JPH06219956A - 免疫賦活剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 サイトカイン誘導能を示す新規な免疫賦活剤
の提供。 【構成】 ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエン
スの培養上清液より得ることができ、サイトカイン誘導
能を示し、下記の理化学的性質を有する物質を有効成分
として含有する免疫賦活剤。 a) 外観：白〜淡黄色粉末 b) 元素分析：Ｃ35.5〜39.3％； Ｈ 5.3〜 6.0％；
Ｎ11.3〜12.6％； Ｏ21.2〜26.8％ c) 有機物物の分子量：30,000〜100,000 d) 赤外部吸収スペクトル：以下にあげる各範囲に明ら
かなピークが見られる。3300〜3500, 1650〜1660, 1538
〜1540, 1227〜1229, 1064〜1065cm^-1 e) 糖分含有量：70〜 150μg/mg f) 蛋白含有量：70〜 230μg/mg g) 糖分／蛋白含量比： 0.9〜1.2(重量比)

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な免疫賦活剤、特に
抗腫瘍剤、免疫不全症治療剤等としての効用が期待され
る免疫賦活剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、種々の抗腫瘍性抗生物質が微
生物より生産されていることが知られている。その内の
いくつかのものは、制癌剤として実用化されている。特
に、放線菌由来の制癌剤として、マイトマイシンＣ、ブ
レオマイシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチ
ン等が知られており、治療に応用されている。しかしな
がら多くの抗腫瘍性抗生物質が、骨髄抑制、胃腸障害、
心機能障害や脱毛といった副作用を伴い、癌の患者にと
って大きな負担となっている。又、多くの癌患者におい
て免疫能が低下し、癌の進行の促進が見られたり、各種
細菌に対する抵抗性が減弱し、重篤な感染症にかかりや
すくなる。このような背景から、近年、臨床サイドから
癌の治療法として、クオリティー・オブ・ライフという
概念が検討されるようになり、制癌剤の領域について
も、より副作用の少ない、かつ癌患者の免疫能を亢進し
て癌の治療を試みることが盛んになってきている。

【０００３】放線菌の１種であるストレプトバーチシリ
ウム・ハチジョウエンス（Streptoverticillium hachij
oense ）〔ストレプトマイセス・ハチジョウエンシス
（Streptomyces hachijoensis)と同義〕由来の有効成分
として、膣トリコモナス症に有効なポリエン系抗生物質
トリコマイシンの存在が知られている。また、本発明者
の一人である添田はストレプトバーチシリウム・ハチジ
ョウエンスＨ−２６０９株（IFO 12782)(ATCC 19769)か
ら分子量1200の抗腫瘍物質を得ている( 特公昭49-42560
号公報、防衛衛生 第14巻、第１号、第１頁、1967、特
公昭52-50278号公報) 。また、津国らは同じ菌を用いて
分子量 1.5万〜 3.5万の蛋白質を主体とした抗腫瘍性物
質を得ている( 特公昭56-9517 号公報）。また、河野は
同じ菌を用いて分子量２万から６万の蛋白質を主体とし
た抗腫瘍剤を得た（特開平2-53729号公報）。また、イ
ンターロイキン、腫瘍壊死因子等のサイトカインを誘起
する物質は癌、免疫不全症、感染性疾患等の治療に有用
である（特公平4-69610 号公報、特公平4-5005号公報、
特開平2-258723号公報、特開昭62-19533号公報等) 。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】癌化学療法の分野にお
いては、多様な癌の種類、症状に対応して多様な抗腫瘍
剤が要求されている。本発明は抗腫瘍剤や免疫不全症治
療剤としての効用が期待される免疫賦活剤を提供するこ
とを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明はストレプトバー
チシリウム・ハチジョウエンスの培養上清液より得るこ
とができ、サイトカイン誘導能を示し、下記の理化学的
性質を有する物質を有効成分として含有する免疫賦活剤
に関する。 a) 外観：白〜淡黄色粉末 b) 元素分析：Ｃ35.5〜39.3％； Ｈ5.3 〜 6.0％；
Ｎ11.3〜12.6％； Ｏ21.2〜26.8％ c) 有機物の分子量：30,000〜100,000 d) 赤外部吸収スペクトル：以下にあげる各範囲に明ら
かなピークが見られる。3300〜3500，1650〜1660, 1538
〜1540, 1227〜1229, 1064〜1065cm^-1 e) 糖分含有量：70〜 150μg/mg f) 蛋白含有量：70〜 230μg/mg g) 糖分／蛋白含量比：0.9 〜1.2(重量比) 上記において元素分析で測定されたＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ以外
の成分は無機物であり、無機部分はNa、リン酸イオン、
灰分、水等より構成されると考えられる。また、上記で
元素分析は熱伝導度検出法(Heraeus社 CHN-0-Rapid使
用) 、分子量はゲル濾過法、赤外部吸収スペクトルはKB
r 錠剤法、糖分含有量はフェノール硫酸法、蛋白含有量
はバイオラッド社プロテインアッセイキッドを用いて行
った（実施例１においても同様）。

【０００６】本発明の免疫賦活剤の有効成分は、ストレ
プトバーチシリウム・ハチジョウエンスの培養上清液よ
り得ることができる。ストレプトバーチシリウム・ハチ
ジョウエンスの菌学的性状は、「抗トリコモナス・抗ガ
ン作用を有する新抗生物質、トリコマイシンについて」
（細谷ら、ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス第
10巻、第564 頁、1952年）において、ストレプトバーチ
シリウム・ハチジョウエンスのＨ−２６０９株について
述べられており、また「スタディーズ オンザ アンチ
バイオティクス サブスタンス プロデューシング ス
トレインズＨ２０７５、Ｈ−２６０９アンドＨ−３０３
０」（ザ ジャーナル オブ アンチバイオティクス
シリーズＡ、第７巻、第１号、第10頁、1954年）におい
て、ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンスのＨ
−２６０９株及びＨ−２０７５株について述べられてい
る。また、Ｈ−２６０９株は IFO 12782号(ATCC 19769)
として寄託されている。本発明においてはＨ−２６０９
株、Ｈ−２０７５株、Ｈ−３０３０株を具体的菌株とし
て用いることができるが、それらに限らず、ストレプト
バーチシリウム・ハチジョウエンスに属し、上記有効成
分を生産する能力を有する限り、他の野性株も使用で
き、さらにはこれらの微生物の常法による変異処理（例
えば紫外線照射、変異剤処理、遺伝子工学的処理）によ
って得られる変異株も使用可能である。

【０００７】この放射菌ストレプトバーチシリウム・ハ
チジョウエンスの培養は、以下に示すような方法によっ
て行うことができる。栄養源としては、従来放射線菌の
培養に利用されている公知のものが使用できる。例え
ば、炭素源としてグルコース、糖蜜、澱粉、デキストリ
ン、スクロース、水飴、動植物油等を使用しうる。また
窒素源として大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカ
ー、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウ
ム、硝酸ナトリウム、尿素等を使用しうる。その他必要
に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸およびその他のイ
オンを生成することができる無機塩類を添加すること
は、有効である。また菌の発育を助け、有効成分の生産
を促進するような有機及び無機物を適当に添加すること
ができる。培養方法としては、好気的条件での培養法が
適しており、培養に適当な温度は27〜30℃であるが、多
くの場合28℃付近で培養する。また、培養に適当なpH域
は7.0 〜9.0 である。上記条件下に通常３〜７日培養を
行うことにより活性の高い培養液を得ることができる。

【０００８】培養液からの有効成分の分離は以下のごと
く行われる。まず、培養液から菌体を除去し、菌体除去
液に塩化亜鉛等の電解質無機塩を加えて塩析し、生ずる
沈澱を採取し、これに第二燐酸ナトリウム等の燐酸アル
カリの水溶液を加えて抽出を行い、この抽出液にメタノ
ール等の親水性有機溶媒を加えて沈澱する画分を採取
し、これを水に溶解し不溶物を除去して溶液を得る。こ
のものはそのまま次の工程に使用できるが、必要に応じ
凍結乾燥等によって乾燥物として次の工程に供してもよ
い。この溶液または凍結乾燥物取得までの工程は特公昭
49-42560号にも記載されているが、より具体的には例え
ば以下の如く行われる。すなわち、培養液から菌体を除
去し、その上清に50％(w/v) の塩化亜鉛、硫酸アンモニ
ウム等の電解質無機塩の水溶液を最終濃度約2.5 ％にな
るように加えて塩析し、生ずる沈澱を採取し、これに10
％(w/v) の第二燐酸ナトリウム等の燐酸ナトリウムの水
溶液を上清に対して約55％(w/v) 加えて抽出を行い、こ
の抽出液に親水性有機溶媒であるメタノール、エタノー
ル、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコール
や、アセトン、イソブチルケトン等のケトン系溶媒等を
加えて、沈澱する画分を採取する。採取した沈澱物を蒸
留水に溶解後、適当な濾過材を用いて濾過して不溶物を
除去し、濾液を必要に応じ濃縮、透析、凍結乾燥する
（一次分離物）。この一次分離物は免疫賦活活性成分と
殺細胞活性成分の両方を含んでいる。

【０００９】次にこの一次分離物をゲル透過クロマトグ
ラフィー（gel permeation chromatography)(GPC) に付
して分子量３万〜10万の区分を得る。このゲル透過クロ
マトグラフィーは例えばカラムとしてG3000PW （東ソー
（株）製）を用い、溶出剤として20mM燐酸緩衝液(pH7.
2) ＋0.2MNaClを用いて行うことができる。溶出液を濃
縮し、必要に応じ透析、凍結乾燥して本発明の免疫賦活
剤の有効成分を得る。上記で濃縮は例えば排除分子量３
万の膜を用いる限外濾過によって行うことができる。本
発明の免疫賦活剤の有効成分は上記の如くして得ること
ができ、前記した物性を有する。なお、有効成分は透
析、限外濾過等による無機物の除去の程度によって、通
常、無機物を例えば１０％以下含有する。したがって、
無機物を完全に除去した場合、前記物性値は多少異なる
ものとなり得るが、そのような有効成分を用いる場合も
当然本発明の免疫賦活剤の範囲に入るものである。本有
効成分は殺細胞活性を有さず、サイトカイン誘導能を有
する。サイトカイン誘導能として具体的には腫瘍壊死因
子（TNF)のひとつとしてのTNF-αの誘導能及びインター
ロイキン(IL)のひとつとしてのIL-1の誘導能を有する。
なお、本有効成分は一次分離物と比べて、殺細胞成分を
実質上含有しないこと、及びTNF-α誘導能及びIL-1誘導
能がはるかに高められていることにおいて際立った相異
を示す。

【００１０】癌の免疫療法は担癌宿主の癌に対する抵抗
性を高めることによって癌を治癒させる方法であり、特
に免疫担当細胞の賦活化がその根幹にある。本有効成分
は免疫担当細胞であるマクロファージや脾細胞を活性化
し、腫瘍細胞を障害することから癌の免疫療法剤として
大いに期待できる。又、免疫療法剤は化学療法剤と異な
り血液障害、消化器障害、肺障害、心毒性、神経系障
害、皮膚障害、二次発癌といった副作用や毒性等が現れ
にくく、長期投与する場合も白血球減少その他の造血障
害、肝腎機能障害等をもたらさず、安心して使えるとい
う利点がある。

【００１１】本有効成分の治療への適用については、動
物実験の結果から、注射剤として使用することが好まし
く、特に皮下注射により生体内の網内系を刺激して免疫
系を亢進させるようにするのがよい。また、製剤方法を
選択することにより経口、坐薬等の剤形にして使用する
こともできる。注射剤としては皮下の他、筋肉内、静脈
内注射剤のいずれでもよく、懸濁液、溶液もしくは使用
時溶解させる粉末等の剤形が用いられる。また、注射剤
には局部麻酔剤を含ませる必要はない。注射剤としての
製剤形態は、通常減菌水水溶液を包含する。上記形態の
製剤はまた緩衝剤pH調節剤（リン酸水素ナトリウム、ク
エン酸等）、等張化剤（塩化ナトリウム、グルコース
等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキ
シ安息香酸プロピル等）等の水以外の他の製薬補助剤を
含有することができる。該製剤は細菌保持フィルターを
通す濾過、組成物への殺菌剤の混入、組成物の照射や加
熱によって滅菌することができる。該製剤はまたは殺菌
固体組成物として製造し、用時滅菌水素等に溶解して使
用することもできる。本発明の有効成分の投与量は患者
の症状に応じて適宜選択されるが、一般に成人において
１〜100mg/kgを１日１〜数回に分け投与するのが好まし
く、投与方法としては皮下、筋肉内、静脈内もしくは患
部への注射によってなされるのが好ましい。

【００１２】

【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明す
る。 実施例１ 1) 請求項１の有効成分の製造 ストレプトバーチシリウム・ハチジョウエンスＨ−2609
株の保存菌株2.0ml をスピッツコルベン中の下記組成の
サブロー培地寒天培地50mlに流し込み、28℃で８日間静
置培養した。出現したコロニー（スピッツコルベン２本
分）を 500ml容坂口フラスコ６本中の下記組成の液体培
地各100ml に白金耳で接種し、28℃、150rpmで３日間振
盪培養した。培養物全量（約600ml)を30Ｌ発酵槽中の上
記と同一組成の液体培地16Ｌに加え、28℃、245rpm、通
気量16L/min で３日間通気攪拌培養した。 サブロー寒天培地及び調製 グルコース30g 、ペプトン10g 及び寒天20g を純水1000
mlに溶解。pH無調整。 液体培地及び調製 (1)ポリペプトン5g、プロテオースペプトン(Difco)10
g、グルコース5g、塩化ナトリウム7.5g及び肉エキス3g
を純水1000mlに溶解。 (2)バレイショデンプン20g を純水200ml に溶解。 (1)液を80℃に加熱し、(2) 液を３回に分け、攪拌しな
がら添加、溶解させる。

【００１３】培養終了後、培養物を遠心除菌し、上清液
を吸引濾過した。濾液（12Ｌ）に50％ＺｎＣｌ₂ 0.6 Ｌ
を加え、１分間攪拌し、ついで９分間静置後上記と同様
に吸引濾過した。沈澱を10％Na₂HPO₄ 6.6 Ｌに溶解し、
１時間攪拌し、４℃で一夜静置後上記と同様に吸引濾過
した。濾液 6.6Ｌにメタノール（４℃）26.4Ｌを添加
し、５分攪拌後上記と同様に吸引濾過した。得られた沈
澱を水7.92Ｌに溶解し、上記と同様に吸引濾過した。濾
液 7.9Ｌを凍結乾燥して一次分離物226.7 g を得た。

【００１４】一次分離物92g を22mM燐酸緩衝液（pH7.2)
920ml に溶解し、同緩衝液を用いて充填したＧ3000ＰＷ
φ21.5×60cmカラムに注ぎ、0.2 MNaCl を含有する20mM
燐酸緩衝液（pH7.2)を2.5ml/min の通塔速度で通塔する
ことによりゲル透過クロマトグラフィーを行った。最初
の550ml の溶出液の後の2800mlの溶出液を排除分子量３
万の膜を用いる限外濾過（圧力10Kg/cm²) に40分付し
た。内液を凍結乾燥し、凍結乾燥物を水に溶解し、水に
対して透析し、内液を凍結乾燥して凍結乾燥物（本発明
の免疫賦活剤の有効成分、以下「本発明品」という）10
0mg を得た。この物質の外観は白〜淡黄色粉末で物性値
は下記の通りである。なお物性値に関し、元素分析で測
定されたＣ、Ｈ、Ｎ、Ｏ以外の成分は無機物であり、無
機部分はNa、リン酸イオン、灰分、水等より構成される
と考えられる。 元素分析：Ｃ39.3； Ｈ6.0 ； Ｎ11.3； Ｏ21.2 有機物の分子量：30,000〜100,000 赤外部吸収スペクトル：図１ 紫外部吸収スペクトル（水溶液中で測定）：図２ 糖分含有量：79μg/mg 蛋白含有量：71μg/mg 糖分／蛋白含有量比：1.11

【００１５】2) ＴＦＮ−α誘導能の測定 （誘導方法）７週令の雄性Balb/cマウスにミネラルオイ
ル0.5ml を腹腔内投与した。６日後、冷ハンクス液10ml
で腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）を洗い出し、トリス塩化アン
モニウム溶液5ml を加えて遠心分離により赤血球を除去
した。上清に10％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ
培地（以下単にＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地という）10mlを
加えて遠心分離してマクロファージを沈澱させた。沈澱
にＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地10mlを加えて遠心分離するこ
とによりマクロファージを洗浄する操作を２回繰り返し
てマクロファージを採取した。これをＦＢＳ含有ＤＭＥ
Ｍ培地に4.0 ×10⁶/mlになるように懸濁し、96ウェルマ
イクロプレートに 100μl あて分注し、37℃で１〜２時
間静置培養した。培養液をピペッティングにて除去する
ことにより非付着細胞を除去し、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培
地を加えて 200μｌ/ ウェルとした。ついで種々濃度の
上記１）で得た本発明品水溶液各22μl を各別にウェル
に加え室温で40時間培養した。培養液を４℃、220 ×g
で10分遠心分離して上清を得た。

【００１６】（測定方法）（ゼンザイム社ＴＮＦ−α／
ＥＬＩＳＡ法による） 抗マウスＴＮＦモノクローナル抗体を固定化した96ウェ
ルマイクロプレートに各上清 100μl を各別に加え、室
温で 120分インキュベートした。液体をピペッティング
除去後、ロバ抗マウスＴＮＦポリクローナル抗体の水溶
液 100μl を各ウェルに加え、室温で90分インキュベー
トした。液体をピペッティング除去後、ペルオキシダー
ゼ結合ヤギ抗ロバIg抗体の水溶液 100μl を各ウェルに
加え、室温で60分インキュベートした。液体をピペッテ
ィング除去後、オルトフェニレンジアミン水溶液 100μ
l を加えて４〜６分反応させ、ついで２Ｎ硫酸 100μl
を加えて反応を停止させ、490nm で光学密度（吸光度）
を測定した。その結果、本発明品のＴＮＦ−α誘導量は
誘導時濃度 7.5μg/mlで3200pg/ml であった。なお、本
発明品に代えて同様に試験した結果、一次分離物では0.
5mg/mlで1600pg/ml であり、これより本発明品では比活
性が大幅に向上していることが明らかである。

【００１７】3) ＩＬ−１α誘導能の測定 （誘導方法）懸濁液を96ウェルマイクロプレートに 100
μl あて分注したことを除き、ＴＦＮ−α誘導能の測定
における誘導方法と同一の操作を行って上清を得た。 （測定方法）（ゼンザイム社ＩＬ−１α／ＥＬＩＳＡ法
による） 抗マウスＩＬ−１モノクローナル抗体を固定化した96ウ
ェルマイクロプレートに各上清 100μl を各別に加え、
37℃で40分インキュベートした。液体をピペッティング
除去後、ビオチンを結合した抗マウスＩＬ−１ポリクロ
ーナル抗体の水溶液 100μl を各ウェルに加え、37℃で
40分インキュベートした。液体をピペッティング除去
後、ペルオキシダーゼ結合アビジンの水溶液 100μl を
各ウェルに加え、37℃で25分インキュベートした。液体
をピペッティング除去後、過酸化水素水溶液とテトラメ
チルベンジジン水溶液との混合物を 100μl 添加し、４
〜５分後ＩＭ硫酸 100μl を加えて反応を停止させた。
ついで450nm で光学密度（吸光度）を測定した。その結
果、本発明品のＩＬ−１α誘導量は誘導時濃度60μg/ml
で250pg/mlであった。なお、本発明品に代えて同様に試
験した結果、一次分離物では2mg/mlで350pg/mlであり、
これより本発明品では比活性が大幅に向上していること
が明らかである。

【００１８】

【発明の効果】本発明の免疫賦活剤の活性成分はマクロ
ファージ等の細胞のＴＦＮ−α、ＩＬ−１等のサイトカ
インの産生を誘導する作用を有し、免疫賦活剤及び免疫
賦活抗腫瘍剤、免疫不全症治療剤等としての効用が期待
される。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた、本発明の免疫賦活剤の有
効成分の赤外部吸収スペクトル（KBr 錠剤法）を示す。

【図２】実施例１で得られた、本発明の免疫賦活剤の有
効成分の紫外部吸収スペクトル（水溶液中で測定）を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 川島 浩 福岡県北九州市戸畑区境川１丁目７−４− 202 (72)発明者 岡本 茂 福岡県北九州市小倉北区中井２丁目４−６ −405 (72)発明者 関谷 広勝 福岡県北九州市小倉北区中井４丁目10−３

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ストレプトバーチシリウム・ハチジョウ
   エンスの培養上清液より得ることができ、サイトカイン
   誘導能を示し、下記の理化学的性質を有する物質を有効
   成分として含有する免疫賦活剤。 a) 外観：白〜淡黄色粉末 b) 元素分析：Ｃ35.5〜39.3％； Ｈ5.3 〜 6.0％；
   Ｎ11.3〜12.6％； Ｏ21.2〜26.8％ c) 有機物の分子量：30,000〜100,000 d) 赤外部吸収スペクトル：以下にあげる各範囲に明ら
   かなピークが見られる。3300〜3500，1650〜1660, 1538
   〜1540, 1227〜1229, 1064〜1065cm^-1 e) 糖分含有量：70〜 150μg/mg f) 蛋白含有量：70〜 230μg/mg g) 糖分／蛋白含量比：0.9 〜1.2(重量比)