JPS6361619B2

JPS6361619B2 -

Info

Publication number: JPS6361619B2
Application number: JP56207169A
Authority: JP
Priority date: 1981-12-23
Filing date: 1981-12-23
Publication date: 1988-11-29
Also published as: JPS58109504A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は粒状架橋共重合体から成る高速液体ク
ロマトグラフイー用充填剤に関し、更に詳しく
は、主として水系の溶媒を使用した高度の分離又
は分析に適する高速液体クロマトグラフイー用充
填剤に関する。液体クロマトグラフイーは、固定相つまり充填
剤と、液体からなる移動相に溶解している被分離
成分との間の何らかの相互作用により溶出速度に
差が生じることを利用した分離又は分析方法であ
る。なかでも小粒径で機械的強度の大きい充填剤
を用い、溶媒を高速で通液することで高度な分離
又は分析を短時間に行う方法を一般に高速液体ク
ロマトグラフイー（以下HLCという）といい
種々の分野で用いられている。 HLCの一種にゲルパーミエーシヨンクロマト
グラフイー（以下GPCという）があり、本発明
の粒状架橋共重合体はGPCを主たる分離原理と
する水溶媒系のHLC用充填剤として適する。 GPCは充填剤（以下単にゲルという）内のポ
アより小さい分子サイズの成分はその大きさに応
じてゲル内へ浸透し、大きい成分はゲルの外を素
通りする原理を利用して分子サイズの大きい成分
から溶媒と共に順次溶出させる方法である。 GPCは分離又は分析の際に用いる溶媒によつ
て有機溶媒系と水溶媒系に分類される。このうち
水溶媒系のGPCは水溶媒性合成高分子、糖類の
ほかにアミノ酸、蛋白質等の主体成分の分離、分
析に用いることができ、吸着や分配を利用した液
体クロマトグラフイーにくらべて、サンプルの前
処理や分析中の溶媒交換が不要であり、得られた
情報量も多いことから簡便な分析方法として生化
学、医学分野において注目を集めている。これまで水溶媒系GPC用ゲルの製法として、
デキストランをエピクロルヒドリンで架橋する方
法、酢酸ビニルと１，４―ブタンジオールジビニ
ルエーテルの共重合体をケン化する方法、あるい
は酢酸ビニルとジエチレングリコールジメタクリ
レートの共重合体をケン化した後、更にエピクロ
ルヒドリンで架橋する方法等が知られているが、
得られるゲルの機械的強度の低さや製造法の複雑
さに基づくゲル物性の再現性の悪さ等の問題があ
る。更にまた、酢酸ビニルとトリアジン環構造を有
する架橋剤よりなる共重合体を、少なくとも赤外
線吸収スペクトルの1730^-1cmに見られるエステル
の吸収が完全に消失するまでケン化することによ
り硬質ポリビニルアルコールゲルが得られること
も知られている。（特開昭55−58203号公報参照）
しかしながら、本発明者らの研究によるとこのよ
うな方法で得られたゲルは、機械的強度が必ずし
も十分大きいとはいえず、機械的強度を特に必要
としない、粒径の大きいゲルが用いられる工業的
分離、例えば高分子水溶液の脱塩等に対しては用
い得るかもしれないが、小粒径例えば平均径
20μm以下のゲルを高圧下で用いる高速GPCに使
用することはできない。水溶媒系高速GPCゲルとして用いるためには、
被分離成分の分子サイズに応じて厳密に制御され
たポアと小粒径で十分な機械的強度を有し、水溶
媒中の被分離成分に対する吸着性が少ないことが
必要である。一般には、ゲルは非イオン性でかつ
親水性の化学構造よりなることが必要で、疎水性
の骨格よりなるゲルは水溶液中の物質を吸着する
ため水溶媒系GPCには用い得ないといわれてい
る。そのため従来のゲルは、前述のように多量の
水酸基を有するものが殆どである。本発明者は水溶媒系高速GPCに適するものと
して、先にカルボン酸ビニルエステル単量体とイ
ソシアヌレート環を有する架橋性単量体から得ら
れた共重合体のエステル基のモル分率で0.4以上
0.8以下を水酸基に変換せしめたゲルを開発した。
（特願昭55−183703号〔特開昭57−108662号〕明
細書参照。）しかし、本発明者は更に鋭意研究を重ねた結
果、水酸基が更に少ないにもかかわらず、水溶媒
系GPCゲルとして用いることが可能であり、か
つ機械的強度が一段と大きいため、より高流速で
の通液が可能でHLC用充填剤として極めてすぐ
れたゲルを開発し本発明を完成するに到つた。即ち、本発明に従えば、カルボン酸ビニルエス
テル単量体とイソシアヌレート環を有する架橋性
単量体の割合が 0.1≦3b／（ａ＋3b）≦0.4 ここで、ａ：カルボン酸ビニルエステルのモル数ｂ：イソシアヌレート環を有する架橋性単量体
のモル数の範囲にあるカルボン酸ビニルエステル単量体、
イソシアヌレート環を有する架橋性単量体、単量
体を溶解するがカルボン酸ビニルエステル重合体
を溶解しにくい有機溶媒及び重合開始剤を少なく
とも含んで成る混合物を懸濁重合して得られた共
重合体のエステル基のモル分率で0.4未満を水酸
基に変換せしめた水酸基密度が5.1meq／ｇ以下
である粒状架橋共重合体からなる高速液体クロマ
トグラフイー用充填剤が提供される。これまでに酢酸ビニル共重合体よりなるゲルが
アルコールやアセトンを含む有機溶媒中での
GPCに用いられることは公知（W.W.Yau、J.J.
Kirkland他「Modern Size―Exclusion Liquid
Chromatography」171頁Wiley
Interscience1979年）であるが、このような疎水
性の骨格からなるゲルは通常前述の理由により水
溶媒系GPCに用いることはできない。本発明のように水酸基が少ないか又は殆どない
にもかかわらず水溶媒系GPCに用い得るゲルは
これまで殆ど知られておらず、実に驚くべきこと
である。以下本発明を更に詳細に説明する。本発明で用いられるカルボン酸ビニルエステル
とは重合可能なカルボン酸ビニルエステル基を一
つ以上有する化合物のことで、例えば酢酸ビニ
ル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビ
ニル及びピバリン酸ビニルの中から選ばれ、単独
又は二種以上の組合せで用いられる。なかでもこ
の中では比較的親水性があり、重合やエステル交
換又はケン化及び入手の容易な酢酸ビニルやプロ
ピオン酸ビニルが好ましく、酢酸ビニルは特に好
ましい。またエステル基を水酸基に変換せしめる
割合をモル分率で表わした値（ケン化率という）
が0.05未満のゲルを得る場合は特に酢酸ビニルや
プロピオン酸ビニルを用いるのが好ましく、酢酸
ビニルが最も好ましい。次に本発明で用いられるイソシアヌレート環を
有する架橋性単量体とは下記の構造式で表わされ
るものである。（ただしR₁、R₂及びR₃はそれぞれ独立に−CH₂
−CH₂＝CH₂、−CH₂−Ｃ≡CH又は

【式】を示す。）とりわけ、R₁、R₂及びR₃がすべて−CH₂−CH
＝CH₂であるトリアリルイソシアヌレートは酢酸
ビニルとの共重合性が良く、かつエステル交換又
はケン化に対しても安定性が大きいので架橋剤と
して好ましい。全単量体中のイソシアヌレート環を有する架橋
性単量体の割合は特に限定されないが、機械的強
度が特に大きくかつ吸着性の小さいゲルを作る場
合は次式の範囲になるのが良い。 0.1≦3b／（ａ＋3b）≦0.4 ここでａ：カルボン酸ビニルエステルのモル数ｂ：イソシアヌレート環を有する架橋性単量体
のモル数更に、小粒径で機械的強度が大きいゲルを得る
場合は、 0.2≦3b／（ａ＋3b）≦0.4 の範囲にあるのが好ましい。カルボン酸ビニルエステルやイソシアヌレート
環を有する架橋性単量体以外の単量体をゲルの物
性にほとんど影響しない程度に併用し共重合させ
ることは本発明のゲルを得るうえで何ら支障な
い。また本発明ではカルボン酸ビニルエステル単量
体とイソシアヌレート環を有する架橋性単量体と
を懸濁重合させる際に、生成共重合体をポーラス
な構造にするために、単量体を溶解するがカルボ
ン酸ビニルエステル重合体を溶解しにくい有機溶
媒をモノマーと共存させる。単量体を溶解するがカルボン酸ビニルエステル
重合体を溶解しにくい有機溶媒とは、前述のよう
な重合度200以上のカルボン酸ビニルエステルの
重合体の溶解度が３重量％以下である有機溶媒を
いい、例えばオクタン、デカン、シクロヘキサ
ン、デカヒドロナフタレン等の脂肪族炭化水素化
合物、ｎ―ブチルエーテル、ジ―２―エチルヘキ
シルエーテル等のエーテル化合物、あるいはヘプ
タノール、オクタノール、ドデシルアルコール等
のアルコール化合物があげられる。これらの有機
溶媒は単独又は二種以上を組み合わせて用いるこ
とができる。重合して得られる共重合体の孔径あるいは孔径
分布を制御するために、カルボン酸ビニルエステ
ル重合体を溶解する有機溶媒、あるいは単量体混
合液に溶解する有機溶媒、あるいは単量体混合液
に溶解する線状重合体をカルボン酸ビニルエステ
ル重合体を溶解しにくい有機溶媒と併用しても良
い。カルボン酸ビニルエステル重合体を溶解する
有機溶媒とは、例えばベンゼン、トルエン等の芳
香族炭化水素化合物、酢酸エチル、酢酸ブチル、
酢酸アミル等のカルボン酸エステル化合物、メチ
ルイソブチルケトン、ベンジルアルコール等をい
う。また単量体混合液に溶解する線状重合体と
は、単量体と有機溶媒からなる混合液に１重量％
以上溶解する線状重合体をいい、例えばポリ酢酸
ビニルやポリスチレンのことである。これらの有機溶媒や線状重合体を混合して用い
る場合、有機溶媒混合液中のカルボン酸ビニルエ
ステル重合体を溶解しにくい有機溶媒の割合は、
併用する溶媒や線状重合体の種類、あるいは作ろ
うとしている共重合体粒子のポア構造によつて異
なり一概にはいえないが、通常５重量％以上、好
ましくは10重量％以上である。有機溶媒混合液は単量体100重量部に対して通
常は20〜200重量部の範囲で用いられるが、HLC
用ゲルをつくる場合はやや少ない方が良く、例え
ば20〜100重量部の範囲で用いられる。重合に際して用いられる開始剤は、通常の懸濁
重合に用いられる一般的なラジカル重合開始剤で
よく、例えば２，2′―アゾビスイソブチロニトリ
ル、２，2′―アゾビス―（２，４―ジメチルバレ
ロニトリル）等のアゾ系の開始剤や、過酸化ベン
ゾイル、過酸化ラウロイル、ジ―ｔ―ブチルパー
オキサイド又はクメンハイドロパーオキサイド等
の過酸化物系の開始剤を用いることができる。懸濁重合を行う際には、水相にはポリビニルア
ルコールやメチルセルロース等の通常用いられる
有機高分子系の懸濁安定剤を加えておくのがよ
く、必要によりリン酸ナトリウム等のPH緩衝剤を
併用してもよい。懸濁安定剤の種類が量或いは撹
拌速度を変えることによつて、重合によつて得ら
れる粒状共重合体の粒径を変えることができる。
重合によつて得られた粒状共重合体を抽出して線
状重合体、残留単量体あるいは有機溶媒を除いた
後、必要により分級を行なつてそのままHLC用
ゲルとして用いることもできるが通常は更にケン
化又はエステル交換反応を行なう。エステル交換反応又はケン化反応は、水やアル
コール又はその混合液を溶媒として酸又はアルカ
リを用いて行なわれるが、ケン化率が0.4未満に
なるように反応をコントロールしなければならな
い。ケン化率のコントロールは酸やアルカリの
量、反応溶媒、反応温度又は反応時間とケン化率
の関係を事前に把握しておき、その中から条件を
選択することにより行なうことができる。ケン化反応又はエステル交換反応後、得られた
ゲルは必要により分級してHLC用充填剤として
用いることができる。ケン化率が0.05以上0.4未満のときはゲルの吸
着性が少ないため、広範囲の物質のGPC分離又
は分析用ゲルとして用いることができる。またケ
ン化率が0.05未満であつても糖類等は吸着しない
ので被分離物質によつてはGPC分離又は分析に
供し得る。ケン化反応は、重合が終了したのち、粒子を濾
別せずに酸やアルカリを重合液に添加して行つて
も良い。ゲルのケン化率は、原料として用いた単量体の
種類と量比がわかつている場合は、ゲルの水酸基
密度（q_OH）を測定すれば、計算して知ることが
できる。q_OHはゲル単位重量あたりの水酸基の量
をいい、ゲルはピリジン溶媒中で無水酢酸と共に
加熱し、水酸基と反応して消費した無水酢酸の量
又はゲルの重量変化を測定し、これから求めるこ
とができる。乾燥ゲル１ｇが1mmolの無水酢酸
と反応したときのq_OHが1meq／ｇである。また原
料単量体の種類や量が不明な場合は、架橋性単量
体の種類をゲルの赤外線吸収スペクトルから、量
をゲルの窒素の元素分析から求め、エステル基の
種類をゲルの再ケン化により生成するカルボン酸
を同定すれば、同様に。q_OHを測定したのち計算
して求め得る。本発明のゲルの平均粒径（）は通常５〜
1000μmの範囲にある。ただしHLC用ゲルとして
用いる場合は小さい方が好ましく、例えば５〜
20μm、更に好ましくは５〜15μmの範囲にあるの
が良く、特に高分離能を必要とする場合は５〜
12μmの範囲にあるのが好ましい。またアフイニ
テイークロマトグラフイー用担体や、工業規模の
分離用充填剤として用いる場合はHLC用ゲルよ
りも大きい粒径で良い。Dwの測定法はいろいろ
あるが本発明では通常コールターカウンター（米
国コールターエレクトロニクス社）を用いて測定
し、粒径diの表われる頻度をniとすれば次式によ
つて表わされる。＝Σ（ni d⁴ _i／Σ（ni d³ _i）コールターカウンターで測定しにくい大きい粒
径のゲルのDwはハイアツク（米国パシフイツク
サイエンテイフイクカンパニー）等の粒径測定機
器やフルイを用いて同様に求めることができる。液体クロマトグラフイーにおいて充填剤を小粒
径化することにより分離能が向上することは良く
知られている。しかしながら、小粒径のゲルを充
填剤したカラムに溶媒を通液した場合、大粒径の
ゲルを用いた場合にくらべて充填層の圧力損失が
大きくなる。従つて、ゲルの機械的強度が小さい
とゲルが変形又は破壊し、異常に大きい圧力損失
を生じ小粒径のゲルを用いたHLCを行なうこと
はできない。本発明のゲルはエステル交換率をは
じめとする諸特性の制御により機械的強度の改良
に成功したので、小粒径でも高流速又は高圧に耐
えられる。従来、水溶媒系GPCゲルは親水性が大でなけ
ればならないとされており、多量の水酸基を持つ
ものが多い。例えば酢酸ビニルとトリアジン環構
造を有する架橋剤との共重合体から架橋ポリビニ
ルアルコールゲルが得られることは前述のように
公知であるが、十分な親水性をもたせるためには
架橋剤の量を少なくすること（特開昭55−10430
号公報参照）やケン化をほとんど100％行なうこ
と（特開昭55−58203号公報及び同56−151703号
公報参照）が必要とされていた。本発明のゲルも
カルボン酸ビニルエステル単量体とイソシアヌレ
ート環を有する架橋性単量体との共重合体から得
られるが、従来のゲルに比べて架橋剤は多く用い
られ、ゲル中の水酸基は非常に少なく、ほとんど
なくても良い。このように本発明のゲルは必ずし
も親水性が大きいとはいえないが、従来のこの分
野の常識に反して、糖類、ポリエチレングリコー
ル、蛋白質等の水に溶解する多くの物質に対して
水溶媒系GPCによる分離、分析が可能である。
また完全なGPCではなく、GPCと吸着や分配の
作用を併用した分離、分析を行なうつもりであれ
ばより広範囲の物質に対して用い得る。もちろん
吸着や分配を主たる分離原則とするクロマトグラ
フイー用のゲルとしても用い得る。ケン化率が低いにもかかわらず本発明のゲルが
水溶媒系GPCに用い得る理由は必ずしも明らか
ではないが、重合時にカルボン酸ビニルエステル
重合体を溶解しにくい有機溶媒を単量体と共に用
いるため、生成共重合体がいわゆるポーラスな構
造になり、その後のケン化反応又はエステル交換
反応はポアを形成するポリマーの表面から進行し
て、ケン化率は低くても水酸基がポア付近に集中
しているためではないかと推定される。しかも本発明のゲルは架橋性単量体を多く用い
てつくられていると同時に比較的疎水性のエステ
ル基を多量に含むためか、水溶液中での機械的強
度は非常に大きい。従来はゲルの親水性と機械的
強度が両立しにくく、親水性を持たせるために機
械的強度が犠牲になる傾向があつたが、本発明の
ゲルについてはそのような不安はほとんどない。
そのためケン化率の高いゲルにくらべ、より粒径
を小さくすることや、より高流速での通液が可能
であり、水溶媒系のHLC用充填剤としてこれま
でにない極めてすぐれたものである。また本発明のゲルはHLC用充填剤としてばか
りでなく、工業規模の分離用充填剤やアフイニテ
イークロマトグラフイー用担体としても用いるこ
ともできる。以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の
範囲をこれらの実施例に限定するものでないこと
をいうまでもない。実施例１酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト41.4ｇ、デカヒドロナフタレン56.4ｇ、酢酸ｎ
―ブチル42.4ｇ、及び２，2′―アゾビスイソブチ
ロニトリル3.5ｇよりなる均一混合液と、ポリビ
ニルアルコール１重量％、リン酸二水素ナトリウ
ム二水和物0.05重量％及びリン酸水素二ナトリウ
ム十二水和物1.5重量％を溶解した水800mlとを２
フラスコに入れ、十分撹拌したのち60℃で18時
間、更に75℃で５時間加熱撹拌して懸濁重合を行
ない、粒状共重合体を得た。濾過、水洗、次いで
アセトン抽出後、水中で沈降分級を数回行なつて
平均粒径（）9.2μmのゲルを得た。の測定
はコールターカウンターZB型（米国コールター
エレクトロニクス社）で行なわれた。このゲルを
ケン化反応に供することなく、そのまま内径7.5
mm、長さ50cmのステンレスカラムに充填して、純
水を溶媒として種々の分子量のデキストランやポ
リエチレングリコールを測定して、それぞれ分子
量の高い順に溶出することが確認された。検量線
は第１図に示した通りであつた。実施例２実施例１のゲル50ｇを、水酸化ナトリウム3.3
ｇを水500mlに溶解した液と共に１のフラスコ
に入れ、15℃で20時間撹拌し、ケン化反応を行な
つた。反応後ゲルを水洗したのち、分級して
が9.8μmのゲルを得た。ゲルをピリジン中で無水
酢酸と反応させ、変化したゲル重量から水酸基密
度（q_OHを求め、この値から計算したケン化率は
0.19であつた。ゲルを実施例１と同様にステンレ
スカラムに充填して、デキストランやポリエチレ
ングリコールの標準サンプルを分析して、やはり
分子量の高い順に溶出することが確認された。検
量線は第２図の通りであつた。また塩化ナトリウム及び緩衝剤を含むPH７の水
溶液を溶媒として、卵白アルブミン、人血清アル
ブミン、グロブリン等の蛋白質を分析したところ
分子量の高い順に溶出し回収率はほとんど90％以
上であつた。このことからこのゲルは蛋白の
GPC分離又は分析にも用い得ると思われる。充
填カラムへの通液は２ml／min以上の流速で行な
つても、圧力が一方的に上昇して通液不能になる
ことはなく、短時間での分離、分析が可能であつ
た。実施例３酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト41.4ｇ、ドデシルアルコール99ｇ及び２，2′―
アゾビスイソブチロニトリル3.5ｇよりなる均一
混合液を用い、実施例１と同様に懸濁重合して粒
状共重合体を得た。この粒状共重合体50ｇを、水
酸化ナトリウム13.2ｇをメタノール700mlに溶解
した液と共に１のフラスコに入れ、15℃で20時
間撹拌した。反応後ゲルを濾別して水洗したのち
分級した。は10.4μmq_OHを測定して求めたケ
ン化率は0.37であつた。このゲルを実施例１と同
様にカラムに充填してデキストランやポリエチレ
ングリコールを分析したところ、それぞれ分子量
の高い順に溶出し、第３図に示した検量線を得
た。この充填カラムも２ml／min以上の流速での
通液が可能であつた。実施例４酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト41.4ｇ、デカン21.3ｇ、酢酸ｎ―ブチル77.8ｇ
及び２，2′―アゾビスイソブチロニトリル3.5ｇ
よりなる均一混合液を用いて実施例１と同様に懸
濁重合して粒状共重合体を得た。この粒状共重合
体を更に実施例２と同様にしてケン化反応、水洗
及び分級を行なつてが9.8μmのゲルを得た。
ケン化率は0.2であつた。このゲルを実施例１と
同様にカラムに充填してデキストランやポリエチ
レングリコールを分析したところ、それぞれ分子
量の高い順に溶出する検量線が得られた。卵白ア
ルブミン、人血清アルブミン、グロブリン等の蛋
白質も、分子量の大きい順にかつ90％以上の回収
率で溶出することが確認された。この充填カラム
も２ml／min以上の流速での通液が可能であつ
た。実施例５デカンの代りにジ―２―エチルヘキシルエーテ
ルを用いた以外は実施例４と同様に重合及びケン
化反応を行なつてが10.3μmのゲルを得た。ケ
ン化率は0.19であつた。このゲルを実施例１と同
様にカラムに充填してデキストランやポリエチレ
ングリコールを分析したところ、それぞれ分子量
の高い順に溶出する検量線が得られた。この充填
カラムも２ml／min以上の流速での通液が可能で
あつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたデキストランとポ
リエチレングリコールの検量線を示すグラフ図で
あり、第２図は実施例２で得られたデキストラン
とポリエチレングリコールの検量線を示すグラフ
図であり、第３図は実施例３で得られたデキスト
ランとポリエチレングリコールの検量線を示すグ
ラフ図であり、各図において丸印（○）はデキストラン、三角
印（△）はポリエチレングリコールの測定点であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１カルボン酸ビニルエステル単量体とイソシア
ヌレート環を有する架橋性単量体の割合が 0.1≦3b／（ａ＋3b）≦0.4 ここで、ａ：カルボン酸ビニルエステルのモル数ｂ：イソシアヌレート環を有する架橋性単量体
のモル数の範囲にあるカルボン酸ビニルエステル単量体、
イソシアヌレート環を有する架橋性単量体、単量
体を溶解するがカルボン酸ビニルエステル重合体
を溶解しにくい有機溶媒及び重合開始剤を少なく
とも含んで成る混合物を懸濁重合して得られた共
重合体のエステル基のモル分率で0.4未満を水酸
基に変換せしめた水酸基密度が5.1meq／ｇ以下
である粒状架橋共重合体からなる高速液体クロマ
トグラフイー用充填剤。２エステル基のモル分率で0.05以上0.4未満を
水酸基に変換せしめた特許請求の範囲第１項に記
載の充填剤。３エステル基のモル分率で0.05未満を水酸基に
変換せしめた特許請求の範囲第１項に記載の充填
剤。４平均粒径が５〜20μmの範囲にある特許請求
の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の充
填剤。５カルボン酸ビニルエステルが酢酸ビニル又は
プロピオン酸ビニルである特許請求の範囲第１項
〜第４項のいずれか１項に記載の充填剤。