重合反応は、通常の重合方法で行うことが可能である
が、懸濁重合を用いるのが好ましい。このとき使用され
る有機溶媒は、重合反応に不活性で、水に不溶または溶
けにくい溶媒で、単量体を溶解するものであればよく、
具体的には、トルエン、酢酸ｎ−ブチル、ブタノールな
どが挙げられる。使用量は、単量体成分と有機溶媒の合
量の２０〜７０ｗｔ％、好ましくは２５〜５０ｗｔ％の
範囲が好ましい。なお、有機溶剤は、生成する架橋共重
合体の孔径調節にも役立ち、生成架橋共重合体に対し膨
潤性の小さい有機溶媒を用いると、孔径の大きい架橋共
重合体を得ることができ、膨潤性の大きい有機溶媒を用
いると、孔径の小さい架橋共重合体を得ることができ
る。

【００２２】また、上記の重合反応の際に用いられる重
合開始剤については、特に制限はなく、任意のものでよ
く、例えば、過酸化ベンゾイルなどの過酸化物、２，
２′−アゾビスイソブチロニトリルなどのカップリング
性のないアゾ化合物などが挙げられる。

【００２３】重合反応によって得られた架橋共重合体の
エステル基を水酸基に変換する際のケン化反応およびエ
ステル交換反応は、通常の方法で行うことができる。例
えば、架橋共重合体を、水、アルコール、水とアルコー
ルとの混合溶液などに溶解させた溶液と、酸またはアル
カリとを混合して行えばよい。このときの反応率は、反
応溶媒、反応時間、温度などによって制御することが可
能であり、これらの条件を選ぶことにより、反応率を約
１５〜７５％（すなわち、架橋共重合体のエステル基が
水酸基に変換する割合）に調整する。

【００２４】架橋共重合体にスペーサー分子を介してリ
ガンドを共有結合させるには、上記のケン化反応または
エステル交換反応によって変換された水酸基にスペーサ
ー分子を反応させて共有結合させ、該スペーサー分子に
リガンドを固定化するか、あるいは先にスペーサー分子
とリガンドとを反応させておき、この後スペーサー分子
と水酸基とを共有結合させて固定化してもよい。

【００２５】スペーサー分子としては、通常用いられて
いるものが使用でき、例えば、エピクロロヒドリン、エ
ポキシシラン、１，４−ブタンジオールジグリシジルエ
ーテルなどを挙げることができる。スペーサー分子の長
さは、特に制限はないが、メチレン基相当でＣ２〜Ｃ１
０のものが好ましく、この範囲から、固定化しようとす
るリガンドの種類などにより適当な長さのスペーサー分
子を選択すればよい。

【００２６】また、スペーサー分子として選択したもの
によっては、常法に従って官能基を変化させてからレク
チンと固定化反応を行う。例えば、スペーサー分子とし
てエピクロルヒドリンを用いるときは、水酸化ナトリウ
ムや水酸化カルシウムなどのアルカリ水溶液中でエピク
ロルヒドリンと架橋共重合体を反応させることにより固
定化した後、固定化されたエピクロルヒドリンのエポキ
シ基をジオール基、アルデヒド基などに変換し、これら
の官能基とレクチンとを反応させる。

【００２７】レクチンとの反応方法については、特別に
制限はなく、常法によって固定化することができる。こ
のときの条件も特に制限はなく、固定化しようとするレ
クチン、スペーサー分子の種類に応じて、温度、時間、
レクチンと架橋共重合体との割合などを、任意に選ぶこ
とができる。

【００２８】レクチンの種類についても、特に制限はな
く、例えば、コンカナバリンＡ、ヒママメレクチン、ダ
イズレクチン、エンドウマメレクチンなどの植物レクチ
ン、カブトガニレクチン、カタツムリレクチンなどの動
物レクチンなどをあげることができる。

【００２９】以上のようにして調製される本発明のクロ
マトグラフィー用吸着担体は、マンノース、グルコー
ス、ガラクトース、フルクトース、ラムノースなどの単
糖類、マルトース、サッカロース、ラクトースなどの多
糖類の分離・精製に用いられるが、分離度を大きく向上
させることができる点で、単糖類の分離・精製に好適に
用いられる。

【００３０】

【実施例】

〔吸着担体の製造例〕 実施例１ 酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレート４
７．５ｇ、ヘプタン２０ｇ、デカリン６０ｇ、酢酸ｎ−
ブチル４０ｇ、および重合開始剤として２，２′−アゾ
ビスイソブチロニトリル３．５ｇからなる均一混合液
を、ポリビニルアルコール１．５ｗｔ％を溶解した水１
０００ミリリットル（以下、リットルを「Ｌ」と記し、
ミリリットルを「ｍＬ」と記す）に混合し、激しく攪拌
しながら、６０℃で２０時間保持し、次に７５℃で４時
間保持することにより、懸濁重合を行った。得られた共
重合体を、ろ過、水洗し、アセトンによる抽出を行った
後、水酸化ナトリウム６０ｇを溶解したメタノール２０
００ｍＬと混合し、攪拌しながら、２０℃で２４時間保
持することにより、ケン化反応を行った。得られた粒状
共重合体を、ろ過、水洗し、乾燥した。

【００３１】上記の粒状共重合体２．５ｇと、エピクロ
ルヒドリン１０ｍＬ、１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液６ｍ
Ｌ、水６ｍＬとを混合し、超音波照射下で３分間攪拌
し、次いで５０℃で２時間攪拌することにより、エピク
ロルヒドリンを結合させ、ろ過、水洗した。得られた化
合物を、０．０１Ｎ塩酸溶液５０ｍＬに混合し、６０℃
で１時間攪拌することにより、エポキシ基を開環させて
ジオールとし、ろ過、水洗した後、酢酸３０ｍＬ、水５
ｍＬ、メタ過よう酸ナトリウム２ｇを混合して、２５℃
で２時間攪拌し、ろ過、水洗し、アセトン洗浄を行い、
ジオールをアルデヒド基にした。

【００３２】次に、硫酸ナトリウム０．２５Ｍ、硫酸マ
ンガン０．５ｍＭ、硫酸カルシウム０．５ｍＭを含む５
０ｍＭトリス−硫酸緩衝液（ｐＨ７．６）を１Ｌつくり
（これをＡ液とする）、この溶液５ｍＬに、上記の反応
で活性基をアルデヒド基にした活性担体を混合し、超音
波照射下で５分間攪拌した。この溶液と、Ａ液１ｍＬに
シアノトリヒドロホウ酸ナトリウムを溶かした溶液と、
Ａ液３ｍＬにコンカナバリンＡ１５０ｍｇを溶かした溶
液との３つの溶液を混合し、４℃で４８時間攪拌した
後、１Ｍ硫酸溶液でｐＨを７に調整し、水酸化ホウ素ナ
トリウム５０ｍｇを加え、さらに４℃で２時間攪拌し、
コンカナバリンＡを固定化し、ろ過、水洗、乾燥した。

【００３３】以上のようにして得られた本発明の吸着担
体は、平均粒子径が９．０μｍで、吸着担体当たり、水
酸基密度が５ｍｍｏｌ／ｇ、保水量が２．０ｇ／ｇ、比
表面積が３８ｍ^２／ｇであった。また、コンカナバリン
Ａを２５ｍｇ／ｇ固定化していることが、未反応回収コ
ンカナバリンＡの量から確かめられた。

【００３４】比較例１ 酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレート１０
ｇ、ヘプタン１２０ｇ、酢酸エチル１２０ｇ、および重
合開始剤として２，２′−アゾビスイソブチロニトリル
３．５ｇからなる均一混合液を、実施例１と同様にし
て、懸濁重合、ケン化反応を行った後、実施例１と同様
にして、スペーサー、コンカナバリンＡの固定化を行っ
た。

【００３５】以上のようにして得られた比較の吸着担体
は、平均粒子径が８０μｍで、吸着担体当たり、水酸基
密度が１０ｍｍｏｌ／ｇ、保水量が４．０ｇ／ｇ、比表
面積が５ｍ^２／ｇであった。また、コンカナバリンＡを
８ｍｇ／ｇ固定化していることが、未反応回収コンカナ
バリンＡの量から確かめられた。

【００３６】〔マンノースまたはガラクトースの分離・
精製例〕 例１ 実施例１および比較例１で得られた本発明の吸着担体と
比較吸着担体とを、それぞれ、内径４．６ｍｍ、長さ１
５０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、５０ｍＭトリ
ス硫酸緩衝液（ｐＨ７．０）を移動相として、室温、流
速０．５ｍＬ／ｍｉｎで、ＵＤＰ−マンノースとＵＤＰ
−ガラクトースとを、それぞれ、２５μｇ注入した。検
出器としてＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所（株））を用
い、検出波長２６１ｎｍにて、ＵＤＰ−マンノースとＵ
ＤＰ−ガラクトースとについての理論段数を、それぞれ
測定した。この結果を、表１示す。また、上記の各吸着
担体を充填したカラムを使用して得られた結果を、図１
および図２に示す。図１が、実施例１で得られた本発明
の吸着担体を充填したカラムによる結果であり、図２は
比較例１で得られた比較吸着担体を充填したカラムによ
る結果である。

【００３７】表１より本発明の吸着担体と比較の吸着担
体を比べた結果、理論段数において２〜３倍の差がみら
れ、これと図１，２とを合わせて考慮すれば、本発明の
吸着担体によれば、カラム性能が優れていることが明白
である。

【００３８】

【表１】

【００３９】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明の吸着担体
は、例えば高速液体アフィニティクロマトグラフィー用
充填剤として使用し、ＵＤＰ−マンノースまたはＵＤＰ
−ガラクトースの分離・精製を行う場合、従来の吸着担
体に比べ、同一条件において理論断数が極めて高くな
り、分離度を大幅に向上することができ、目的化合物の
より正確な分離・精製を行うことができる。しかも、本
発明の吸着材によれば、この種の吸着体に要求される
広範囲のｐＨ領域および温度領域で安定であること、
粒子径が十分小さいにもかかわらず機械的強度が高いこ
と、リガンドの結合が容易で固定化可能容量が大きい
こと、生物学的汚染に耐えられることの全てを、十分
満足することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の吸着担体を充填したカラムによる結果
を示す。

【図２】比較の吸着担体を充填したカラムによる結果を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大野 陽一 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 糖類の分離あるいは精製に使用されるク
   ロマトグラフィー用吸着担体であって、 吸着担体当たり、アルコール性水酸基１．２〜１２．０
   ｍｍｏｌ／ｇ、含水量０．５〜３．０ｇ／ｇ、比表面積
   １０〜８００ｍ^２／ｇを有する架橋共重合体の、 前記水酸基に結合基を介して共有結合されたレクチン
   ０．００５〜２００μｍｏｌ／ｇを含有する多孔性の架
   橋共重合体からなることを特徴とするクロマトグラフィ
   ー用吸着担体。