JPH06201700A

JPH06201700A - 癌抑制遺伝子ｍｃｃの産物に対する抗体

Info

Publication number: JPH06201700A
Application number: JP27849992A
Authority: JP
Inventors: Toru Akiyama; 山徹秋; Masatane Moriyama; 山正胤守; Kumao Toyoshima; 島久真男豊
Original assignee: NODA WAX KK
Current assignee: NODA WAX KK
Priority date: 1992-10-16
Filing date: 1992-10-16
Publication date: 1994-07-22
Anticipated expiration: 2012-05-07
Also published as: JP2608012B2

Abstract

(57)【要約】【目的】癌抑制遺伝子 MCC の産物に対する抗体を提
供する。【構成】大腸癌の癌抑制遺伝子 MCC に関する産物の
推定構造において抗原性が高いものと推定される部分の
アミノ酸配列である Cys Glu Asn Ser Arg Pro His Thr Asn Glu Thr Ser Le
u をコードするペプチドとキャリヤー蛋白との結合物を抗
原として得られる抗体である。【効果】抗原として用いるペプチドの鎖長が短く、従
ってその合成が容易であり、この抗原性ペプチドの合成
を含めて自体周知の手法により所望の抗体を調製するこ
とができ、本発明による抗体は癌や腫瘍の診断に利用す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗体に係り、殊に癌抑制
遺伝子 MCC の産物に対する抗体に係るものであり、癌
及び腫瘍の診断に利用することができる。

【０００２】

【従来の技術】正常細胞と癌細胞とを融合させることに
より得られるハイブリドーマは正常細胞と変わらない形
値を示すこと並びに網膜芽細胞腫、Wilms 腫瘍、神経芽
細胞腫等の遺伝性腫瘍においては染色体の特定部位に異
常が認められるので、遺伝性腫瘍の発生には癌抑制遺伝
子の異常が関与しているものと考えられてきた。事実、
分子生物学の進歩により、最近になって遺伝性腫瘍であ
る網膜芽細胞腫、Wilms腫瘍等に関する癌抑制遺伝子が
次々とクローニングされ、その構造が明らかにされ、当
該遺伝子における異常が確認されるに至っている。更
に、現在では上記の遺伝性腫瘍のみならず肺癌、乳癌、
胃癌、大腸癌等の一般的な腫瘍の発生に関しても癌抑制
遺伝子の異常が重要な役割を果たしていることが解明さ
れつつある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題乃至発明の目的】上記の
従来技術に鑑みて、癌や腫瘍の発生を解明するためには
癌抑制遺伝子、殊にその産物に関する研究が肝要であ
る。従って、本発明の目的は癌抑制遺伝子の産物に対す
る抗体を提供し、これによって各種の癌や腫瘍の発生に
関する研究を発展させ、延いては癌や腫瘍の診断に利用
する途を開くことにある。

【０００４】

【課題を解決し目的を達成する手段及び作用】本発明に
よれば、上記の課題はアミノ酸配列が Cys-Glu-Asn-Ser-Arg-Pro-His-Thr-Asn-Glu-Thr-Ser-Le
u である抗原性ペプチドとキャリヤー蛋白との結合物を抗
原として得られる抗体であって、免疫グロブリンクラス
が IgG、分子量が約 150000、分子吸光係数 [E^1%(1cm),
(280nm)] が 1.40 であることを特徴とする、癌抑制遺
伝子 MCC の産物に対する抗体により解決されると共
に、上記の目的が達成される。

【０００５】本発明において、抗原性ペプチドとして特
定の上記アミノ酸配列を有するペプチドが採択された理
由は、大腸癌に関する癌抑制遺伝子 MCC の推定構造の
一部であって、抗原性が高い部分であると推定されたか
らである。この抗原性ペプチドと結合させるべきキャリ
ヤー蛋白としては各種のものを用いることができ、例え
ばキーホールリンペットヘモシアニン (KLH)、ウシ血清
アルブミン等を例示することができる。抗原性ペプチド
とキャリヤー蛋白との結合は自体公知の手法にて、例え
ばサクシンイミドを用いる方法 [T. Kitagawa 等「J. B
iochem.」第 79 巻、第 233 頁(1976 年)] にて行うこ
とができる。

【０００６】得られた結合物は、抗原として、免疫目的
でマウス、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物に慣用の方
法で投与される。免疫した動物から本発明による抗体を
得る方法としても慣用の手法を採用することができる。
例えば、免疫した動物から採血し、常法に従い抗血清を
調製することにより行うことができ [この場合における
抗体の存否の判定は癌抑制遺伝子 MCC を発現している
細胞、例えばサル正常繊維芽細胞株 CV-1 を可溶化さ
せ、上記の抗血清を用いウエスタンブロット法により解
析し、癌抑制遺伝子 MCC の産物 (分子量 100000) が検
出されるか否かにより行うことができる]、又免疫した
動物のリンパ球を採取しミエローマ細胞と融合させて
ハイブリドーマを調製し、スクリーニングにより抗体を
特異的に産生するハイブリドーマを特定し、該抗体産生
ハイブリドーマを培養することによりモノクローナル抗
体として得ることができる。尚、上記の抗体産生ハイブ
リドーマを動物に移植して抗体を産生させ、次いで採血
等により採取し単離することによっても所望の抗体を得
ることができる。

【０００７】

【実施例等】次に、抗体の製造例、確認試験例等により
本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。

【０００８】製造例 (A) 抗原性ペプチドの調製大腸癌に関する癌抑制遺伝子 MCC の産物について既に
報告されている推定構造を検討し、抗原性が高い部分と
推定されるペプチドであって、下記のアミノ酸配列を有
するペプチドを、自動ペプチド合成装置 (ベックマン社
製の 990B 型)により、固相法で合成した。 Cys-Glu-Asn-Ser-Arg-Pro-His-Thr-Asn-Glu-Thr-Ser-Le
u 上記の合成ペプチドを 0℃ において 30 分間にわたり
75% 弗化水素/25% アニソールで処理することにより固
相から剥離させ、1mM ジチオスライトール含有0.05M 酢
酸アンモニウム緩衝液 (pH 7.0) により平衡化させ、SP
セファデックスカラム (2.5 x 50cm) に吸着させた。
上記の平衡化用緩衝液 500ml と 1mM ジチオスライトー
ル含有 0.5M 酢酸 (pH 7.0) 500ml とのグラジェントに
より上記カラム内の吸着物を分画溶出させた。各画分を
フルオロレスカミンにてチェックすることによりペプチ
ド含有画分を集めて濃縮し、この濃縮物を、30% 酢酸溶
液で平衡化したセファデックス G-10 カラム (1.0 x 50
cm) に吸着させ、上記と同様にしてペプチド含有画分を
集めて濃縮し、乾固させることにより所望の抗原性ペプ
チドを得た。このペプチドを 1N 塩酸溶液に 120℃ で
一晩浸漬して加水分解させ、アミノ酸分析装置によりア
ミノ酸組成を調べた結果は下記の通りであった。 Cys 1.0; Glu 1.9; Asn 2.0; Ser 2.0; Arg 0.9; Pro
1.1; His 1.0;Thr 1.9; Leu 1.0 (%)

【０００９】 (b) 抗原の調製 (キャリヤー蛋白との結合) 10mg/ml の割合で 10mM 燐酸緩衝液に溶解させたキーホ
ールリンペットヘモシアニンと、15mg/ml の割合で 10m
M 燐酸緩衝液に溶解させた n-マレイミド-n-ハイドロキ
シサクシンイミドエステル 63μl とを混合し、室温下
に 30 分間保持して反応させた。0.1M 燐酸緩衝液 (pH
6.0) により平衡化させたセファデックス G-25 カラム
を用い 4℃ の温度条件下で、上記の反応液をクロマト
グラフィーすることによりキーホールリンペットヘモシ
アニンを活性化させた。この活性化キーホールリンペッ
トヘモシアニン 2.3ml と、10mg/ml の割合で10mM 燐酸
緩衝液 (pH 7.3) に既述の (a) 項で得た抗原性ペプチ
ドを溶解させた溶液に 5mM EDTA を添加した溶液 0.1ml
とを混合し、pH を 6.5 に調整し、次いで室温下で 4
時間混合することにより所望の抗原 (抗原性ペプチド
と、キャリヤー蛋白であるキーホールリンペットヘモシ
アニンとの結合物) を得た。この結合物が生成したこと
は、SDS-ゲル電気泳動解析により確認された。

【００１０】(c) 抗体の調製上記の (b) 項で得た抗原 200μg をフロインドの完全
アジュバンドと共にウサギの手掌部に注射投与した。そ
の後、更に、3 週間間隔で抗原を 200μg 宛 4回背皮下
に注射投与することにより免疫を施した。最終投与から
10 日目に採血し、血清を分取した。この血清を遠心
(10000 x g) して得た上清に飽和硫安溶液 (pH 7.4) を
添加して硫安濃度を 14% になした。この溶液を氷冷下
で一晩攪拌した後に 10000 x g にて 10 分間遠心して
沈澱物を採取した。得られた沈澱物を蒸留水に溶解さ
せ、500 倍量の 0.15M NaCl に対して 48 時間透析処理
して抗血清溶液を得た。

【００１１】10mM 燐酸緩衝液 (pH 7.2) により平衡化
させた DEAE-セルロース (ワットマン DE32) カラム
(1.0 x 15cm) に上記の抗血清溶液 2ml を流し、素通り
画分として免疫グロブリン IgG 画分を得た。この IgG
の収量は 24mg である。集められた IgG を 0.1M 炭酸
ナトリウム緩衝液 (pH 8.0) により透析処理した。一
方、活性化 CH-セファロース 4B (ファルマシア社製) 1
g を 0.1M 炭酸ナトリウム緩衝液 (pH 8.0) 5μl に懸
濁させ、これに既述の (a) 項で得た抗原性ペプチド 10
mg を添加して室温下で 2 時間攪拌することによりペプ
チド結合 CH-セファロース 4B を調製してカラム (0.5
x 2.0cm) に入れ、このカラムに上記の透析処理済み Ig
G 画分をチャージし、0.15M NaCl/0.002M 炭酸ナトリウ
ム緩衝液 (pH 8.0) により充分に洗浄し、次いでカラム
に吸着しているペプチド抗体を 0.17M グリシン-塩酸緩
衝液 (pH 2.3) により溶出させた。集めた溶出液を0.15
M NaCl に対して透析処理し、次いで限外濾過すること
により所望の IgG 抗体を含有する溶液を 0.5ml 得た。

【００１２】確認試験例 (1) 免疫グロブリンクラスの決定カッペル社製の抗ウサギ IgG 抗体、抗ウサギ IgM 抗体
及び抗ウサギ IgA +IgM + IgG 抗体を使用し、オクタロ
ニー法により、上記の製造例により得られた抗体 (癌抑
制遺伝子 APC の産物に対する精製抗体) の免疫沈降試
験を実施して、その免疫グロブリンクラスを決定した。
即ち、1% 寒天ゲルに形成した穴の中心部には上記の 3
種の抗ウサギ抗体を入れ、周囲に形成された穴には、こ
れらの抗ウサギ抗体に対して 1/20 量から 2倍づつ稀釈
した製造例による精製抗体を入れ、0℃ において一晩放
置した後に、形成された沈降縁を観察した処、当該精製
抗体は抗ウサギ IgG 抗体及び抗ウサギ IgA + IgM + Ig
G 抗体によって免疫沈降を示していたので、その免疫グ
ロブリンクラスは IgG であることが確認された。

【００１３】(2) 分子量の決定製造例で得た精製抗体の分子量をセファデックス G-100
を用い、ゲル濾過法により決定した。即ち、0.02M 炭
酸ナトリウム緩衝液にて平衡化させたセファデックス G
-100カラム (1.0 x 100cm) に製造例で得た精製抗体を
1mg チャージし、上記の緩衝液にて展開させ、280nm で
の吸光度を測定して溶出する蛋白を検出し、分子量マー
カ [バイオラッド社製の分子量測定キット(No. 151 - 1
901) であってチログロブリン (分子量 670000)、γ-グ
ロブリン (分子量 158000)、卵白アルブミン(分子量 44
000)、ミオグロビン (分子量 17000) 及びビタミン B₁₂
(分子量1350) が予めセットされているもの] における
溶出パターンと比較した処、精製抗体の分子量は約 150
000 であることが判明した。

【００１４】(3) 分子吸光係数製造例で得た精製抗体 1mg を 1ml の炭酸ナトリウム緩
衝液 (pH 9.0) に溶解させ、280nm での吸光度を測定し
た処、1.40 であった。従って分子吸光係数はE^1% (1cm)
= 1.40 となる。

【００１５】(4) 免疫特異性癌抑制遺伝子 MCC を発現しているサル繊維芽細胞株 CV
-1 を RIPA 緩衝液(1% NP-40、0.1% デオキシコール酸
ナトリウム塩、0.5% NaCl 及び 1mM フェニルメチルス
ルフォニルフルオライド及び 50mM トリス塩酸緩衝液を
含有、pH7.4) により可溶化させた後に 10000 x g にて
30 分間遠心して上清を採取し、この上清をレムリ (L
emmli) の方法に従い 10% SDS-ゲル電気泳動法により分
離した。得られた各分離蛋白を常法によりニトロセルロ
ースフィルタにウエスタントランスファーした後に、製
造例により得た精製抗体とアルカリフォスファターゼ結
合抗ウサギ IgG 抗体 (カッペル社製) とを用いて癌抑
制遺伝子 MCC 産物の検出を行った。その結果、癌抑制
遺伝子 MCC を発現しているサル繊維芽細胞株 CV-1 に
関しては分子量 100000 の蛋白の存在が確認された。
尚、製造例の (a) 項に記載の抗原性ペプチドを添加し
て抗体を吸収させた後に、上記と同様の試験を行った
処、分子量 100000 の蛋白を検出することはできなかっ
た。これらの事実は、製造例により得られた抗体が癌抑
制遺伝子 MCC の産物を特異的に認識するものであるこ
とを示している。

【００１６】

【発明の効果】本発明による抗体は癌抑制遺伝子の産物
を特異的に認識する。癌抑制遺伝子は遺伝性の特殊な癌
や腫瘍のみならず、一般的な各種の癌や腫瘍の発生に関
与するものであることが解明されつつあるので、本発明
による抗体は癌や腫瘍の発生解明や診断に利用すること
が可能である。更に、本発明による抗体は鎖長の短い、
従って合成が容易なペプチドを抗原材料とするのみで、
他は生物工学分野において自体周知の手法を用いて調製
することができ、従って製造が容易である。

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸トポロジー：直線状配列の種類：合成ペプチド配列 Cys Glu Asn Ser Arg Pro His Thr Asn Glu Thr Ser Leu 1 5 10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列が Cys-Glu-Asn-Ser-Arg-Pro-His-Thr-Asn-Glu-Thr-Ser-Le
u である抗原性ペプチドとキャリヤー蛋白との結合物を抗
原として得られる抗体であって、免疫グロブリンクラス
が IgG、分子量が約 150000、分子吸光係数 [E^1%(1cm),
(280nm)] が 1.40 であることを特徴とする、癌抑制遺
伝子 MCC の産物に対する抗体。