JPH06220091A - 修飾された血小板第４因子 - Google Patents
修飾された血小板第４因子Info
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- JPH06220091A JPH06220091A JP5237846A JP23784693A JPH06220091A JP H06220091 A JPH06220091 A JP H06220091A JP 5237846 A JP5237846 A JP 5237846A JP 23784693 A JP23784693 A JP 23784693A JP H06220091 A JPH06220091 A JP H06220091A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/522—Alpha-chemokines, e.g. NAP-2, ENA-78, GRO-alpha/MGSA/NAP-3, GRO-beta/MIP-2alpha, GRO-gamma/MIP-2beta, IP-10, GCP-2, MIG, PBSF, PF-4, KC
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 修飾された血小板第４因子を提供する。
【構成】 式：
NH2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Gl
u-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-
Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Le
u-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-COOH で示されるアミノ酸配列を含有する修飾血小板第４因
子。 【効果】 脈管形成阻害剤の活性成分として有効。
u-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-
Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Le
u-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-COOH で示されるアミノ酸配列を含有する修飾血小板第４因
子。 【効果】 脈管形成阻害剤の活性成分として有効。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト血小板第４因子から
プロセスされた新規なＮ−末端領域［以下、修飾された
ヒト血小板第４因子（ＭＰＦ−４）と称する］について
の発見に基づく。本発明はまた、蛋白分解的に開裂され
た、非還元型血小板第４因子［以下、開裂された血小板
第４因子（ＣＰＦ−４）と称する］をも含む。ＭＰＦ−
４およびＣＰＦ−４のいずれもリポ多糖類で刺激した抹
消血白血球（ＰＢＬ）のスペント（spent)培養培地から
単離され得る。
プロセスされた新規なＮ−末端領域［以下、修飾された
ヒト血小板第４因子（ＭＰＦ−４）と称する］について
の発見に基づく。本発明はまた、蛋白分解的に開裂され
た、非還元型血小板第４因子［以下、開裂された血小板
第４因子（ＣＰＦ−４）と称する］をも含む。ＭＰＦ−
４およびＣＰＦ−４のいずれもリポ多糖類で刺激した抹
消血白血球（ＰＢＬ）のスペント（spent)培養培地から
単離され得る。
【０００２】
【従来技術と発明が解決すべき課題】アミノ酸配列決定
により、ＭＰＦ−４はSer-14から始まって、血小板第４
因子（ＰＦ−４）と相同であり、従って、天然に存在す
るＰＦ−４の開裂産物であることが分かった。ＣＰＦ−
４はＰＦ−４と同じアミノ酸配列を有するが、残基１６
と１７の間のペプチド結合が存在しない点で異なる。し
かしながら、生成した２つのペプチドはジスルフィド結
合を介して結合したままの状態に止まっている。最も重
要な点は、本発明の化合物は内皮細胞増殖の強力な阻害
物質であり、ＰＦ−４の起源および報告した実験室によ
って異なるが、いずれにせよ天然のＰＦ−４の１０〜１
００倍、活性である。
により、ＭＰＦ−４はSer-14から始まって、血小板第４
因子（ＰＦ−４）と相同であり、従って、天然に存在す
るＰＦ−４の開裂産物であることが分かった。ＣＰＦ−
４はＰＦ−４と同じアミノ酸配列を有するが、残基１６
と１７の間のペプチド結合が存在しない点で異なる。し
かしながら、生成した２つのペプチドはジスルフィド結
合を介して結合したままの状態に止まっている。最も重
要な点は、本発明の化合物は内皮細胞増殖の強力な阻害
物質であり、ＰＦ−４の起源および報告した実験室によ
って異なるが、いずれにせよ天然のＰＦ−４の１０〜１
００倍、活性である。
【０００３】ＰＦ−４はミトゲンまたはサイトカインに
よる刺激の後に様々な型の細胞から放出される小さい誘
導可能なタンパク質の成長ファミリーの原型（プロトタ
イプ）メンバーである。このタンパク質ファミリーは
「インタークリン(intercrine)」として知られており、
それらは脈管形成、細胞増殖、凝固、炎症、および組織
の修復など様々な生物学的工程を調節していることが分
かっている。オッペンハイムら（Oppenheim et al., Pr
operties of the Norvel Proinflamatory Supergene "I
ntercrine" Cytokine Family, Ann.Rev. Immunol. 9: 61
7-648, 1991）;テイラーら（Taylor et al., Protamine
is an Inhibitor of Angiogenesis, Nat ure 297: 307-
312, 1982）; マイオンら（Maione et al., Inhibition
of Angiogenesis by Recombinant Human Platelet Fac
tor-4 and Related Peptides, Science 247: 77-79, 19
90)。インタークリンファミリーの他のメンバーには、
インターロイキン−８（ＩＬ−８）、メラノサイト成長
刺激活性（ｈＧｒｏ／ＭＧＳＡ）、β−トロンボグロブ
リン（β−ＴＧ）、好中球活性化タンパク（ＮＡＰ−
２）、ＩＰ−１０，およびマクロファージ炎症タンパク
質（ＭＩＰ−２）が含まれる。リンドレィら（Lindley
et al.）, Synthesisi and Expression in Escherichia
coli of the Gnene Encoding Monocyte-derived Neuro
phil-Activating Factor: Biological Equivalence bet
ween Natural and Recombinant Neutrohil-activating
Factor, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:9199-9203 (198
8); ワルツら（Waltz et al.）, A Novel Cleavage of
Stimulated Mononuclear Cells Activates Human Neutr
ophils, Biochem. Biophys. Res., Commun. 159: 969-9
75, 1989; ラスター（Lusteret al.）, Gamma-interfer
on Transcriptionally Regulates an Early ResponseGe
ne Containing Homology to Platelet Proteins, Natur
e 315:672-676, 1985;およびウォルプら（Wolpe et a
l.）, Identification and Characterization of Macro
phage Inflammatory Protein 2, Proc.Natl.Acad. Sci.
86:612-616, 1989。
よる刺激の後に様々な型の細胞から放出される小さい誘
導可能なタンパク質の成長ファミリーの原型（プロトタ
イプ）メンバーである。このタンパク質ファミリーは
「インタークリン(intercrine)」として知られており、
それらは脈管形成、細胞増殖、凝固、炎症、および組織
の修復など様々な生物学的工程を調節していることが分
かっている。オッペンハイムら（Oppenheim et al., Pr
operties of the Norvel Proinflamatory Supergene "I
ntercrine" Cytokine Family, Ann.Rev. Immunol. 9: 61
7-648, 1991）;テイラーら（Taylor et al., Protamine
is an Inhibitor of Angiogenesis, Nat ure 297: 307-
312, 1982）; マイオンら（Maione et al., Inhibition
of Angiogenesis by Recombinant Human Platelet Fac
tor-4 and Related Peptides, Science 247: 77-79, 19
90)。インタークリンファミリーの他のメンバーには、
インターロイキン−８（ＩＬ−８）、メラノサイト成長
刺激活性（ｈＧｒｏ／ＭＧＳＡ）、β−トロンボグロブ
リン（β−ＴＧ）、好中球活性化タンパク（ＮＡＰ−
２）、ＩＰ−１０，およびマクロファージ炎症タンパク
質（ＭＩＰ−２）が含まれる。リンドレィら（Lindley
et al.）, Synthesisi and Expression in Escherichia
coli of the Gnene Encoding Monocyte-derived Neuro
phil-Activating Factor: Biological Equivalence bet
ween Natural and Recombinant Neutrohil-activating
Factor, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:9199-9203 (198
8); ワルツら（Waltz et al.）, A Novel Cleavage of
Stimulated Mononuclear Cells Activates Human Neutr
ophils, Biochem. Biophys. Res., Commun. 159: 969-9
75, 1989; ラスター（Lusteret al.）, Gamma-interfer
on Transcriptionally Regulates an Early ResponseGe
ne Containing Homology to Platelet Proteins, Natur
e 315:672-676, 1985;およびウォルプら（Wolpe et a
l.）, Identification and Characterization of Macro
phage Inflammatory Protein 2, Proc.Natl.Acad. Sci.
86:612-616, 1989。
【０００４】ＰＦ−４の完全な１次構造は当業界で周知
である［ポンツら(Poncz et al., Cloning and Charact
erization of Platelet Factor 4 cDNA Derived from a
Human Erythroleukemic Cell Line, Blood 69:219-22
3, 1987］。ＰＦ−４の類似体およびフラグメントも周
知であり、本明細書に引用する米国特許４，６４５，８
２８及び４，７３７，５８０で「オンコスタチン−Ａ」
と称されている。研究の結果、インタークリンファミリ
ーのタンパク質はＮ−末端領域に位置するシステイン−
Ｘ−システイン（ＣＸＣ）モチーフを特徴とすることが
分かった。このＣＸＣモチーフは残基Cys-36およびCys-
51との分子内ジスルフィド結合の形成を介して第２およ
び第３次構造の生産に関与している［セントチャールス
ら（St.Charles et al.）, The Three-dimensional Str
ucture of Bovine Platelet Factor4 at 3.0-A Resolut
ion, J.B iol.Chem. 264:2092-2098 , 1989］。さらに、
公開されたウシＰＦ−４の３次元構造に基づいて、Ｎ−
末端残基Gln-9からVal-19は大きいオープンループを形
成しており、Thr-16はCys-51と水素結合していることが
決定された。これらのＮ−末端構造はＰＦ−４の免疫調
節活性に重要であることが示された［カッツら（Katz e
t al.）, Protease-induced Immunoregulatory Activit
y of Platelet Factor 4, Proc. Natl. Ac ad. Sci. 83:
3491-3495, 1986］。
である［ポンツら(Poncz et al., Cloning and Charact
erization of Platelet Factor 4 cDNA Derived from a
Human Erythroleukemic Cell Line, Blood 69:219-22
3, 1987］。ＰＦ−４の類似体およびフラグメントも周
知であり、本明細書に引用する米国特許４，６４５，８
２８及び４，７３７，５８０で「オンコスタチン−Ａ」
と称されている。研究の結果、インタークリンファミリ
ーのタンパク質はＮ−末端領域に位置するシステイン−
Ｘ−システイン（ＣＸＣ）モチーフを特徴とすることが
分かった。このＣＸＣモチーフは残基Cys-36およびCys-
51との分子内ジスルフィド結合の形成を介して第２およ
び第３次構造の生産に関与している［セントチャールス
ら（St.Charles et al.）, The Three-dimensional Str
ucture of Bovine Platelet Factor4 at 3.0-A Resolut
ion, J.B iol.Chem. 264:2092-2098 , 1989］。さらに、
公開されたウシＰＦ−４の３次元構造に基づいて、Ｎ−
末端残基Gln-9からVal-19は大きいオープンループを形
成しており、Thr-16はCys-51と水素結合していることが
決定された。これらのＮ−末端構造はＰＦ−４の免疫調
節活性に重要であることが示された［カッツら（Katz e
t al.）, Protease-induced Immunoregulatory Activit
y of Platelet Factor 4, Proc. Natl. Ac ad. Sci. 83:
3491-3495, 1986］。
【０００５】ＲＦ−４は主に血小板のアルファ顆粒に見
いだされているが、ゲノムクローニングにより、ヒトＲ
Ｆ−４遺伝子がＲＦ−４の２つの形、即ちＲＦ−４ｖａ
ｒＩおよびＲＦ−４ａｌｔ、を生産するという２重性が
明らかになった［ドイら（Doi et al.）, Structure of
the Rat Platelet Factor 4 Gnene: A Marker for Mag
akaryocyte Differentiation, Mol. Cell Biol. 7: 898
-912, 1987］。変異体の推定のアミノ酸配列 は、Ｎ−
末端リーダー配列およびリジンに富むＣ−末端ドメイン
における重要な相違を示した［グリーンら（Green et a
l.）, Identification and Characterization of RF4va
rl, a Human Gene Variant of PlateletFactor 4, Mol.
Cel l. Biol.9: 1445ー1451、 1989; エイスマンら（Eis
man etal.）, Structural and Functional Comparison
of the Genes for Human Platelet Factor 4 and RF4al
t, Blood 76: 336-344, 1990］。リーダー配列における
変化はその分泌方法の相違およびそれが発現する組織の
違いを示唆している。このように、ＰＦ−４の異なる２
つの形は血小板以外の細胞によっても生産される。
いだされているが、ゲノムクローニングにより、ヒトＲ
Ｆ−４遺伝子がＲＦ−４の２つの形、即ちＲＦ−４ｖａ
ｒＩおよびＲＦ−４ａｌｔ、を生産するという２重性が
明らかになった［ドイら（Doi et al.）, Structure of
the Rat Platelet Factor 4 Gnene: A Marker for Mag
akaryocyte Differentiation, Mol. Cell Biol. 7: 898
-912, 1987］。変異体の推定のアミノ酸配列 は、Ｎ−
末端リーダー配列およびリジンに富むＣ−末端ドメイン
における重要な相違を示した［グリーンら（Green et a
l.）, Identification and Characterization of RF4va
rl, a Human Gene Variant of PlateletFactor 4, Mol.
Cel l. Biol.9: 1445ー1451、 1989; エイスマンら（Eis
man etal.）, Structural and Functional Comparison
of the Genes for Human Platelet Factor 4 and RF4al
t, Blood 76: 336-344, 1990］。リーダー配列における
変化はその分泌方法の相違およびそれが発現する組織の
違いを示唆している。このように、ＰＦ−４の異なる２
つの形は血小板以外の細胞によっても生産される。
【０００６】ＰＦ−４のリジンに富むＣ−末端領域はヘ
パリンに強く結合しグリコサミノグリカンに関連してい
ることも周知である［ルシンスキら（Rucinski et a
l.）, Human Platelet Factor 4 and its C-terminal P
eptides: Heparin Binding andClearance from the Cir
culation, Thrombos. Haemos tas. 63: 493-498, 199
0］。 突然変異型ＲＦ−４については、突然変異体を
脈管形成性疾患の治療に用いることが開示された。本明
細書に引用する米国特許５，０８６，１６４および５，
１１２，９４６参照。これらの特許では、ＲＦ−４のＣ
−末端領域を修飾すると、もはやヘパリン結合能力をも
たない類似体が得られることを教示している。本発明
は、ＲＦ−４のプロセスされた型である、ＭＰＦ−４お
よびＣＰＦ−４を開示する。
パリンに強く結合しグリコサミノグリカンに関連してい
ることも周知である［ルシンスキら（Rucinski et a
l.）, Human Platelet Factor 4 and its C-terminal P
eptides: Heparin Binding andClearance from the Cir
culation, Thrombos. Haemos tas. 63: 493-498, 199
0］。 突然変異型ＲＦ−４については、突然変異体を
脈管形成性疾患の治療に用いることが開示された。本明
細書に引用する米国特許５，０８６，１６４および５，
１１２，９４６参照。これらの特許では、ＲＦ−４のＣ
−末端領域を修飾すると、もはやヘパリン結合能力をも
たない類似体が得られることを教示している。本発明
は、ＲＦ−４のプロセスされた型である、ＭＰＦ−４お
よびＣＰＦ−４を開示する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、本質的に、配
列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質からなるＭ
ＰＦ−４組成物、および本質的に、配列番号２のアミノ
酸配列を有するタンパク質とジスルフィド結合している
配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる
ＣＰＦ−４組成物を含む。このジスルフィド結合は、Ｃ
ＰＦ−４の２つのタンパク質鎖を、配列番号１のCys-20
と配列番号２のCys-10、および配列番号１のCys-36と配
列番号２のCys-12との間で架橋している。本発明はま
た、逆相クロマトグラフィー、次いでヘパリンアフィニ
ティークロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフ
ィーからなる、ＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４の精製法を
も含む。さらに、阻害量のＭＰＦ−４またはＣＰＦ−４
を投与することからなる脈管形成阻害法をも主張するも
のである。最後に、ＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４をコー
ドする組換えＤＮＡ化合物は、そのような組換えＤＮＡ
化合物を含有するベクターおよび宿主細胞として本発明
の範囲に包含される。図１はＭＰＦ−４、ＣＰＦ−４お
よびＰＦ−４による内皮細胞増殖の阻害を示す濃度−効
果グラフである。ＭＰＦ−４は５４アミノ酸残基からな
り、ＳＤＳ ＰＡＧＥで測定した分子量が約７キロダル
トンである、天然に存在するタンパク質である。ＭＰＦ
−４は、ＰＦ−４の５４Ｃ−末端配列と１００％相同性
であり、ＰＦ−４のプロセス形であると考えられてい
る。ＭＰＦ−４のアミノ酸配列は配列番号１に記載され
ている。ＣＰＦ−４は、１６アミノ酸鎖（配列番号２）
およびＭＰＦ−４の５４アミノ酸鎖（配列番号１）から
なる。ＣＰＦ−４はＳＤＳ ＰＡＧＥにより測定した分
子量が約７.８〜８.０キロダルトンである。ＣＰＦ−４
の２つのタンパク質鎖は配列番号１のCys-20と配列番号
２のCys-10の間との間、および配列番号１のCys-36と配
列番号２のCys-12との間でジスルフィド結合により結合
している。
列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質からなるＭ
ＰＦ−４組成物、および本質的に、配列番号２のアミノ
酸配列を有するタンパク質とジスルフィド結合している
配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる
ＣＰＦ−４組成物を含む。このジスルフィド結合は、Ｃ
ＰＦ−４の２つのタンパク質鎖を、配列番号１のCys-20
と配列番号２のCys-10、および配列番号１のCys-36と配
列番号２のCys-12との間で架橋している。本発明はま
た、逆相クロマトグラフィー、次いでヘパリンアフィニ
ティークロマトグラフィー、次いで逆相クロマトグラフ
ィーからなる、ＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４の精製法を
も含む。さらに、阻害量のＭＰＦ−４またはＣＰＦ−４
を投与することからなる脈管形成阻害法をも主張するも
のである。最後に、ＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４をコー
ドする組換えＤＮＡ化合物は、そのような組換えＤＮＡ
化合物を含有するベクターおよび宿主細胞として本発明
の範囲に包含される。図１はＭＰＦ−４、ＣＰＦ−４お
よびＰＦ−４による内皮細胞増殖の阻害を示す濃度−効
果グラフである。ＭＰＦ−４は５４アミノ酸残基からな
り、ＳＤＳ ＰＡＧＥで測定した分子量が約７キロダル
トンである、天然に存在するタンパク質である。ＭＰＦ
−４は、ＰＦ−４の５４Ｃ−末端配列と１００％相同性
であり、ＰＦ−４のプロセス形であると考えられてい
る。ＭＰＦ−４のアミノ酸配列は配列番号１に記載され
ている。ＣＰＦ−４は、１６アミノ酸鎖（配列番号２）
およびＭＰＦ−４の５４アミノ酸鎖（配列番号１）から
なる。ＣＰＦ−４はＳＤＳ ＰＡＧＥにより測定した分
子量が約７.８〜８.０キロダルトンである。ＣＰＦ−４
の２つのタンパク質鎖は配列番号１のCys-20と配列番号
２のCys-10の間との間、および配列番号１のCys-36と配
列番号２のCys-12との間でジスルフィド結合により結合
している。
【０００８】当業者ならば容易に理解することである
が、本発明に不利な影響を及ぼす事なく、これらの配列
に幾つかの保存的アミノ酸置換を行うことができる。保
存的アミノ酸置換にはGlyとAla、AspとGlu、AsnとGln、
PheとTyr、LysとArgの間の相互変化が含まれる。親タン
パク質と同様に、ＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４の両者は
ヘパリンと結合し、内皮細胞の増殖を阻止するので、そ
れらは脈管形成および細胞増殖疾患の治療に有用な、魅
力ある候補者である。ヘパリン結合領域は配列番号１の
Lys-45からLys-50の間と考えられる。 本明細書に開示した配列情報および固相タンパク質合成
における技術状態を鑑みて、本質的に純粋なＭＰＦ−４
およびＣＰＦ−４を化学合成によって得ることができ
る。ポリペプチドの固相化学合成の原理は当業者に周知
であり、一般的な書物に認めることができる［例、デュ
ーガス（Dugas,H.）およびペニー（Penney, C.）, Bioo
rganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, New York,
p.54-92］。
が、本発明に不利な影響を及ぼす事なく、これらの配列
に幾つかの保存的アミノ酸置換を行うことができる。保
存的アミノ酸置換にはGlyとAla、AspとGlu、AsnとGln、
PheとTyr、LysとArgの間の相互変化が含まれる。親タン
パク質と同様に、ＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４の両者は
ヘパリンと結合し、内皮細胞の増殖を阻止するので、そ
れらは脈管形成および細胞増殖疾患の治療に有用な、魅
力ある候補者である。ヘパリン結合領域は配列番号１の
Lys-45からLys-50の間と考えられる。 本明細書に開示した配列情報および固相タンパク質合成
における技術状態を鑑みて、本質的に純粋なＭＰＦ−４
およびＣＰＦ−４を化学合成によって得ることができ
る。ポリペプチドの固相化学合成の原理は当業者に周知
であり、一般的な書物に認めることができる［例、デュ
ーガス（Dugas,H.）およびペニー（Penney, C.）, Bioo
rganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, New York,
p.54-92］。
【０００９】例えば、ＭＰＦ−４のようなタンパク質ま
たはペプチドはApplied Biosystems430A peptide synth
esizer (Applied Biosystems Inc., 850 Lincoln Cente
r Drive, Foster City, CA 94404)により、Applied Bio
systems供給の合成サイクルを用いて固相法で合成する
ことができる。Ｂｏｃアミノ酸および他の試薬はApplie
d Biosystemsおよび他の化学試薬会社から市販されて
いる。ダブルカップリング法（double couple protoco
l)を用いる連続Ｂｏｃ化学を出発ｐ−メチルベンズヒド
リルアミン残基に適用してＣ−末端カルボキサミドを生
成させる。Ｃ−末端酸の生成のためには、対応するＰＡ
Ｍ樹脂を用いる。アスアラギン、グルタミン、およびア
ルギニンを予め形成しておいたヒドロキシベンゾトリア
ゾールエステルを用いて結合させる。以下の側鎖保護基
を用いてもよい。Arg, トシル; Asp, シクロヘキシル;
Glu, シクロヘキシル; Ser, ベンジル; Thr, ベンジル;
Tyr, ４−ブロモカーボベンゾキシ。
たはペプチドはApplied Biosystems430A peptide synth
esizer (Applied Biosystems Inc., 850 Lincoln Cente
r Drive, Foster City, CA 94404)により、Applied Bio
systems供給の合成サイクルを用いて固相法で合成する
ことができる。Ｂｏｃアミノ酸および他の試薬はApplie
d Biosystemsおよび他の化学試薬会社から市販されて
いる。ダブルカップリング法（double couple protoco
l)を用いる連続Ｂｏｃ化学を出発ｐ−メチルベンズヒド
リルアミン残基に適用してＣ−末端カルボキサミドを生
成させる。Ｃ−末端酸の生成のためには、対応するＰＡ
Ｍ樹脂を用いる。アスアラギン、グルタミン、およびア
ルギニンを予め形成しておいたヒドロキシベンゾトリア
ゾールエステルを用いて結合させる。以下の側鎖保護基
を用いてもよい。Arg, トシル; Asp, シクロヘキシル;
Glu, シクロヘキシル; Ser, ベンジル; Thr, ベンジル;
Tyr, ４−ブロモカーボベンゾキシ。
【００１０】Ｂｏｃ脱保護は塩化メチレン中、トリフル
オロ酢酸で行うことが出来る。ペプチド合成の完了後、
ペプチドを、１０％メタクレゾール含有無水フッ化水素
（ＨＦ）脱保護し、樹脂から開裂する。側鎖保護基
（群）の開裂およびペプチドの樹脂からの開裂は、０℃
またはそれ以下、好ましくは−２０℃で３０分間、次い
で０℃で２０分間行う。ＨＦの除去後、ペプチド／樹脂
をエーテル洗浄し、ペプチドを氷酢酸で抽出し、凍結乾
燥する。同様に、分子生物学の技術により、当業者は本
質的に純粋なＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４を製造する他
の手段を得ることができる。両分子とも、固相ペプチド
合成法、スペント培養培地からの単離、または組換え法
で製造することができるが、高収率を望むなら組換え法
が好ましい。ＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４のいずれも、
組換え法による製造の基本工程には、以下の工程が含ま
れる。 ａ）ＭＰＦ−４をコードする天然ＤＮＡ配列の単離また
は合成または半合成ＤＮＡ暗号配列を構築する、 ｂ）暗号配列をタンパク質が単独または融合タンパク質
として発現されるに適した方法で発現ベクターに配置す
る、 ｃ）適当な真核性または原核性宿主細胞を発現ベクター
で形質転換する、 ｄ）形質転換された宿主細胞を、ＭＰＦ−４またはＣＰ
Ｆ−４を発現させる条件下で培養する、 ｅ）組換え的に製造されたタンパク質を回収、精製し、
（もし必要なら）タンパク質を天然の立体配座に再度お
りたたむ。
オロ酢酸で行うことが出来る。ペプチド合成の完了後、
ペプチドを、１０％メタクレゾール含有無水フッ化水素
（ＨＦ）脱保護し、樹脂から開裂する。側鎖保護基
（群）の開裂およびペプチドの樹脂からの開裂は、０℃
またはそれ以下、好ましくは−２０℃で３０分間、次い
で０℃で２０分間行う。ＨＦの除去後、ペプチド／樹脂
をエーテル洗浄し、ペプチドを氷酢酸で抽出し、凍結乾
燥する。同様に、分子生物学の技術により、当業者は本
質的に純粋なＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４を製造する他
の手段を得ることができる。両分子とも、固相ペプチド
合成法、スペント培養培地からの単離、または組換え法
で製造することができるが、高収率を望むなら組換え法
が好ましい。ＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４のいずれも、
組換え法による製造の基本工程には、以下の工程が含ま
れる。 ａ）ＭＰＦ−４をコードする天然ＤＮＡ配列の単離また
は合成または半合成ＤＮＡ暗号配列を構築する、 ｂ）暗号配列をタンパク質が単独または融合タンパク質
として発現されるに適した方法で発現ベクターに配置す
る、 ｃ）適当な真核性または原核性宿主細胞を発現ベクター
で形質転換する、 ｄ）形質転換された宿主細胞を、ＭＰＦ−４またはＣＰ
Ｆ−４を発現させる条件下で培養する、 ｅ）組換え的に製造されたタンパク質を回収、精製し、
（もし必要なら）タンパク質を天然の立体配座に再度お
りたたむ。
【００１１】既述のごとく、２つのタンパク質の暗号配
列は全合成でき、またはそれらは、より大きい、天然の
ＲＦ−４暗号ＤＮＡの修飾の結果であってもよい。天然
ＲＦ−４をコードするＤＮＡ配列は、米国特許第５，０
８６，１６４号に記載されており、所望の結果を得るた
めに、その天然配列を変化させることにより、ＭＰＦ−
４または前駆体の組換え製造における出発物質として用
いることができる。そのインビトロまたはインビボでの
転写および翻訳によりＭＰＦ−４またはＣＰＦ−４のい
ずれかを生成する合成遺伝子は当業者に周知の方法で構
築することができる。遺伝子暗号の縮重の結果、当業者
はＭＰＦ−４またはＣＰＦ−４のいずれかをコードする
数多くのしかし一定の数のＤＮＡ配列が構築されること
を理解し得るであろう。合成遺伝子の構築法は当該技術
分野で周知であろう。ブラウンら（Brown, etal.）, (1
979) Methods in Enzymology, Academic Press, N.
Y．，Vol.68, p.109-151参照。ＭＰＦ−４またはＣＰＦ
−４をコードするＤＮＡ配列は本明細書に開示され公開
されたＰＦ−４ＤＮＡ配列に基づいて設計され得る。１
度設計されれば、配列そのものは、Applied Biosystems
Model 380Aまたは380B DNA Synthesizer(Applied Bios
ystems Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster Cit
y, CA94404)のような通常のＤＮＡ合成装置を用いて生
成することができる。
列は全合成でき、またはそれらは、より大きい、天然の
ＲＦ−４暗号ＤＮＡの修飾の結果であってもよい。天然
ＲＦ−４をコードするＤＮＡ配列は、米国特許第５，０
８６，１６４号に記載されており、所望の結果を得るた
めに、その天然配列を変化させることにより、ＭＰＦ−
４または前駆体の組換え製造における出発物質として用
いることができる。そのインビトロまたはインビボでの
転写および翻訳によりＭＰＦ−４またはＣＰＦ−４のい
ずれかを生成する合成遺伝子は当業者に周知の方法で構
築することができる。遺伝子暗号の縮重の結果、当業者
はＭＰＦ−４またはＣＰＦ−４のいずれかをコードする
数多くのしかし一定の数のＤＮＡ配列が構築されること
を理解し得るであろう。合成遺伝子の構築法は当該技術
分野で周知であろう。ブラウンら（Brown, etal.）, (1
979) Methods in Enzymology, Academic Press, N.
Y．，Vol.68, p.109-151参照。ＭＰＦ−４またはＣＰＦ
−４をコードするＤＮＡ配列は本明細書に開示され公開
されたＰＦ−４ＤＮＡ配列に基づいて設計され得る。１
度設計されれば、配列そのものは、Applied Biosystems
Model 380Aまたは380B DNA Synthesizer(Applied Bios
ystems Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster Cit
y, CA94404)のような通常のＤＮＡ合成装置を用いて生
成することができる。
【００１２】ＭＰＦ−４またはＣＰＦ−４を発現させる
ために、適当な制限エンドヌクレアーゼを用い、操作さ
れた合成ＤＮＡ配列を多くの適当な組換えＤＮＡ発現ベ
クターに挿入する。一般的手法は、マニアティスらの記
載（Maniatis et al., (1989) Molecular Cloning; A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPre
ss, N.Y., Vol. 1-3）参照。既知の増幅および発現ベク
ターからの単離および導入を容易にするよう、ＭＰＦ−
４をコードするＤＮＡのいずれかの末端に制限エンドヌ
クレアーゼ開裂部位を工作して入れる。使用する特定の
エンドヌクレアーゼは、用いる親発現ベクターの制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂パターンによって決まる。制限部
位は、目的のタンパク質の適切な枠内（インフレーム）
読み取りおよび発現が達成されるよう、暗号配列とコン
トロール配列が適切な方向になるよう選択される。暗号
配列は発現ベクターの、いずれもタンパク質を発現させ
るべき宿主細胞内で機能的なプロモーターおよびリボソ
ーム結合部位と共に、適当なリーディングフレーム内に
あるよう、位置しなければならない。
ために、適当な制限エンドヌクレアーゼを用い、操作さ
れた合成ＤＮＡ配列を多くの適当な組換えＤＮＡ発現ベ
クターに挿入する。一般的手法は、マニアティスらの記
載（Maniatis et al., (1989) Molecular Cloning; A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPre
ss, N.Y., Vol. 1-3）参照。既知の増幅および発現ベク
ターからの単離および導入を容易にするよう、ＭＰＦ−
４をコードするＤＮＡのいずれかの末端に制限エンドヌ
クレアーゼ開裂部位を工作して入れる。使用する特定の
エンドヌクレアーゼは、用いる親発現ベクターの制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂パターンによって決まる。制限部
位は、目的のタンパク質の適切な枠内（インフレーム）
読み取りおよび発現が達成されるよう、暗号配列とコン
トロール配列が適切な方向になるよう選択される。暗号
配列は発現ベクターの、いずれもタンパク質を発現させ
るべき宿主細胞内で機能的なプロモーターおよびリボソ
ーム結合部位と共に、適当なリーディングフレーム内に
あるよう、位置しなければならない。
【００１３】合成遺伝子の効率的な発現を達成するため
に、該遺伝子はプロモーター−オペレーター領域に操作
可能に結合しなければならない。従って、合成遺伝子の
プロモーター−オペレーター領域は合成遺伝子のＡＴＧ
開始コドンと同じ連続方向に配置される。当該技術分野
では、原核性および真核性細胞を形質転換するのに有用
な様々な発現ベクターが知られている。The Promega Bi
ological Research Produ cts Catalogue (1992)(Promeg
a Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, 5371
1-5399); およびT he Stratagene Cloning Systems Cata
logue (1992) (StrategeneCloning Systems Catalogue
(1992)(Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines
Road, La Jolla, CA, 92037）参照。米国特許第４，７
１０，４７３は大腸菌内で高レベルに外因性遺伝子を発
現させるのに有用な環状ＤＮＡプラスミド形質転換ベク
ターを記載している。これらのプラスミドは組換えＤＮ
Ａ法における形質転換ベクターとして有用であり、そし
て （ａ）プラスミドに宿主細胞内で自律的に複製する能力
を付与し、 （ｂ）宿主細胞培養を維持する温度に関して、自律的な
プラスミドの複製をコントロールし、 （ｃ）宿主細胞集団の中でのプラスミドを安定維持し、 （ｄ）宿主細胞集団内でのプラスミドの維持を示す、生
産物のタンパク質生成物能力合成を指令し、 （ｅ）プラスミドにユニークな一連の制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位を与え、そして （ｆ）ｍＲＮＡ転写を終止する。
に、該遺伝子はプロモーター−オペレーター領域に操作
可能に結合しなければならない。従って、合成遺伝子の
プロモーター−オペレーター領域は合成遺伝子のＡＴＧ
開始コドンと同じ連続方向に配置される。当該技術分野
では、原核性および真核性細胞を形質転換するのに有用
な様々な発現ベクターが知られている。The Promega Bi
ological Research Produ cts Catalogue (1992)(Promeg
a Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, 5371
1-5399); およびT he Stratagene Cloning Systems Cata
logue (1992) (StrategeneCloning Systems Catalogue
(1992)(Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines
Road, La Jolla, CA, 92037）参照。米国特許第４，７
１０，４７３は大腸菌内で高レベルに外因性遺伝子を発
現させるのに有用な環状ＤＮＡプラスミド形質転換ベク
ターを記載している。これらのプラスミドは組換えＤＮ
Ａ法における形質転換ベクターとして有用であり、そし
て （ａ）プラスミドに宿主細胞内で自律的に複製する能力
を付与し、 （ｂ）宿主細胞培養を維持する温度に関して、自律的な
プラスミドの複製をコントロールし、 （ｃ）宿主細胞集団の中でのプラスミドを安定維持し、 （ｄ）宿主細胞集団内でのプラスミドの維持を示す、生
産物のタンパク質生成物能力合成を指令し、 （ｅ）プラスミドにユニークな一連の制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位を与え、そして （ｆ）ｍＲＮＡ転写を終止する。
【００１４】これらの環状ＤＮＡプラスミドは外因性遺
伝子の高レベル発現を確かにする上で、ベクターとして
有用である。発現ベクターが構築されたら、次の工程で
はベクターを適当な細胞に導入し、その結果、目的遺伝
子の発現に有用な組換え宿主細胞を構築する。組換えＤ
ＮＡベクターによる形質転換の方法は当該技術分野で周
知であり、マニアティスら（前掲）のような一般的な参
考書に記載されている。宿主細胞は真核性または原核性
細胞のいずれからも構築される。真核性宿主細胞は、発
現されたタンパク質の、翻訳後グリコシル化を行うこと
ができ、あるものは、所望のタンパク質を培養培地に分
泌することができる。
伝子の高レベル発現を確かにする上で、ベクターとして
有用である。発現ベクターが構築されたら、次の工程で
はベクターを適当な細胞に導入し、その結果、目的遺伝
子の発現に有用な組換え宿主細胞を構築する。組換えＤ
ＮＡベクターによる形質転換の方法は当該技術分野で周
知であり、マニアティスら（前掲）のような一般的な参
考書に記載されている。宿主細胞は真核性または原核性
細胞のいずれからも構築される。真核性宿主細胞は、発
現されたタンパク質の、翻訳後グリコシル化を行うこと
ができ、あるものは、所望のタンパク質を培養培地に分
泌することができる。
【００１５】原核性宿主細胞は一般にタンパク質を高速
で製造し、それらは培養が容易であるが、最終タンパク
質のグリコシル化はできない。高レベル細菌発現システ
ムで発現されたタンパク質は、特徴的に顆粒状に凝集す
るか、過剰に発現されたタンパク質を高レベルで含有す
る封入体に凝集する。そのようなタンパク質凝集物は通
常、当業者周知の方法で可溶化、変性およびリフォール
ドされねばならない。クルーガーら（Kruger, et a
l.）, (1990) in Protei n Folding, ギラッシュ（Giera
sch）およびキング（King）編., p.136-142 , Amereica
n Association forthe Advancement of Science Public
ation No. 89-18S, Washington, D.C.; および米国特許
第４，９２３，９６７号参照。ＭＰＦ−４およびＣＰＦ
−４はまたミトゲンで刺激したＰＢＬ標品またはそれら
を生産する任意の細胞系のスペント培養培地から単離す
ることもできる。ヒトＰＢＬの場合、当業者周知の方法
から、任意の数の方法を用いて、全血のバフィーコート
からＰＢＬを単離する。多くの公知の方法の１例とし
て、シンら（Singh et al.）, Purification and Bioch
emical Properties of Human Monocyte Derived Growth
Factor, Pr oc.Natl.Acad. Sci. 85: 6374-6378（198
5）がある。単離したら、ＰＢＬ標品を平衡化食塩水で
完全に洗浄してあらゆる非細胞物質を除去する。
で製造し、それらは培養が容易であるが、最終タンパク
質のグリコシル化はできない。高レベル細菌発現システ
ムで発現されたタンパク質は、特徴的に顆粒状に凝集す
るか、過剰に発現されたタンパク質を高レベルで含有す
る封入体に凝集する。そのようなタンパク質凝集物は通
常、当業者周知の方法で可溶化、変性およびリフォール
ドされねばならない。クルーガーら（Kruger, et a
l.）, (1990) in Protei n Folding, ギラッシュ（Giera
sch）およびキング（King）編., p.136-142 , Amereica
n Association forthe Advancement of Science Public
ation No. 89-18S, Washington, D.C.; および米国特許
第４，９２３，９６７号参照。ＭＰＦ−４およびＣＰＦ
−４はまたミトゲンで刺激したＰＢＬ標品またはそれら
を生産する任意の細胞系のスペント培養培地から単離す
ることもできる。ヒトＰＢＬの場合、当業者周知の方法
から、任意の数の方法を用いて、全血のバフィーコート
からＰＢＬを単離する。多くの公知の方法の１例とし
て、シンら（Singh et al.）, Purification and Bioch
emical Properties of Human Monocyte Derived Growth
Factor, Pr oc.Natl.Acad. Sci. 85: 6374-6378（198
5）がある。単離したら、ＰＢＬ標品を平衡化食塩水で
完全に洗浄してあらゆる非細胞物質を除去する。
【００１６】次いで、ＰＢＬ標品を規定のミトゲン含有
血清不含増殖培地には種する。当業者はＰＢＬ標品の培
養に適した、公表された、および市販の広範な増殖培地
を知っている。同様に、ＰＢＬ活性を刺激し得る多くの
ミトゲンも当業者には既知である。以下に本発明に適合
し得るミトゲンの例を挙げるが、これらは例示にすぎ
ず、制限的なものではない。リポ多糖類（ＬＰＳ）、フ
ィトヘモアグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ
（ＣｏｎＡ）、チモザン（zymozan）およびミトゲン性
決定基（mitogenic determinants）に向けたある種の抗
生物質。次いで、ＰＢＬ標品を適当な条件下、ＭＰＦ−
４およびＣＰＦ−４を形成させるに必要な時間、通常、
初期播種密度に応じて１〜数日間培養する。さらにスペ
ント増殖培地を集め、ろ過、遠心または他のなんらかの
方法により、細胞と分離する。ＭＰＦ−４またはＣＰＦ
−４の製造に用いた方法にかかわらず、精製する必要が
ある。非常に様々なタンパク質精製法が当該技術分野で
周知であり、その多くが適し、ここに開示した新規な教
示に照らして、通常の技術者にとっては容易に理解され
る。タンパク質精製法の技術状態を記述した基礎的なテ
キストは、ジャンソン（Jannson)およびライデン(Ryde
n)のタンパク質精製法である(Protein Pur ification, V
CH Publishers Inc., New York 1989）。
血清不含増殖培地には種する。当業者はＰＢＬ標品の培
養に適した、公表された、および市販の広範な増殖培地
を知っている。同様に、ＰＢＬ活性を刺激し得る多くの
ミトゲンも当業者には既知である。以下に本発明に適合
し得るミトゲンの例を挙げるが、これらは例示にすぎ
ず、制限的なものではない。リポ多糖類（ＬＰＳ）、フ
ィトヘモアグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ
（ＣｏｎＡ）、チモザン（zymozan）およびミトゲン性
決定基（mitogenic determinants）に向けたある種の抗
生物質。次いで、ＰＢＬ標品を適当な条件下、ＭＰＦ−
４およびＣＰＦ−４を形成させるに必要な時間、通常、
初期播種密度に応じて１〜数日間培養する。さらにスペ
ント増殖培地を集め、ろ過、遠心または他のなんらかの
方法により、細胞と分離する。ＭＰＦ−４またはＣＰＦ
−４の製造に用いた方法にかかわらず、精製する必要が
ある。非常に様々なタンパク質精製法が当該技術分野で
周知であり、その多くが適し、ここに開示した新規な教
示に照らして、通常の技術者にとっては容易に理解され
る。タンパク質精製法の技術状態を記述した基礎的なテ
キストは、ジャンソン（Jannson)およびライデン(Ryde
n)のタンパク質精製法である(Protein Pur ification, V
CH Publishers Inc., New York 1989）。
【００１７】１つの特に有用な精製法が発見され、それ
は、最初にスペント培養培地を逆相精製カラムに負荷す
ることからなる。そのようなカラムは当該技術分野で周
知であり、Pharmacia, BioRad, Amicon等の多くの業者
から購入できる。カラムとの相互作用で、目的タンパク
質は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中、有機溶媒の増加
直線勾配溶出（グラディエント）を用いて溶離する。好
ましい有機溶媒は、アセトニトリルであり、ＭＰＦ−４
およびＣＰＦ−４を含有する画分がグラディエントの３
０−５０％アセトニトリル部分に見いだされる。より好
ましいグラディエント部分は３３−３９％領域であっ
た。溶離したタンパク質を次いでヘパリンアフィニティ
ー樹脂に接触させる。当業者は容易に理解するが、この
工程はカラムクロマトグラフィー法で最も良く達成され
る。ヘパリンアフィニティーカラムは上記と同じ業者の
あるものから市販されており入手可能である。この工程
で、目的の分子、ＭＰＦ−４またはＣＰＦ−４、はヘパ
リンカラムに結合し、増加直線塩グラディエントを用い
て溶離する。好ましい塩はＮaＣlであり、採取するに好
ましいグラディエント部分は０.１−２.０Ｍ部分であ
る。さらに一層好ましいグラディエント部分は０.７−
２.０Ｍ部分である。最終工程は０.７−２.０Ｍ溶出液
を第２の逆相カラム上にかけ、ＴＦＡ中アセトニトリル
直線グラディエントで溶離する。好ましいグラディエン
トは２５−７５％アセトニトリルおよび２７−６７％ア
セトニトリルがより好ましい。カラム流出液を２２０ｎ
ｍの吸収に関して監視する。ピークのタンパク質画分を
細胞抗増殖活性（生物活性）に関して分析する。早期に
溶出した生物活性を示すピークはＣＰＦ−４であり、後
期に溶出した生物活性ピークはＭＰＦ−４である。
は、最初にスペント培養培地を逆相精製カラムに負荷す
ることからなる。そのようなカラムは当該技術分野で周
知であり、Pharmacia, BioRad, Amicon等の多くの業者
から購入できる。カラムとの相互作用で、目的タンパク
質は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中、有機溶媒の増加
直線勾配溶出（グラディエント）を用いて溶離する。好
ましい有機溶媒は、アセトニトリルであり、ＭＰＦ−４
およびＣＰＦ−４を含有する画分がグラディエントの３
０−５０％アセトニトリル部分に見いだされる。より好
ましいグラディエント部分は３３−３９％領域であっ
た。溶離したタンパク質を次いでヘパリンアフィニティ
ー樹脂に接触させる。当業者は容易に理解するが、この
工程はカラムクロマトグラフィー法で最も良く達成され
る。ヘパリンアフィニティーカラムは上記と同じ業者の
あるものから市販されており入手可能である。この工程
で、目的の分子、ＭＰＦ−４またはＣＰＦ−４、はヘパ
リンカラムに結合し、増加直線塩グラディエントを用い
て溶離する。好ましい塩はＮaＣlであり、採取するに好
ましいグラディエント部分は０.１−２.０Ｍ部分であ
る。さらに一層好ましいグラディエント部分は０.７−
２.０Ｍ部分である。最終工程は０.７−２.０Ｍ溶出液
を第２の逆相カラム上にかけ、ＴＦＡ中アセトニトリル
直線グラディエントで溶離する。好ましいグラディエン
トは２５−７５％アセトニトリルおよび２７−６７％ア
セトニトリルがより好ましい。カラム流出液を２２０ｎ
ｍの吸収に関して監視する。ピークのタンパク質画分を
細胞抗増殖活性（生物活性）に関して分析する。早期に
溶出した生物活性を示すピークはＣＰＦ−４であり、後
期に溶出した生物活性ピークはＭＰＦ−４である。
【００１８】以下の実施例は本発明の精製法の指導およ
び理解に有用である。これらの実施例は例示のみを目的
としており、いかなる意味でも発明を制限することを意
味しない。
び理解に有用である。これらの実施例は例示のみを目的
としており、いかなる意味でも発明を制限することを意
味しない。
【実施例】実施例１ 健康な供給者の血液から調製したプールされたバッフィ
ーコートをInterstateBlood Bankから購入した。histop
aqueTM(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO63178)を用
い、４℃でグラディエント遠心により、プールしたバッ
フィーコートからＰＢＬ細胞標品を単離した。ＰＢＬ標
品をＨａｎｋの平衡化塩溶液（ＧＩＢＣＯ；Grand Isla
nd, N.Y.)で洗浄し、３ｘ１０6細胞／ml（総量４Ｌ）の
密度で、２mＭＬ−グルタミン、非必須アミノ酸、０.８
mＭ Ｄ−グルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１
００μｇ／mlストレプトマイシンおよび２０μｇ／mlリ
ポ多糖類（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO 63178）
を補充した、血清不含最少必須培地（ＧＩＢＣＯ；Gran
d Island、N.Y.)にプレートした。ＰＢＬ標品を５％Ｃ
Ｏ2、９５％空気中、３７℃で３０時間、インキュベー
トした。スペント培養培地を収穫し、ＰＢＬを０.２μ
ｍフィルターで濾過してＰＢＬを除去した。
ーコートをInterstateBlood Bankから購入した。histop
aqueTM(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO63178)を用
い、４℃でグラディエント遠心により、プールしたバッ
フィーコートからＰＢＬ細胞標品を単離した。ＰＢＬ標
品をＨａｎｋの平衡化塩溶液（ＧＩＢＣＯ；Grand Isla
nd, N.Y.)で洗浄し、３ｘ１０6細胞／ml（総量４Ｌ）の
密度で、２mＭＬ−グルタミン、非必須アミノ酸、０.８
mＭ Ｄ−グルコース、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１
００μｇ／mlストレプトマイシンおよび２０μｇ／mlリ
ポ多糖類（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO 63178）
を補充した、血清不含最少必須培地（ＧＩＢＣＯ；Gran
d Island、N.Y.)にプレートした。ＰＢＬ標品を５％Ｃ
Ｏ2、９５％空気中、３７℃で３０時間、インキュベー
トした。スペント培養培地を収穫し、ＰＢＬを０.２μ
ｍフィルターで濾過してＰＢＬを除去した。
【００１９】実施例２ 細胞不含スペント培養培地４Ｌを０.１％（ｖ／ｖ）Ｔ
ＦＡ酸で酸性にした後、直接、逆相Ｃ４−ＲＰ−３０４
TM（２５０ｘ２１．５ｍｍ）半−調製用カラム（Biora
d, Richmond, CA 94804)で、流速約１５ml／分において
負荷した。カラムを０.１％ＴＦＡ中、０−５０％アセ
トニトリルの直線グラディエントにより４０分間溶離
し、次いで、５０％アセトニトリル、０.１％ＴＦＡで
１０分間溶離した。流速は１５ml／分であった。約５
０、１５ml画分を収集した。溶離像を２２０ｎｍで監視
し、３３％−３９％アセトニトリルで溶離した画分を集
めプールした（Ｃ４−プール）。
ＦＡ酸で酸性にした後、直接、逆相Ｃ４−ＲＰ−３０４
TM（２５０ｘ２１．５ｍｍ）半−調製用カラム（Biora
d, Richmond, CA 94804)で、流速約１５ml／分において
負荷した。カラムを０.１％ＴＦＡ中、０−５０％アセ
トニトリルの直線グラディエントにより４０分間溶離
し、次いで、５０％アセトニトリル、０.１％ＴＦＡで
１０分間溶離した。流速は１５ml／分であった。約５
０、１５ml画分を収集した。溶離像を２２０ｎｍで監視
し、３３％−３９％アセトニトリルで溶離した画分を集
めプールした（Ｃ４−プール）。
【００２０】実施例３ Ｃ４プールをさらに、Econo-packTM５mlヘパリン−セフ
ァロースカートリッジ(Biorad,Richmond, CA 94804)を
用いるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーで分
画した。結合したタンパク質を０−２.０Ｍ ＮaＣl／
りん酸緩衝化バッファー（ＰＢＳ）の直線勾配溶出によ
り、流速２.０ml／分で溶離する。カラムから溶出した
タンパク質を３画分に分取する：（１）非−ヘパリン結
合（通過）画分、（２）低ヘパリン親和性結合（０−
０.７Ｍ ＮaＣl）画分、および（３）高ヘパリン親和
性結合（０.７−２.０Ｍ ＮaＣl）画分。
ァロースカートリッジ(Biorad,Richmond, CA 94804)を
用いるヘパリンアフィニティークロマトグラフィーで分
画した。結合したタンパク質を０−２.０Ｍ ＮaＣl／
りん酸緩衝化バッファー（ＰＢＳ）の直線勾配溶出によ
り、流速２.０ml／分で溶離する。カラムから溶出した
タンパク質を３画分に分取する：（１）非−ヘパリン結
合（通過）画分、（２）低ヘパリン親和性結合（０−
０.７Ｍ ＮaＣl）画分、および（３）高ヘパリン親和
性結合（０.７−２.０Ｍ ＮaＣl）画分。
【００２１】実施例４ 高親和性ヘパリン結合画分（３）（０.７Ｍから２.０Ｍ
ＮaＣl）を予め２７％アセトニトリル、０.１％ＴＦ
Ａで平衡化したVydacTM ０.４６ｘ１０ｃｍＣ−４ＨＰ
ＬＣカラム（Marshall Co., Worthington, OH 43085)に
適用した。カラムを０.１％ＴＦＡ中、２７％アセトニ
トリル−６７％アセトニトリルの直線グラディエントで
４０分間にわたって溶離した。２２０ｎｍの吸収を監視
し、ピークのタンパク質画分を手動で集めた。次いで、
ピーク画分の生物活性を実施例５に従って分析した。２
つのピークが細胞増殖阻害活性を示した。常套のアミノ
酸配列決定では、初期に溶離した生物活性なピークはＣ
ＰＦ−４であり、後に溶離した生物活性なピークはＭＰ
Ｆ−４であることが分かった。
ＮaＣl）を予め２７％アセトニトリル、０.１％ＴＦ
Ａで平衡化したVydacTM ０.４６ｘ１０ｃｍＣ−４ＨＰ
ＬＣカラム（Marshall Co., Worthington, OH 43085)に
適用した。カラムを０.１％ＴＦＡ中、２７％アセトニ
トリル−６７％アセトニトリルの直線グラディエントで
４０分間にわたって溶離した。２２０ｎｍの吸収を監視
し、ピークのタンパク質画分を手動で集めた。次いで、
ピーク画分の生物活性を実施例５に従って分析した。２
つのピークが細胞増殖阻害活性を示した。常套のアミノ
酸配列決定では、初期に溶離した生物活性なピークはＣ
ＰＦ−４であり、後に溶離した生物活性なピークはＭＰ
Ｆ−４であることが分かった。
【００２２】実施例５ 原発性網膜毛細血管内皮細胞培養を実質上、ブズネーら
の方法［Buzney et al., Retinal Vascular Endothelia
l Cells and Pericytes: Differential GrowthCharacte
ristics in vitro, Invest.Ophthalmol.Vi sual Sci. 2
4: 470-483 (1983)］に従い調製し、ボイテの方法［Voy
te et al., Identification and Isolation of Endothe
lial Cells Based on their Increased Uptake of Acet
ylated-low density Lipoprotein, J.Cell Biol. 99: 2
034-2040 (1981)］に従い混在する細胞から分離した。
あるいは、ウシ心臓内皮細胞を検定に用いるために得た
［American Type Culture Collection; Rockville MD 2
0852］。供給源にかかわらず、内皮細胞を２４ウエルの
組織培養プレートに、５％ウシ血清アルブミン、１％ペ
ニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミンお
よび２０ng/ml線維芽細成長因子を補充したDulbecco's
modified Eagle Medium (GIBCO; Grand Island, N.Y.)
中、細胞密度１０，０００細胞／ウエルで播種する。細
胞の播種の直後、様々な量のＰＦ−４（Sigma Chemical
Co., St. Louise, MO 63178)、 ＭＰＦ−４またはＣＰ
Ｆ−４（上記実施例記載の方法で単離）を各々の増殖ウ
エルに加えた。ＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４は最終濃度
０.００１−１μｇ／mlで試験した。比較のために、天
然ＰＦ−４を０.００１−３μｇ／mlの範囲にわたって
試験し、補充した培地のみを負対照として用いた。内皮
細胞培養を３７℃、５％ＣＯ2で、加湿組織培養インキ
ュベーター内において４日間増殖させた。次いで、培養
物を個別にトリプシナイゼーションにより収穫し、Ｚｍ
−Coulter Counter(Coulter Electronics, Inc., Opa L
ocka FL 33054）を用いて計数した。
の方法［Buzney et al., Retinal Vascular Endothelia
l Cells and Pericytes: Differential GrowthCharacte
ristics in vitro, Invest.Ophthalmol.Vi sual Sci. 2
4: 470-483 (1983)］に従い調製し、ボイテの方法［Voy
te et al., Identification and Isolation of Endothe
lial Cells Based on their Increased Uptake of Acet
ylated-low density Lipoprotein, J.Cell Biol. 99: 2
034-2040 (1981)］に従い混在する細胞から分離した。
あるいは、ウシ心臓内皮細胞を検定に用いるために得た
［American Type Culture Collection; Rockville MD 2
0852］。供給源にかかわらず、内皮細胞を２４ウエルの
組織培養プレートに、５％ウシ血清アルブミン、１％ペ
ニシリン−ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミンお
よび２０ng/ml線維芽細成長因子を補充したDulbecco's
modified Eagle Medium (GIBCO; Grand Island, N.Y.)
中、細胞密度１０，０００細胞／ウエルで播種する。細
胞の播種の直後、様々な量のＰＦ−４（Sigma Chemical
Co., St. Louise, MO 63178)、 ＭＰＦ−４またはＣＰ
Ｆ−４（上記実施例記載の方法で単離）を各々の増殖ウ
エルに加えた。ＭＰＦ−４およびＣＰＦ−４は最終濃度
０.００１−１μｇ／mlで試験した。比較のために、天
然ＰＦ−４を０.００１−３μｇ／mlの範囲にわたって
試験し、補充した培地のみを負対照として用いた。内皮
細胞培養を３７℃、５％ＣＯ2で、加湿組織培養インキ
ュベーター内において４日間増殖させた。次いで、培養
物を個別にトリプシナイゼーションにより収穫し、Ｚｍ
−Coulter Counter(Coulter Electronics, Inc., Opa L
ocka FL 33054）を用いて計数した。
【００２３】結果を図１にプロットした。各グラフ上の
各点は４つのデータポイント（即ち、データポイントあ
たり１個の増殖ウエル）の平均値を表す。その結果、Ｒ
Ｆ−４が内皮細胞増殖を阻止し、ＩＣ50が約８００−１
０００ng／ml（約１３０ｎＭ）であった。これらの結果
は、組換えＲＦ−４の抗増殖活性に関する最近公表され
た研究と良い相関関係にある（Science 247: 77-79 (19
90))。このデータはまた、同じ条件下、ＭＰＦ−４およ
びＣＰＦ−４の両方が内皮細胞増殖のより強力な阻害物
質であることを示している。ＭＰＦ−４のＩＣ50は３０
−５０ng／ml（約７ｎＭ）、ＣＰＦ−４のＩＣ50は約１
５０ng／ml（２０ｎＭ）であった。ＭＰＦ−４に対する
阻止濃度はヒト血漿に見いだされる生理学的範囲に近い
（前掲）。
各点は４つのデータポイント（即ち、データポイントあ
たり１個の増殖ウエル）の平均値を表す。その結果、Ｒ
Ｆ−４が内皮細胞増殖を阻止し、ＩＣ50が約８００−１
０００ng／ml（約１３０ｎＭ）であった。これらの結果
は、組換えＲＦ−４の抗増殖活性に関する最近公表され
た研究と良い相関関係にある（Science 247: 77-79 (19
90))。このデータはまた、同じ条件下、ＭＰＦ−４およ
びＣＰＦ−４の両方が内皮細胞増殖のより強力な阻害物
質であることを示している。ＭＰＦ−４のＩＣ50は３０
−５０ng／ml（約７ｎＭ）、ＣＰＦ−４のＩＣ50は約１
５０ng／ml（２０ｎＭ）であった。ＭＰＦ−４に対する
阻止濃度はヒト血漿に見いだされる生理学的範囲に近い
（前掲）。
【００２４】
【００２５】配列番号：１ 配列の長さ：５４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ser Gln Val Arg Pro Arg His Ile Thr Ser Leu Glu Val Ile Lys Ala 1 5 10 15 Gly Pro His Cys Pro Thr Ala Gln Leu Ile Ala Thr Leu Lys Asn Gly 20 25 30 Arg Lys Ile Cys Leu Asp Leu Gln Ala Pro Leu Tyr Lys Lys Ile Ile 35 40 45 Lys Lys Leu Leu Glu Ser 50 54
【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ １ ５
１０ １５
Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ １ ５
１０ １５
【図１】 ＭＰＦ−４、ＣＰＦ−４およびＰＦ−４によ
る内皮細胞増殖の阻害を示す濃度−効果グラフである。
る内皮細胞増殖の阻害を示す濃度−効果グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 ジャイ・パル・シン アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、ヒルクレスト・コート13774番
Claims (3)
- 【請求項１】 式： NH2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Gl
u-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-
Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Le
u-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-
Lys-Leu-Leu-Gln-Ser-COOH で示されるアミノ酸配列を有する修飾された血小板第４
因子（ＭＰＦ−４）。 - 【請求項２】 式： NH2-Glu-Ala-Glu-Glu-Asp-Gly-Asp-Leu-Gln-Cys-Leu-Cy
s-Val-Lys-Thr-Thr-COOH で示されるアミノ酸配列を有する第２タンパク質と式： NH2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Gl
u-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-
Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Le
u-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-
Lys-Leu-Leu-Gln-Ser-COOH で示されるアミノ酸配列を有するＭＰＦ−４とが、ＭＰ
Ｆ−４のCys-20と該第２タンパク質のCys-10、およびＭ
ＰＦ−４のCys-36と第２タンパク質のCys-12との間のジ
スルフィド結合によって結合している、開裂された血小
板第４因子（ＣＰＦ−４）。 - 【請求項３】 請求項１または２のＭＰＦ−４またはＣ
ＰＦ−４を活性成分とし、製剤的に許容される担体、賦
形剤又は希釈剤と共に含有する脈管形成阻害剤。
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|---|---|---|---|
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| CN101307106B (zh) * | 1995-12-13 | 2013-06-12 | 儿童医学中心公司 | 内皮细胞增殖抑制剂及其应用方法 |
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| EP0423641A3 (en) * | 1989-10-18 | 1992-01-15 | Nippon Mining Company Limited | Expression vector, transformed microorganism, fusion protein and method for the production of platelet factor 4 or tgfalpha |
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