JPH06233693A - 連鎖球菌ｍ蛋白免疫原 - Google Patents
連鎖球菌ｍ蛋白免疫原Info
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- JPH06233693A JPH06233693A JP5172076A JP17207693A JPH06233693A JP H06233693 A JPH06233693 A JP H06233693A JP 5172076 A JP5172076 A JP 5172076A JP 17207693 A JP17207693 A JP 17207693A JP H06233693 A JPH06233693 A JP H06233693A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 連鎖球菌感染予防用ワクチンの免疫原として
使用することができるポリペプタイドを提供する。 【構成】 ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptoc
occus pyogenes）の免疫反応性抗原決定部位を有するポ
リペプタイドをコードするストレプトコッカス・ピオゲ
ネスＭ蛋白質をコードする精製されたＤＮＡ配列を含む
組換えプラスミドを含む単細胞生物により生成されるス
トレプトコッカス・ピオゲネスＭ蛋白質の免疫反応性抗
原決定部位を有するポリペプタイド、及びその製法。
使用することができるポリペプタイドを提供する。 【構成】 ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptoc
occus pyogenes）の免疫反応性抗原決定部位を有するポ
リペプタイドをコードするストレプトコッカス・ピオゲ
ネスＭ蛋白質をコードする精製されたＤＮＡ配列を含む
組換えプラスミドを含む単細胞生物により生成されるス
トレプトコッカス・ピオゲネスＭ蛋白質の免疫反応性抗
原決定部位を有するポリペプタイド、及びその製法。
Description
【０００１】ここに記載されている発明は、その一部に
つき厚生省（Department of Healthand Human Service
s）の国立衛生研究所からの補助金の援助を受けてなさ
れたものである。 １．発明の分野 本発明はＡ群連鎖球菌のＭ６蛋白質のような抗食菌作用
性連鎖球菌蛋白質を診断用プローブとして用いるため
の、及びそれを免疫原として利用したワクチンを製造す
るための組成物及び方法に関する。Ｍ蛋白質は繊維状表
面分子であって、それは連鎖球菌を、感染した宿主生物
のマクロファージ及び多形核（polymorphonuclear ）好
中球（neutrophiles）により、食菌作用に抵抗するよう
になしうる。
つき厚生省（Department of Healthand Human Service
s）の国立衛生研究所からの補助金の援助を受けてなさ
れたものである。 １．発明の分野 本発明はＡ群連鎖球菌のＭ６蛋白質のような抗食菌作用
性連鎖球菌蛋白質を診断用プローブとして用いるため
の、及びそれを免疫原として利用したワクチンを製造す
るための組成物及び方法に関する。Ｍ蛋白質は繊維状表
面分子であって、それは連鎖球菌を、感染した宿主生物
のマクロファージ及び多形核（polymorphonuclear ）好
中球（neutrophiles）により、食菌作用に抵抗するよう
になしうる。
【０００２】本発明はＭ蛋白質又はその一部をコードす
るＤＮＡ配列をビールスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又は
コスミドＤＮＡのようなプラスミドＤＮＡに挿入するた
めに組換えＤＮＡ技術を利用し、これによりそのプラス
ミドは細菌の宿主又は他の単細胞系中にＭ蛋白質の遺伝
子を複製し発現させることができる。生ずる組換えＤＮ
Ａ分子はＭ蛋白質、又はそのある部分又は分子の変化し
たものを製造しうるように宿主細胞に導入される。産生
した蛋白質はついで分離され、精製され連鎖球菌感染に
対するワクチン中の免疫原として用いるために修飾され
る。
るＤＮＡ配列をビールスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又は
コスミドＤＮＡのようなプラスミドＤＮＡに挿入するた
めに組換えＤＮＡ技術を利用し、これによりそのプラス
ミドは細菌の宿主又は他の単細胞系中にＭ蛋白質の遺伝
子を複製し発現させることができる。生ずる組換えＤＮ
Ａ分子はＭ蛋白質、又はそのある部分又は分子の変化し
たものを製造しうるように宿主細胞に導入される。産生
した蛋白質はついで分離され、精製され連鎖球菌感染に
対するワクチン中の免疫原として用いるために修飾され
る。
【０００３】本発明はさらにＡ群、Ｃ群及びＧ群の連鎖
球菌の検出法を提供する。かかる検出はＡ群連鎖球菌の
Ｍ蛋白質をコードする全遺伝子又はその遺伝子の断片に
基づく特定の分子状プローブを使用して達成される。交
雑スクリーニング法において有用なＤＮＡプローブが連
鎖球菌感染と疑われる場合の臨床的分離物の検査のため
にここに記載されている。
球菌の検出法を提供する。かかる検出はＡ群連鎖球菌の
Ｍ蛋白質をコードする全遺伝子又はその遺伝子の断片に
基づく特定の分子状プローブを使用して達成される。交
雑スクリーニング法において有用なＤＮＡプローブが連
鎖球菌感染と疑われる場合の臨床的分離物の検査のため
にここに記載されている。
【０００４】
２．発明の背景 急性リウマチ熱や急性糸球体腎炎（glomerulonephriti
s）がＡ群連鎖球菌感染の後遺症であることは広く認め
られているところである。熱帯及び亜熱帯の開発途上国
においてはリウマチ性心臓疾患が現在心障害の最も普通
の形である。世界のある開発途上の都市部の貧民街にお
ける学齢児童についてこの病気の流行率は１，０００人
に対し２２−２３人もの高さであることが報告されてい
る。インドだけでも６百万もの多くの子供が苦しんでい
ることとなる。この病気の正確な発病機構はわからない
が、リウマチ熱、さらに急性腎炎がストレプトコッカス
・ピオゲネス（streptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球
菌）の感染に伴うものであることは明らかである。
s）がＡ群連鎖球菌感染の後遺症であることは広く認め
られているところである。熱帯及び亜熱帯の開発途上国
においてはリウマチ性心臓疾患が現在心障害の最も普通
の形である。世界のある開発途上の都市部の貧民街にお
ける学齢児童についてこの病気の流行率は１，０００人
に対し２２−２３人もの高さであることが報告されてい
る。インドだけでも６百万もの多くの子供が苦しんでい
ることとなる。この病気の正確な発病機構はわからない
が、リウマチ熱、さらに急性腎炎がストレプトコッカス
・ピオゲネス（streptococcus pyogenes）（Ａ群連鎖球
菌）の感染に伴うものであることは明らかである。
【０００５】連鎖球菌Ｍ蛋白質は、それが食細胞攻撃に
対する抵抗性を生物に与えるという事実に基づいてこの
細菌の重要な毒性因子である。抗原的変化は、それによ
りＡ群連鎖球菌が宿主の免疫反応を避けることができ、
その結果人間に病気を起こすという最初の機構である。
Ａ群連鎖球菌感染に対する抵抗性は、生物の表面に見い
だされる繊維状分子であるＭ蛋白質に対する形質特異的
（type-specific ）な抗体の存在によるものである。分
類し得ない（nontypable）株のいくつかに加えて、現在
では約７０の明らかなＡ群連鎖球菌Ｍ形が認められてい
る。ある種のＭ型の間で交叉反応性があるのは普通であ
るという事実にも拘わらず、同族の型に対してつくられ
た抗体のみが生体の食菌作用を発生せしめうる（すなわ
ち、それらはオプソニン抗体である）。さらに、すべて
の同族体、又は形質特異性抗体が食菌性であるというわ
けではない。
対する抵抗性を生物に与えるという事実に基づいてこの
細菌の重要な毒性因子である。抗原的変化は、それによ
りＡ群連鎖球菌が宿主の免疫反応を避けることができ、
その結果人間に病気を起こすという最初の機構である。
Ａ群連鎖球菌感染に対する抵抗性は、生物の表面に見い
だされる繊維状分子であるＭ蛋白質に対する形質特異的
（type-specific ）な抗体の存在によるものである。分
類し得ない（nontypable）株のいくつかに加えて、現在
では約７０の明らかなＡ群連鎖球菌Ｍ形が認められてい
る。ある種のＭ型の間で交叉反応性があるのは普通であ
るという事実にも拘わらず、同族の型に対してつくられ
た抗体のみが生体の食菌作用を発生せしめうる（すなわ
ち、それらはオプソニン抗体である）。さらに、すべて
の同族体、又は形質特異性抗体が食菌性であるというわ
けではない。
【０００６】特定の抗血清がＡ群連鎖球菌に対してつく
られうるという事実は、咽喉洗滌によって得られるもの
のような臨床上の分離物を血清学的な試験に付すること
により連鎖球菌感染を検出することを可能にした。感染
におけるＡ群連鎖球菌の同定は純粋培養中の生物の単
離、群特異的炭水化物の抽出、及び群特異的抗血清との
反応とを必要とする。すべての病原性株に対してのみ共
通な性質に基づきうる連鎖球菌感染に対する臨床試験
は、従って非常に望ましいものとなる。
られうるという事実は、咽喉洗滌によって得られるもの
のような臨床上の分離物を血清学的な試験に付すること
により連鎖球菌感染を検出することを可能にした。感染
におけるＡ群連鎖球菌の同定は純粋培養中の生物の単
離、群特異的炭水化物の抽出、及び群特異的抗血清との
反応とを必要とする。すべての病原性株に対してのみ共
通な性質に基づきうる連鎖球菌感染に対する臨床試験
は、従って非常に望ましいものとなる。
【０００７】２．１組換えＤＮＡ技術と遺伝子の発現 組換えＤＮＡ技術は、それにより特定のＤＮＡ断片が宿
主細胞中で複製し、転写しうるベクターと呼ばれる遺伝
学的要素中に挿入されるＤＮＡクローニングの技術を包
含している。ベクターはプラスミド又はビールスのいず
れでもありうる。プラスミドは小さい環状の二重螺旋Ｄ
ＮＡの分子で、それは天然にバクテリアや酵母中に見出
され、そこで宿主細胞の繁殖とは無関係な単位として複
製する。これらのプラスミドは通常全宿主細胞ＤＮＡの
わずかなフラクションとしてのみ説明され、しばしば抗
生物質に対する耐性を与える遺伝子を保有している。こ
れらの遺伝子、そして比較的小さい大きさのプラスミド
ＤＮＡが組換えＤＮＡ技術において利用される。
主細胞中で複製し、転写しうるベクターと呼ばれる遺伝
学的要素中に挿入されるＤＮＡクローニングの技術を包
含している。ベクターはプラスミド又はビールスのいず
れでもありうる。プラスミドは小さい環状の二重螺旋Ｄ
ＮＡの分子で、それは天然にバクテリアや酵母中に見出
され、そこで宿主細胞の繁殖とは無関係な単位として複
製する。これらのプラスミドは通常全宿主細胞ＤＮＡの
わずかなフラクションとしてのみ説明され、しばしば抗
生物質に対する耐性を与える遺伝子を保有している。こ
れらの遺伝子、そして比較的小さい大きさのプラスミド
ＤＮＡが組換えＤＮＡ技術において利用される。
【０００８】組換えＤＮＡ分子の挿入されたＤＮＡ断片
は自然には宿主生物と情報を交換しない生物から誘導さ
れうるものであり、また全体的にあるいは部分的に合成
的に作られうるものである。制限酵素及び結合方法（li
gation method)を用いて組換えプラスミドを製造する方
法はコーエン及びボイヤー発明にかかわる発行された米
国特許第４，２３７，２２４号に記載されている。この
ようにしてつくられた組換えプラスミドは形質転換の手
段により単細胞生物中に導入され、複製される。そこに
記載されている技術の一般的適用性の故に、米国特許第
４，２３７，２２４号はここに本明細書中に参考文献と
して包含される。
は自然には宿主生物と情報を交換しない生物から誘導さ
れうるものであり、また全体的にあるいは部分的に合成
的に作られうるものである。制限酵素及び結合方法（li
gation method)を用いて組換えプラスミドを製造する方
法はコーエン及びボイヤー発明にかかわる発行された米
国特許第４，２３７，２２４号に記載されている。この
ようにしてつくられた組換えプラスミドは形質転換の手
段により単細胞生物中に導入され、複製される。そこに
記載されている技術の一般的適用性の故に、米国特許第
４，２３７，２２４号はここに本明細書中に参考文献と
して包含される。
【０００９】単細胞生物中に組換えＤＮＡ分子を導入す
る別の方法は、コリンズ及びホーンにより、米国特許第
４，３０４，８６３号に記載されており、それもまたこ
こに参考文献として包含される。この方法は、バクテリ
オファージ・ベクターによるパッケージング／トランス
ダクション（packaging/transduction）システムを利用
するものである。
る別の方法は、コリンズ及びホーンにより、米国特許第
４，３０４，８６３号に記載されており、それもまたこ
こに参考文献として包含される。この方法は、バクテリ
オファージ・ベクターによるパッケージング／トランス
ダクション（packaging/transduction）システムを利用
するものである。
【００１０】プラスミドは高次螺旋であるので、宿主細
胞のＤＮＡから容易に分離することができ、精製するこ
とができる。クローニング・ベクターとして用いるに
は、このような精製プラスミドＤＮＡ分子は制限ヌクレ
アーゼで切断され、クローンさるべきＤＮＡ断片に結合
される。製造された雑種のプラスミドＤＮＡ分子は、次
いで一時的に大分子（合理的に）に対して浸透性を有す
るようにされたバクテリア中に再導入される。処理され
た細胞のいくつかだけがプラスミドを拾いあげ、これら
の細胞はプラスミドによってそれらが獲得している抗生
物質耐性によって選択できる。それはそれらのものだけ
が抗生物質の存在下に生育するからである。これらのバ
クテリアは分裂するから、プラスミドもまた当初のＤＮ
Ａ断片の多数のコピーをつくるように複製する。繁殖期
間の終りに、雑種のプラスミドＤＮＡ分子は精製され当
初のＤＮＡ断片のコピーは同じエンドヌクレアーゼによ
る第二の処理で切断される。
胞のＤＮＡから容易に分離することができ、精製するこ
とができる。クローニング・ベクターとして用いるに
は、このような精製プラスミドＤＮＡ分子は制限ヌクレ
アーゼで切断され、クローンさるべきＤＮＡ断片に結合
される。製造された雑種のプラスミドＤＮＡ分子は、次
いで一時的に大分子（合理的に）に対して浸透性を有す
るようにされたバクテリア中に再導入される。処理され
た細胞のいくつかだけがプラスミドを拾いあげ、これら
の細胞はプラスミドによってそれらが獲得している抗生
物質耐性によって選択できる。それはそれらのものだけ
が抗生物質の存在下に生育するからである。これらのバ
クテリアは分裂するから、プラスミドもまた当初のＤＮ
Ａ断片の多数のコピーをつくるように複製する。繁殖期
間の終りに、雑種のプラスミドＤＮＡ分子は精製され当
初のＤＮＡ断片のコピーは同じエンドヌクレアーゼによ
る第二の処理で切断される。
【００１１】構築に用いられた方法には無関係に、組換
えＤＮＡ分子は宿主細胞と両立し得なければならない。
すなわち、宿主細胞中で自律的に複製できなければなら
ない。組換えＤＮＡ分子は、その組換えＤＮＡ分子によ
り形質転換された宿主細胞を選択できるマーカーの機能
をも有していなければならない。さらに加えて、プラス
ミド上に適当な複製、転写及び翻訳のシグナルが正確に
配置されているならば、外来遺伝子は形質転換細胞及び
その子孫中に適切に発現するであろう。
えＤＮＡ分子は宿主細胞と両立し得なければならない。
すなわち、宿主細胞中で自律的に複製できなければなら
ない。組換えＤＮＡ分子は、その組換えＤＮＡ分子によ
り形質転換された宿主細胞を選択できるマーカーの機能
をも有していなければならない。さらに加えて、プラス
ミド上に適当な複製、転写及び翻訳のシグナルが正確に
配置されているならば、外来遺伝子は形質転換細胞及び
その子孫中に適切に発現するであろう。
【００１２】２．２ワクチン ワクチンは病気の制御と予防へのアプローチである。ワ
クチンは抗原の免疫原部分をアジュバントと混合するこ
とにより製造できる。この製剤は宿主の動物又はヒトに
注射すると、その抗原に対する抗体の産生を誘導し、そ
の抗原を生ずる対象生物により起る病気に対する活性な
免疫を与える。
クチンは抗原の免疫原部分をアジュバントと混合するこ
とにより製造できる。この製剤は宿主の動物又はヒトに
注射すると、その抗原に対する抗体の産生を誘導し、そ
の抗原を生ずる対象生物により起る病気に対する活性な
免疫を与える。
【００１３】ペプタイド・ワクチンは、バクテリアおよ
びビールスの表面蛋白質の部分のような必要かつ適切な
免疫原物質のみを含んでいる。ペプタイド・ワクチンは
高度に純化されたバクテリアの画分から該当するペプタ
イドを単離することにより、又は該当するポリペプタイ
ドを合成することによってつくることができる。ペプタ
イド・ワクチンの大きい利点は、バクテリア起原の無関
係な物質や、宿主又は提供主から導かれる障害となる物
質の排除にある。しかし、現在において、これらの方法
を用いてのペプタイド・ワクチンの製造は、一般的に広
範囲の商業的使用にはあまりにも高価につく。組換えＤ
ＮＡ技術はペプタイド・ワクチンの製造に多くを提供す
る。バクテリアの適切な免疫原部分をコードするバクテ
リア遺伝子の分子クローニング及び宿主細胞での発現に
より、ペプタイド・ワクチンにおいて使用するための適
切な免疫原の充分な量を製造することができる。
びビールスの表面蛋白質の部分のような必要かつ適切な
免疫原物質のみを含んでいる。ペプタイド・ワクチンは
高度に純化されたバクテリアの画分から該当するペプタ
イドを単離することにより、又は該当するポリペプタイ
ドを合成することによってつくることができる。ペプタ
イド・ワクチンの大きい利点は、バクテリア起原の無関
係な物質や、宿主又は提供主から導かれる障害となる物
質の排除にある。しかし、現在において、これらの方法
を用いてのペプタイド・ワクチンの製造は、一般的に広
範囲の商業的使用にはあまりにも高価につく。組換えＤ
ＮＡ技術はペプタイド・ワクチンの製造に多くを提供す
る。バクテリアの適切な免疫原部分をコードするバクテ
リア遺伝子の分子クローニング及び宿主細胞での発現に
より、ペプタイド・ワクチンにおいて使用するための適
切な免疫原の充分な量を製造することができる。
【００１４】ワクチンは、しばしば種々のアジュバンド
とともに乳化液として投与される。アジュバンドは、免
疫原それだけを投与するときよりも、よりわずかな投与
量でより少ない量の抗原を用いて、より持続性があり、
より高レベルの免疫を達成することに役立つ。アジュバ
ンドの作用機序は複雑であり、完全にはわからない。し
かし、それは細網内皮組織の食菌作用や他の活性を刺激
するとともに、抗原の放出と分解を遅延させることを含
んでいるであろう。アジュバンドの例としては、フロイ
ンドのアジュバンド（Freund′s adjuvant)（完全又は
不完全）、アジュバント６５（落花生油、マンナイド・
モノオレエート及びモノステアリン酸アルミニウムを含
む）、及び水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又
は明礬のような鉱物質ゲルが挙げられる。フロインドの
アジュバントは、もはやヒトや食用動物のためのワクチ
ン製剤には用いられない。それは代謝できない鉱物質油
を含んでいて、それが潜在的癌原性物質（potential ca
rcinogen) でありうることによる。しかし、鉱物質ゲル
は商業上獣医用ワクチンに広く用いられている。
とともに乳化液として投与される。アジュバンドは、免
疫原それだけを投与するときよりも、よりわずかな投与
量でより少ない量の抗原を用いて、より持続性があり、
より高レベルの免疫を達成することに役立つ。アジュバ
ンドの作用機序は複雑であり、完全にはわからない。し
かし、それは細網内皮組織の食菌作用や他の活性を刺激
するとともに、抗原の放出と分解を遅延させることを含
んでいるであろう。アジュバンドの例としては、フロイ
ンドのアジュバンド（Freund′s adjuvant)（完全又は
不完全）、アジュバント６５（落花生油、マンナイド・
モノオレエート及びモノステアリン酸アルミニウムを含
む）、及び水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又
は明礬のような鉱物質ゲルが挙げられる。フロインドの
アジュバントは、もはやヒトや食用動物のためのワクチ
ン製剤には用いられない。それは代謝できない鉱物質油
を含んでいて、それが潜在的癌原性物質（potential ca
rcinogen) でありうることによる。しかし、鉱物質ゲル
は商業上獣医用ワクチンに広く用いられている。
【００１５】２．３Ｍ蛋白質抗原を用いる連鎖球菌ワク
チン開発の試み フォックス（ジャーナル・オブ・イムノロジー９３：８
２６−８３７（１９６４））は、連鎖球菌から精製した
Ｍ蛋白質を型特異的（type−specific) な滅菌性抗体
（bactericidal antibodies)を誘導するためにウサギに
おける免疫原として用いた。しかし、部分的精製連鎖球
菌Ｍ蛋白質でヒトにワクチン接種をする試みは常に被接
種者に強い局所および組織的反応が起ったため成功に至
らなかった。シュミット、ジャーナル・インフェクシャ
ス・デイジーズ１０６：２５０−２５５（１９６０）及
びポッターら、ジャーナル・クリニカル・インベストメ
ント４１：３０１−３１０（１９６２）参照。フォック
スら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・デイジー
ズ１２０：５９８−６０４（１９６９）及びフォックス
ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン
１２４：１１３５−１１５１（１９６６）は、精製され
た酸抽出したＭ蛋白質を用い、一部についてそのワクチ
ンを用いて成功した。ワクチン接種を受けた２２名の成
人のうち１５名は型特異性抗体力価の二次上昇を伴う反
応を示したが、５人についてのみ抗バクテリア抗体の上
昇を示したにすぎなかった。
チン開発の試み フォックス（ジャーナル・オブ・イムノロジー９３：８
２６−８３７（１９６４））は、連鎖球菌から精製した
Ｍ蛋白質を型特異的（type−specific) な滅菌性抗体
（bactericidal antibodies)を誘導するためにウサギに
おける免疫原として用いた。しかし、部分的精製連鎖球
菌Ｍ蛋白質でヒトにワクチン接種をする試みは常に被接
種者に強い局所および組織的反応が起ったため成功に至
らなかった。シュミット、ジャーナル・インフェクシャ
ス・デイジーズ１０６：２５０−２５５（１９６０）及
びポッターら、ジャーナル・クリニカル・インベストメ
ント４１：３０１−３１０（１９６２）参照。フォック
スら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・デイジー
ズ１２０：５９８−６０４（１９６９）及びフォックス
ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン
１２４：１１３５−１１５１（１９６６）は、精製され
た酸抽出したＭ蛋白質を用い、一部についてそのワクチ
ンを用いて成功した。ワクチン接種を受けた２２名の成
人のうち１５名は型特異性抗体力価の二次上昇を伴う反
応を示したが、５人についてのみ抗バクテリア抗体の上
昇を示したにすぎなかった。
【００１６】ビーチェイら、ジャーナル・オブ・エクス
ペリメンタル・メジシン１５０：８６２−８７７（１９
７９）は、Ｍ２４蛋白質のペプシン誘導画分（pepsin-d
erived fragment)（Pep Ｍ２４）の明礬沈澱製剤で１２
名の成人にワクチン接種を行なった。局所的又は全身的
反応が観察されなかったから、これは充分に親和性があ
るものと考えられた。ワクチン接種を受けた１２名のう
ち１０名がＭ２４型特異的オプソニン抗体を産生するこ
とにより反応を示した。
ペリメンタル・メジシン１５０：８６２−８７７（１９
７９）は、Ｍ２４蛋白質のペプシン誘導画分（pepsin-d
erived fragment)（Pep Ｍ２４）の明礬沈澱製剤で１２
名の成人にワクチン接種を行なった。局所的又は全身的
反応が観察されなかったから、これは充分に親和性があ
るものと考えられた。ワクチン接種を受けた１２名のう
ち１０名がＭ２４型特異的オプソニン抗体を産生するこ
とにより反応を示した。
【００１７】デイルらによる免疫学的研究、ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メジシン１５１：１０２
６−１０３７（１９８０）によれば、１２名のボランテ
アのうちの２名がＭ２４で免疫されたがＭ５及びＭ６蛋
白質の両者に結合するように改良された抗体のＭ６だけ
がオプソニックであった。しかし、ビーチイらは、シン
ポジウム・オン・バクテリアル・ワクチン、ジェイ・ビ
ー・ロビンス編、ジェイ・シー・ヒル、ブライアン・デ
ッカー・パブリシャー、ニューヨーク、４０１−４１０
頁（１９８１）で、精製された Pep Ｍ５蛋白質（Ｍ５
蛋白質のペプシン誘導画分）で免疫された４匹の兎のう
ちの１匹が高い力価で心臓組織に対する抗体を生成した
ことを見出した。この抗血清は、Ｍ５型蛋白質と心臓組
織と交叉免疫反応を起した。
・オブ・エクスペリメンタル・メジシン１５１：１０２
６−１０３７（１９８０）によれば、１２名のボランテ
アのうちの２名がＭ２４で免疫されたがＭ５及びＭ６蛋
白質の両者に結合するように改良された抗体のＭ６だけ
がオプソニックであった。しかし、ビーチイらは、シン
ポジウム・オン・バクテリアル・ワクチン、ジェイ・ビ
ー・ロビンス編、ジェイ・シー・ヒル、ブライアン・デ
ッカー・パブリシャー、ニューヨーク、４０１−４１０
頁（１９８１）で、精製された Pep Ｍ５蛋白質（Ｍ５
蛋白質のペプシン誘導画分）で免疫された４匹の兎のう
ちの１匹が高い力価で心臓組織に対する抗体を生成した
ことを見出した。この抗血清は、Ｍ５型蛋白質と心臓組
織と交叉免疫反応を起した。
【００１８】２．４ＤＮＡ交雑検定 病原微生物の検出のための通常の診断的方法は、かかる
生物中に見出されると思われるゲノムのＤＮＡ断片が純
粋な形態で入手できるならば、創案できるだろう。もし
そうならば、化学的、酵素的又は放射性同位原素的レポ
ーター・グループで標識をつけることにより、そのＤＮ
Ａ断片を交雑プローブとして用いることができよう。
生物中に見出されると思われるゲノムのＤＮＡ断片が純
粋な形態で入手できるならば、創案できるだろう。もし
そうならば、化学的、酵素的又は放射性同位原素的レポ
ーター・グループで標識をつけることにより、そのＤＮ
Ａ断片を交雑プローブとして用いることができよう。
【００１９】グルンスタイン及びホグネス［プロシージ
ングス・オブ・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス，Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３９６１（１９７５）］は、
このアプローチをコロニー・ハイブリダイゼイションと
呼ばれる方法で使用した。この方法では、検定されるべ
きバクテリアはニトロセルロース・フィルターに移され
た。フィルター上のコロニーはついで分解され、溶出す
るゲノムＤＮＡはフィルターに固定された。32Ｐで標識
されたプローブの配列に補充的に付加されたＤＮＡ中の
ヌクレオチド配列の存在はオートラジオグラフィーによ
って追跡された。ＤＮＡの交雑の他の一般的態様はファ
ルコウらにより米国特許第４，３５８，５３５号明細書
に記載されている。
ングス・オブ・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス，Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３９６１（１９７５）］は、
このアプローチをコロニー・ハイブリダイゼイションと
呼ばれる方法で使用した。この方法では、検定されるべ
きバクテリアはニトロセルロース・フィルターに移され
た。フィルター上のコロニーはついで分解され、溶出す
るゲノムＤＮＡはフィルターに固定された。32Ｐで標識
されたプローブの配列に補充的に付加されたＤＮＡ中の
ヌクレオチド配列の存在はオートラジオグラフィーによ
って追跡された。ＤＮＡの交雑の他の一般的態様はファ
ルコウらにより米国特許第４，３５８，５３５号明細書
に記載されている。
【００２０】
３．発明の概要 連鎖球菌のＭ蛋白質遺伝子の単細胞生物中でのクローニ
ングと発現のための方法と組成物とが提供される。ま
た、これらの新規な単細胞生物をＭ蛋白質を生産するた
めに培養する方法、Ｍ蛋白質ＤＮＡを発現する単一のコ
ロニーを同定する急速検定、及び遺伝子産物の特定のた
めの方法も記載されている。ここに記されている組変え
ＤＮＡ技術により製造されるＭ蛋白質は、ストレプトコ
ッカス・ピオゲネス（Streptococcus Pyogenes) 感染に
対して保護するためワクチン中の免疫原として用いるた
めに調製されうるものである。
ングと発現のための方法と組成物とが提供される。ま
た、これらの新規な単細胞生物をＭ蛋白質を生産するた
めに培養する方法、Ｍ蛋白質ＤＮＡを発現する単一のコ
ロニーを同定する急速検定、及び遺伝子産物の特定のた
めの方法も記載されている。ここに記されている組変え
ＤＮＡ技術により製造されるＭ蛋白質は、ストレプトコ
ッカス・ピオゲネス（Streptococcus Pyogenes) 感染に
対して保護するためワクチン中の免疫原として用いるた
めに調製されうるものである。
【００２１】ここに記載されている特定の態様では、大
腸菌トランスダクタント（E. colitransductants)によ
り生産される蛋白質はＡ群連鎖球菌の細胞壁の可溶化に
よって単離されるＭ６蛋白質よりごく少し大きいが、連
鎖球菌のプロトプラストとＬ型により分泌されるものと
同程度の大きさを有している。免疫学的に大腸菌トラン
スダクタントにより合成される分子は連鎖球菌Ｍ６蛋白
質と同じ型特異性決定部位を有している。Ｍ蛋白質は、
オクターロニー（Ouchterlony)二重融合実験により抗原
的に、（ａ）オプソニン抗体除去試験及び（ｂ）オプソ
ニン抗体の生産誘導能により免疫原的に特徴づけられ
る。クロン化されたＭ蛋白質は単離され、ドデシル硫酸
ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法で分
画される。さらに発現された遺伝子産物の単離方法も記
載されている。
腸菌トランスダクタント（E. colitransductants)によ
り生産される蛋白質はＡ群連鎖球菌の細胞壁の可溶化に
よって単離されるＭ６蛋白質よりごく少し大きいが、連
鎖球菌のプロトプラストとＬ型により分泌されるものと
同程度の大きさを有している。免疫学的に大腸菌トラン
スダクタントにより合成される分子は連鎖球菌Ｍ６蛋白
質と同じ型特異性決定部位を有している。Ｍ蛋白質は、
オクターロニー（Ouchterlony)二重融合実験により抗原
的に、（ａ）オプソニン抗体除去試験及び（ｂ）オプソ
ニン抗体の生産誘導能により免疫原的に特徴づけられ
る。クロン化されたＭ蛋白質は単離され、ドデシル硫酸
ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法で分
画される。さらに発現された遺伝子産物の単離方法も記
載されている。
【００２２】本発明は連鎖球菌のオプソニン抗体及び抗
原の製造法を提供する。それらは、ヒトの医薬及び微生
物学的研究において一般的重要性を有するものである。
この用途は本発明で生産される連鎖球菌Ｍ蛋白質をラジ
オイムノアッセイのような超高感度検定のための高度に
再現性を有する標準抗原として用いることを含むもので
ある。これらの検定は生物学的標本中の連鎖球菌に対す
る抗体の発見のための診断的手段として用いられうる。
原の製造法を提供する。それらは、ヒトの医薬及び微生
物学的研究において一般的重要性を有するものである。
この用途は本発明で生産される連鎖球菌Ｍ蛋白質をラジ
オイムノアッセイのような超高感度検定のための高度に
再現性を有する標準抗原として用いることを含むもので
ある。これらの検定は生物学的標本中の連鎖球菌に対す
る抗体の発見のための診断的手段として用いられうる。
【００２３】連鎖球菌Ｍ蛋白質遺伝子又はその画分の分
子プローブとしての使用を通じて、生体組織及び体液中
の病原性連鎖球菌の診断的同定のための方法も提供され
ている。本方法においては、ＤＮＡが微生物的単離物か
ら抽出され、分子状プローブへの交雑により相補的ヌク
レオチド配列が試験される。この手段によって多数の単
離物中の、比較的容易に連鎖球菌の存在を高感度、高信
頼度でスクリーニングできる。その結果は現在用いられ
ているより厄介な血清学的診断検査よりも顕著に有利な
スクリーニング・テストを提供するものである。
子プローブとしての使用を通じて、生体組織及び体液中
の病原性連鎖球菌の診断的同定のための方法も提供され
ている。本方法においては、ＤＮＡが微生物的単離物か
ら抽出され、分子状プローブへの交雑により相補的ヌク
レオチド配列が試験される。この手段によって多数の単
離物中の、比較的容易に連鎖球菌の存在を高感度、高信
頼度でスクリーニングできる。その結果は現在用いられ
ているより厄介な血清学的診断検査よりも顕著に有利な
スクリーニング・テストを提供するものである。
【００２４】４．発明の詳細な記載 ４．１Ｍ蛋白質免疫原 本発明はワクチン製剤における免疫原として用いられう
る連鎖球菌Ｍ蛋白質を製造する組変えＤＮＡ技術に関す
るものである。さらに特定すれば、Ｍ６蛋白質の製造が
記載されている。
る連鎖球菌Ｍ蛋白質を製造する組変えＤＮＡ技術に関す
るものである。さらに特定すれば、Ｍ６蛋白質の製造が
記載されている。
【００２５】ここに記載されているように構成された組
換えプラスミドは、宿主細胞（原核又は真核）に対し宿
主細胞の分解に対して安定かつ抵抗性のある連鎖球菌Ｍ
蛋白質の生産性を与える。かかるプラスミドは天然に存
在するＭ蛋白質の免疫学的、抗原的決定部位を含む多量
の蛋白質又はその画分を生成することができる。ここに
記されている特定の態様はＭ６蛋白質に関する。しか
し、ここに記載されるＤＮＡ分子はＭ６蛋白質の生産に
限定されるものではなく、いかなるＡ群連鎖球菌Ｍ蛋白
の製造にも用いうるものである。
換えプラスミドは、宿主細胞（原核又は真核）に対し宿
主細胞の分解に対して安定かつ抵抗性のある連鎖球菌Ｍ
蛋白質の生産性を与える。かかるプラスミドは天然に存
在するＭ蛋白質の免疫学的、抗原的決定部位を含む多量
の蛋白質又はその画分を生成することができる。ここに
記されている特定の態様はＭ６蛋白質に関する。しか
し、ここに記載されるＤＮＡ分子はＭ６蛋白質の生産に
限定されるものではなく、いかなるＡ群連鎖球菌Ｍ蛋白
の製造にも用いうるものである。
【００２６】Ｍ６蛋白質についてここに記載されている
組成物と方法とのすべてのＭ蛋白質への一般的応用可能
性はフィシエティ及びマンジュラの研究（１９８２，ロ
ビンス，ヒル及びサドフ（編集）、バクテリアル・ワク
チン中の４１１−４４８頁、連鎖球菌Ｍ蛋白質及び哺乳
動物トロポミオシン間の構造の関係の免疫学的連係）か
ら明らかである。たとえばこれまでに配列がきめられた
すべてのＭ蛋白質はＭ５、Ｍ６及びＭ２４を含んで明瞭
な同族性を示し、すべて多重コイル構造である。アミノ
末端及び他の配列がきめられた画分は３種のＭ分子のす
べてについて７個の残基の周期的くりかえしを示してい
る。さらに数種のＭ型の免疫学的分析は、各種の型の間
の交叉反応を示した。フィシェッティ，ジャーナル・オ
ブ・エクスペリメンタル・メジシン１４６：１１０８−
１１２３（１９７７）；マンジュラ及びフィシェッテ
ィ，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン
１５１：６９５−７０８（１９８０）；マンジュラ及び
フィシェッティ，ジャーナル・オブ・イムノロジー１２
４：２６１−２６７（１９８０）。さらに下記に示す交
雑のデータは試験した５６種のＭ蛋白質遺伝子のすべて
の間で構造の類似性を示している。
組成物と方法とのすべてのＭ蛋白質への一般的応用可能
性はフィシエティ及びマンジュラの研究（１９８２，ロ
ビンス，ヒル及びサドフ（編集）、バクテリアル・ワク
チン中の４１１−４４８頁、連鎖球菌Ｍ蛋白質及び哺乳
動物トロポミオシン間の構造の関係の免疫学的連係）か
ら明らかである。たとえばこれまでに配列がきめられた
すべてのＭ蛋白質はＭ５、Ｍ６及びＭ２４を含んで明瞭
な同族性を示し、すべて多重コイル構造である。アミノ
末端及び他の配列がきめられた画分は３種のＭ分子のす
べてについて７個の残基の周期的くりかえしを示してい
る。さらに数種のＭ型の免疫学的分析は、各種の型の間
の交叉反応を示した。フィシェッティ，ジャーナル・オ
ブ・エクスペリメンタル・メジシン１４６：１１０８−
１１２３（１９７７）；マンジュラ及びフィシェッテ
ィ，ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン
１５１：６９５−７０８（１９８０）；マンジュラ及び
フィシェッティ，ジャーナル・オブ・イムノロジー１２
４：２６１−２６７（１９８０）。さらに下記に示す交
雑のデータは試験した５６種のＭ蛋白質遺伝子のすべて
の間で構造の類似性を示している。
【００２７】この技術における熟達者にとっては、種々
の免疫原及びワクチン製剤をつくりうることを直ちに知
ることができよう。
の免疫原及びワクチン製剤をつくりうることを直ちに知
ることができよう。
【００２８】４．２Ｍ蛋白質分子プローブ ここに記載されるＭ蛋白質遺伝子又はその画分は連鎖球
菌に対する診断試験における分子プローブとして使用さ
れうる。この試験の原理は、病原性連鎖球菌は、本発明
のＭ蛋白質の画分に対し相補的な遺伝子配列を有してい
るという事実である。かかる遺伝子の相補性は連鎖球菌
感染と疑われるものから微生物ＤＮＡを単離し、そのＤ
ＮＡを固状担体上又は液状媒体中で適切な条件下に分子
プローブと結合させることにより直ちに検出されうる。
交雑の生起は適当なリポーター群のプローブに対する添
加により容易に検出されうる。
菌に対する診断試験における分子プローブとして使用さ
れうる。この試験の原理は、病原性連鎖球菌は、本発明
のＭ蛋白質の画分に対し相補的な遺伝子配列を有してい
るという事実である。かかる遺伝子の相補性は連鎖球菌
感染と疑われるものから微生物ＤＮＡを単離し、そのＤ
ＮＡを固状担体上又は液状媒体中で適切な条件下に分子
プローブと結合させることにより直ちに検出されうる。
交雑の生起は適当なリポーター群のプローブに対する添
加により容易に検出されうる。
【００２９】連鎖球菌状生物はいかなる体組織や体液中
の感染部位からも単離されうるが、単純な咽喉洗滌物は
最も好適な材料となろう。多分混合培養物であろうこの
ようにして得られた微生物は直接（すなわち洗滌物上
で）又は当該技術の専門家によく知られている培養媒体
のいづれかの中で多数の細胞を生成するよう生育させて
用いられうる。そして、混合培養物からのＤＮＡは、凍
結−融解、音波処理又は他の機械的手段によりおよび／
または一般的あるいは特異的な細菌細胞壁分解試薬での
処理により分裂させたのち抽出されうる。
の感染部位からも単離されうるが、単純な咽喉洗滌物は
最も好適な材料となろう。多分混合培養物であろうこの
ようにして得られた微生物は直接（すなわち洗滌物上
で）又は当該技術の専門家によく知られている培養媒体
のいづれかの中で多数の細胞を生成するよう生育させて
用いられうる。そして、混合培養物からのＤＮＡは、凍
結−融解、音波処理又は他の機械的手段によりおよび／
または一般的あるいは特異的な細菌細胞壁分解試薬での
処理により分裂させたのち抽出されうる。
【００３０】抽出されたＤＮＡは通常水性アルカリの添
加により変性され、ついで緩衝溶液で洗浄される。アル
カリの特定の濃度や緩衝液の組成等は実験の条件によ
り、通常実験により容易に決定しうる。本発明の変性Ｍ
蛋白質遺伝子プローブは、ついで微生物のＤＮＡ製剤に
加えられ、ＤＮＡ配列の点において相補的に交雑させら
れる。特異的結合は交雑混合物を充分に洗滌して非特異
的結合を除去したのちに残すことにより確認されよう。
加により変性され、ついで緩衝溶液で洗浄される。アル
カリの特定の濃度や緩衝液の組成等は実験の条件によ
り、通常実験により容易に決定しうる。本発明の変性Ｍ
蛋白質遺伝子プローブは、ついで微生物のＤＮＡ製剤に
加えられ、ＤＮＡ配列の点において相補的に交雑させら
れる。特異的結合は交雑混合物を充分に洗滌して非特異
的結合を除去したのちに残すことにより確認されよう。
【００３１】交雑はその目的のために開発され、認めら
れて来ている多数の溶液のひとつの中で行われる。ファ
ルコウらは米国特許第４，３５８，５３５号明細書に全
般的に溶液組成及び交雑工程の多くの考察を記載した。
この特許はその一般的有用性の故に、ここに参考文献と
して包含される。他の交雑の指標となる特定の数値、た
とえば時間や温度、および用いられる方法は本発明にと
って必須のものではない。たとえばゴール及びパーデュ
［プロシージングス・オブ・ナチュラル・アカデミー・
オブ・サイエンスＵ．Ｓ．Ａ．６３：３７８−３８３
（１９６９）］及びジョンら［ネイチュアー２２３：５
８２−５８７（１９６９）］によって記載された方法が
適用されうる。事実交雑のために選ばれる方法は技術水
準の進歩とともに変ってゆくものと期待される。
れて来ている多数の溶液のひとつの中で行われる。ファ
ルコウらは米国特許第４，３５８，５３５号明細書に全
般的に溶液組成及び交雑工程の多くの考察を記載した。
この特許はその一般的有用性の故に、ここに参考文献と
して包含される。他の交雑の指標となる特定の数値、た
とえば時間や温度、および用いられる方法は本発明にと
って必須のものではない。たとえばゴール及びパーデュ
［プロシージングス・オブ・ナチュラル・アカデミー・
オブ・サイエンスＵ．Ｓ．Ａ．６３：３７８−３８３
（１９６９）］及びジョンら［ネイチュアー２２３：５
８２−５８７（１９６９）］によって記載された方法が
適用されうる。事実交雑のために選ばれる方法は技術水
準の進歩とともに変ってゆくものと期待される。
【００３２】本発明の基礎となる分子プローブは、特定
の交雑を起しうるように遺伝子配列を保持するに充分で
あるかぎりは、Ｍ蛋白質遺伝子の全部又はその一部だけ
をも色括するものである。かかる交雑はごくわずかな程
度であってさえも、その分子プローブに適切なリポータ
ー・グループを結合させることによって検出されうる。
そのプローブは放射性同位原素で標識を付しうる（たと
えば32Ｐ，3 Ｈ，14Ｃ，35Ｓ等による標識）し、また化
学的あるいは酵素的リポーター・グループで標識されう
る。たとえば、生物的に細分化された（biotinylated)
プローブと組み合わされた比色検出装置を、たとえばフ
ルオレッセイン・アビジン，ローダミン・アピジン又は
酵素と結合したアビジン等のアビジン誘導体と共に用い
ることができる。
の交雑を起しうるように遺伝子配列を保持するに充分で
あるかぎりは、Ｍ蛋白質遺伝子の全部又はその一部だけ
をも色括するものである。かかる交雑はごくわずかな程
度であってさえも、その分子プローブに適切なリポータ
ー・グループを結合させることによって検出されうる。
そのプローブは放射性同位原素で標識を付しうる（たと
えば32Ｐ，3 Ｈ，14Ｃ，35Ｓ等による標識）し、また化
学的あるいは酵素的リポーター・グループで標識されう
る。たとえば、生物的に細分化された（biotinylated)
プローブと組み合わされた比色検出装置を、たとえばフ
ルオレッセイン・アビジン，ローダミン・アピジン又は
酵素と結合したアビジン等のアビジン誘導体と共に用い
ることができる。
【００３３】Ｍ６蛋白質のエシエリヒア・コリ（大腸
菌）（Escherichier coli)中でのクローニングと発現の
方法及び連鎖球菌感染を特徴づけるためのプローブとし
てのＭ６蛋白質遺伝子の使用法の下記する実施例は、例
示の目的で記されるもので、発明の範囲についての限定
の意図によるものではない。
菌）（Escherichier coli)中でのクローニングと発現の
方法及び連鎖球菌感染を特徴づけるためのプローブとし
てのＭ６蛋白質遺伝子の使用法の下記する実施例は、例
示の目的で記されるもので、発明の範囲についての限定
の意図によるものではない。
【００３４】
５．実施例：連鎖球菌Ｍ蛋白質遺伝子を含むクロンの製
造、及び該遺伝子の連鎖球菌感染の診断的試験における
分子プローブとしての使用 ５．１連鎖球菌ＤＮＡの単離 Ｍ６蛋白質遺伝子の起原は、ストレプトコッカス・ピオ
ゲネス（Streptococcus Pyogenes) Ｄ４７１株（Ａ群連
鎖球菌）であった。Ｃ群連鎖球菌ファージ細胞溶解素
（Group C streptococcal phage lysin)が、３０％ラフ
イノーズの存在下に、安定なプロトプラストを残してＡ
群連鎖球菌の細胞壁を溶解するために用いられた（フィ
リップスら、プロシージングス・オブ・ナチュラル・ア
カデミー・オブ・サイエンス，Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：４６
８９（１９８１））。ついでそのプロトプラストは充分
に洗浄され連鎖球菌のデオキシリボヌクレアーゼ（DNAs
e)を除去するため蛋白分解酵素Ｋで処理された。プロト
プラストはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中に希釈
して溶菌され、抽出物がＲＮＡを消化するためリボヌク
レアーゼＩで処理された。塩化セシウムが加えられた。
この製品は蛋白質を除去するために約１００ｘｇで遠心
分離され、一夜透析された。ＤＮＡはエタノールにより
沈澱させられた。使用のために選択されたＤＮＡ画分は
消化前に充分１００キロベース（kb) 以上であった（Ｐ
1 ファージＤＮＡを１００ｋｂの標準とし、Ｐ１分子の
半分を５０ｋｂの標準として０．４％アガローズ・ゲル
上でのアガローズ・ゲル電気泳動で検定した）。
造、及び該遺伝子の連鎖球菌感染の診断的試験における
分子プローブとしての使用 ５．１連鎖球菌ＤＮＡの単離 Ｍ６蛋白質遺伝子の起原は、ストレプトコッカス・ピオ
ゲネス（Streptococcus Pyogenes) Ｄ４７１株（Ａ群連
鎖球菌）であった。Ｃ群連鎖球菌ファージ細胞溶解素
（Group C streptococcal phage lysin)が、３０％ラフ
イノーズの存在下に、安定なプロトプラストを残してＡ
群連鎖球菌の細胞壁を溶解するために用いられた（フィ
リップスら、プロシージングス・オブ・ナチュラル・ア
カデミー・オブ・サイエンス，Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：４６
８９（１９８１））。ついでそのプロトプラストは充分
に洗浄され連鎖球菌のデオキシリボヌクレアーゼ（DNAs
e)を除去するため蛋白分解酵素Ｋで処理された。プロト
プラストはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中に希釈
して溶菌され、抽出物がＲＮＡを消化するためリボヌク
レアーゼＩで処理された。塩化セシウムが加えられた。
この製品は蛋白質を除去するために約１００ｘｇで遠心
分離され、一夜透析された。ＤＮＡはエタノールにより
沈澱させられた。使用のために選択されたＤＮＡ画分は
消化前に充分１００キロベース（kb) 以上であった（Ｐ
1 ファージＤＮＡを１００ｋｂの標準とし、Ｐ１分子の
半分を５０ｋｂの標準として０．４％アガローズ・ゲル
上でのアガローズ・ゲル電気泳動で検定した）。
【００３５】５．２大腸菌へのクローニング Ｍ蛋白質生成のためにスクリーニングされるのに必要で
あり、かつＭ蛋白質の構造遺伝子に結合される調節部位
を残すのに必要な大腸菌クロンの候補の数を減らすため
に、連鎖球菌ＤＮＡの大きい断片がクローンされなけれ
ばならなかった。従って、３５ないし４０ｋｂのＤＮＡ
の挿入を受け入れるコスミド・ベクターが必要であっ
た。クローニング・ビヒクルとして５．４ｋｂのベクタ
ー，ｐＪＢ８が選ばれた。このベクターは、イッシュ−
ホロウイッツ及びバーク、ヌクレイック・アシッヅ・リ
サーチ９（１３）：２９８９−２９９８（１９８１）が
記載した方法によりアンピシリン耐性プラスミドHomer
Ｉと合成Bam ＨＩリンカーとから構成された。
あり、かつＭ蛋白質の構造遺伝子に結合される調節部位
を残すのに必要な大腸菌クロンの候補の数を減らすため
に、連鎖球菌ＤＮＡの大きい断片がクローンされなけれ
ばならなかった。従って、３５ないし４０ｋｂのＤＮＡ
の挿入を受け入れるコスミド・ベクターが必要であっ
た。クローニング・ビヒクルとして５．４ｋｂのベクタ
ー，ｐＪＢ８が選ばれた。このベクターは、イッシュ−
ホロウイッツ及びバーク、ヌクレイック・アシッヅ・リ
サーチ９（１３）：２９８９−２９９８（１９８１）が
記載した方法によりアンピシリン耐性プラスミドHomer
Ｉと合成Bam ＨＩリンカーとから構成された。
【００３６】本発明においては、ベクターｐＪＢ８は、
ベクターを特有な位置で切断し「粘着末端」を生成する
マニアティスら、上掲書、１０４−１０６頁）が一般的
に記載したところによりBam ＨＩで消化された。切断さ
れたベクターは、ベクター・ベクター間の再結合や再環
形成を防ぐために、アルカリ性フォスファターゼで処理
され（たとえばマニアティスら、上掲書、１３３−１３
４）、線状化されたベクターの５′−フォスフェートが
除去された。ランダムなＤＮＡ断片を生成させるため、
第５．１節に記載したようにして単離された連鎖球菌Ｄ
ＮＡを部分的に消化するためにSau ３ａ制限酵素が用い
られた（たとえばマニアティスら、前掲書、２９８）。
分画された連鎖球菌ＤＮＡはｐＪＢ８ベクター上のBam
ＨＩの部分に結合された（第１図参照、たとえばマニア
ティスら、上掲書、２９８−２９９）。
ベクターを特有な位置で切断し「粘着末端」を生成する
マニアティスら、上掲書、１０４−１０６頁）が一般的
に記載したところによりBam ＨＩで消化された。切断さ
れたベクターは、ベクター・ベクター間の再結合や再環
形成を防ぐために、アルカリ性フォスファターゼで処理
され（たとえばマニアティスら、上掲書、１３３−１３
４）、線状化されたベクターの５′−フォスフェートが
除去された。ランダムなＤＮＡ断片を生成させるため、
第５．１節に記載したようにして単離された連鎖球菌Ｄ
ＮＡを部分的に消化するためにSau ３ａ制限酵素が用い
られた（たとえばマニアティスら、前掲書、２９８）。
分画された連鎖球菌ＤＮＡはｐＪＢ８ベクター上のBam
ＨＩの部分に結合された（第１図参照、たとえばマニア
ティスら、上掲書、２９８−２９９）。
【００３７】連鎖球菌ＤＮＡが挿入されたベクターは試
験管内でラムダ・ファージの頭部にとりこまれた［ホー
ン及びコリンズ，ジーン１１：２９１（１９８０）］。
とりこまれたキメラＤＮＡを包含するファージは、熱的
に誘起されうるプロファージを有する大腸菌Ｋ１２の制
限部位のない株Ｃ６００（lambdac Ｉ８５７）rec Ａを
形質導入するために用いられた。アンピシリン耐性コロ
ニーが３０℃で選び出され、同じ選択培地に移され、一
夜３０℃で培養されて、マスター・プレートをつくっ
た。
験管内でラムダ・ファージの頭部にとりこまれた［ホー
ン及びコリンズ，ジーン１１：２９１（１９８０）］。
とりこまれたキメラＤＮＡを包含するファージは、熱的
に誘起されうるプロファージを有する大腸菌Ｋ１２の制
限部位のない株Ｃ６００（lambdac Ｉ８５７）rec Ａを
形質導入するために用いられた。アンピシリン耐性コロ
ニーが３０℃で選び出され、同じ選択培地に移され、一
夜３０℃で培養されて、マスター・プレートをつくっ
た。
【００３８】大腸菌中にクロンされたほとんどのグラム
陽性遺伝子は発現しているので、Ｍ蛋白質遺伝子が大腸
菌中で発現するという可能性は高かった。しかし、Ｍ蛋
白質はペリプラスム（periplasm)と外膜といういずれも
連鎖球菌には存在しないものを通して移送されなければ
ならないから、Ｍ蛋白質が大腸菌の表面に現われるとは
思われなかった。この理由から、その大腸菌のマスター
・プレートはプロファージを誘起し、宿主細胞を溶菌す
るために４２℃に移され、クロン化された遺伝子の発現
を確認した。［シャルカ及びシャピロ，ジーン１：６５
（１９７６）］
陽性遺伝子は発現しているので、Ｍ蛋白質遺伝子が大腸
菌中で発現するという可能性は高かった。しかし、Ｍ蛋
白質はペリプラスム（periplasm)と外膜といういずれも
連鎖球菌には存在しないものを通して移送されなければ
ならないから、Ｍ蛋白質が大腸菌の表面に現われるとは
思われなかった。この理由から、その大腸菌のマスター
・プレートはプロファージを誘起し、宿主細胞を溶菌す
るために４２℃に移され、クロン化された遺伝子の発現
を確認した。［シャルカ及びシャピロ，ジーン１：６５
（１９７６）］
【００３９】５．３Ｍ蛋白質の発現のための単一コロニ
ーの高速検定 Ｍ蛋白質を発現する大腸菌のクロンを認識するため高速
検定法を開発した。この技術はＭ蛋白質を発現する単一
のコロニーを容易に見分けうる。
ーの高速検定 Ｍ蛋白質を発現する大腸菌のクロンを認識するため高速
検定法を開発した。この技術はＭ蛋白質を発現する単一
のコロニーを容易に見分けうる。
【００４０】この検定法は、試験さるべき溶菌されたコ
ロニーをニトロセルローズフィルターに移し、蛋白質に
対するフィルターの非特異的親和性を減少させるため牛
血清アルブミン中で該フィルターを洗滌し、そのフィル
ターを大腸菌細胞で充分に予備吸収（pre-absorbed) し
た精製されたLys Ｍ６に対する抗血清と反応させ、適宜
に洗浄し、125 Ｉ−連鎖球菌蛋白質Ａ（抗原−抗体複合
体に結合している）と反応させ、再び洗浄し、ついでオ
ートラジオグラフィーで測定することからなる。
ロニーをニトロセルローズフィルターに移し、蛋白質に
対するフィルターの非特異的親和性を減少させるため牛
血清アルブミン中で該フィルターを洗滌し、そのフィル
ターを大腸菌細胞で充分に予備吸収（pre-absorbed) し
た精製されたLys Ｍ６に対する抗血清と反応させ、適宜
に洗浄し、125 Ｉ−連鎖球菌蛋白質Ａ（抗原−抗体複合
体に結合している）と反応させ、再び洗浄し、ついでオ
ートラジオグラフィーで測定することからなる。
【００４１】Ｍ６蛋白質を検出するには抗血清は１００
０倍以上に希釈される。抗血清が１０倍希釈（さらに１
００倍以上濃縮された）で用いられたときは大腸菌と検
出しうる反応を起さない。この方法により、親の連鎖球
菌中に生産された１％未満の量のＭ６蛋白質の大腸菌ク
ロンによる生成が検出されうる。
０倍以上に希釈される。抗血清が１０倍希釈（さらに１
００倍以上濃縮された）で用いられたときは大腸菌と検
出しうる反応を起さない。この方法により、親の連鎖球
菌中に生産された１％未満の量のＭ６蛋白質の大腸菌ク
ロンによる生成が検出されうる。
【００４２】スクリーンされた３３５のコロニーのう
ち、１つが精製Ｍ６蛋白質に対する抗血清と強く反応し
た。この株のうちに存在するキメラ・プラスミドは pJR
S ４２と名づけられた。この大腸菌クロンのＭ６蛋白質
の生産能はアンピシリン含有培地中のサブ・カルチュア
上で安定に維持された。プラスミド pJRS ４２は EcoＲ
Ｉエンドヌクレアーゼで処理され、連鎖球菌ＤＮＡの画
分を除去し pJRS ４２．１３を生成した。このプラスミ
ドはすべての必要な複製機能とそのプロモーター系とと
もにＭ６蛋白質をコードする完全な配列を保持してい
る。
ち、１つが精製Ｍ６蛋白質に対する抗血清と強く反応し
た。この株のうちに存在するキメラ・プラスミドは pJR
S ４２と名づけられた。この大腸菌クロンのＭ６蛋白質
の生産能はアンピシリン含有培地中のサブ・カルチュア
上で安定に維持された。プラスミド pJRS ４２は EcoＲ
Ｉエンドヌクレアーゼで処理され、連鎖球菌ＤＮＡの画
分を除去し pJRS ４２．１３を生成した。このプラスミ
ドはすべての必要な複製機能とそのプロモーター系とと
もにＭ６蛋白質をコードする完全な配列を保持してい
る。
【００４３】５．４遺伝子産物の同定 pJB ８と pJRS ４２を含むＣ６００ＮＲトランスダクタ
ントを含む大腸菌Ｃ６００ＮＲ株は、アンピシリン含有
のトッド−ヘウイット肉汁（牛心臓添加肉汁（beef hea
rt infusion broth)）中で対数増殖期の終期まで３０℃
で生育させた。細胞はペレット化され、二度洗浄され、
ついでエチレン・ジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）−リ
ゾチームで溶菌され、乾燥氷−エタノール中で凍結し、
３７℃で急速に解凍された。ＤＮＡ−アーゼ（ＤＮＡ s
e ）処理にひきつづき、１０，０００ｘｇで３０分間遠
心分離して細胞の破片を除去し、抽出物を０．４５ミク
ロンのミリボア・フィルターに通し、５０ｍＭの重炭酸
アンモニウムに対して透析した。
ントを含む大腸菌Ｃ６００ＮＲ株は、アンピシリン含有
のトッド−ヘウイット肉汁（牛心臓添加肉汁（beef hea
rt infusion broth)）中で対数増殖期の終期まで３０℃
で生育させた。細胞はペレット化され、二度洗浄され、
ついでエチレン・ジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）−リ
ゾチームで溶菌され、乾燥氷−エタノール中で凍結し、
３７℃で急速に解凍された。ＤＮＡ−アーゼ（ＤＮＡ s
e ）処理にひきつづき、１０，０００ｘｇで３０分間遠
心分離して細胞の破片を除去し、抽出物を０．４５ミク
ロンのミリボア・フィルターに通し、５０ｍＭの重炭酸
アンモニウムに対して透析した。
【００４４】大腸菌中に生成したＭ蛋白質分子の同定は
免疫吸収分析（immunoblot analysis)で決定された。フ
ォリンの反応［ロウリーら、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー１９３：２６５（１９５１）］
で決定された当量蛋白質濃度がＳＤＳ含有の１２％ポリ
アクリルアミド・ゲルに適用された。６型連鎖球菌から
ファージ細胞溶解素で細胞壁を可溶化することにより、
６型連鎖球菌から抽出された精製Ｍ６蛋白質の標準製品
が対象として隣接するウェル（well) に対して適用され
た。電気泳動後、分離された蛋白質はニトロセルローズ
上に移され、フィルター上の未反応部位はツイーン２０
（ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレート）
を用いて保護され、大腸菌で吸収された連鎖球菌から得
られた細胞溶解素で抽出されたＭ６蛋白質に対して向け
られた抗血清とともにフィルターが培養された。山羊の
抗ウサギ IgGに結合したアルカリ性フォスファターゼを
用いる酵素結合免疫検定法が結合抗体を検出するために
用いられた。アルカリ性フォスファターゼの基質として
インドキシル・フォスフェイトが、発色団としてニトロ
ブルー・テトラゾリウムが用いられ、ブレイクらの方法
［アナリティカル・バイオケミストリー１３６：１７５
−１７９（１９８４）］でバンドが可視化された。Ｍ６
抗血清は対照のＭ６と pJRS ４２を含む大腸菌クロンの
抽出物のいづれとも反応したが、pJB ８ベクターのみを
含む親の大腸菌の抽出物とは反応しなかった。
免疫吸収分析（immunoblot analysis)で決定された。フ
ォリンの反応［ロウリーら、ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー１９３：２６５（１９５１）］
で決定された当量蛋白質濃度がＳＤＳ含有の１２％ポリ
アクリルアミド・ゲルに適用された。６型連鎖球菌から
ファージ細胞溶解素で細胞壁を可溶化することにより、
６型連鎖球菌から抽出された精製Ｍ６蛋白質の標準製品
が対象として隣接するウェル（well) に対して適用され
た。電気泳動後、分離された蛋白質はニトロセルローズ
上に移され、フィルター上の未反応部位はツイーン２０
（ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレート）
を用いて保護され、大腸菌で吸収された連鎖球菌から得
られた細胞溶解素で抽出されたＭ６蛋白質に対して向け
られた抗血清とともにフィルターが培養された。山羊の
抗ウサギ IgGに結合したアルカリ性フォスファターゼを
用いる酵素結合免疫検定法が結合抗体を検出するために
用いられた。アルカリ性フォスファターゼの基質として
インドキシル・フォスフェイトが、発色団としてニトロ
ブルー・テトラゾリウムが用いられ、ブレイクらの方法
［アナリティカル・バイオケミストリー１３６：１７５
−１７９（１９８４）］でバンドが可視化された。Ｍ６
抗血清は対照のＭ６と pJRS ４２を含む大腸菌クロンの
抽出物のいづれとも反応したが、pJB ８ベクターのみを
含む親の大腸菌の抽出物とは反応しなかった。
【００４５】大腸菌クロンにより生成されるＭ蛋白質の
分子量が、精製された LysＭ６蛋白質の標準製品と免疫
吸収分析（immunoblot analysis)で比較された。この分
子はファージ細胞溶解素という酵素によるストレプトコ
ッカスの細胞壁の可溶化とカラム・クロマトグラフィー
による精製の結果物である。それは連鎖球菌の細胞壁か
ら分離された最大のＭ蛋白質分子であることを示してい
る。
分子量が、精製された LysＭ６蛋白質の標準製品と免疫
吸収分析（immunoblot analysis)で比較された。この分
子はファージ細胞溶解素という酵素によるストレプトコ
ッカスの細胞壁の可溶化とカラム・クロマトグラフィー
による精製の結果物である。それは連鎖球菌の細胞壁か
ら分離された最大のＭ蛋白質分子であることを示してい
る。
【００４６】このＭ６蛋白質はつぎのようにして精製さ
れた。プラスミド pJRS ４２．１３を含む大腸菌をＥＤ
ＴＡ及び２０％のショ糖の存在下にリゾチームで処理し
た。これにより原形質をとりまく内容物が周辺の液体中
に溶出される。生物の遠心分離により原形質外（peripl
asmic)の内容物を他の大腸菌関連蛋白質とともに上澄液
中にのこす。この技術を用いて、Ｍ蛋白質は原形質外空
間には高濃度で存在するが、実質上は細胞質には存在し
ないことが知られた。従って、この方法はＭ蛋白質精製
の出発原料を生成させるのに用いられた。
れた。プラスミド pJRS ４２．１３を含む大腸菌をＥＤ
ＴＡ及び２０％のショ糖の存在下にリゾチームで処理し
た。これにより原形質をとりまく内容物が周辺の液体中
に溶出される。生物の遠心分離により原形質外（peripl
asmic)の内容物を他の大腸菌関連蛋白質とともに上澄液
中にのこす。この技術を用いて、Ｍ蛋白質は原形質外空
間には高濃度で存在するが、実質上は細胞質には存在し
ないことが知られた。従って、この方法はＭ蛋白質精製
の出発原料を生成させるのに用いられた。
【００４７】粗製の原形質外の内容物中のＭ蛋白質は他
の夾雑する蛋白質からカラム・クロマトグラフィーで精
製された。粗製の原形質外調製品は５ｍＭ重炭酸アンモ
ニウムのｐＨ５．５緩衝液で透析され、カルボキシメチ
ルセルロースのカラムにかけられた。カラムは同じ緩衝
液の３倍量で洗浄し、ｐＨ７．０で１００ｍＭリン酸ナ
トリウムで１段で付着する蛋白質を溶出した。遊離蛋白
（Ｍ蛋白を含む）は２５ｍＭ濃度のリン酸ナトリウムｐ
Ｈ７．０で平衡化したヒドロキシアパタイトに直接使用
した。カラムをカラムの２倍量のｐＨ７．０の２００ｍ
Ｍリン酸ナトリウムで洗浄し、ついで付着するＭ蛋白質
をｐＨ７．０のリン酸ナトリウム４００ｍＭ溶液で溶出
した。この方法によって、高度に精製されたＭ蛋白質製
品が得られ、それはＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動法と配列分析法（sequence analysis)で決定さ
れた。
の夾雑する蛋白質からカラム・クロマトグラフィーで精
製された。粗製の原形質外調製品は５ｍＭ重炭酸アンモ
ニウムのｐＨ５．５緩衝液で透析され、カルボキシメチ
ルセルロースのカラムにかけられた。カラムは同じ緩衝
液の３倍量で洗浄し、ｐＨ７．０で１００ｍＭリン酸ナ
トリウムで１段で付着する蛋白質を溶出した。遊離蛋白
（Ｍ蛋白を含む）は２５ｍＭ濃度のリン酸ナトリウムｐ
Ｈ７．０で平衡化したヒドロキシアパタイトに直接使用
した。カラムをカラムの２倍量のｐＨ７．０の２００ｍ
Ｍリン酸ナトリウムで洗浄し、ついで付着するＭ蛋白質
をｐＨ７．０のリン酸ナトリウム４００ｍＭ溶液で溶出
した。この方法によって、高度に精製されたＭ蛋白質製
品が得られ、それはＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル
電気泳動法と配列分析法（sequence analysis)で決定さ
れた。
【００４８】アミノ末端配列分析で精製大腸菌合成Ｍ６
蛋白質から単一のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）
−アミノ酸が各分解段階で得られ、最終製品の均質性が
証明された。さらに、アミノ末端の配列は、アミノ末端
の残基を除く最初の配列された３５箇の残基によって L
ys Ｍ６のアミノ末端配列と同一であることがわかっ
た。大腸菌の分子はリジン分子の精製の間に脱離されう
るアミノ末端に余分にアルギニン残基を有している。精
製された Lys Ｍ６製品はさきにＭ６分子でみられた多
重バンドの模様を有しているが、それはおそらく抽出と
精製との過程での分解によるものであろう。３つの大き
いバンドは５１，０００、５２，０００及び５３，００
０ダルトンのはっきりした分子量に相当する。Ｍ６製品
の大きさの異質さは、おそらく蛋白質のカルボキシ末端
部分の相違からくるものであろう。この理由は、配列の
分解による本製品のアミノ末端配列分析の間に各段階ご
とに一つのアミノ酸残基のみが放出されることによる。
抗Ｍ６抗体と反応する pJRS４２を含むクロンによるバ
ンドはすべて連鎖球菌製品からのものに比して大きい
（分子量５５，０００、５７，０００、５９，０００ダ
ルトン）。このことは、pJRS４２はＭ６蛋白質の全構造
遺伝子を含んでいることを示唆していた。このことは、
この分子の大きさが１２型連鎖球菌のプロトプラスト及
びＬ型から分泌されるＭ蛋白質の大きさとして報告され
ているもの（分子量５８，０００ダルトン）とよく一致
しているという事実によってうらづけられた。従って、
大腸菌製品中の蛋白質は、連鎖球菌の細胞溶解素抽出に
より放出されるものより完全な自然のＭ分子の大きさに
より近いものであろう。
蛋白質から単一のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）
−アミノ酸が各分解段階で得られ、最終製品の均質性が
証明された。さらに、アミノ末端の配列は、アミノ末端
の残基を除く最初の配列された３５箇の残基によって L
ys Ｍ６のアミノ末端配列と同一であることがわかっ
た。大腸菌の分子はリジン分子の精製の間に脱離されう
るアミノ末端に余分にアルギニン残基を有している。精
製された Lys Ｍ６製品はさきにＭ６分子でみられた多
重バンドの模様を有しているが、それはおそらく抽出と
精製との過程での分解によるものであろう。３つの大き
いバンドは５１，０００、５２，０００及び５３，００
０ダルトンのはっきりした分子量に相当する。Ｍ６製品
の大きさの異質さは、おそらく蛋白質のカルボキシ末端
部分の相違からくるものであろう。この理由は、配列の
分解による本製品のアミノ末端配列分析の間に各段階ご
とに一つのアミノ酸残基のみが放出されることによる。
抗Ｍ６抗体と反応する pJRS４２を含むクロンによるバ
ンドはすべて連鎖球菌製品からのものに比して大きい
（分子量５５，０００、５７，０００、５９，０００ダ
ルトン）。このことは、pJRS４２はＭ６蛋白質の全構造
遺伝子を含んでいることを示唆していた。このことは、
この分子の大きさが１２型連鎖球菌のプロトプラスト及
びＬ型から分泌されるＭ蛋白質の大きさとして報告され
ているもの（分子量５８，０００ダルトン）とよく一致
しているという事実によってうらづけられた。従って、
大腸菌製品中の蛋白質は、連鎖球菌の細胞溶解素抽出に
より放出されるものより完全な自然のＭ分子の大きさに
より近いものであろう。
【００４９】さらに、分泌性の連鎖球菌Ｌ型及びプロト
プラストから分離されたＭ蛋白質はもっと均質性がある
と思われる。抗Ｍ６抗体と反応性を有する大腸菌蛋白質
と精製された標準Ｍ蛋白質のバンドとの泳動性における
差異については、いくつかの説明がありうる。たとえ
ば：１）蛋白質は、大腸菌では除去されていないリーダ
ー・配列を含みうるが、連鎖球菌では通常除去されてい
る。２）その Lys Ｍ６分子は連鎖球菌細胞壁に付着す
る間に生成する分解産物に相当する。３）そのLys Ｍ６
分子は蛋白の精製過程で生成した部分分解物かも知れな
い。４）その大腸菌蛋白質はベクター中のプロモータか
ら生成した「融合」物質かも知れない。５）連鎖球菌で
は機能できない翻訳開始配列が大腸菌中では活性なのか
も知れない。及び／又は６）連鎖球菌中では通常機能的
な「停止」コドンが大腸菌の株中では supＥ変異により
おさえられているのかも知れない。
プラストから分離されたＭ蛋白質はもっと均質性がある
と思われる。抗Ｍ６抗体と反応性を有する大腸菌蛋白質
と精製された標準Ｍ蛋白質のバンドとの泳動性における
差異については、いくつかの説明がありうる。たとえ
ば：１）蛋白質は、大腸菌では除去されていないリーダ
ー・配列を含みうるが、連鎖球菌では通常除去されてい
る。２）その Lys Ｍ６分子は連鎖球菌細胞壁に付着す
る間に生成する分解産物に相当する。３）そのLys Ｍ６
分子は蛋白の精製過程で生成した部分分解物かも知れな
い。４）その大腸菌蛋白質はベクター中のプロモータか
ら生成した「融合」物質かも知れない。５）連鎖球菌で
は機能できない翻訳開始配列が大腸菌中では活性なのか
も知れない。及び／又は６）連鎖球菌中では通常機能的
な「停止」コドンが大腸菌の株中では supＥ変異により
おさえられているのかも知れない。
【００５０】５．５遺伝子産物の免疫原的特徴づけ 大腸菌のＭ蛋白質と連鎖球菌の細胞溶解素での抽出によ
るＭ蛋白質のオクテルロニー・イムノディフュージョン
（Ochterlony immnodiffusion)での比較を行った。ウェ
ル１（ well １）には連鎖球菌で合成された細胞溶解素
抽出Ｍ６に対して製造された吸収されていないウサギの
抗血清を入れた。ウェル２には精製された細胞溶解素抽
出Ｍ６蛋白質を入れた。ウェル３にはＤＥＡＥとＣＭセ
ルロース上のクロマトグラフィーで部分的に精製された
エスチェリチアコリー（E. coli)Ｃ６００ＮＲ（pJRS４
２）株から得られたＭ６蛋白質を入れた。反応はｐＨ
８．６で５０ｍＭバルビトール緩衝液中で調製した１％
寒天ゲル中で行われた。ゲルは乾燥し、クーマシー・ブ
ルー（Coomasie blue)で染色した。
るＭ蛋白質のオクテルロニー・イムノディフュージョン
（Ochterlony immnodiffusion)での比較を行った。ウェ
ル１（ well １）には連鎖球菌で合成された細胞溶解素
抽出Ｍ６に対して製造された吸収されていないウサギの
抗血清を入れた。ウェル２には精製された細胞溶解素抽
出Ｍ６蛋白質を入れた。ウェル３にはＤＥＡＥとＣＭセ
ルロース上のクロマトグラフィーで部分的に精製された
エスチェリチアコリー（E. coli)Ｃ６００ＮＲ（pJRS４
２）株から得られたＭ６蛋白質を入れた。反応はｐＨ
８．６で５０ｍＭバルビトール緩衝液中で調製した１％
寒天ゲル中で行われた。ゲルは乾燥し、クーマシー・ブ
ルー（Coomasie blue)で染色した。
【００５１】この二重拡散実験の結果は（ゲルは示され
ていない）、pJRS４２を有する大腸菌の抽出物（挿入な
しのプラスミドのそれではない）は、少なくとも連鎖球
菌Ｍ６蛋白質のそれらのあるものには共通な抗原決定部
位を含んでいるという結論を裏付けた。そこで、大腸菌
製品はより高い明瞭な分子置を有しているけれども、大
腸菌中で合成されたＭ６蛋白質は６型連鎖球菌から抽出
されたＭ蛋白質と同じ型特異性決定部位を有している。
ていない）、pJRS４２を有する大腸菌の抽出物（挿入な
しのプラスミドのそれではない）は、少なくとも連鎖球
菌Ｍ６蛋白質のそれらのあるものには共通な抗原決定部
位を含んでいるという結論を裏付けた。そこで、大腸菌
製品はより高い明瞭な分子置を有しているけれども、大
腸菌中で合成されたＭ６蛋白質は６型連鎖球菌から抽出
されたＭ蛋白質と同じ型特異性決定部位を有している。
【００５２】５．６クロン化Ｍ蛋白質の減菌効果 大腸菌の生産したＭ蛋白質がウサギ及びヒトのオプソニ
ン抗血清の両者からのオプソニン抗体を除去するに要す
る抗原決定部位を含むかどうかを決定するため、次の吸
収実験を行った。
ン抗血清の両者からのオプソニン抗体を除去するに要す
る抗原決定部位を含むかどうかを決定するため、次の吸
収実験を行った。
【００５３】精製した大腸菌で合成したＭ６蛋白質が３
０μｇづつ２つに分けて凍結乾燥された。一方にウサギ
の６型オプソニン抗血清（０．５ｍｌ）を加え、同様の
量の６型連鎖球菌に対するヒト血清オプソニンを他の乾
燥蛋白質標本に加えて溶液をつくった。これらの試験管
を３７℃で１時間培養し、４℃で一夜放置した。かくし
て得られた沈澱を２０，０００ｘｇで遠心分離し、得ら
れた上澄液を６型連鎖球菌を用いる滅菌検定に使用し
た。
０μｇづつ２つに分けて凍結乾燥された。一方にウサギ
の６型オプソニン抗血清（０．５ｍｌ）を加え、同様の
量の６型連鎖球菌に対するヒト血清オプソニンを他の乾
燥蛋白質標本に加えて溶液をつくった。これらの試験管
を３７℃で１時間培養し、４℃で一夜放置した。かくし
て得られた沈澱を２０，０００ｘｇで遠心分離し、得ら
れた上澄液を６型連鎖球菌を用いる滅菌検定に使用し
た。
【００５４】間接的滅菌検定は当初ランスフィールドに
よって記載されたように（ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・メジシン１１０：２７１（１９５９））し
て行った。正常な提供者（normal donors)から得たペパ
リン処理された全人血を食細胞原として用いた。６型連
鎖球菌の希釈物（１００μｌ）を、吸収され又は吸収さ
れていない血清（１００μｌ）の存在又は不存在下に、
人血４００μｌに混合した。混合物を３７℃で３時間回
転させた。生存している生物を埋没平板法で決定した。
抗血清なしで回転させた対照について提供者の血液中で
連鎖球菌が生育する能力のテストを行なった。大腸菌ト
ランスダクタントが生成したＭ蛋白質は、ウサギ及びヒ
トの血清からオプソニン抗体を除去した。第１表参照。
従って、大腸菌Ｍ蛋白質の抗食菌作用性決定部位は自然
のＭ６分子のそれと同様に機能する。
よって記載されたように（ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・メジシン１１０：２７１（１９５９））し
て行った。正常な提供者（normal donors)から得たペパ
リン処理された全人血を食細胞原として用いた。６型連
鎖球菌の希釈物（１００μｌ）を、吸収され又は吸収さ
れていない血清（１００μｌ）の存在又は不存在下に、
人血４００μｌに混合した。混合物を３７℃で３時間回
転させた。生存している生物を埋没平板法で決定した。
抗血清なしで回転させた対照について提供者の血液中で
連鎖球菌が生育する能力のテストを行なった。大腸菌ト
ランスダクタントが生成したＭ蛋白質は、ウサギ及びヒ
トの血清からオプソニン抗体を除去した。第１表参照。
従って、大腸菌Ｍ蛋白質の抗食菌作用性決定部位は自然
のＭ６分子のそれと同様に機能する。
【００５５】
【表１】
【００５６】５．７６型食菌性抗体の生産 精製された大腸菌が生産したＭ６蛋白質による免疫後の
ウサギ中での６型オプソニン抗体の生産は次のようにし
て行われた。精製された大腸菌が生産したＭ６蛋白質に
対する抗血清がニュージーランドシロウサギ中で作られ
た。。一次接種は完全フロインド担体で乳化した１００
μｇのＭ６蛋白質から成り、複数部位に皮下投与され
た。動物は４週間後に不完全フロインド担体中の同用量
のＭ６蛋白質で増強された。動物は１０日後採血され
た。
ウサギ中での６型オプソニン抗体の生産は次のようにし
て行われた。精製された大腸菌が生産したＭ６蛋白質に
対する抗血清がニュージーランドシロウサギ中で作られ
た。。一次接種は完全フロインド担体で乳化した１００
μｇのＭ６蛋白質から成り、複数部位に皮下投与され
た。動物は４週間後に不完全フロインド担体中の同用量
のＭ６蛋白質で増強された。動物は１０日後採血され
た。
【００５７】滅菌検定（上記）により認められたところ
によれば、大腸菌Ｍ６蛋白質で免疫されたウサギは６型
連鎖球菌の食菌作用性を認める抗体を産生した。第２表
参照。
によれば、大腸菌Ｍ６蛋白質で免疫されたウサギは６型
連鎖球菌の食菌作用性を認める抗体を産生した。第２表
参照。
【００５８】
【表２】
【００５９】５．８連鎖球菌に対する診断試験 ５．８．１Ｍ遺伝子ＤＮＡプローブの製造と精製 Ｍ６型蛋白質をコードする遺伝子（emm ６）をつきとめ
るため、上記第５．３節中に記載されたプラスミド pJR
S ４２．１３を種々の制限酵素又はその複合体による消
化に付した。かくして得られたＤＮＡ断片は上記マニア
チスらの文献１５０−１６１頁に記載されているところ
により０．８％アガロース・ゲルを通して電気泳動に付
して分画され、ついで種々のベクター中に結合された。
熱誘導性（thermally inducible)ラムダ・ファージに対
し溶原性エスチェリチア・コリー（E. coli)Ｋ１２菌中
に、これらの組換えベクターが組み込まれ、第５．４節
に記載したように抗Ｍ６蛋白質抗血清と反応性を有する
蛋白質の生産についてスクリーニングされた。
るため、上記第５．３節中に記載されたプラスミド pJR
S ４２．１３を種々の制限酵素又はその複合体による消
化に付した。かくして得られたＤＮＡ断片は上記マニア
チスらの文献１５０−１６１頁に記載されているところ
により０．８％アガロース・ゲルを通して電気泳動に付
して分画され、ついで種々のベクター中に結合された。
熱誘導性（thermally inducible)ラムダ・ファージに対
し溶原性エスチェリチア・コリー（E. coli)Ｋ１２菌中
に、これらの組換えベクターが組み込まれ、第５．４節
に記載したように抗Ｍ６蛋白質抗血清と反応性を有する
蛋白質の生産についてスクリーニングされた。
【００６０】多数のこれらのクロン化されたＤＮＡ断片
についてのＭ６蛋白質発現分析結果を第３図に示す。白
色のブロックで示されているクロンは抗Ｍ６抗血清と反
応性があったが、斜線を施したブロックで示されたもの
は反応性がなかった。pJRS４２．１９のようないくつか
の反応性クロンは全Ｍ６蛋白質をコードする連鎖球菌Ｄ
ＮＡをごくわずかしか含んでいなかったが、その発現す
る物質はあきらかにポリクロナール抗血清と抗原性反応
性を示すに充分な大きさであった。
についてのＭ６蛋白質発現分析結果を第３図に示す。白
色のブロックで示されているクロンは抗Ｍ６抗血清と反
応性があったが、斜線を施したブロックで示されたもの
は反応性がなかった。pJRS４２．１９のようないくつか
の反応性クロンは全Ｍ６蛋白質をコードする連鎖球菌Ｄ
ＮＡをごくわずかしか含んでいなかったが、その発現す
る物質はあきらかにポリクロナール抗血清と抗原性反応
性を示すに充分な大きさであった。
【００６１】クロン化されたＤＮＡ断片中のemm ６遺伝
子の配置についてさらに検討するため、プラスミド pJR
S ４２．１９中の連鎖球菌ＤＮＡをプラスミド pUC９及
びpUC ８の Bam ＨＩ部分に挿入した［メッシング及び
ベイラ，ジーン１９：２６９−２７６（１９８２）］。
これらプラスミド相互間の関係は挿入されたＤＮＡがプ
ラスミド中で反対の方向に配列されている。抗Ｍ６抗血
清は、これらクロンの両方の製品と反応し、連鎖球菌Ｄ
ＮＡがこれらのベクターのいづれの配列中にも存在する
ときにＭ６蛋白質画分が合成されることを示している。
従って、挿入された連鎖球菌ＤＮＡはそれ自身のプロモ
ータを有しているものと思われる。もしこの結論が正し
ければ、pJRS４２．１９はＭ６蛋白質のＮ末端をコード
するもののはずである。
子の配置についてさらに検討するため、プラスミド pJR
S ４２．１９中の連鎖球菌ＤＮＡをプラスミド pUC９及
びpUC ８の Bam ＨＩ部分に挿入した［メッシング及び
ベイラ，ジーン１９：２６９−２７６（１９８２）］。
これらプラスミド相互間の関係は挿入されたＤＮＡがプ
ラスミド中で反対の方向に配列されている。抗Ｍ６抗血
清は、これらクロンの両方の製品と反応し、連鎖球菌Ｄ
ＮＡがこれらのベクターのいづれの配列中にも存在する
ときにＭ６蛋白質画分が合成されることを示している。
従って、挿入された連鎖球菌ＤＮＡはそれ自身のプロモ
ータを有しているものと思われる。もしこの結論が正し
ければ、pJRS４２．１９はＭ６蛋白質のＮ末端をコード
するもののはずである。
【００６２】pJRS４２．１９の連鎖球菌ＤＮＡ断片をＭ
１３ mp ８及び mp ９中に挿入［メシング及びベイラ
ル，上掲書］したのち、サンガーのジデオキシ法［サン
ガーら、プロシージングス・オブ・ナチュラル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３
（１９７７）］で挿入されたＤＮＡの配列が決定され
た。Ｍ６蛋白質のアミノ末端をコードする部分配列をそ
れにより特定されるアミノ酸配列とともに第４図に示
す。逐次的エドマン分解により決定された（参考文献）
アミノ末端アミノ酸は、アミノ酸配列の下に「Ｎ」で示
してある。この方法で決定されたアミノ酸配列はペプシ
ン処理により、又はファージ溶菌により連鎖球菌ストレ
インＤ４７１［参考］から抽出されたＭ６蛋白質のアミ
ノ末端について確立されている配列と同一であった。そ
れはまた、上記第５．４節中の大腸菌における組換えＤ
ＮＡ方法により生成されたＭ蛋白質のアミノ末端部分と
も同一であった。
１３ mp ８及び mp ９中に挿入［メシング及びベイラ
ル，上掲書］したのち、サンガーのジデオキシ法［サン
ガーら、プロシージングス・オブ・ナチュラル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３
（１９７７）］で挿入されたＤＮＡの配列が決定され
た。Ｍ６蛋白質のアミノ末端をコードする部分配列をそ
れにより特定されるアミノ酸配列とともに第４図に示
す。逐次的エドマン分解により決定された（参考文献）
アミノ末端アミノ酸は、アミノ酸配列の下に「Ｎ」で示
してある。この方法で決定されたアミノ酸配列はペプシ
ン処理により、又はファージ溶菌により連鎖球菌ストレ
インＤ４７１［参考］から抽出されたＭ６蛋白質のアミ
ノ末端について確立されている配列と同一であった。そ
れはまた、上記第５．４節中の大腸菌における組換えＤ
ＮＡ方法により生成されたＭ蛋白質のアミノ末端部分と
も同一であった。
【００６３】これらの結果は、emm ６遺伝子は pJRS ４
２．１９中に含まれるＤＮＡ中に始まることを示した。
第４図に示されるＤＮＡ配列とアミノ酸配列の比較は、
さらに、第３図に示すように、Ｍ６蛋白質のＮ末端は N
ci Ｉ部位の左へ３２塩基目の点であることを示してい
る。
２．１９中に含まれるＤＮＡ中に始まることを示した。
第４図に示されるＤＮＡ配列とアミノ酸配列の比較は、
さらに、第３図に示すように、Ｍ６蛋白質のＮ末端は N
ci Ｉ部位の左へ３２塩基目の点であることを示してい
る。
【００６４】大腸菌中で生成されたＭ６蛋白質は、ドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動［フィシエッチら、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メジシン１５９：１０８３−１０９５（１９８
４）］により明らかに５９，０００ダルトンの分子量を
有することが示された。この事実は遺伝子配列の他の末
端を第３図における Pvu II部位またはその付近に定め
ることとなる。さらに配列の分析をつづけたところ、蛋
白質を終了する無意味なコドンＴＡＡが PvuII部位の右
へ３８塩基目に位置していることが明らかとなった（ホ
リングシードら、原稿作成中）。
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド・ゲル電気泳
動［フィシエッチら、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メジシン１５９：１０８３−１０９５（１９８
４）］により明らかに５９，０００ダルトンの分子量を
有することが示された。この事実は遺伝子配列の他の末
端を第３図における Pvu II部位またはその付近に定め
ることとなる。さらに配列の分析をつづけたところ、蛋
白質を終了する無意味なコドンＴＡＡが PvuII部位の右
へ３８塩基目に位置していることが明らかとなった（ホ
リングシードら、原稿作成中）。
【００６５】プラスミド pJRS ４２．１３を Nci Ｉ及
び Pvu IIで処理して emm６遺伝子の大部分を含む適当
なプローブを作成した。pJRS４２．１３の制限酵素地図
中でのこのプローブの位置を第３図に太い矢印で示す。
このプローブ断片は、０．８％アガロース・ゲル中での
電気泳動法、電気的溶出及びエルチップ−ｄ（Elutip-
d ）のカラム（シュライヘル及びシュエル）を通過させ
ることにより精製された。
び Pvu IIで処理して emm６遺伝子の大部分を含む適当
なプローブを作成した。pJRS４２．１３の制限酵素地図
中でのこのプローブの位置を第３図に太い矢印で示す。
このプローブ断片は、０．８％アガロース・ゲル中での
電気泳動法、電気的溶出及びエルチップ−ｄ（Elutip-
d ）のカラム（シュライヘル及びシュエル）を通過させ
ることにより精製された。
【００６６】５．８．２細菌のＤＮＡの単離 Ａ群連鎖球菌の細胞をフィシエッチらの方法［ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン１３３：１１
０５（１９７１）］で溶菌するのにはファージ細菌溶解
素を用いた。他の連鎖球菌については、一夜のトッド・
ヘウイット・酵母肉汁培養物（酵母抽出物を添加した牛
心臓浸出肉汁）を１０倍に希釈し、３７℃で細胞濃度を
１ｍｌあたり約５×１０6 細胞となるまで生育させた。
３％（ｗ／ｖ）の濃度までグリセリンを添加し、細胞を
さらに２時間３７℃で培養した。ついで細胞を洗浄し、
１５秒のパルスで２度音波処理し、庶糖３０％（ｗ／
ｖ）とリゾチーム１０ｍｇ／ｍｌを含む１０ｍＭトリス
・塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中に分散させた。
ル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン１３３：１１
０５（１９７１）］で溶菌するのにはファージ細菌溶解
素を用いた。他の連鎖球菌については、一夜のトッド・
ヘウイット・酵母肉汁培養物（酵母抽出物を添加した牛
心臓浸出肉汁）を１０倍に希釈し、３７℃で細胞濃度を
１ｍｌあたり約５×１０6 細胞となるまで生育させた。
３％（ｗ／ｖ）の濃度までグリセリンを添加し、細胞を
さらに２時間３７℃で培養した。ついで細胞を洗浄し、
１５秒のパルスで２度音波処理し、庶糖３０％（ｗ／
ｖ）とリゾチーム１０ｍｇ／ｍｌを含む１０ｍＭトリス
・塩酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中に分散させた。
【００６７】３７℃で３０分間培養したのち、最終濃度
１０ｍＭまでエチレンジアミンテトラ酢酸を加え、さら
に３７℃で３０分間培養を続けた。ついでプロテアーゼ
Ｋ［０．１ｍｇ／ｍｌ、源（source) ］及びドデシル硫
酸ナトリウム（１％ｗ／ｖ）を加え、これらの成分をゆ
っくりと回転させて混合し、さらに３７℃で３０分間培
養を続けた。この工程につづいて、混濁を示さない細胞
懸濁液を界面に蛋白質がみえなくなるまでフェノール：
クロロフォルム（１０：１）で抽出した。抽出されたＤ
ＮＡは、ついでエタノールで沈澱させた。
１０ｍＭまでエチレンジアミンテトラ酢酸を加え、さら
に３７℃で３０分間培養を続けた。ついでプロテアーゼ
Ｋ［０．１ｍｇ／ｍｌ、源（source) ］及びドデシル硫
酸ナトリウム（１％ｗ／ｖ）を加え、これらの成分をゆ
っくりと回転させて混合し、さらに３７℃で３０分間培
養を続けた。この工程につづいて、混濁を示さない細胞
懸濁液を界面に蛋白質がみえなくなるまでフェノール：
クロロフォルム（１０：１）で抽出した。抽出されたＤ
ＮＡは、ついでエタノールで沈澱させた。
【００６８】試験した細菌株は、ストレプトコッカス・
アウレウス（Staphylococcus aureus)，バチルス・スブ
チリス（ B. subtilis )（ＣＵ１０６５株）、ストレプ
トコッカス・プノイモニエ（Streptococcus pneumonia
e) 及びロックフェラー大学のコレクションから得られ
た次の連鎖球菌株であって、それぞれ特異的抗血清をつ
くるに用いられる標準タイピング及びグルーピング株で
ある。Ｍ１，Ｔ１／１９５／２；Ｍ３，Ｂ９３０／６１
／５；Ｍ３Ｒ，Ｄ５８Ｘ；Ｍ４，Ｔ４／９５／ＲＢ５；
Ｍ５，Ｔ５Ｂ／１２６／４；Ｍ６，Ｓ４３／１９２／
３；Ｍ８，Ｃ２５６／８６／３；Ｍ１１，Ｔ１１／１３
７／３；Ｍ１２，Ｔ１２／１２６／４（ＣＯＬ６）；Ｍ
１４，Ｔ１４／４６／８，Ｍ１５，Ｔ１５／２３／７，
Ｍ１８，Ｊ１７Ｃ／５５／４；Ｍ２２，Ｔ２２／１４６
／１；Ｍ２３，Ｔ２３／１０２／ＲＢ５；Ｍ２４，Ｃ９
８／１３５／２；Ｍ２５，Ｂ３４６／１３６／１；Ｍ２
７，Ｔ２７／８７／１；Ｍ２８，Ｔ２８／１５０Ａ／
５；Ｍ２９，Ｄ２３；Ｍ３０，Ｄ２４／１２６／３；Ｍ
３１，Ｊ１３７／６９／３；Ｍ３２，Ｃ１２１／３９／
８；Ｍ３３，Ｃ１０７／１０２／２；Ｍ３６，Ｃ１１９
／８３／２；Ｍ３７，Ｃ２４２；Ｍ３８，Ｃ９４／８０
／２；Ｍ３９，Ｃ９５／９５／１；Ｍ４０，Ｃ１４３／
２５／９；Ｍ４１，Ｃ１０１／１０３／４；Ｍ４２，Ｃ
１１３／５５／５；Ｍ４３，Ｃ１２６／１７０／２；Ｍ
４６，Ｃ１０５／４１／５；Ｍ４７，Ｃ７４４／ＲＢ４
／６／５；Ｍ４８，Ｂ４０３／４８／５；Ｍ４９，Ｂ７
３７／１３７／２；Ｍ５０，Ｂ５１４／３３／６；Ｍ５
１，Ａ３０９／７７／１；Ｍ５２，Ａ８７１／１０６／
２；Ｍ５３，Ａ９５２／９４／３；Ｍ５４，Ａ９５３／
８７／３；Ｍ５５，Ａ９２８／７３／１；Ｍ５６，Ａ９
６３；Ｍ５７，Ａ９９５／９１／２；Ｍ５８，Ｄ３１５
／８７／３；Ｍ６０，Ｄ３３５／３８／３；Ｍ６３，Ｄ
４５９／５０／２；Ｍ６６，Ｄ７９４／７６／２；Ｍ６
７，Ｄ７９５／９５／１；Ａ群，Ｊ１７Ａ４；Ｂ群，０
９０Ｒ；Ｃ群，Ｃ７４；Ｄ群，Ｄ７６；Ｅ群，Ｋ１３
１；Ｆ群，Ｆ６８Ｃ；Ｇ群，Ｄ１６６Ｂ；Ｈ群，Ｆ９０
Ａ；Ｌ群，Ｄ１６７Ａ；Ｍ群，Ｄ１６８Ａ″Ｘ″；Ｎ
群，Ｃ５５９；Ｏ群，Ｂ３６１。次のＡ群でＭ型にタイ
ピングされるジョージア州アトランタのセンター・フォ
ー・デイジーズ・コントロールから入手された株も使用
された。Ｍ２，ＳＳ６３３；Ｍ９，ＳＳ７５４；Ｍ１
３，ＳＳ９３６；Ｍ１７，ＳＳ６３１；Ｍ１９，ＳＳ４
００；Ｍ３４，ＳＳ１３４；Ｍ５９，ＳＳ９１３及びＭ
６２，ＳＳ９８４。
アウレウス（Staphylococcus aureus)，バチルス・スブ
チリス（ B. subtilis )（ＣＵ１０６５株）、ストレプ
トコッカス・プノイモニエ（Streptococcus pneumonia
e) 及びロックフェラー大学のコレクションから得られ
た次の連鎖球菌株であって、それぞれ特異的抗血清をつ
くるに用いられる標準タイピング及びグルーピング株で
ある。Ｍ１，Ｔ１／１９５／２；Ｍ３，Ｂ９３０／６１
／５；Ｍ３Ｒ，Ｄ５８Ｘ；Ｍ４，Ｔ４／９５／ＲＢ５；
Ｍ５，Ｔ５Ｂ／１２６／４；Ｍ６，Ｓ４３／１９２／
３；Ｍ８，Ｃ２５６／８６／３；Ｍ１１，Ｔ１１／１３
７／３；Ｍ１２，Ｔ１２／１２６／４（ＣＯＬ６）；Ｍ
１４，Ｔ１４／４６／８，Ｍ１５，Ｔ１５／２３／７，
Ｍ１８，Ｊ１７Ｃ／５５／４；Ｍ２２，Ｔ２２／１４６
／１；Ｍ２３，Ｔ２３／１０２／ＲＢ５；Ｍ２４，Ｃ９
８／１３５／２；Ｍ２５，Ｂ３４６／１３６／１；Ｍ２
７，Ｔ２７／８７／１；Ｍ２８，Ｔ２８／１５０Ａ／
５；Ｍ２９，Ｄ２３；Ｍ３０，Ｄ２４／１２６／３；Ｍ
３１，Ｊ１３７／６９／３；Ｍ３２，Ｃ１２１／３９／
８；Ｍ３３，Ｃ１０７／１０２／２；Ｍ３６，Ｃ１１９
／８３／２；Ｍ３７，Ｃ２４２；Ｍ３８，Ｃ９４／８０
／２；Ｍ３９，Ｃ９５／９５／１；Ｍ４０，Ｃ１４３／
２５／９；Ｍ４１，Ｃ１０１／１０３／４；Ｍ４２，Ｃ
１１３／５５／５；Ｍ４３，Ｃ１２６／１７０／２；Ｍ
４６，Ｃ１０５／４１／５；Ｍ４７，Ｃ７４４／ＲＢ４
／６／５；Ｍ４８，Ｂ４０３／４８／５；Ｍ４９，Ｂ７
３７／１３７／２；Ｍ５０，Ｂ５１４／３３／６；Ｍ５
１，Ａ３０９／７７／１；Ｍ５２，Ａ８７１／１０６／
２；Ｍ５３，Ａ９５２／９４／３；Ｍ５４，Ａ９５３／
８７／３；Ｍ５５，Ａ９２８／７３／１；Ｍ５６，Ａ９
６３；Ｍ５７，Ａ９９５／９１／２；Ｍ５８，Ｄ３１５
／８７／３；Ｍ６０，Ｄ３３５／３８／３；Ｍ６３，Ｄ
４５９／５０／２；Ｍ６６，Ｄ７９４／７６／２；Ｍ６
７，Ｄ７９５／９５／１；Ａ群，Ｊ１７Ａ４；Ｂ群，０
９０Ｒ；Ｃ群，Ｃ７４；Ｄ群，Ｄ７６；Ｅ群，Ｋ１３
１；Ｆ群，Ｆ６８Ｃ；Ｇ群，Ｄ１６６Ｂ；Ｈ群，Ｆ９０
Ａ；Ｌ群，Ｄ１６７Ａ；Ｍ群，Ｄ１６８Ａ″Ｘ″；Ｎ
群，Ｃ５５９；Ｏ群，Ｂ３６１。次のＡ群でＭ型にタイ
ピングされるジョージア州アトランタのセンター・フォ
ー・デイジーズ・コントロールから入手された株も使用
された。Ｍ２，ＳＳ６３３；Ｍ９，ＳＳ７５４；Ｍ１
３，ＳＳ９３６；Ｍ１７，ＳＳ６３１；Ｍ１９，ＳＳ４
００；Ｍ３４，ＳＳ１３４；Ｍ５９，ＳＳ９１３及びＭ
６２，ＳＳ９８４。
【００６９】５．８．３ドット・ブロット（ Dot blot
) 交雑実験 カファトスら［ヌクレイック・アシッド・リサーチ７；
１５４１−１５５２（１９７９）］が記載した特異的Ｄ
ＮＡ配列をみつける手段を用いて、抽出されたＤＮＡの
標本についてドット・ハイブリダイゼーションが行われ
た。ボッチャンらの方法［セル９：２６９−２８７（１
９７６）］でニック翻訳により32Ｐで標識したのち、プ
ローブに対して emm６遺伝子の大部分を含む Nci Ｉ／
Pvu IIＤＮＡ画分（第５．８．１節）が用いられた。
) 交雑実験 カファトスら［ヌクレイック・アシッド・リサーチ７；
１５４１−１５５２（１９７９）］が記載した特異的Ｄ
ＮＡ配列をみつける手段を用いて、抽出されたＤＮＡの
標本についてドット・ハイブリダイゼーションが行われ
た。ボッチャンらの方法［セル９：２６９−２８７（１
９７６）］でニック翻訳により32Ｐで標識したのち、プ
ローブに対して emm６遺伝子の大部分を含む Nci Ｉ／
Pvu IIＤＮＡ画分（第５．８．１節）が用いられた。
【００７０】交雑を行うにあたって、種々の微生物原か
ら得られたＤＮＡ抽出物は室温で１５分間０．６ＮＮａ
ＯＨ中で変性され、ついで０℃で１０分間変性された。
さらに、試料は２Ｍ酢酸アンモニウムで中和され、ＤＮ
Ａの画分はペセスダ・リサーチ・ラボラトリーの多枝管
中のバイオダインＡ０．２ミクロン・ナイロン・フィル
ター（ニューヨーク州グレン・コープ，ポール・フィル
トレーション・コーポレーション）上にスポットされ
た。交雑は１．８Ｍトリス塩酸塩を含み、０．２Ｍのト
リス塩基を含む緩衝液中でニック翻訳された32Ｐプロー
ブを少なくとも２×１０6 cpm ／フィルターの割合で加
え、フィルターを一夜６４℃に保持することにより行わ
れた。フィルターは、ついで同じ緩衝液を用いて６４℃
で１０回洗浄され、乾燥され、増感スクリーンを用いコ
ダックＸＡＲ−５フィルム上でオートラジオグラフィー
に付された。露光は−８０℃で２−４日行われた。これ
らの実験結果の要約を第３表に示す。
ら得られたＤＮＡ抽出物は室温で１５分間０．６ＮＮａ
ＯＨ中で変性され、ついで０℃で１０分間変性された。
さらに、試料は２Ｍ酢酸アンモニウムで中和され、ＤＮ
Ａの画分はペセスダ・リサーチ・ラボラトリーの多枝管
中のバイオダインＡ０．２ミクロン・ナイロン・フィル
ター（ニューヨーク州グレン・コープ，ポール・フィル
トレーション・コーポレーション）上にスポットされ
た。交雑は１．８Ｍトリス塩酸塩を含み、０．２Ｍのト
リス塩基を含む緩衝液中でニック翻訳された32Ｐプロー
ブを少なくとも２×１０6 cpm ／フィルターの割合で加
え、フィルターを一夜６４℃に保持することにより行わ
れた。フィルターは、ついで同じ緩衝液を用いて６４℃
で１０回洗浄され、乾燥され、増感スクリーンを用いコ
ダックＸＡＲ−５フィルム上でオートラジオグラフィー
に付された。露光は−８０℃で２−４日行われた。これ
らの実験結果の要約を第３表に示す。
【００７１】
【表３】
【００７２】全体としてドット・ブロット実験は、emm
６プローブとＡ群連鎖球菌の５６種中の５６の異なるＭ
型から得られるＤＮＡ、及びＡ群株のタイプ分けできな
い４種及びすでにＭ- と特徴づけられている２つの株と
の間に交雑が認められた。グラム陽性菌であるスタフィ
ロコッカス・オウレウス（Staphylococcus aureus)又は
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis)からのＤＮ
Ａ、連鎖球菌ランスフィールドＢ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，
Ｌ，Ｍ，Ｎ又はＯ群からのＤＮＡ、又はストレプトコッ
カス・プノイモニエ（Streptococcus pneumoniae) から
のＤＮＡとは交雑は見られなかった。しかし、Ｃ群及び
Ｇ群連鎖球菌ＤＮＡとは交雑がみられた。この知見は、
Ｃ群連鎖球菌はしばしばヒトの感染に関係し、ある株は
その外面に機能的にＭ蛋白質と同様な分子を有している
らしいので予期し得ない知見ではなかった［ウールコッ
ク，インフェクション・アンド・インムノロジー１０：
５６８（１９７４）］。
６プローブとＡ群連鎖球菌の５６種中の５６の異なるＭ
型から得られるＤＮＡ、及びＡ群株のタイプ分けできな
い４種及びすでにＭ- と特徴づけられている２つの株と
の間に交雑が認められた。グラム陽性菌であるスタフィ
ロコッカス・オウレウス（Staphylococcus aureus)又は
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis)からのＤＮ
Ａ、連鎖球菌ランスフィールドＢ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，
Ｌ，Ｍ，Ｎ又はＯ群からのＤＮＡ、又はストレプトコッ
カス・プノイモニエ（Streptococcus pneumoniae) から
のＤＮＡとは交雑は見られなかった。しかし、Ｃ群及び
Ｇ群連鎖球菌ＤＮＡとは交雑がみられた。この知見は、
Ｃ群連鎖球菌はしばしばヒトの感染に関係し、ある株は
その外面に機能的にＭ蛋白質と同様な分子を有している
らしいので予期し得ない知見ではなかった［ウールコッ
ク，インフェクション・アンド・インムノロジー１０：
５６８（１９７４）］。
【００７３】Ｇ群連鎖球菌もまた広範囲のヒトへの感染
を起すことが報告されている。これらの生物の毒性が必
ずＭ様細胞表面蛋白質の存在によるかどうかははっきり
しないが、そういうこともありうるところである。ヒト
感染物から分離したＧ群連鎖球菌の３株を試験したとこ
ろ、１２型Ｍ細胞蛋白質が株中に存在することがわかっ
た［マクステッド及びポター，ジャーナル・オブ・ゼネ
ラル・マイクロバイオロジー４９：１１９（１９６
７）］。
を起すことが報告されている。これらの生物の毒性が必
ずＭ様細胞表面蛋白質の存在によるかどうかははっきり
しないが、そういうこともありうるところである。ヒト
感染物から分離したＧ群連鎖球菌の３株を試験したとこ
ろ、１２型Ｍ細胞蛋白質が株中に存在することがわかっ
た［マクステッド及びポター，ジャーナル・オブ・ゼネ
ラル・マイクロバイオロジー４９：１１９（１９６
７）］。
【００７４】試験されたＡ群株の中に、機能的にＭ-
（すなわち、保護的Ｍ蛋白質を生成せず食菌性化された
もの）が３株あった。これらのＭ- 株の２種からのＤＮ
Ａは、それにも拘わらず emm６遺伝子プローブと交雑
し、少なくともいくらかの emm遺伝子を完全に保持して
いることを示した。おそらく、これらの株は、その emm
遺伝子産物が無機能的（ nonfunctional )であるかわず
かな量しか合成しないような変異株であろう。１つのＭ
- 株からのＤＮＡはプローブと交雑せず、その株中では
emm遺伝子は実質的に除去されていることを示唆してい
た。
（すなわち、保護的Ｍ蛋白質を生成せず食菌性化された
もの）が３株あった。これらのＭ- 株の２種からのＤＮ
Ａは、それにも拘わらず emm６遺伝子プローブと交雑
し、少なくともいくらかの emm遺伝子を完全に保持して
いることを示した。おそらく、これらの株は、その emm
遺伝子産物が無機能的（ nonfunctional )であるかわず
かな量しか合成しないような変異株であろう。１つのＭ
- 株からのＤＮＡはプローブと交雑せず、その株中では
emm遺伝子は実質的に除去されていることを示唆してい
た。
【００７５】ドット・ブロット実験の結果は、種々のＭ
型Ａ群連鎖球菌株から得られるＤＮＡを抽出し、Nci Ｉ
及び Hin d IIIで消化する実験により確かめられた。得
られるＤＮＡ断片の試料は、アミアティスら、上掲書、
１５０−１６１に記載のアガロース・ゲル・電気泳動で
分離され、emm ６の32Ｐで標識されたプローブと交雑さ
れ、雑種ＤＮＡ断片の位置がオートラジオグラフィーで
示された。結果は第５図に示す。
型Ａ群連鎖球菌株から得られるＤＮＡを抽出し、Nci Ｉ
及び Hin d IIIで消化する実験により確かめられた。得
られるＤＮＡ断片の試料は、アミアティスら、上掲書、
１５０−１６１に記載のアガロース・ゲル・電気泳動で
分離され、emm ６の32Ｐで標識されたプローブと交雑さ
れ、雑種ＤＮＡ断片の位置がオートラジオグラフィーで
示された。結果は第５図に示す。
【００７６】第５図において、第１列は32Ｐで標識され
た１０．９，７．７４，５．１５，２．４４，１．８０
及び０．６０ｋｂのＤＮＡ分子サイズのマーカーを示
す。第２列ないし第１０列は連鎖球菌Ｍの型６，４７，
５，１９，２６，１１，２４，１２及び２３のそれぞれ
から得られたＤＮＡのプローブ交雑 Nci Ｉ／ HindIII
画分を含んでいる。各々の場合プローブで交雑された２
種または以上のＤＮＡフラグメントが含まれていた。ド
ット・ブロット試験から予期されたように、Ｔ２８／５
１／４のＭ- 株からのＤＮＡは交雑しなかった（第１１
列）が、Ｔ２８／１５０Ａ／５のＭ+ 株（第１２列）は
交雑した。
た１０．９，７．７４，５．１５，２．４４，１．８０
及び０．６０ｋｂのＤＮＡ分子サイズのマーカーを示
す。第２列ないし第１０列は連鎖球菌Ｍの型６，４７，
５，１９，２６，１１，２４，１２及び２３のそれぞれ
から得られたＤＮＡのプローブ交雑 Nci Ｉ／ HindIII
画分を含んでいる。各々の場合プローブで交雑された２
種または以上のＤＮＡフラグメントが含まれていた。ド
ット・ブロット試験から予期されたように、Ｔ２８／５
１／４のＭ- 株からのＤＮＡは交雑しなかった（第１１
列）が、Ｔ２８／１５０Ａ／５のＭ+ 株（第１２列）は
交雑した。
【００７７】６．微生物の寄託 次表に示すプラスミドを有する次表の大腸菌は、イリノ
イ州ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ・カルチ
ュア・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託されており、次
の寄託番号を付与されている。
イ州ペオリアのアグリカルチュラル・リサーチ・カルチ
ュア・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託されており、次
の寄託番号を付与されている。
【００７８】 大腸菌株 プラスミド 寄託番号 Ｋ−１２，Ｃ６００ＮＲ ｐＪＲＳ４２．１３ ＮＲＲＬ Ｂ−１５５２９ ラムダ ｃＩ８５７ Ｋ−１２，Ｃ６００ＮＲ ｐＪＲＳ４２ ＮＲＲＬ Ｂ−１５５３５ ラムダ ｃＩ８５７
【００７９】寄託微生物は本発明の幾多の態様を代表す
ることを意図したものであるから、本発明は寄託された
微生物により範囲として限定さるべきものではない。事
実、ここに示され、記載されたところに加えて、この発
明の種々の修飾は、以上の記載と添付の図面から、当該
技術の専門家にとっては明らかとなるであろう。かかる
修飾は、上記特許請求の範囲のうちに入るべきことを意
図している。
ることを意図したものであるから、本発明は寄託された
微生物により範囲として限定さるべきものではない。事
実、ここに示され、記載されたところに加えて、この発
明の種々の修飾は、以上の記載と添付の図面から、当該
技術の専門家にとっては明らかとなるであろう。かかる
修飾は、上記特許請求の範囲のうちに入るべきことを意
図している。
【００８０】本明細書中でヌクレオタイドについての塩
基対の大きさは概略のものであって、記載の目的のため
に使用されたものである。
基対の大きさは概略のものであって、記載の目的のため
に使用されたものである。
【図１】図１（大きさは比例していない）は連鎖球菌Ｄ
ＮＡ断片と pJB８から導かれた組換えプラスミドである
pJRS ４２の構造を示している。（第５．２節参照）連
鎖球菌ＤＮＡ中の種々の制限部位は示されていない。
ＮＡ断片と pJB８から導かれた組換えプラスミドである
pJRS ４２の構造を示している。（第５．２節参照）連
鎖球菌ＤＮＡ中の種々の制限部位は示されていない。
【図２】図２は pJRS ４２．１３の制限地図を示す。本
プラスミドは pJRS ４２から不必要な連鎖球菌を除くた
め Eco RI で消化し再結合することにより誘導された。
プラスミド pJRS ４２．１３は Eco RI 部位を一箇所の
み有している。（第５．３節参照）
プラスミドは pJRS ４２から不必要な連鎖球菌を除くた
め Eco RI で消化し再結合することにより誘導された。
プラスミド pJRS ４２．１３は Eco RI 部位を一箇所の
み有している。（第５．３節参照）
【図３】図３は６型Ａ群連鎖球菌のＭ６蛋白質をコード
する遺伝子を含むプラスミドpJRS４２．１３の種々のサ
ブクロンの制限地図である。白色の四角形はＭ６蛋白質
を発現するクロンを示し、斜線を施した四角形は発現し
ないクロンを示している。ベクター pBR３２２は４２．
２１及び４２．１９を除くすべての場合に用いられた。
それらはそれぞれＭ１３において及び pUC８及び pUC９
においてである。制限地図の上方の矢印は６型Ｍ蛋白質
（ emm 6 )をコードする遺伝子の転写の方向及び遺伝子
の概略の範囲を示している。蛋白質のアミノ末端に相当
する分子の末端は″Ｎ″で示してある。
する遺伝子を含むプラスミドpJRS４２．１３の種々のサ
ブクロンの制限地図である。白色の四角形はＭ６蛋白質
を発現するクロンを示し、斜線を施した四角形は発現し
ないクロンを示している。ベクター pBR３２２は４２．
２１及び４２．１９を除くすべての場合に用いられた。
それらはそれぞれＭ１３において及び pUC８及び pUC９
においてである。制限地図の上方の矢印は６型Ｍ蛋白質
（ emm 6 )をコードする遺伝子の転写の方向及び遺伝子
の概略の範囲を示している。蛋白質のアミノ末端に相当
する分子の末端は″Ｎ″で示してある。
【図４】図４は、サンガーら［プロシージングス・オブ
・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンス、Ｕ．
Ｓ．Ａ．７４：５４６３（１９７７）］の方法によって
決定されるＭ６蛋白質のアミノ末端をコードする emm
６遺伝子のＤＮＡ配列の部分及びそのＤＮＡ配列から予
測される蛋白質のアミノ酸配列を示している。連続的エ
ドマン分解により決定されたアミノ末端アミノ酸はアミ
ノ酸配列の下の″Ｎ″で示されている。
・ナチュラル・アカデミー・オブ・サイエンス、Ｕ．
Ｓ．Ａ．７４：５４６３（１９７７）］の方法によって
決定されるＭ６蛋白質のアミノ末端をコードする emm
６遺伝子のＤＮＡ配列の部分及びそのＤＮＡ配列から予
測される蛋白質のアミノ酸配列を示している。連続的エ
ドマン分解により決定されたアミノ末端アミノ酸はアミ
ノ酸配列の下の″Ｎ″で示されている。
【図５】図５は図３のプラスミド pJRS ４２．１３の制
限酵素消化で得られる NciＩ／Pvu II emm６ＤＮＡプロ
ーブによるＤＮＡ交雑の寒天ゲル電気泳動分析を示して
いる。各レーン中のＤＮＡは次のとうりである：レーン
１，オリゴヌクレオチドの大きさの１０．９０，７．７
４，５．１５，２．４４，１．８０及び０．６０ｋｂの
標準，レーン２，Ｍ６株Ｄ４７１；レーン３，Ｍ４７；
レーン４，Ｍ５；レーン５，Ｍ１９；レーン６，Ｍ２
６，レーン７，Ｍ１１；レーン８，Ｍ２４；レーン９，
Ｍ１２；レーン１０，Ｍ２３，レーン１１，Ｍ２８（Ｍ
株Ｔ２８／５１／４から）；及びレーン１２，Ｍ２８
（Ｍ+ 株Ｔ２８／１５０Ａ／５から）。
限酵素消化で得られる NciＩ／Pvu II emm６ＤＮＡプロ
ーブによるＤＮＡ交雑の寒天ゲル電気泳動分析を示して
いる。各レーン中のＤＮＡは次のとうりである：レーン
１，オリゴヌクレオチドの大きさの１０．９０，７．７
４，５．１５，２．４４，１．８０及び０．６０ｋｂの
標準，レーン２，Ｍ６株Ｄ４７１；レーン３，Ｍ４７；
レーン４，Ｍ５；レーン５，Ｍ１９；レーン６，Ｍ２
６，レーン７，Ｍ１１；レーン８，Ｍ２４；レーン９，
Ｍ１２；レーン１０，Ｍ２３，レーン１１，Ｍ２８（Ｍ
株Ｔ２８／５１／４から）；及びレーン１２，Ｍ２８
（Ｍ+ 株Ｔ２８／１５０Ａ／５から）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｕ 7236−4Ｂ 15/62 Ｃ１２Ｑ 1/14 6807−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 9015−2Ｊ 33/577 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/62 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 ジューン アール． スコット アメリカ合衆国、30329 ジョージア、ア トランタ、リバリー リッジ ロード 1500 (72)発明者 ビンセント エイ．フィシェッティ アメリカ合衆国、11552 ニューヨーク、 ウエスト ヘンプステッド、ジョーン コ ート 448
Claims (16)
- 【請求項１】（ａ）連鎖球菌蛋白質の免疫反応性と抗原
的決定部位とを有するポリペプタイドをコードするＤＮ
Ａ配列を含み、単細胞生物中で複製、転写及び翻訳され
うる組換えプラスミドを含む単細胞生物を培養し、 （ｂ）かかるポリペプタイドを培養物から単離すること
を含む連鎖球菌Ｍ又はＭ様蛋白質の免疫反応性と抗原的
決定部位とを有するポリペプタイドの製造法。 - 【請求項２】 そのポリペプタイドが免疫原性である請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 そのポリペプタイドが抗原として用いら
れたとき、オプソニック抗体を誘出しうるポリペプタイ
ドである請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 組換えプラスミドが形質転換により単細
胞生物中に導入される請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 組換えプラスミドが形質導入により単細
胞生物に導入される請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 組換えプラスミドが形質転換により単細
胞生物に導入される請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 Ｍ蛋白質がＡ群連鎖球菌の１員から得ら
れるものである請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 Ｍ様蛋白質がＣ群連鎖球菌の１員から得
られるものである請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 Ｍ様蛋白質がＧ群連鎖球菌の１員から得
られるものである請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 単細胞生物が真核生物である請求項１
記載の方法。 - 【請求項１１】 単細胞生物が原核生物である請求項１
記載の方法。 - 【請求項１２】 原核生物が大腸菌である請求項１１記
載の方法。 - 【請求項１３】 連鎖球菌Ｍ蛋白質の免疫反応性と抗原
的決定部位とを有するポリペプタイドをコードするＤＮ
Ａ配列を含み、単細胞生物中で複製、転写及び翻訳され
うる組換えプラスミドを誘導することからなる：連鎖球
菌Ｍ蛋白質の免疫反応性と抗原的決定部位とを有するポ
リペプタイドをコードするＤＮＡ配列を有する単細胞の
製造法。 - 【請求項１４】 ストレプトコッカス・ピオゲネス（St
reptococcus pyogenes）の免疫反応性と抗原的活性部位
とを有するポリペプタイドをコードするストレプトコッ
カス・ピオゲネスＭ蛋白質又はそのいずれかの一部をコ
ードする精製されたＤＮＡ配列を含む組換えプラスミド
を含む単細胞生物により生成されるストレプトコッカス
・ピオゲネスＭ蛋白質の免疫反応性と抗原的決定部位と
を有するポリペプタイド。 - 【請求項１５】 単細胞生物が大腸菌である請求項１４
記載のポリペプタイド。 - 【請求項１６】 請求項１４記載のポリペプタイド及び
それに適合しうる薬学的アジュバントとを含有するワク
チン製剤。
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|---|---|---|---|
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| US621,716 | 1990-12-05 |
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|---|---|
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| JP2614176B2 JP2614176B2 (ja) | 1997-05-28 |
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|---|---|---|---|
| JP59503195A Expired - Lifetime JP2926180B2 (ja) | 1983-08-10 | 1984-08-09 | 連鎖球菌ｍ蛋白質遺伝子及びその分子状プローブ |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59503195A Expired - Lifetime JP2926180B2 (ja) | 1983-08-10 | 1984-08-09 | 連鎖球菌ｍ蛋白質遺伝子及びその分子状プローブ |
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| JP (2) | JP2926180B2 (ja) |
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| DK (1) | DK158585A (ja) |
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| DE3678702D1 (de) * | 1985-12-28 | 1991-05-16 | Ohgen Research Lab Ltd | Antitumorprotein-gen von streptococcus pyogenes su, plasmide, die das gen enthalten, transformantenzellen, die die plasmide beherbergen, und verfahren zur herstellung des antitumorproteins. |
| AU8108587A (en) * | 1986-10-08 | 1988-05-06 | David Bernstein | Method for exposing group a streptococcal antigens and an improved diagnostic test for the identification of group a streptococci |
| ATE78513T1 (de) * | 1987-05-13 | 1992-08-15 | Hightech Receptor Ab | Immunoglobulin-a-rezeptor-protein (arp), sowie dessen klonierung und expression. |
| US5162226A (en) * | 1987-08-24 | 1992-11-10 | University Of Tennessee Research Corp. (U.T.R.C.) | Therapeutic compositions against streptococcal infections, transformed hosts, methods of immunization and genetically engineered products |
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| ES2199932T3 (es) * | 1989-06-21 | 2004-03-01 | The Rockefeller University | Poxvirus recombinante y vacuna estreptococica que contiene proteina m. |
| US5616686A (en) * | 1990-05-11 | 1997-04-01 | The Rockefeller University | Polypeptide of a hybrid surface protein by bacteria |
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| NL9100510A (nl) * | 1991-03-21 | 1992-10-16 | Centraal Diergeneeskundig Inst | Dna-sequenties die coderen voor kenmerken van virulentie van streptococcus suis en delen daarvan, daarvan afgeleide polypeptiden en antilichamen, alsmede toepassing daarvan bij de diagnose van en de bescherming tegen infectie met s. suis bij zoogdieren, waaronder de mens. |
| US5232831A (en) * | 1991-06-28 | 1993-08-03 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes to streptococcus pyogenes |
| AU5128493A (en) * | 1992-09-16 | 1994-04-12 | University Of Tennessee Research Corporation, The | Recombinant multivalent m protein vaccine |
| EP0618813B1 (en) * | 1992-09-16 | 2002-01-09 | The University Of Tennessee Research Corporation | Antigen of hybrid m protein and carrier for group a streptococcal vaccine |
| AU4932493A (en) * | 1992-09-25 | 1994-04-26 | Dynagen, Inc. | An immunobooster for delayed release of immunogen |
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| BR9714641A (pt) | 1996-12-06 | 2002-01-22 | Univ Minnesota | Mutantes de toxina a de estreptococo e métodos de uso |
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1993
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-
1994
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| JOURNAL OF MEDICAL MICROBILOGY=1978 * |
Also Published As
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