JPH06205699A

JPH06205699A - α−アミラーゼ活性測定法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬

Info

Publication number: JPH06205699A
Application number: JP1962793A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Watabe; 聡渡部; Toshiyuki Kitagawa; 俊之北川
Original assignee: B L KK; Tauns Laboratories Inc
Current assignee: B L KK; Tauns Laboratories Inc
Priority date: 1993-01-11
Filing date: 1993-01-11
Publication date: 1994-07-26

Abstract

(57)【要約】【目的】 α−アミラーゼの真の活性を正しく簡便に自
動分析機を使用して測定することができるα−アミラー
ゼ活性測定法及びこの測定法に使用するための試薬を提
供する。【構成】還元性末端が色素で修飾されたマルトオリゴ
糖からなる基質に、α−アミラーゼを含む検体をカルシ
ウムイオンの共存下に、該α−アミラーゼの活性至適ｐ
Ｈで作用させて基質を分解する第一工程、第一工程で得
られた生成物にα−グルコシダーゼ及びカルシウムイオ
ン捕捉剤を、α−グルコシダーゼの活性至適ｐＨで作用
させる第二工程、及び第二工程で生成した色素を比色定
量する第三工程からなるα−アミラーゼ活性測定法。色
素で修飾されたマルトオリゴ糖からなる基質、水溶性カ
ルシウム塩化合物及びα−アミラーゼの活性至適ｐＨを
有する緩衝液を含む第一液、及びα−グルコシダーゼ、
カルシウムイオン捕捉剤及び緩衝液を含む第二液からな
るα−アミラーゼ活性測定用試薬

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新しいα−アミラーゼ
活性測定法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】急性膵炎の高アミラーゼ血症、耳下腺
炎、肺ガン等の異所性アミラーゼ産生腫瘍等の診断のた
めに、血清、膵液、尿などのα−アミラーゼ活性を測定
することが重要であり、古くから行われている。

【０００３】α−アミラーゼ活性測定法として、旧くは
粘稠なデンプン溶液の粘度の減少を測定する粘度法、混
濁したデンプン溶液の濁度の減少を測定する比濁法等が
あるが、感度及び精度の問題から現在殆ど使用されてい
ない。また、α−アミラーゼの作用により生成した還元
糖による銅の還元を利用したソモジー法や、デンプンに
色素チバクロン（Cibachron ）を結合させた青色デンプ
ン（ブルースターチ）を発色基質とするブルースターチ
法が広く使用されているが、操作が煩雑で、基質の品質
が不安定であると言う問題がある。

【０００４】最近、糖鎖の短い均一な組成のオリゴ糖が
比較的容易に調製できるようになり、これらの合成基質
にα−アミラーゼを作用させて生じる成分を更に検出酵
素と共役させて酵素的にα−アミラーゼを測定する酵素
的測定法が、測定の自動化に伴って日常使用されてい
る。

【０００５】酵素的測定法の中に合成発色基質を使用す
る方法がある。その一例は、下記の原理１又は原理２を
測定原理とする方法である。

【０００６】

【化１】

【０００７】即ち、原理１に於ては、ｐ−ニトロフェノ
ールを標識した基質（ｐ−ニトロフェニルマルトヘプタ
オシド：ｐＮＰ−Ｇ７）にα−アミラーゼが作用し、生
成するｐ−ニトロフェニルマルトトリオシド（ｐＮＰ−
Ｇ３）にα−グルコシダーゼが作用して、遊離するｐ−
ニトロフェノール（ｐＮＰ）を比色定量する。また、原
理２に於ては、２，４−ジクロロフェノールを標識した
基質（２，４−ジクロロフェニルマルトヘプタオシド：
ＤＣＰ−Ｇ７）にα−アミラーゼが作用し、生成する
２，４−ジクロロフェニルマルトトリオシド（ＤＣＰ−
Ｇ３）にα−グルコシダーゼが作用して、遊離する２，
４−ジクロフェノール（ＤＣＰ）を、４−アミノアンチ
ピリンと過ヨウ素酸カリで酸化して生成する赤色キノン
色素を比色定量する。

【０００８】これらの酵素的測定法は、一般に、反応時
間０での酵素反応速度を測定する（実際には、単位時間
当りの酵素反応速度が直線的である部分を測定する）レ
ート法（rate法：初速度分析法とも呼ばれる）により行
われており、α−アミラーゼを含有する検体と基質及び
α−グルコシダーゼとを一緒に作用させて反応させてい
る。従って、上記の反応は一般にα−グルコシダーゼの
活性至適ｐＨ域である７．０〜７．２のｐＨを有する緩
衝液中で行われている。

【０００９】ヒト血清中のα−アミラーゼの活性至適ｐ
Ｈ域は７．０〜７．２であり、α−グルコシダーゼの活
性至適ｐＨ域と同じであり、ヒト血清中のα−アミラー
ゼとα−グルコシダーゼとを同じｐＨの環境下で反応さ
せても、両酵素がそれぞれ最大活性を示すので特に問題
は無い。

【００１０】しかしながら、α−アミラーゼはその起源
が異なるとその活性至適ｐＨ域が異なることが考えられ
る。例えば、動物由来のα−アミラーゼとヒト由来のα
−アミラーゼとでは、またヒト由来でも血清中のα−ア
ミラーゼと膵液中のα−アミラーゼとでは、その活性至
適ｐＨ域が異なると考えられる。若し、測定しようとす
るα−アミラーゼの活性至適ｐＨ域が、α−グルコシダ
ーゼの活性至適ｐＨ域とは異なっていると、レート法に
よりα−アミラーゼ活性を測定する際に、反応液のｐＨ
をα−グルコシダーゼの活性至適ｐＨに合わせた場合に
はα−アミラーゼはその最大活性を示さず、逆に反応液
のｐＨを測定対象のα−アミラーゼの活性至適ｐＨ域に
合わせた場合にはα−グルコシダーゼはその最大活性を
示さないことになる。このような場合、レート法による
酵素的測定法によっては、α−アミラーゼの真の活性を
正しく測定することはできなくなる。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、α−
アミラーゼの真の活性を正しく簡便に自動分析機を使用
して測定することができるα−アミラーゼ活性測定法及
びこの測定法に使用するための試薬を提供することにあ
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、還元性末端が
色素で修飾されたマルトオリゴ糖からなる基質に、α−
アミラーゼを含む検体をカルシウムイオンの共存下に、
該α−アミラーゼの活性至適ｐＨで作用させて基質を分
解する第一工程、第一工程で得られた生成物にα−グル
コシダーゼ及びカルシウムイオン捕捉剤を、α−グルコ
シダーゼの活性至適ｐＨで作用させる第二工程、及び第
二工程で生成した色素を比色定量する第三工程からなる
ことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法である。

【００１３】他の本発明は、還元性末端が色素で修飾さ
れたマルトオリゴ糖からなる基質、水溶性カルシウム塩
化合物及び測定対象のα−アミラーゼの活性至適ｐＨを
有する緩衝液を含む第一液、及び、α−グルコシダー
ゼ、カルシウムイオン捕捉剤及びα−グルコシダーゼの
活性至適ｐＨを有する緩衝液を含む第二液からなるα−
アミラーゼ活性測定用試薬である。

【００１４】本発明の好適な態様は下記の通りである。

【００１５】（１）上記マルトオリゴ糖が、ｐ−ニトロ
フェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２，
４−ジクロロフェノール等の色素で修飾されたマルトオ
リゴ糖である、上記のα−アミラーゼ活性測定法又はα
−アミラーゼ活性測定用試薬。

【００１６】（２）上記マルトオリゴ糖が、その非還元
末端が未置換（無修飾）グルコース又は４位及び／又は
６位で置換（修飾）されたマルトオリゴ糖である、上記
のα−アミラーゼ活性測定法又はα−アミラーゼ活性測
定用試薬。

【００１７】（３）上記カルシウムイオン捕捉剤が、エ
チレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩である、上記の
α−アミラーゼ活性測定法又はα−アミラーゼ活性測定
用試薬。

【００１８】本発明のα−アミラーゼ活性測定法の測定
原理は、基質として還元末端がｐ−ニトロフェノールで
修飾され、非還元末端がβ−ガラクトースで修飾された
マルトオリゴ糖である、ｐ−ニトロフェニル−β−ガラ
クトシル−α−マルトペンタオシドを使用する場合を例
にすると、下記の原理３に示す通りである。

【００１９】

【化２】

【００２０】即ち、第一反応に於て、ｐ−ニトロフェニ
ル−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド（ｐＮ
Ｐ−Ｇ５−Ｇａ）にα−アミラーゼが作用し、ｐ−ニト
ロフェニルマルトトリオシド（ｐＮＰ−Ｇ３）及びｐ−
ニトロフェニルマルトジオシド（ｐＮＰ−Ｇ２）が生成
し、第二反応に於て、これら両者にα−グルコシダーゼ
が作用して、ｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）を生成す
る。

【００２１】本発明のα−アミラーゼ活性測定法に於て
は、第一工程で上記第一反応を行い、第二工程で上記第
二反応を行い、第三工程で上記第二反応で生成したｐ−
ニトロフェノールを比色定量する。上記の原理３から明
らかなように、本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、
従来のα−アミラーゼの酵素的測定法で採用されている
レート法とは異なり、終点法（end point 法）による測
定法である。

【００２２】本発明のα−アミラーゼ活性測定法に於け
る第一工程で使用する基質は、還元性末端が色素で修飾
されたマルトオリゴ糖である。上記原理で例示したｐＮ
Ｐ−Ｇ５−Ｇａは、ｐ−ニトロフェノールの色素で還元
末端が修飾されたグルコース単位が５個のマルトオリゴ
糖である。上記色素としては、上記第二反応で遊離され
比色法により定量できるものであれば特に限定されな
い。ｐ−ニトロフェノール以外の好ましい色素として、
２−クロロ−４−ニトロフェノール、２，４−ジクロロ
フェノール等を挙げることができる。上記マルトオリゴ
糖のグルコース単位の数は、４〜７個であるものが好ま
しい。

【００２３】本発明のα−アミラーゼ活性測定法で使用
する基質として好ましいものは、ｐ−ニトロフェニル−
α−マルトペンタオシド（ｐＮＰ−Ｇ５）、ｐ−ニトロ
フェニル−α−マルトヘキサオシド（ｐＮＰ−Ｇ６）、
ｐ−ニトロフェニル−α−マルトヘプタオシド（ｐＮＰ
−Ｇ７）、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マル
トペンタオシド（ＣＮＰ−Ｇ５）、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル−α−マルトヘキサオシド（ＣＮＰ−Ｇ
６）、２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−マルトヘ
プタオシド（ＣＮＰ−Ｇ７）等を挙げることができる。

【００２４】本発明のα−アミラーゼ活性測定法で使用
する基質は、上記のようにその非還元末端が未置換（無
修飾）のものであってもよいが、非還元末端が４位及び
／又は６位が、例えば、ガラクトース、エチリデン、ベ
ンジリデン、３−ケトブチリデン、アジド等で置換（修
飾）されたものであってもよい。非還元末端が修飾され
たマルトオリゴ糖を基質として使用すると、共役酵素と
してグルコアミラーゼが使えるため、反応のラグタイム
がなくなるという効果があるので好ましい。

【００２５】本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第一
工程の反応液中の上記の基質の濃度は、０．５〜５０ミ
リモル／Ｌであることが好ましい。

【００２６】本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第一
工程は、カルシウムイオンの共存下に行う。上記第一工
程でカルシウムイオンを存在させるために、第一工程に
酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、クエン酸カルシ
ウム等の水溶性の有機酸カルシウム、塩化カルシウム、
水酸化カルシウム等のカルシウム含有水溶性化合物を添
加することが好ましい。上記第一工程の反応液中のカル
シウム含有化合物の濃度は、０．０１〜５０ミリモル／
Ｌであることが好ましい。

【００２７】上記第一工程の反応液中には、更に、従来
のα−アミラーゼ活性測定法に於けると同様にＮａＣ
ｌ、ＣａＣｌ₂ 、ＭｇＣｌ₂ 等の塩が含まれていてもよ
い。

【００２８】上記第一工程は、反応液のｐＨが、測定対
象のα−アミラーゼの活性至適ｐＨ域（α−アミラーゼ
が最大活性を示すｐＨ域）内のｐＨになるように調整さ
れた緩衝液中で行う。測定対象のα−アミラーゼの活性
至適ｐＨ域は、本明細書に記載した参考例の方法に従っ
て測定することができる。本発明者らの測定によれば、
α−アミラーゼの活性至適ｐＨ域は、例えば、ヒト血清
中のもの：７．０〜７．２、ヒト膵液中のもの：７．５
〜７．６、イヌ血清中のもの：７．６〜７．８、ラット
血清中のもの：７．０である。

【００２９】上記第一工程で反応液に添加する測定対象
のα−アミラーゼが含まれていると考えられる検体は、
ヒト又は動物の血清、膵液、尿等の何れであってもよ
い。更に、植物、細菌、カビ等の資源からのα−アミラ
ーゼを含む検体を使用することもできる。第一工程の反
応液中のα−アミラーゼの濃度が５０００Ｕ（国際単
位）／Ｌ以下の濃度になるように上記検体を添加するこ
とが好ましい。

【００３０】上記第一工程の反応温度は一般の酵素反応
に於けると同様に約３７℃であることが好ましく、上記
第一工程の反応時間は１〜５分間であることが好まし
い。

【００３１】本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第二
工程に於ては、第一工程で得られた生成物にα−グルコ
シダーゼ及びカルシウムイオン捕捉剤を、α−グルコシ
ダーゼの活性至適ｐＨで作用させる。

【００３２】上記第二工程で反応液に添加するα−グル
コシダーゼの量は、第一工程で生成した色素で修飾され
たマルトオリゴ糖を分解するに十分な量以上であり、一
般に１〜２００Ｕ／ｍＬであることが好ましい。

【００３３】上記第二工程の反応液に添加するカルシウ
ムイオン捕捉剤は、水溶性であり且つカルシウムイオン
を捕捉して、反応液中にカルシウムイオンが実質的に存
在しないようにするものであれば特に限定されない。こ
のカルシウムイオン捕捉剤として特に好ましい化合物と
しては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
のアルカリ金属（ナトリウム、カリウム等）塩、トラン
ス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、グリコールエーテルジア
ミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）等を挙げることができる。

【００３４】上記第二工程に於ては、カルシウムイオン
捕捉剤を存在させることにより第一工程で得られた反応
生成液中のカルシウムイオンを消去する。α−アミラー
ゼ活性が発現するためにはカルシウムイオンが必要であ
り、カルシウムイオンを消去することによってα−アミ
ラーゼの活性発現が停止し、上記第二工程での反応への
α−アミラーゼの影響を無くすることができる。

【００３５】上記第二工程は、反応液のｐＨを、α−グ
ルコシダーゼの活性至適ｐＨ域である７．０〜７．２の
範囲内に維持する緩衝液中で反応を行う。

【００３６】上記第二工程の反応温度は一般の酵素反応
に於けると同様に約３７℃であることが好ましく、上記
第二工程の反応時間は３〜１０分間であることが好まし
い。

【００３７】本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第三
工程に於ては、第二工程で得られた生成液中の色素を、
従来の酵素的測定法に於けると同様にして比色定量す
る。例えば、色素としてｐ−ニトロフェノールを使用し
た場合には４０５ｎｍ付近での吸光度を測定することに
より、色素として２−クロロ−４−ニトロフェノールを
使用した場合には４００ｎｍ付近での吸光度を測定する
ことにより、２，４−ジクロロフェノールを使用した場
合には前記原理２に示すように生成する赤色キノン色素
を５００ｎｍ付近での吸光度を測定することにより定量
できる。特定濃度の色素の水溶液の吸光度とα−アミラ
ーゼ活性との規定された関係から、第三工程で得られた
吸光度から検体中のα−アミラーゼ活性を求めることが
できる。

【００３８】本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、従
来の酵素活性測定法で使用されているような自動分析装
置を使用して行うことができる。

【００３９】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬
は、還元性末端が色素で修飾されたマルトオリゴ糖から
なる基質０．５〜５０ミリモル／Ｌ、水溶性カルシウム
塩化合物０．０１〜５０ミリモル／Ｌ及び測定対象のα
−アミラーゼの活性至適ｐＨを有する緩衝液を含む第一
液、及びα−グルコシダーゼ１〜２００Ｕ／ｍＬ、カル
シウムイオン捕捉剤１〜１５ミリモル／Ｌ及びα−グル
コシダーゼの活性至適ｐＨを有する緩衝液を含む第二液
からなる。

【００４０】上記第一液は本発明のα−アミラーゼ活性
測定法の第一工程で使用するためのものであり、上記第
二液は本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第二工程で
使用するためのものである。従って、本発明のα−アミ
ラーゼ活性測定用試薬中の各成分の内容及び作用効果
は、前記の本発明のα−アミラーゼ活性測定法について
説明したことと同様である。上記第一液中には、更に、
ＮａＣｌ、ＣａＣｌ₂ 、ＭｇＣｌ₂ 等の塩が含まれてい
てもよい。

【００４１】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬
は、第一液及び第二液のそれぞれについて、必要な全て
の成分を含有させた溶液を製造しておき、使用に際して
必要に応じて適宜希釈して使用してもよく、また、それ
ぞれ二個以上に分割して調製し貯蔵し（必要に応じて凍
結乾燥品として）、使用に際して必要に応じて適宜希釈
し混合して使用するようにしてもよい。

【００４２】

【実施例】次に、参考例、実施例及び比較例により本発
明を更に詳細に説明する。

【００４３】［参考例］この参考例に於て、由来の異な
るα−アミラーゼが、それぞれ異なる活性至適ｐＨ域を
有することを示す。

【００４４】測定試料として下記の６種の試料を用意し
た。（１）試薬ブランク（生理食塩水）（２）ヒト血清（Moni-Trol-II、デイド社製、管理血
清）（３）ヒト膵液（４）イヌ血清（５）ラット血清（６）２．５ｍＭｐ−ニトロフェノール水溶液（反応
液中のｐＨにより、ｐ−ニトロフェノールの解離度が異
なるため、ｐＨ補正用として含める）

【００４５】測定試薬として、下記の第一液及び第二液
を調製した。（第一液）６．５、７．０、７．５、８．０又は８．５
のｐＨ値に調整した５種類の３０ｍＭリン酸塩緩衝液の
各々に、２４ｍＭの塩化ナトリウム、０．４ｍＭの酢酸
カルシウム及び５ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−ガラ
クトシル−α−マルトペンタオシド（ＬＧ−５Ｐ）が含
有されている、５種類の第一液。

【００４６】（第二液）７．２のｐＨ値に調整した１０
０ｍＭリン酸塩緩衝液に、７５Ｕ／ｍＬのα−グルコシ
ダーゼ（活性至適ｐＨ＝７．０〜７．２）及び３ｍＭの
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩が含有されてい
る。

【００４７】日立７０５０型自動分析機（株式会社日立
製作所製）を使用して、下記の方法により上記の各測定
試料についてα−アミラーゼ活性を測定した。

【００４８】測定試料４μＬと第一液１５０μＬとを混
合して３７℃で５分間維持し、次いでこの混合物に第二
液３００μＬを添加混合して（α−グルコシダーゼの濃
度：５０Ｕ／ｍＬ）３７℃で５分間維持した後、生成し
たｐ−ニトロフェノールに基づく４１５ｎｍ（主波長）
での吸光度を測定した。

【００４９】第一液に比較して第二液の量が多いので、
第二液を添加した後の反応液のｐＨはα−グルコシダー
ゼの活性至適ｐＨ域内である７．２前後に保持されてい
た。

【００５０】この測定操作を、上記６種類の測定試料の
それぞれに対して、５種類の第一液のそれぞれを使用し
て行った。第一液の各ｐＨ値での２．５ｍＭｐ−ニト
ロフェノール水溶液からの吸光度から、各ｐＨ値での補
正係数を求め、各ｐＨ値に於いて、上記（２）〜（５）
の測定試料について自動分析機から打ち出された吸光度
から、（１）のブランク試料について自動分析機から打
ち出された吸光度を差し引き、上記の補正係数を乗じる
ことによって、上記（２）〜（５）の測定試料について
の吸光度を得た。

【００５１】このようにして得た上記（２）〜（５）の
測定試料についての吸光度と、使用した第一液のｐＨ値
との関係をプロットしたグラフを、図１［測定試料
（２）ヒト血清及び測定試料（３）ヒト膵液］及び図２
［測定試料（４）イヌ血清及び測定試料（５）ラット血
清］に実線で示す。

【００５２】図１から、ヒト血清中のα−アミラーゼの
活性至適ｐＨは７．０〜７．２であり、ヒト膵液中のα
−アミラーゼの活性至適ｐＨは７．５〜７．６であるこ
とが分かり、図２から、イヌ血清中のα−アミラーゼの
活性至適ｐＨは７．６〜７．８であり、ラット血清中の
α−アミラーゼの活性至適ｐＨは７．０であることが分
かる。図１及び図２から、由来が異なるα−アミラーゼ
はそれぞれ異なった独自の活性至適ｐＨ域を有すること
が明らかである。

【００５３】［比較参考例］この比較参考例に於ては、
従来のレート法により、参考例で使用したものと同じ基
質及びα−グルコシダーゼを使用して、参考例に於ける
のと同じ測定試料についてα−アミラーゼ活性を測定し
た。

【００５４】測定試料として参考例で使用したものと同
じ試料を用意した。

【００５５】測定試薬として、下記の第一液及び第二液
を調製した。（第一液）６．５、７．０、７．５、８．０又は８．５
のｐＨ値に調整した５種類の３０ｍＭリン酸塩緩衝液の
各々に、７２ｍＭの塩化ナトリウム、１．２ｍＭの酢酸
カルシウム及び１５０Ｕ／ｍＬのα−グルコシダーゼ
（活性至適ｐＨ＝７．０〜７．２）が含有されている、
５種類の第一液。

【００５６】（第二液）７．５ｍＭのｐ−ニトロフェニ
ル−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド（ＬＧ
−５Ｐ）の水溶液。

【００５７】日立７０５０型自動分析機（株式会社日立
製作所製）を使用して、下記の方法により上記の各測定
試料についてα−アミラーゼ活性を測定した。

【００５８】測定試料４μＬと第一液１５０μＬとを混
合して３７℃で５分間維持し、次いでこの混合物に第二
液３００μＬを添加混合して（α−グルコシダーゼの濃
度：５０Ｕ／ｍＬ、ＬＧ−５Ｐの濃度：５ｍＭ）３７℃
で５分間維持し、第二液を添加して４分後と５分後の間
の１分間の、生成したｐ−ニトロフェノールに基づく４
１５ｎｍ（主波長）での吸光度差を測定した。

【００５９】全反応時間を通して、反応液のｐＨは各々
６．５、７．０、７．５、８．０、及び８．５に保持さ
れていた。

【００６０】この測定操作を、上記６種類の測定試料の
それぞれに対して、５種類の第一液のそれぞれを使用し
て行った。参考例と同様にして上記（２）〜（５）の測
定試料についての１分間当りの吸光度差を算出した。

【００６１】このようにして得た上記（２）〜（５）の
測定試料についての１分間当りの吸光度差を５倍（第二
液を添加した後に維持した５分間に対応）して得られた
吸光度と、使用した第一液のｐＨ値との関係をプロット
したグラフを、図１［測定試料（２）ヒト血清及び測定
試料（３）ヒト膵液］及び図２［測定試料（４）イヌ血
清及び測定試料（５）ラット血清］に点線で示す。

【００６２】図１及び図２に於いて、参考例（終点法）
で得られた結果（実線）と比較参考例（レート法）で得
られた結果（点線）とを比較すると、α−グルコシダー
ゼの活性至適ｐＨ域（７．０〜７．２）近傍では両者の
間に殆ど差がないが、ｐＨが７．５より高くなると比較
参考例に於いては吸光度が著しく低下している。このこ
とから、レート法による測定をα−グルコシダーゼの活
性至適ｐＨ域で行った場合には、ヒト膵液及びイヌ血清
ではα−アミラーゼの最大活性を示さず、これらのα−
アミラーゼの活性至適ｐＨ域で行った場合にはα−グル
コシダーゼの活性至適ｐＨ域から外れるためにα−グル
コシダーゼの活性が大きく低下し、レート法によっては
正確なα−アミラーゼ活性を測定できないことが分か
る。

【００６３】［実施例１］測定試料として下記の３種の
試料を使用した。（１）試薬ブランク（生理食塩水）（２）ヒト膵液（３）２．５ｍＭｐ−ニトロフェノール水溶液

【００６４】測定試薬として、下記の第一液及び第二液
を調製した。（第一液）７．５のｐＨ値に調整した３０ｍＭリン酸塩
緩衝液に、２４ｍＭの塩化ナトリウム、０．４ｍＭの酢
酸カルシウム及び５ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−ガ
ラクトシル−α−マルトペンタオシド（ＬＧ−５Ｐ）が
含有されている。

【００６５】（第二液）７．２のｐＨ値に調整した１０
０ｍＭリン酸塩緩衝液に、７５Ｕ／ｍＬのα−グルコシ
ダーゼ及び３ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム塩が含有されている。

【００６６】日立７０５０型自動分析機（株式会社日立
製作所製）を使用して、参考例に於けると同様の方法に
より上記の各測定試料についてα−アミラーゼ活性測定
操作を行い、生成したｐ−ニトロフェノールに基づく４
１５ｎｍ（主波長）での吸光度を測定した。第一液中の
反応時には反応液のｐＨは、ヒト膵液の活性至適ｐＨ域
内の７．５であったが、第二液を添加した後の反応液の
ｐＨはα−グルコシダーゼの活性至適ｐＨ域内である
７．２前後に保持されていた。

【００６７】測定試料（２）ヒト膵液について自動分析
機から打ち出された吸光度から、測定試料（１）試薬ブ
ランクの吸光度を差し引くと、０．８２３３Ａｂｓであ
った。酵素の国際単位（Ｕ）は、１分間に１μＭの基質
を分解するとき、その酵素活性を１単位と定められてお
り、本例に於ては、２．５ｍＭ、即ち２５００μＭのｐ
−ニトロフェノールが１分間に全て分解されたとして、
測定試料（３）２．５ｍＭｐ−ニトロフェノール水溶
液について得られた吸光度が、α−アミラーゼ２５００
Ｕ／Ｌであると仮定して、上記測定試料（３）について
得られた吸光度０．２６５５Ａｂｓから、Ｋ−ファクタ
ー＝１８８３（＝２５００／５分／０．２６５５）が得
られた。このＫ−ファクターを測定試料（２）について
の吸光度０．８２３３Ａｂｓに乗じることにより、測定
試料（２）のα−アミラーゼ活性は１５５０Ｕ／Ｌであ
ると求められた。

【００６８】［比較例１］測定試料として下記の３種の
試料を使用した。（１）試薬ブランク（生理食塩水）（２）ヒト膵液（３）２．５ｍＭｐ−ニトロフェノール水溶液

【００６９】測定試薬として、下記の第一液及び第二液
を調製した。（第一液）７．０のｐＨ値に調整した３０ｍＭリン酸塩
緩衝液に、７２ｍＭの塩化ナトリウム、１．２ｍＭの酢
酸カルシウム及び１５０Ｕ／ｍＬのα−グルコシダーゼ
が含有されている。

【００７０】（第二液）７．５ｍＭのｐ−ニトロフェニ
ル−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド（ＬＧ
−５Ｐ）の水溶液。

【００７１】日立７０５０型自動分析機（株式会社日立
製作所製）を使用して、比較参考例に於けると同様の方
法により上記の各測定試料についてα−アミラーゼ活性
測定操作を行い、生成したｐ−ニトロフェノールに基づ
く４１５ｎｍ（主波長）での吸光度を測定した。

【００７２】測定試料（２）ヒト膵液のα−アミラーゼ
活性は、実施例１に於けると同様の算出方法で求めたと
ころ、１１８０Ｕ／Ｌであった。（測定試料（１）試薬
ブランクの吸光度を差し引いた、測定試料（２）ヒト膵
液についての吸光度は、０．０９８７であり、Ｋ−ファ
クターは１１９５６であった。）

【００７３】実施例１と比較例１との比較から、比較例
１で得られたα−アミラーゼ活性測定値は、実施例１で
得られたα−アミラーゼ活性測定値に対して２４％小さ
いことが分かる。

【００７４】

【発明の効果】本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、
α−アミラーゼの真の活性を正しく簡便に自動分析機を
使用して測定することができるという顕著な効果を奏す
る。従って、本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、広
範な種々の起源に由来するα−アミラーゼ活性の測定に
利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例及び比較参考例で得られたヒト血清及び
ヒト膵液についての吸光度と、使用した第一液のｐＨ値
との関係をプロットしたグラフである。

【図２】参考例及び比較参考例で得られたイヌ血清及び
ラット血清についての吸光度と、使用した第一液のｐＨ
値との関係をプロットしたグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】還元性末端が色素で修飾されたマルトオ
リゴ糖からなる基質に、α−アミラーゼを含む検体をカ
ルシウムイオンの共存下に、該α−アミラーゼの活性至
適ｐＨで作用させて基質を分解する第一工程、第一工程
で得られた生成物にα−グルコシダーゼ及びカルシウム
イオン捕捉剤を、α−グルコシダーゼの活性至適ｐＨで
作用させる第二工程、及び第二工程で生成した色素を比
色定量する第三工程からなることを特徴とするα−アミ
ラーゼ活性測定法。
【請求項２】還元性末端が色素で修飾されたマルトオ
リゴ糖からなる基質、水溶性カルシウム塩化合物及び測
定対象のα−アミラーゼの活性至適ｐＨを有する緩衝液
を含む第一液、及び、α−グルコシダーゼ、カルシウム
イオン捕捉剤及びα−グルコシダーゼの活性至適ｐＨを
有する緩衝液を含む第二液からなるα−アミラーゼ活性
測定用試薬。