JPH02104281A - α−アミド化酵素組成物およびそれらの製造方法ならびに利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は１９８４年９月２７日出願の米国特許筒６５５
．３６６号の一部継続出願であり、その全開示をここに
参考として引用するものとする。

（産業上の利用分野） 本井明はα−アミド化酵素、α−アミド化酵素の製造な
らびにグリシン−延長基質（ｇｌｙｃｉｎｅ−ｅｘｔｅ
ｎｄｅｄ　５ｕｂｓｔｒａｔｅｓ）に対する酵素の作用
によるα−アミド化生成物の製造におけるそれらの利用
に関する。成る好ましい実施態様において、本発明のα
−アミド化酵素は、カルシトニン、成長ホルモン放出因
子、カルシトニン遺伝子Ｉｌｌ連ペプチドおよびその他
のα−アミド化生成物を含む有用なα−アミド化ホルモ
ンおよび農業および医学用生成物の製造に際して利用す
ることができる。

（従来の技術） 核酸のコーディング・シーケンスからそれらの翻訳をも
たらす前駆体形状天然蛋白質の細胞間プロセシング（開
裂および／または官能基変性）は明白に実証されている
。

一般に吐乳動物細胞およびその他の真核生物は成る種の
翻訳後プロセシング手順を実行することができるのに対
し、原核生物はできない。成る種の原核生物、たとえば
エシェリヒア・コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）は組換えＤＮＡテクノロジーによる１４ｆｉ
　？Ｌ　ｉＩＩ物蛋物質白質製造用主として広く使用さ
れている。

これはそれらがバッチ発酵法において容易に成長させる
ことができ、またそれらが遺伝学的に良く特徴づけられ
ているからである。しかしながら、遺伝子工学テクノロ
ジーにより生成された多くの吐乳動物蛋白質は成るタイ
プの翻訳後プロセシングを必要とし、そしてこれは大規
模生産用途に関し費用の掛けられない生体外化学方法に
おいて錯体を使用することにより１４行われなければな
らない。

プロセシング活性の一タイプは、蛋白質のカルボキシル
末端アミノ酸の具体的なアミド化を包含している。数多
くの天然産のホルモンおよびペプチドはこの種の一時変
異であって、もしその蛋白質が生物学的に活性である場
合にはＭ々本質的であるところのものを含んでいる。カ
ルシトニンが一例であって、非アミド化プロリン残基の
未変性状アミド化プロリンによる置換は生物学的活性に
おいて３，０００倍の減退をもたらすものである。

このＣ−末端（α）アミド化を行う薬剤はアミドイヒす
ベーきアミノ酸（Ｒ−Ｘ−ｇｌｙ、式中Ｒｉ、を蛋白質
の本体、Ｘはアミド化される残基、そして（ｃａｌｙ」
はグリシン残基である。）を直ちにもたらすグリシン残
基をＩｎする。グリシンは切断され、そしてアミン部分
を最後から二番目のアミノ酸に事実上供与し、それによ
りそのアミド化を行う。

α−アミド化酵素の大凡の分子世を最初に報告した筆者
はブラッドバリイ・エイ・エフ、他（Ｂｒａｄｂｕｒｙ
　Ａ、Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、）、［ネイチュア（Ｎａｔ
ｕｒｅ）　ＪＶｏｌ、２９Ｂ　、１９８２年、第６８６
−８８頁テアッた。「セフＦデツクス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）　Ｇ−１００Ｊを使用して、彼等は最小見掛は分子
質量が約６０．０００ダルトンであることを示唆した。

引き続く研究はこの種の酵素の分子質量が（ゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより測定されたとき）６０、０００
乃至７０．０００ダルトンであることを示唆していた。

これらにはツーサイン会アイ（Ｈｕｓａｉｎ　ｉ）おヨ
Ｔｊテート−ニス−ニス（Ｔａｔｅ　Ｓ、Ｓ、）、ＦＥ
ＢＳレターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）、Ｖｏｌ、１５２１２
．１９８３年、第２７７−２８１頁；エイツバ−他（Ｅ
ｉｐｐｅｒ、　ａｔ　ａｌ、）　、ＰＨＡｓ　Ｖｏｌ、
８０．１９８３年、第５，１４４−　５，１４８頁；ゴ
メス他（Ｇｏｍｅｚ　ｅｔ　ａｌ、）　、ＦＥＢＳレタ
ーズ、ＶＯｌ、１６７書１．１９８４年、第１６０−　
１６４頁；およびカイザー・ジエー・ニス他（に１ｚｅ
ｒ、　Ｊ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）　、ＰＮＡＳ　Ｖｏｌ
、ｌＮ　、１９８４年、第３，２２８−３，２３２頁が
ある。

エイツバ−他ノＰＮＡＳ　Ｖｏｌ、８０．１９８３年、
第５．１４４−５，１４８頁は、分子酸素の伯に最大酵
素アミド化活性のために２個の補因子を要すること、そ
してこれらはアスコルビン酸および銅（ＩＩ）イオンで
あることを報告している。

ペプチドのカルボキシル−末端のアミド化をもたらす化
学反応はアミン基源を必要とする。ブラッドバリイ・エ
イ・エフ他の「ネイチュアＪ　Ｖｏｌ。

２９８．１９ｇ２年、第６８６−６８８頁は、グリシン
が切断され、そしてアミン部分を最後から２番目のアミ
ノ酸に対し供与する結果、後者のアミド化のもたらされ
ることを示している。アミノ基供与体としてのグリシン
に関する要件は他の著者により立証されている。

ランデイモア・エイ・イー・エフ他（Ｌａｎｄｙｍｏｒ
ｅ。

＾、Ｅ、Ｎ、、　　ｅｔ　ａｌ、）　、ＢＢＲＣＶｏｌ
、１１７．１１．１９８３年、第２８９−２９３頁は、
アミド化反応に際してＤ−アラニンもまた、アミン供与
体として機能し得ることを示した。カイザー他による引
き続く仕事、ＰＨＡｓ　Ｖｏｌ、８１．１９８４年、第
３，２２８−第３，２３２頁はラットの脳における２個
の明確な酵素活性を示しており、これらはα−アミド化
反応を触媒し得るものであった。高分子質量種（７０，
０００ダルトン）は基質のカルボキシル末端においてグ
リシンに関し制限される特異性を有している。低分子質
量酵素はカルボキシル−末端アミノ酸としてβ−アラニ
ンを伴う基質を受容する。

ブタの脳下垂体から抽出し、かつ部分的に精製されたα
−アミド化酵素に関する最適ｐＨよ、ブラツドバリイ・
エイ・エフおよびスマイス・デイ−・ジー（Ｓｎｙｔｈ
ｅ　Ｄ、Ｇ、）、ＢＢＩＩＣ，Ｖｏｌ、１１２　、番２
．１９８３年、第３７２−３７７頁により約７．０であ
ることが報告された。エイツバ−・ビーφニー他のＰＮ
ＡＳ　Ｖｏｌ、８０　、１９８３年、第５，１４４−　
５，１４８頁はラットの脳下垂体から部分的に精製され
たα−アミド化酵素に関する最３ａＤＨが７であること
を報告することによりこれらの結果を確証した。彼等は
また、ｐＨレベル６．５未満または７．５超過において
酵素活性が速やかに下降することに言及している。

〈ここに参考として引用するものとする）上述の刊行物
の全てにおいて、説明した抽出物および部分的に精製し
た酵素混合物は潜在的基質および生成物ならびにα−ア
ミド化酵素自体を分解する可能性のある付加的な蛋白質
分解酵素を含んでおり、その結果天然の供給源から精製
され、あるいは組換えＤＮＡ技術によって精製されたペ
プチドおよびポリペプチドのこの種酵素によってアミド
化が遅延される。

一般的に、他の人々により先に測定された全てのアミド
化活性はＤ−基質、例えばトリペプチド、Ｄ−Ｔｙｒ−
Ｖａｔ−Ｇｌｙ−Ｃ００１１からＤ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−
Ｇｌｙ−ＣＯＮＩＩ２への変換に基づくものである。二
つの可能性成る形状（“Ｄ　ＩＩまたは“Ｌ”）に関し
て、天然に得られる生物学的に重要なアミノ酸は°“Ｌ
″型で得られる。しかしながら、これら他の研究者によ
る１１　Ｄ　ＩＩ型の利用は、これら研究者により用い
られる不純アミド化酵素製剤中の異質の蛋白質分解酵素
の存在に対抗させるために不可避であった。これらの異
質酵素はし−アミノ酸基質に対し顕著な蛋白質分解効果
を有するのに対し、Ｄ−基質に関しては殆ど効果を有し
ていない。研究者等は不純物の成る種の影響を回避する
ために、それらの酵素であって、使用された非天然“Ｄ
　１１基質中の蛋白質分解およびその他の不純物の利用
を課した。

これまで先行の何人もそれらの酵素調製物が如何なる生
理学的に関連する基質をも有効にアミド化し得る、すな
わちＬ−基質を生物学的に活性なα−アミド化酵素り一
生成物に変換できることを示し得なかった。

本明細書中に示すように、本発明による調製物はＬ−基
質を効果的にアミド化し得るものであり、またＤ−基質
に対しても本出願人が知り得るあらゆる先行技術中で言
及された最高の活性よりも６０乃至１，０００倍以上高
い活性を有している。

ペプチドおよび蛋白質のカルボキシル−末端をアミド化
し得る酵素ｖＡ製物は様々な供給源から説明されて来た
。例えば、プラツドバリイ・エイ・エフ他の「ネイチュ
アＪ　Ｖｏｌ、２９８．１９８２年、第６８６−６８８
頁（その全開示はここに参考として引用するものとする
）は、ブタの脳下垂体中に存在すべきα−アミド化酵素
活性を報告している。酵素を含有するブタの脳下垂体調
製物は、グリシンで終結しているペプチドを対応するデ
スグリシン（ｄｅｓｇｌｙｃｉｎｅ）ペプチドアミドに
変換させる能力を有している。しかし、プラツドバリイ
・エイ・エフ他はこのＷ４製物が天然供給源から′ｔａ
製されたペプチドまたはポリペプチドをアミド化するも
のではないことを認めている。

「脳下垂体におけるアミド化活性を検出かつ推定・　　
するアッセイ・システムは、酵素調製物の、合成トリペ
プチド、Ｄ−チＯシルヴアリルグリシンを対応するジペ
プチドアミド、Ｄ−チロシルヴアリンアミドに変換する
能力を調べることにより得られた・・・。Ｄ−チロシン
残基は組織ホモジネート中に存在するアミノペプチダー
ゼによる分解に対する安定性をもたらした・・・。対照
実験は、合成・・・Ｄ−チロシルヴアリンアミドを同−
条＋１でインキュベートしたとき、それは緩慢に分解さ
れた。このようにして、脳下垂体酵素によるジペプチド
アミドの生成に引き続いて、その脳下垂体抽出物中に存
在する他の酵素によるその破壊が生じた。」（第　６８
６頁） このように、プラッドバリイ他は、説明した調製物が他
の蛋白質分解酵素を含み、これがベブチドまたはポリペ
プチドを分解することならびに非天然産のＤ−チロシン
残基が利用されてこの種の分解を最小とすることを認め
ている。

更にブラッドバリイ他は、均質化または１ＩＩＩｔｌ下
（５ｕｂ−ｃｅｌ　！ｕｌａｒ）分画の採用がゲル濾過
クロマトグラフィーを随伴して、アミド化酵素を生成し
、これが明らかに蛋白質分解酵素により汚染されたまま
であることを教示している。

ツーサイン・アイおよびテート・ニス・ニスのＦＥＢＳ
レターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）、Ｖｏｌ、１５２１２．１
９８３年、第２７７−２８１頁は仔牛の脳下垂体神経分
泌顆粒中に存在するα−アミド化活性を説明している。

エイツバ−他＋７）ＰＮＡＳ　ＶＯｌ、８０　、１９８
３年、第５，１４４−５，１４８頁は、ラットの脳下垂
体の前菜、中葉および侵菓ならびに仔牛の中葉脳下垂体
内に存在すべきα−アミド化酵素活性を報告していた。

しかし、この文献は合成り−Ｔｙｒ−Ｖａ　ｌ　−Ｇ　
Ｉ　Ｖ基質を利用してα−アミド化活性をサーチし、生
成した調製物の不純物の認識を教示しているに過ぎない
。

ゴメス他）　、ＦＥＢＳレタース、Ｖｏｌ、ｔ６７１１
．１９８４年、第１６０−　　ＩＥｉ４頁は、ラットの
視床下部ちまた、α−アミド化酵素活性を有することを
確認した。

第８回アメリカン・ペプチド・シンポジウム（ｔｈｅ　
Ｅｉｇｔｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙ
ｎｐｏｓｉｏｕｍ）議事録、第２４９−５２頁（１９８
３年）、編集人、フルビイ・ヴイ・ジェー（Ｈｒｕｂｙ
　Ｖ、Ｊ、　）およびリッヂ・デイ−・エッチ（Ｒｉｃ
ｈ　Ｄ、Ｈ，）、「ペプチド構造および機能（Ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎ）Ｊにおいてブラッドバリイ・ニー・エフ、スミス
・デイｍ−ジー（Ｓｍｙｔｈｅ、　Ｄ、Ｇ、）はラット
の甲状腺におけるα−アミド化酵素活性を説明している
。

メインズ・アール・イー他（Ｍａｉｎｓ　Ｒ，Ｅ、　ｅ
ｔ　ａｌ、）、［内分泌学ＥｎｄＯＣｒｉｎＯＩＯｇＶ
）Ｊ　、ＶＯｌ、１１４．１９８４年、第１，５２２−
　１，５３０頁は脳下垂体前葉に由来するマウスの細胞
系（ＡＴＴ−２０）がα−アミド化酵素活性を有してい
るが、これは培養に際して明らかに減少するものである
ことを報告した。

アミド化ペプチドを含有することが知られている腺また
は臓器はアミド化反応を触媒し得る酵素を含む可能性が
ある。例えば、サメ（Ｓｑｕａｌｕｓ　ａｃａｎｔｈｉ
ａｓ）のような下級生活態動物（ｌｏｗｅｒ　１ｉｆｅ
　ｆｏｒｍｓ）は脳下垂体抽出物中にアミド化ペプチド
を含有することがオドノヒュー・ティー・エル他（０°
Ｄｏｎｏｈｕｅ　Ｔ、Ｌ、　ｅｔ　ａｍ）によって［ペ
プチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　Ｊ　３．１９８２年、第
３５３−３９５頁中に報告されている。シェラ−・アー
ル・エッチ他（Ｓｃｈｅｌｌｅｒ、　Ｒ，Ｈ，ｅｔ　ａ
ｔ、）、［細胞（Ｃｅｌｌ）　Ｊ、Ｖｏ　ｌ　、　３２
．１９８３年、第７−２２頁は、マリーン・スネイル−
７ブリシア（ｍａｒｉｎｅ　５ｎａｉｌ　Ａｐｌｙｓｉ
ａ）中のアミド化シグナルペプチドの存在を報告した。

その天性におけるこの活性の明白な遍在分布にも拘らず
、この酵素の物理学的および化学的特性に関しては殆ど
情報が刊行されていない。このことはこれら神経内分泌
器官中に存在する非常に【レベルの酵素に起因する可能
性がある。

特別な組織中のアミド化ペプチドの存在は高レベルのα
−アミド化酵素と必ずしも同じことではない。例えば、
ラットの脳下垂体前菜組織は高α−アミド化活性を有す
るが、知られた基質は有しティなイ［エイツバ−他（７
）ＰＮＡＳ　ＶＯｌ、８０　、第５．１４４−５，１４
８頁（１９８３年）］。ラットの脳下垂体前菜組織はア
ミド化ペプチド（オキシトシンおよびバソプレッシン）
を含有するが、殆どα−アミド化活性を有していない［
エイツバ−他、Ｅｎｄｏ　１１６、第　２，４９７−　
２，５０４頁（１９８５年）］、、従って、α−アミド
化活性に関して個々の組織が試験されるまで、その酵素
の存在またはボテンシヤル・レベルを予知することはで
きない。

（発明の目的） 本発明の目的はα−アミド化酵素組成物を提供すること
であり、これはＬ−アミノ酸、例えば天然供給源から精
製されるか、組換えＤＮＡ技術により生成されたペプチ
ドまたはポリペプチド基質を含有する基質からのもので
すら、有用なα−アミド化生成物を有効に生成させるこ
とができるものである。

本発明の別の目的は酵素組成物の有効かつ費用効率の高
い製造方法を提供することである。

更に別の本発明の目的は、α−アミド化酵素および固定
化抗体、精製樹脂、免疫親和性カラム等に関し特有のモ
ノクローナル抗体を提供することであって、前記抗体を
利用するものはα−アミド化酵素を能率的に精製するも
のである。

本発明の別の目的はα−アミド化酵素の高収率発現の可
能な遺伝子工学宿主細胞を提供することである。

本発明の更に別の目的はＣ−末端グリシン残□塁を含有
する基質を酵素組成物の存在下で反応させることにより
該基質からα−アミド化酵素生成物を調製することであ
る。

（発明の構成） これらおよび他の目的は本開示の解釈を通じて明らかと
なるであろう。この発明に従って、本出願人は新規なα
−アミド化酵素組成物を提供するものであるが、これは
前記酵素組成物中に存在する蛋白質のη当たり少なくと
も約２５ｍＵ、そして好ましくは約５０以上乃至１５０
ｍＵ以上／蛋白質ηの十分な純度を呈するものである。

ここで述べる全ての特異的な活性ハ’ｊ　ンシル−［）
−Ｔｙｒ−ＶａへＧｌｙ−ＣＯＯＨのダンシル−〇−Ｔ
ｙｒ−ＶａへＧｌｖ−ＣＯＮＩＩ２への変換に基づくも
のである。１ｍＵは次のように定義される。

すなわち、ダンシル−〇−Ｔｙｒ−Ｖａ　Ｉ　−ＣＯＯ
Ｈ１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）をダンシル−〇−Ｔｙｒ−
Ｖａｔ−Ｇｌｙ−ＣＯＭＭ２１ナノモルへ、濃度３ｍＭ
（酵素、基質、補因子とを含む全反応混合物基準で）の
アスコルベートイオン、基質を覆うモル過剰における分
子酵素および活性を最大とするのに有効な第二銅イオン
の濃度（酵素の純度状態により一般に約２μＭ）の存在
下、ｐＨ７，０かつ３７℃において１分間当たり変換す
るのに要する活性量として定義される。

本発明のα−アミド化酵素、例えばペプチジルグリシン
α−アミド化酵素モノオキシゲナーゼは、ペプチド鎖の
少なくともＣ−末端においてグリシン残基を有するペプ
チジル化合物の、Ｃ−末端グリシンの代わりにアミノ基
を有する対応するペプチジルアミド化合物への変換を触
媒し得るものである。本明細書中で使用されるように、
用語「ペプチド鎖」はペプチド結合により互いに結合さ
れた少なくとも２個のアミノ酸を含むあらゆるポリペプ
チドを意味している。用８ｎ「ペプチジル化合物」はペ
プチド鎖を有するあらゆる化合物を包含する。用語［対
応するペプチジルアミド」はＣ−末端グリシンのペプチ
ド鎖の代わりにアミノ基を置換する反応の全生成物を意
味するものである。

（作　　用） α−アミド化反応は酸素および還元剤の存在下で行わせ
るのが好ましい。有用な還元剤ではあるが、それらに限
定されるものではないものにはアスコルビン酸、アスコ
ルビン酸塩類、ジヒドロキシフマレート、金属シアン化
物化合物テトラヒドロプテリン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ
ｐｔｅｒｉｎ）がある。成る種補因子に関しては、これ
が酵素の反応の進行および／または分解あるいは不活性
化の遅延を助長することが判明している。これらの補因
子であって、それらに限定されるものではないものには
カタラーゼ、エタノール、よう化カリウムおよび第二銅
イオンがある。本発明の精製した酵素組成物は好ましく
は蛋白質分解活性であって、α−アミド化酵素あるいは
α−アミド化反応の生成物または反応体を分解し得るも
のを殆ど含まないことであり、その結果酵素組成物はた
とえその基質および生成物がＬ−アミノ酸を含んで成る
としても、α−アミド化反応を触媒することができる。

α−アミド化反応混合物中の蛋白質分解活性はプロテア
ーゼの濃度を直接反映しなくてもよい。高プロテアーゼ
濃度においてさえ、活性は例えば各種のインヒビターの
作用により抑制することができる。Ｌ−アミノ酸を含ん
で成る基質と共に使用するための酵素組成物の商業およ
び実用上の望ましさを増加させる蛋白質分解活性の欠如
は、どのようにしてもし−アミノ酸を含まない基質と共
に使用するための組成物の誘引性を減少させるものでは
ない。

更に詳細な説明において述べるように、本出願人は本質
的なα−アミド化活性を有する、多数の特異的な蛋白質
種を精製した。本明細書中で使用されるように「α−ア
ミド化活性」は基質ペプチジル化合物のＣ−末端グリシ
ンにより以前占められていたアミノ基のみを残すような
傾向を有するあらゆる活性を意味している。この種の置
換はグリジンのアミノ基以外の全ての切断を、アミノ基
をして以前にグリシン部分全体によって占められていた
位置に残留させるような形で伴うものであればよい。「
α−アミド化酵素」は本明細書中で使用されるように、
α−アミド化活性を示すあらゆる組成物または化合物を
相称し、かつそれらの同族体およびフラグメントを相称
するものである。

本発明により精製される酵素組成物は均一となるまで精
製すればよい。ここで使用されるように、「均一」とは
、単一の、十分に限定されたバンドを示し、ドデシル硫
酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲルに対する電気泳
動を伴い、そして−殻内なシーケンシング法に応答する
単一のアミノ酸シーケンスデータを示すことを意味する
。

本発明により均一に精製された成る種のα−アミド化酵
素は具体的な酵素活性的１　、５００ｍＵ／■蛋白質以
上を示した。

本発明に従って調製された酵素組成物は、その酵素組成
物を利用する有用なα−アミド化ペプチジル生成物の製
造に際し使用してこの種生成物のα−アミド化を触媒す
ることができる。基質が提供され、これはペプチド鎖の
少なくともＣ−末端においてグリシン残基を有するペプ
チジル化合物であって、ここにおいてＣ−末端グリシン
のアミノ基による置換が所望生成物をもたらすものであ
る。この基質は本発明により調製された酵素組成物の存
在下、好ましくは酸素および還元剤の存在下で、ペプチ
ジル化合物を対応するペプチジルアミドに変換するのに
足る時間に亙り反応させる。

変換は基質と酵素の最初の接触において実質的に開始さ
れるが、反応速度はｐＨ，温度、基質の同一性、補因子
の濃度およびその他のパラメータであって、知られた方
法で調整されてその反応を最適とし得るものにより可成
り変動する。この反応は一般に所望の変換百分率（基質
対生成物）の見地から選択された時間にｎり進行させる
ものとする。

好ましい実施態様において、補因子、例えば先に論）ホ
したものを用いて反応の進行および／または強化あるい
は酵素の活性持続を補助させる。　天然ホルモン等を含
む数多くの有用な生成物であって、それについてα−ア
ミド化が好ましいか、必要であるものはグリシン−延長
ペプチジル化合物を本発明によるα−アミド化酵素組成
物の存在下で反応させることにより調製することができ
る。

例えば、農業または疾病の処置において利用可能なこれ
らの生成物はホルモン欠乏症によって特徴づけられるも
のであり、そしてそれらにはこれに限定されるものでは
ない各種のカルシトニン、成長ホルモン放出因子、カル
シトニン遺伝子−関連ペプチド等がある。ここで称され
るホルモン、例えば先述のカルシトニン、成長ホルモン
放出因子およびカルシトニン遺伝子−関連ペプチドはＣ
−末端アミド蛋白質種を含んでおり、これらは当業者に
より理解されるように名指されたホルモンの特有の活性
を示す。例えば、カルシトニンは知られているカルシト
ニンの特質である骨へのカルシウムの取り込みの管理を
示す。本明細書で論述された各種の蛋白質種の同族体は
その種の定義によってその範喘に数えられ、そしてここ
で述べるあらゆるヌクレオチドシーケンスまたはアミノ
酸シーケンスは相同シーケンスを包含することを意図す
るものであり、ここで置換、付加または欠落が述べられ
たシーケンスにより付与される別能に著しい影響を及ぼ
すものではない。好ましいのはペプチド中のアミノ酸受
なくとも約４０％そしてもつとも好ましくは５０％が先
に述べたものに相当することである。ヌクレオチドシー
ケンスに関して、コドンは勿論均等なコドンであって、
同一のアミノ酸をコーディングするものにより置換して
もよい。

本発明酵素組成物の、たとえＬ−アミノ酸を含んで構成
される基質に対してさえもα−アミド化反応を触媒する
能力は、天然供給源から精製されるか、または組換えＤ
ＮＡ技法により生成された基質を用いてこれら生成物の
有効かつ費用効果のある生産を可能とするものである。

成る好ましい実施態様において、α−アミド化反応は酵
素を固体支持体であって、水性媒質に対し不溶であり、
かつ反応条件下で耐分解性であるものに対し固定させ、
そして固定された酵素を好ましくは適切な補因子の存在
下で支持体を通過させることにより容易に行うことがで
きる。ここで使用されるように、「固定する」は酵素を
支持体に結合させることを称する。この目的のために有
用な支持体にはこれに限定されるものではないが、対照
−細孔ガラスまたは活性化吸収体、例えば臭化シアン−
活性化セファロースがある。この方法で固定した酵素は
反応混合物を除去することにより再使用することができ
、その固定支持体は新しい使用に対し酵素を維持し続け
るものである。

本出願人は本発明による酵素組成物が数多くの方法によ
り得られ、かつ生成され得るものであることを見出して
いる。髄質甲状腺癌組織、好ましくはラットの細胞系に
由来するものおよび／または前記細胞系からの細胞培地
が特に粗α−アミド化酵素の供給源として望ましいこと
が判明している。不純α−アミド化酵素は、粗組成物を
サイズ排除クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロ
マトグラフィー、好ましくは強力な陰イオン交換クロマ
トグラフィーの両者を施すことにより生成することがで
きる。ここで使用されるように、「強力な」陰イオン交
換クロマトグラフィーとは、１１Ｈ２−１２の範囲内の
一定の有効チャージ（ｎｅｔｐ。

５ｃｔｉｖｅ　Ｃｈａｒｏｅ）を維持するあらゆる樹脂
に対して行われる陰イオン交換クロマトグラフィーに関
している。本発明の成る好ましい実施態様において、サ
イズ排除クロマトグラフィーは強力陰イオン交換クロマ
トグラフィーに先行し、そしてサイズ排除クロマトグラ
フィー工程は更に別の陰イオン交換クロマトグラフィー
工程によってさえ先行されていてもよい。第一工程に引
き続く第二の強力陰イオン交換クロマトグラフィー工程
も望ましいものであり、そして一つの好ましい実施態様
において、第−強力陰イオン交換クロマトグラフィーま
たは第二の強力陰イオン交換クロマトグラフィーのいず
れかは塩基ｐＨで行われるのに対し、他方は酸性ｐＨに
おいて行われる。

本発明に従い略均質に生成された酵素種を用いて、その
酵素に対し特異的であるモノクローナルおよびポリクロ
ーナル抗体が、抗原として精製された酵素を使用して、
マウスおよびニワトリそれぞれにおいて免疫応答を引き
出すことにより調製されて来た。あらゆる種からこの方
法により誘導された抗体は、その酵素に特異的な免疫親
和性カラムを精製する目的のために精製し、かつ固体支
持体上に固定することができる。このカラムは粗酵素原
料の精製に使用することができ、その結果酵素の増加し
た効率および再利用可能性をもたらすことができる。

そのトリプシン・フラグメントと共に本発明により精製
された酵素は知られた方法によりシーケンスされ、そし
てシーケンスデータがオリゴヌクレチオドブＯ−ブの調
製のために用いられた。この方法で調製され、標識され
たオリゴヌクレオチドプローブを使用して、本出願人は
α−アミド化酵素に関する遺伝子コーディングを髄質甲
状腺癌組織に由来するポリＡ　　ＲＮＡより合成された
ｃＤＮＡライブラリィ（１ｉｂｒａｒｙ）から単離した
。本出願の具体的な説明部分において特に−層特徴づけ
られている遺伝子は適切な発現ベクター中に結合させて
もよく、そしてその遺伝子を発現させることのできるあ
らゆる宿主細胞内に形質転換させてもよい。適切な宿主
には、これに限定されるものではないが、エシェリヒア
・コリ、酵母株、例えばＳ。

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または高級真核細胞、例えばそ
の酵素が最初にこれから精製されるところの細胞系があ
る。商業的大量生産は、上述のように遺伝子工学的に処
理された微生物によって促進されて大量のα−アミド化
酵素を発現させることができる。

天然供給源からの酵素の商業的大量生産は、サイズ排除
クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフ
ィーの両者を含んで成る精製法により促進させることが
できるが、その場合陰イオン交換クロマトグラフィー・
カラムにより保持された酵素の種が濃度的２５０ｍＨ以
上、そして好ましくは３５０ｍＭ乃至５００ｍＭの高い
濃度を有する塩類溶液を使用することによって溶離され
るものとする。

高い塩類濃度において、大部分が保持された酵素種が溶
離されることになる。サイズ排除クロマトグラフィーは
見掛は分子間約５８．０００乃至６７、０００ダルトン
、そして好ましくは約６０．０００乃至ｅｓ、ｏｏｏダ
ルトンを有する種の単離を意図するべきである。

精製された調製物は、天然供給源から精製され、または
組換えＤＮＡ技法によって生成されているペプチジル化
合物、すなわちし−アミノ酸を含んで成るペプチドをア
ミド化することができる。

（実施例） 好ましい実施態様の詳細な説明 この発明において、均質なα−アミド化酵素が、固定腫
瘍組織抽出物、腫瘍細胞系および腫瘍細胞系の組織培養
物から、サイズ排除法およびイオン交換クロマトグラフ
ィを組合わせて用いる多段法によって得られることが発
見されたのである。

上記酵素は、ルーズ・ビイ・ニーら（Ｒｏｏｓ、　ＢＡ
、　　ｅｔ　ａｌ）　、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　
、　１９７９年、　１５０巻、１号、２７〜３２頁に記
載しているのと同様にしてｄ＾Ｇ／ｒｔｉｊ　Ｗｉｓｔ
ａｒ種のラットに生育させたラット髄様甲状腺癌腫（“
ＨＴＣｓ”）から抽出した。この組織は、ＩＶＩ−１０
０２８号として寄託しである。この酵素は、他の原料、
とりわけヒトとラットの髄様甲状腺癌腫細胞系からも抽
出した。ラット細胞系（”ＣＡ−７７°°）は、ムスチ
ンスキイ・エムら（Ｈｕｓｚｙｎｓｋ　ｉ　、　Ｈｅｔ
　ａｌ）、ＪＢＣ、１９８３年、　２５８巻、１１，６
７８〜８３頁に記載しであるのと同様にしてラット髄様
甲状腺癌腫瘍を連続継代培養して得たものである。この
細胞系はｍ−１００２９号として寄託しである。ヒト細
胞系［”ＨＴＴ　５４（３４）”］は、ビー・エイ・ル
ーズが、米国、オハイオ州、クリーブランドのＶＡメデ
ィカルセンターで、初代培養にヒト髄様甲状腺癌腫細胞
を用いて発布させたものである。ヒト細胞系８７丁５４
（３４）ハ、ＩＶＩ−１００３１号トＬＴ寄託シＴアル
。

（これらの寄託を特徴する特許手続上の微生物の寄託の
１際的承認に関するブダペスト条約″および１９８３年
１１月３日付パブダペスト条約の告示′。

第３４号参照。これらの全開示事項は本願明細書に参照
される）。

ヒトとラットの細胞の両者の前記細胞系から得られた特
定の組織培養物が、相当なレベルのα−アミド化酵素活
性を有していることが証明され、この酵素の一部がこれ
ら細胞から分泌されているということを示したのである
。この酵素は、（使用後の培養基、酵素および不純物を
含有する）粗原料を、好ましくはまずアニオン交換クロ
マトグラフィに付して精製することによって得ることが
できる。試料は、例えば、クツ社（ＣＵＮＯＣｏｒｐ、
　）より入手できるＣＵＩ４０２５０にようなジエチル
アミノエチル（”ＤＥＡε゛′）カートリッジのごとき
生産規模のアニオン交換器にバルクで投入することがで
きる。

このカートリッジから溶出されたα−アミド化活性を有
する組成物は、次に、適当な分離性能を有する樹脂、例
えばフ７−マシア・ファイン・ケミカルズ社（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手
しうるセファクリル（５ｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ−２０
０スーパーフアインカラムのサイズ排除クロマトグラフ
ィに付される。

活性を有する溶出画分が、次に強力アニオン交換マトリ
ックスを用いるイオン交換クロマトグラフィに付される
。使用してもよい樹脂は、ファーマシア・ファイン・ケ
ミカルズ社製のモノ・キュー（Ｍｏｎｏ　Ｑ）　ＨＲ５
１５強力アニオン交換樹脂であり、酵素を均質に精製す
るには、１回以上カラムを通過させる必要がある。モノ
・キューＨＲ５１５カラムは、粒子径が１０μｍ、ボイ
ド容量が４０％であって、電荷を有する基がＣＨ−Ｎ＋
−（ＣＨ３）　　であり、イオン容量が０．２６〜０．
３６ｍｎｏｌ／ｍｌのゲルを有している。

各精製工程は、蛋白質の含量とα−アミド化活性のレベ
ルの両方で監視することができる。この情報は、酵素の
相対純度の指示計として役立つ酵素の比活性を算定する
のに用いられる。

この発明に従って精製されたペプチジル−グリシンα−
アミド化モノオキシゲナーピ（寄託されたラット由来の
酵素：　ＩＶＩ−１００３２号：寄託されたヒト由来の
酵素：　ＩＶＩ−１００３３号）は、ゲル濾過法で測定
して約６０，０００〜６５．０００ダルトンの見掛分子
ｍを有する。

この酵素は、少なくとも約２５ｍＵ／　Ｒｇ蛋白質、好
ましくは少なくとも約５０ｍＵ／ｍｇ蛋白質の比酵素活
性を示すまで精製した。約１５０１！１０／　Ｉｎｇ蛋
白質を超える比活性が特に好ましい。α−アミド化酵素
も、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル
による電気泳動法（５Ｏ３−ＰＡＧＥ　）による、単一
で均一な十分に限定されたバンドを示すまで精製した。

精製したペプチルジル−グリシンα−アミド化モノオキ
ゲナーゼは、末端グリシン残基（この残基においてこの
グリシンはアミノ基ドナーとして機能する）を有するポ
リペプチドのα−カルボキシル基をアミド化するのに用
いられる。基質のペプチドもしくはポリペプチドは、天
然のソースから精製して作製するか、その成分のアミノ
酸から合成するかまたは組換えＯＮＮ演法よって製造す
ることができる。グリシンを末端基とするポリペプチド
を、有効ｍの酵素の存在下、酵素と結合させる。酵素の
必要量は、当該技術分野でよく知られているいくつかの
変数によって決まる。これらの変数としては、限定され
ないが、特に下記のものが含まれる。すなわち、与えら
れた酵素製剤の比活性、変換される基質の吊と化学的性
質、変換が起こる時間および反応混合物の温度とｐｌ＋
である。

当業者は、与えられた状況で必要な酵素の正確な量に［
１する他の変数を認識している。°酵素が、通常、基質
′ａ度に対して、その反応において１モル過剰に存在し
ている。銅イオンが、好ましい濃度で、そのアニオンが
反応に不利な影響を与えないいずれかの銅塩によって与
えられる。約１　ｍｕ／■蛋白質はどの比酵素活性を有
する酵素を用いた場合、比較的高い濃度の約４μＨの第
二銅イオンによって最大のα−アミド化反応が起こる。

酵素の純度が増大するにつれて、外因性第二銅イオンに
対する濃度の必要性が減少する。また酵素の活性は、増
のカチオンが反応に不利に影響しない限り、いずれのア
スコルビン酸塩でも与えることができるアスコルビン酸
イオンの存在によって高めることができる。約５０ｍＵ
／Ｉｎｇ蛋白質の比酵糸活性を有する精製酵素に対して
は約５ｍ１４のアスコルビン酸イオンによって、最大活
性のα−アミド化反応が起こる。α−アミド化活性は、
カタラーゼの添加によって増大する。生物学的に関連す
る基質のアミド化生成物への変換に対する最適ｐＨは６
．５〜７．５である。

この発明の酵素に対する単クローン性抗体と多クローン
性抗体を、マウスや鶏のそれぞれに免疫応答を起こさせ
る抗原として均質な酵素を用いて得た。単クローン性抗
体と多クローン性抗体はともに、実施例８に記載したよ
うにして出願人が製造、精製した。α−アミド化酵素に
対して特異性の抗体の貯蔵品は、出願人の研究所に保管
されている。

抗体は、固体マトリックスに固定化されるが、このマト
リックスはこれが用いられる培地には溶解しない。マト
リックスとしては、耐分解性のものが好ましい。マトリ
ックスは、蛋白質と結合可能な官能基を有し、その官能
基が抗体と共有結合する。抗体のかような固定化によっ
て、天然物および／または組換え体のソースからα−ア
ミド化酵素を容易に単離することができるようになる。

この単離は、固定化された抗体を、酵素の粗製剤と混合
することによって実施される。抗体は、α−アミド化酵
素分子と特異的に結合する。汚染蛋白質は、抗体と結合
しないので、溶離もしくはゆるやかな遠心分離によって
容易に除去される。汚染物質を除去した後、α−アミド
化酵素は、イオン強度もしくはｐＨを変化させたり、ま
たはカオトロビツイオンの添加（アフィニティークロマ
トグラフィー：原理と方法、手引き書、ファーマシア・
ファイン・ケミカルズ社）によって、固定化抗体から脱
着させて高純度で回収することができる。

またこの酵素は、十分に精製されているのでそのアミノ
酸配列を決定することができる。この情報は、この酵素
をコードする核酸を単離するのに利用した。

適切な単細胞生物またはは多細胞生物から単離された宿
主細胞への結合は、本願に引用されている。マニアテイ
スら（ｏａｎｔａｔｔｓ　ｅｔ　ａｌ）　、１ｏＩｅｃ
ｕｆａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎｏ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　！１
ａｒｂｏｒ、　１９８２年；またはつ・アール（ＷｕＲ
，）ｌＩＨｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　　、　　６Ｅ！巻、　八ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒ
ｅｓｓ、　１９７９年に認められるような標準の組換え
ＯＮ＾法で行われる。得られた細胞は、α−アミド化酵
素をコードする非対応ＯＮ＾を有し、生体外で翻訳侵の
α−アミド化反応を行うのに十分な量の酵素を産生ずる
ことができ、またこれらの細胞に、生体内で、ペプチド
もしくはポリペプチドの前記のの修飾を理論的に行わせ
ることができる。

この発明は、その好ましい実施態様と関連させて記載さ
れているが、多くの改変は、当業者にとって明らかなこ
とである。この発明の好ましい実施態様を、下記の実施
例によって例証する。

実施例１ ＨＴＣ腫瘍由来のα−アミド化酵素製剤のＩＩ調製手訪 凍結ラットＨＴＣ１ｉ瘍を小断片に破砕し、２５０ｍＨ
の蔗糖、０．２５％のＮ−アセチルグルコピラノシド、
０．１ｍＭ　ＰＨ３Ｆ　、２０μｃ＋／ｍｌペプスタチ
ンおよび１００μ９／１大豆トリプシン阻害剤を含有す
る１５０ｍＭトリスＩトリス塩酸緩衝液７．５＞中にホ
モジナイズした。

一般に、２５ｇの１！！瘍組織を、氷上の上記Ｍ笥液２
００ｍ１中にホモジナイズした。この均質化は、ポリス
トロン（Ｐｏ１ｙｓｔｒｏｎ）ホモジナイザー［ブリン
クマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）　］を７にセットして用イ
テ、各々２０秒間ずつ４回破砕（ｂｕｒｓｔ）して行っ
た。得られたホモジネートを、ＪＡ−２００−タ［ベッ
クマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　］にて９．０ＯＯＸ（＋で
１５分間遠心分離し、上澄液（第１上澄液）をデカント
した。残ったベレットを、６０ｍの均質化緩衝液中で、
７にセットして、２０秒ずつ３回の破砕を行って再度ホ
モジナイズした。この第２のホモジネートを、同様に９
、０ＯＯＸ（＋で１５分間遠心分離した。この遠心分離
で得た上澄液（第２上澄液）を第１上澄液に合した。

次いで、合した第１および第２上澄液を、５Ｗ２８０−
タ（ベックマン）で、１００．０００ｘｇにて３０分間
４℃で遠心分離した。透明にしたホモシネ−１へ（第３
上澄み液）に、十分量の硫酸アンモニウムの結晶を添加
して、２５％の硫酸アンモニウム溶液とした。この結晶
の添加は、４℃のホモジネートを絶えば攪拌しながら１
５分間かけて徐々に行った。さらに４℃で３０分間撹拌
後、４℃でＪＡ−２００−タ（ベックマン）を用い２７
．０００ｘｇで１５分間遠心分離した。上澄液をデカン
トし、その上澄液にさらに硫酸アンモニウムを加えて、
４０％硫酸アンモニウム溶液にした。更に３０分間攪拌
後、混合物を、上記と同様にして、２７．０００ｘｇで
１５分間再度遠心分離した。この遠心分離による上澄液
を排東した。

残ったベレットには、ホモジネートの全酵素活性の少な
くとも５０％を含有していたが、５０ｍＨトリス塩酸緩
衝液（ｐｔｌ７．０）中に再度懸濁させて試料を作製し
た。その活性は８．２ｍＵ／ｍ９１５白質であった。

セファクリルＳ−３００ゲル濾過サイズ排除クロマトグ
ラフイ セファクリルＳ−３００（ファーマシア社）を、トリス
塩酸緩衝液（ｐｔｌ　７．０＞中で平衡化させ、メーカ
ーの指示に従ってに５０／１００カラム（ファマシア社
）に注入した。カラムのベツド容積は約１．３１であっ
た。試料を、カラムに、カラムのベツド容積の約％を示
す容積でカラムに注入した。蛋白質類を、５０謂Ｈトリ
ス塩酸ＩＩ衝液（ｐｔｌ７．０）中のカラムから約２ｄ
／ｍｉｎの流速で溶離した。１０ｄずつの画分を収集し
、ダンシル−〇−丁Ｖｒ−Ｖａｔ−Ｇ１１／基質を用い
て、α−アミド化酵素活性を検定した。そのカラムから
、分子量が６０．０００〜６５，０００ダルトンの第１
図に示すような単一ピークの活性を有する酵素が溶離さ
れた。その活性は、少なくとも５０．ｍｌＪ／ｍｙ蛋白
質であった。

最大の酵素活性を有する、セファクリルＳ−３００カラ
ムからの画分をためて、２０ｍＨビスートリス緩衝液（
ｐＨ６，０）の４１に対して透析した。次いで得られた
液を、メーカーの指示に従って前処理した後、２０ｍＭ
ビス−トリス緩衝液（ｐＨ６，０）中で平衡化された、
モノＱＩＲ５１５カラムに注入した。カラムに結合しな
い蛋白質をカラム溶出液に集めた後（通過）、結合した
蛋白質を、２０ｍＨビストリス緩衝液（１）８６．０）
　ニ含有されるＱ　〜３００ｍＨＮａＣｌの直線勾配塩
によって溶離した。このカラムを０．５ｍ／ｍｉｎの流
速で作動させ、２１Ｒ１ずつの両分を収集した。モノＱ
カラム（ｐＨ６，０）から溶出する蛋白質溶液を、１．
０Ｈトリス緩衝液（ｐＨ７，０＞を２００μｐずつ入れ
た管に収集して直ちに中和した。

両分のα−アミド化酵素活性を前記と同様にして検定し
、１ビークの活性が観察されたが、これは約１６０ｍＨ
のＮａＣｌから溶離されたものである（第２図）。その
活性は１６１ｍＵ／■蛋白質であった。

ｐＨ８，０でのモノＱクロマトグラフィ１））Ｉ　Ｏ，
０でのモノＱクロマトグラフィで得た、ピークのα−ア
ミド化酵素活性を有する両分を、５０１１１Ｈトリス塩
酸緩衝液（ａｌｌ　８．０＞　４ｆＪずつに２回透析し
た。この酵素を次に、５０ｍＨトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
’　８．０）で平衡化したモノＱｌｌＲ５１５カラム（
ファーマシア社）に注入した。蛋白質類を、５０ｍＭ塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した０−３００１１８Ｎ
ａＣ１の勾配液で溶離した。流速は０．５１Ｒ１＃１ｌ
ｉｎで２Ｉ！ｄｌずつの両分を収集した。各収集管に１
．０ＨトリスｐＨ７，０緩衝液を加えて、各両分を中和
した。酵素活性の二つの明確なピークが認められ、これ
らピークは、１９０ｍＨＮａＣｌと２２０ｍＨＮａＣｌ
で溶離されたものである（第噸図）。その活性はそれぞ
れ少なくとも８０ｍ１ｌ／　ｔｔｙ）蛋白質と４００ｍ
Ｕ／　＃　Ｉ　白質テアツタ。

４８０１ｍＵ／　ＩｓＦ蛋白質の活性を有する、２２０
ｍＨＮａＣ１で溶離された酵素ピークの画分の一部を、
ＳＯ３とβ−メルカプトエタノールとを含有する緩衝液
中で熱変性させた後、１０％ＳＯ３−ポリアクリルアミ
ドゲルに注入した（第４図）。２２０ｍＨＮａＣ１で溶
離された画分から単一のバンドが認められた。このバン
ドの見掛けの分子量は、約７３．０００〜γ５，０００
ダルトンである。

上記したのと同じ基準を用いて精製した別のα−アミド
化酵素製剤の複数のアリコートを、非変性１０％アクリ
ルアミドゲルによる電気泳動に用いた。５０μｌずつの
アリコートを二つのレーンに添加した。電気泳動された
後、これらレーンのうちの一方の蛋白質を、銀染色法を
用いて目視可能にした。第２のレーンを切断して各３１
１ＩＩＩ１幅のストリップを作製し、核ストリップを、
ミクロタイタープレートの一つのウェル中で培養した。

ダンシル基質、カタラーゼ、アスコルビン酸および１５
０＋ａＨトリス緩衝液（１１８７，０）を含有する混合
物１００μｇを各ウェルに添加した。培養は、絶えず振
盪しながら１６時間３７℃で行った。次いで各ウェルの
アリコートについて、！！質のアミド化生成物への変換
を分析した。酵素活性が、二つのゲルスライスに見出さ
れた。この活性は、対応する染色されたゲルレーン中の
強く染色された蛋白質とともに移動した（第５図）。

ヒトカルシトニンは、そのカルボキシル末端にアミド化
プＯリル残基を有する、３２個のアミノ酸からなるペプ
チドホルモンである。ヒトカルシトニンに相当するアミ
ノ酸配列を有する組換え体融合蛋白質を製造するために
、微生物を遺伝子的に加工した。その融合蛋白質の遺伝
子は、ヒトカルシトニンの配列が、そのアミノ末端がア
ルギニル残基でブラケットされ、そのカルボキシル末端
がグリシル残基でブラケットされ、このグリシル残基で
組換え体融合蛋白質が終結するように設計した（第７図
参照）。ヒトカルシトニン遺伝子をプラスミドに連結し
て適切な融合プラスミドを作製した後、微生物をこのプ
ラスミドで形質転換し、融合体の発現が認められた（索
第６図参照）。このヒトカルシトニン含有蛋白質を、前
記組換え体微生物の溶解物から沈澱させて単離した。次
いでそのシステイニル残基をＳ−スルホネート残基に変
換し、そのリシル残基を、シトラコン酸無水物との反応
で可逆的にブロックした。ヒトカルシトニンはアルギニ
ンを含有していないので、前記組換え体融合蛋白質のト
リプシンによる消化によって、カルボキシル末端にグリ
シンが延長したヒトカルシトニン配列を有するペプチド
が生成した。

このペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィ（第８
図参照）または−イオン交換クロマトグラフィによって
単離し、その構造をアミノ酸とマイクロシーケンスの分
析によって確認した。

上記ペプチドのグリシル残基を除去し、末端から２１目
のプロリル基を、この発明のα−アミド化酵素製剤の作
用によってプロリンアミドに変換して。このペプチドの
半量産規模のα−アミド化反応に採用される条件の一例
は次のとおりである。

凍結乾燥されたペプチド（２００〜３００ナノモル）（
基質）を、約７５０μＵのα−アミド化酵素製剤を含有
する、２００μｍの１５０ｍＨトリス塩ｍ緩衝液（ｐｌ
＋７）に溶解した。酵素は、ラットＨＴＣＩＩ織、また
はラットＨＴＣＣＡ−７７細胞系から得た使用済の組織
培養基由来のものである。酵素は、蛋白分解活性がすべ
て除去される程度に精製された。この精製は、イオン交
換法とサイズ排除クロマトグラフィを組合わせて行った
（＃Ｊ記手順参照）。純粋で均質な酵素が要件ではない
。次のアスコルビン酸と硫酸鋼を、上記混合物に、最終
温度がそれぞれ約３ｍＭおよび２μＨになるのに十分な
争で添加した。得られた溶液を混合して、３７℃で５〜
６時間培養した。基質の生成物への代表的な変換百分率
は７０〜９０％である。Ｓ−スルホネート基の除去に続
いて、組換え体ヒトカルシトニン（ｒｈＣＴ）を逆相高
速液体クロマトグラフィで精製した（第９図参照）。最
終製品の特徴は、逆相高速液体クロマトグラフィでの保
持性（第１０図）、定量トリプシンマツピング（第１１
図参照）、アミノ酸分析（第１表参照）およびその生物
学的活性（第１２図参照）である。すべての点において
、組換え体ヒトカルシトニンは、合成ヒトカルシトニン
と区別できなかった。上記のことは、この発明の製剤が
、生理学的に関連のある基質、例えば組換えＤＮＡ技術
によって製造されたヒトカルシトニン、すなわちＬアミ
ノ酸のみを含有している基質をアミド化することができ
ることを証明している。

匿］Ｌ１ 従来技術で特許請求がなされた製剤の活性の比較 特許請求のなされた製剤の比活性を測定する検定法の比
較 従来技術ではいくつかの活性検定法が採用されている。

従来技術としてあげられている大部分の研究は、Ｄ−Ｔ
ｙｒ−Ｖａｔ−ＧｌｙからＤ−Ｔｙｒ−Ｖａへａｍｉｄ
ｅへの変換反応に基づく検定法を採用している。この検
定法では、放射線標識化トレーサー（１−Ｄ−ｔｙｒ−
ＶａへＧｌｙ）を過剰の非標識化物質（Ｄ−ｔｙｒ−Ｖ
ａへＧｌｙ）と混合として用いて定吊が行われる。標識
化されたトレーサーの変換率を測定することによって非
標識化物質に外挿することができ、次いで活性を計算す
ることができる。

出願人はこの検定法を用いたが、特許請求がなされた製
剤の活性測定値は、ダンシル−Ｔｙｒ−ＶａへＧＩＶか
らダンシル−ｔｙｒ−ｖａ＋−ａｍ＋ｄｅへの変換率の
直接測定法によるものである。

従来技術の製剤とこの発明で特許請求がなされている製
剤の比活性を有意義に比較するために、検定法を比較す
る実験を行った。

実験計画を要約すると次のとおりである。

■、モノダンシルＬ−Ｔｙｒ−ＶａへＧｌｙラットの髄
様甲状腺癌の！ｌｉ瘍と、０Ａ−７７細胞より収集した
組織培養物とから単離したα−アミド化酵素製剤を、こ
の実験の酵素源として使用した。

全実験で用いた酵素８１度は、特に記載する場合を除い
て一定にした。

上記のモノダンシル基質を変換させる反応混合物は下記
のものを含有している。

５μｇの酵素 ５μｍの３０ｍ）ｌアスコルビン酸イオン５μｇの２０
μＨＶ１酸第二銅 ５μｐの１００μｇ／ｍＬウシ膵臓カタラーゼ５μｍの
基質（２ｎｌＯ＋）含有液 ２５４１Ｇの　１５Ｏｎ＋Ｈテス！ｌ衝液（ｐＨ７，０
）試料は２個ずつ作製し、３７℃で１０．２０および３
０分間培養した。酵素反応は、１０／１ｌＪｌの５００
ｍＨＥＤＴＡを添加することによって停止させた。基質
と生成物は、ヒユーレット・パラカード１０９０液体ク
ロマトグラフィシステムを用いるＲＰ高速液体クロマト
グラフィによって分離し、定揖は、ＨＰ−３３９２４ａ
分器を用いて行った。モノダンシルＬ−ｔｙｒ−Ｖａへ
Ｇｌｙのα−アミノ化生成物への変換率は、時間と直線
関係にあることが証明された。

Ｉｔ　、　　　Ｉ　０−Ｔｙｒ−ＶａへＧｌｙ［）−Ｔ
ｖｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｖと１５−ｔｖｒ−Ｖａｔ−１４８
２をピアース・ケミカル・カンバニイ（Ｐｉｅｒｃｅ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐａｎｙ）％のヨウ素ビーズ
を用いてヨウ素化した。放射線標識化基質と生成物を用
いてスルフィル−プロピルカチオン交換カラムの校正を
行った。１２５１　Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ　　を
６５０μＨＤ−ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ　ニ添加し基質
として用いた。モノダンシル基質を変換させる反応混合
物は下記のものを含有している。

５μｍの酵素 ５μρのアスコルビン酸イオン（３０ｍＨ）５μｍの１
００μｇ／１ｌ１１カタラーゼ５μρの２０μＨ′ｆＡ
酸第二銅 ５μρの基質、６５０μＨ（最終濃度）２５μｍの１５
０ｍＨテス緩１１液（ｐＨ７，０）試料を、１０．２０
および３０分間、３１℃で培養した。

反応は５００ｍＨのＥＤＴＡを添加することによって停
止さけた。全試料を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（
ＤＨ５，２）で希釈し、次いでスルフィル・プロピル・
カチオン交換カラムで処理した。基質はカラムと結合し
ないが、アミド化生成物は、５００ｍ）４Ｎａｃｌで溶
離した。放射線標識化基質の生成物への変換率は時間と
直線関係であった。

ＩＩｌ、　Ｄ−ｔｙｒ−ＶａへＧｒｙ Ｄ−ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｙのアミド化反応に用いた反
応条件は、ダンシル基質やヨウ素化基質について記載し
たのと同一の条件である。反応混合物中の基質濃度は６
５０μＨであった。基質と生成物の分離は、ＨＰ−１０
９０液体のクロマトグラフィシステムを用いるＲＰ−高
速液体クロマトグラフィによる勾配溶離法で行われる。

カラムからの溶出液を２８０ｎｌｌｌ波長の光で監視し
た。この検定法の感度のレベルは、ダンシル基質やヨウ
素化基質に対する感度よりも著しく低い。この低レベル
の感度に適応させるために、α−アミド化反応を、長時
間および／またはα−アミド化酵素の伍を増やして行っ
た。

１２５！−Ｄ−Ｔｙｒ−ＶａへＧＩＶから１２５１ｎ−
Ｔｙｒ−Ｖａへａｍｉｄｅ　ヘ、およびダンジル−ＴＶ
ｒ−Ｖａｔ−ＧＩＶからダンシル−Ｔｙｒ−Ｖａへａｉ
ｉｄｅへの各画分の変換率の分析ダークは、各時点でヨ
ウ素化基質の方がダンシル基質の約１．５５倍変換した
ことを証明している。

従って、従来技術の検定システムを出願人の使用する検
定法と比較する場合、ダンシル基質法（出願人の方法）
で測定された活性を約１．５倍する換算係数を用いなけ
ればならない。

更に、多少精密な動力学的分析法を使ってダンシル−Ｔ
ｙｒ−ＶａへＧＩＶ検定法（出願人）とローＴｙｒ−Ｖ
ａ１−ＧＩＶ検定法（従来技術）を比較した。この分析
結果を示すと次のとおりである。

基　　　質　　　　　　　　　　　ＫＩＴｈ　　　　　
　　ＶＩＩｌａＸＤ−Ｔｙｒ−ＶａへＧｌｙ　　　　　
　　３７　　　　３１（従来技術） ダンシル−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ　　　　１．７　　
　２１（出願人の方法） ２種の基質についての最大速度（ｖｍａｘ＝　ｐｍｏ＋
生成物／１ｎ／μｇ）を比較すると分かるように、ロー
Ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ法（従来技術）はダンシル−Ｔ
ｙｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｖ法（出願人法）の約１．４８倍で
ある。これは、上記の知見と一致しかつこの知見を確認
している。

活性の比較 エイバーら（Ｅｉｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｔ）は、（ＰＮＡ
Ｓ）の５．１４７頁の第４図に、３９　ｐｍｏｌ／μｏ
／ｈｒのＶｍａｘ値を開示している。この値は、０．６
５ｍＵ／■蛋白質／１ｌｌｉ口の比活性に相当する。こ
の値は、引用した従来技術に報告された活性のうちで最
高の値である。この値を前記換算係数１．５で割り算す
ると、０．４ｍＵ／１９蛋白質／ｓｉｎの比活性が得ら
れる。この値は、出願人が得た前記の比活性値と直接比
較することができる。出願人は、先に示したように、少
なくとも２５ｍＵ／　＃Ｉ９蛋白質および１．５００ｍ
ｔｌ／　Ｑ蛋白質を超える活性を達成したのである。出
願人は、このようにして、エイパー（ＰＮＡＳ）が報告
した活性の６０倍〜３．７５０倍を超える活性を得た。

実施例３ ラットのＨＴＣ腫瘍由来のα−アミ°　　素の精製と特
性決定 凍結ラットｍＴｃＩＩｍを小断片に破砕し、ポリトロン
ホモジナイザーを用いて、水性緩衝液中でホモジナイズ
した。低速で遠心分離した後、上澄液をため、ベレット
を新しい緩衝液で再抽出した。

この２番目のポジネートを再度低速遠心分離に付してそ
の上澄液を１番目の上澄液と一緒にした。

この二つの合した上澄液を次に高速度遠心分離によって
清澄化し、この高速上澄液を酵素精製の出発物質として
使用した。

高速上澄液の５Ａ酸アンモニウムによる分画を行った。

大部分の酵素活性が、２６〜４０％硫酸アンモニウムノ
画分に沈澱することが見出され、この両分由来のベレッ
トは、さらに下記にようにして精製した。

サイズ排除クロマトグラフィをセファクリルＳ−３００
カラムで実施した。実施１では、すべての酵素が、単一
ピークの活性でそのコラムから溶出された。この実施例
では、カラム艮を長くしカラムの流速を下げた。このよ
うな新しい溶離条件下で、（実施例１の場合と同様の）
大ピークの活性が認められ、これに低分子量の酵素に対
応する小さいピークが続いた。低分子量の酵素が、生体
内に存在するのかまたは抽出やｌＩ調製の過程での部分
的蛋白質分解作用によって生成するのかは、現時点では
明らかでない。

Ｓ−３００カラムから得た大ピーク活性部分をためて、
ｐＨ６，０のモノＱカラムのカラムクロマトグラフィに
付した。この実施例では、実施例１のものよりも大きい
生産規模のカラム（モノＱＨＲ１０／１０）を用い、小
勾配の直線塩勾配液を用いて溶離した。

このように条件を変えた結果、１６０ｍＭ　、　　２０
０ｍＭ。

２００ｍＭおよび２４０ｍＭのＮａＣ１が溶１ｌｌｉす
るα−アミド化酵素活性の四つのピーク（それぞれ自体
１３図における第１、■、■および■ビークである）が
この工程で検出された。これは゛、酵素が復台形で存在
し、これらの形態は電荷が不均一であることを示してい
る。更に、酵素活性ピーク中の前記蛋白質類のポリアク
リルアミドゲル分析を行った結果、第■、■およびＩＶ
のピークは、はぼ同じ分子量（すなわち７３．０００〜
７５．０００ダルトン）のα−アミド化酵素を含有して
いることを示し、一方第工ピークは、異なる分子量の、
おそらく小さい分子量のｌＳ？素を含有していた。第■
ピークの活性成分を、下記のようにして均一になるまで
精製した。

第■ビークの酵素をためて、ｐｌ＋８．０のモノＱＨＲ
１０／１０カラムを用いるクロマトグラフィに付したく
第１４図〉。この酵素は、このカラムから２５０ｎＨＮ
ａＣｌによって単一ピークとして溶出し、ゲル分析した
結果、均一に精製されたことが分かったく第１５ａ図、
第６レーン）。下記の特性決定実験は、前記の第■ビー
ク精製酵素について行った。

１、第■ピークの酵素の分子量は、７％ポリアクリルア
ミドゲル分析法で測定した結果、約７５．ＯＯＯダルト
ンであった（第１５ｂ図）。

２、この酵素の活性の最適ｐＨを測定したところ、基質
としてＮダンシル−Ｔｙｒ−ＶａへＧｌｙを用いた場合
ｐ１１５．０〜５．５であった（第１６図）。しかし、
酵素が中性ｐＨで安定性が増大するので、このようなｐ
Ｈがアミド化反応を行うのが有利である。

３、酵素の活性化のための補因子として必要な銅の量が
酵素の純度に反比例することが測定された。均一になる
まで精製されたＰｆ索は、最大活性を得るのに、０．１
μＨ以下のＣｕ”＋を必要としたが、粗製の酵素製剤は
２μＨのＣｕ＋＋を要した。

４、酵素の等電点（ＰＩ）は４．８であった。

５、均一な第■ビークの酵素の比活性は、２、１００１
ｔｌ／■蛋白質であった。

第■ビーク酵素も均一になるまで精製した。しかしこの
酵素の場合、ｐＨ８，０でのモノＱクロマトグラフィが
、均一な製剤を得るには不十分であることが見出された
。それ故に、ｐＨ６，０のモノＱカラムで得た第■ビー
ク酵素のブール（第１３図）を、１Ｍトリス緩衝液ｐＨ
７，０に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化したフェニ
ルセファロースカラムに注入した。不純物を含んでいる
蛋白質種の大部分がカラムを通過中に回収され、侵の工
程で溶離されるるアミド化酵素が十分に精製された。こ
のフェニルセファロースカラムから得られためた酵素を
モノＱＨＲ１０／１０　ｐＨ８，０のカラムでさらに精
製した結果、２２０ｍＭ　ＮａＣｌ以上のところでカラ
ムから溶出する第■ビーク酵素の均一な製剤を得た。

第■ビーク酵素の特性決定の結果下記のことが明らかに
なった。

１、第■ビーク酵素の７％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法による分子量は、約７３．０００〜７５．０ＯＯ
ダルトンであった。このように、第■ビークと第■ビー
クの酵素は、分子量の比較では識別できなかった。

２、第■ビーク酵素を活性化するのに最適ｐＨは、５．
０〜５．５であった。更に、第■ビーク酵素のこの特性
は、第■ビーク酵素と同じであった。

′３．第■ビーク酵素の等電点（Ｐ　Ｉ　）は約５．８
まであった。

ラットの髄様甲状腺癌ｍ細胞系ＣＡ−７７を、８％Ｃ０
２を用い１５０　ＣｒＩのＴ形フラスコ（ユーニング社
）中で単相培養物として培養した。この培養物を、ダル
ベツコの改良イーグル培地（Ｆ−１０，１，１）、３．
７ｇ／ｊのＮａＨＣＯ３，５μｇ／ｍｅのトランスフェ
リン、１０μ９／ｌｌｌ１！のインシュリン、３０ｎＨ
のセレンおよび４μ９／ｒｒｔｌの硫酸ゲンタマイシン
からなる特定の培地内に保持した。このようにして培養
した培養物は、培地を４８時間毎に変えれば無限に保持
できたであろう。ｔｆＡ胞の貯蔵供給を増やすために継
代培養し、次いで血清（５％のウマ血清および２．５％
のウシ胎児血清）を含有する培地で３日間培養した。次
いでこの細胞をリン酸で緩衝した塩水で３回洗浄し特定
培地で満たした。

組織培養物を、４８時間毎に無菌で集めて、精製するま
で一２０℃で保管した。この組織培養物（通常６！Ｊ）
を２ｎの脱イオン水で希釈しく３　：　１　）、４．０
℃の２０ｍＭビストリス塩酸緩衝液（ｐＨ６，０）の１
、Ｏｇで予め平衡化したＤＥＡＥ弱アニオン交換カート
リッジ（先ハ２５０）に流速５０ｍ／１ｎで注入した。

α−アミド化酵素（“ａ−ＡＥ”）が、５００ＩＩＩＨ
ＮａＣｌ含有の５０ｍＨトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０
）によって約５０ｍｅ／ｍｉｎの流速で段階的に溶離さ
れた。二つのアニオン交換製剤からのα−訂活性を有す
る両分（比活性１０〜１５１ｕ／ＩＲｇを集め、サバン
ト（５ａｖａｎｔ　）ＲＨ１００プレツブ・ロータを用
い、減圧下４〜５倍に濃縮した。

この物質を、セファクリル３００−３Ｆ　（）７−マシ
ア社）の入った５ｘ５０Ｃｍカラムに直接注入した。

移動相は、流速１．０ｍ！／ｗｉｎの１００ａＨトリス
塩酸緩衝液ｐＨ７，０であった。ゲル濾過クロマトグラ
フィもすべて４．０℃で行った（第１７図）。

この精製段階でのアミド化酵素製剤は、非特異的な蛋白
分解活性をもっておらず、少なくとも５０１ｕ／ｌｌ１
ｇ蛋白質の活性を有している。この段階で得たアミド化
酵素製剤を、組換え体グリシン延長ヒトカルシトニンと
成長ホルモン放出因子のアミド化に使用して成功した。

細胞密度１〜１．５Ｘ　１０６細胞／ｄ＜Ｔ−フラスコ
由来）で出発して、発明者らは、通常、これら二つの精
製工程を経て、使用済培地１Ｊｌ当り２００〜３５０＋
ａＵのアミド化酵素活性の収量を得た。その酵素は安定
で、溶液で使用するかまたは固体の担体に固定化した侵
で用いるのに好適である。

α−ＡＥ活性を有するカラム画分をため、次いで６ｆＪ
の２０ｍＭビストリス塩酸緩衝液（ｐＨｅ、ｏ）に対し
て透析した。その酵素を、予め２０ｍＭビストリス塩酸
緩衝液（ｐＨ６、ｏ）で平衡化した七ノＱＨＲ１０／１
０強アニオン交換カラム（ファーマシア社）に注入した
。０−３００ａＨＮａＣｌの直線勾配液を、３時間にわ
たって２．５ａｄ／Ｓｉｎの流速で用いて、前記カラム
から酵素を溶離した。この精製段階で、４種のりＯマド
グラフィ的に別個のα−アミド化酵素活性が分離された
。核ピークには、カラムからの溶出類に番号を付けた（
第１８図）。第■と■のビークは、高分子量の酵素を示
し、ＨＴＣ腫瘍由来の第■と■のピークに相当する。第
１と■のビークは低分子量の酵素を示し、第■とＩＶの
ピークの蛋白質分解断片である。

発明者らの研究室で固定された４種のα−アミド化酵素
は互いに実効表面電荷が異なる。これは、′強アニオン
交換クロマトグラフィでの保持時間が異なることによっ
て証明されている（第１８図）。

これら４種のクロマトグラフィ的に別個の酵素のノ　１
？ ｐＨ最適値も異なる。第Φ巷図の結果は、第■と■のビ
ークが、ｐＨ５，０〜５．５の同じｐＨ最適値を有して
いることを示している。これらの結果は、ＨＴＣ腫瘍か
ら精製して得た第■と■のビークについて測定したＤＨ
最適値と一致している。第１と■のビークは、非常に広
範囲のｐＨ活性領域を有し、Ｉ）ＩＩ最適値は５〜８．
５である（第１９図）。これらの結果は、エイバーら、
ＰｅｐｔｉｄｅＳ、　４巻、９２１〜２８頁、１９８３
年およびマーシイら（Ｈｕｒｔｈｙら）　、Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６１巻、　１，８１５〜２２頁、１９８
６年に報告されたｐＨ最適値と厳密に一致している。

第■とＩＶのピーク由来の酵素をＮａ１２５Ｉで放射線
標識化し次いで５Ｏ３−ＰＡＧＥに付した結果、第１Ｖ
のピークの酵素活性体が約７３〜７５ｋＤａ　ｌの分子
量を有し、一方策■ビークの酵素活性体の分子ｍは５５
ｋＯより小さいことが確認された。第■ビークの酵素は
、均一になるまで精製されていなかったので（いくつか
の蛋白質のバンドが４５〜５５ｋＤａｌの領域にはっき
りと現われている）、正確な分子層は不明である。

第■とＩＶのピークの酵素は、疎水的相互作用クロマト
グラフィ、強アニオン交換クロマトグラフィ（ｐＨ８，
０）を組合わせて用いることによって均一にまで精製す
ることができる。第１Ｖピーク酵素活性体（第１８図）
をため、減圧下約２ｍに濃縮し、次いで５００ｍＨｔ−
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したフェニルセ
ファロースカラム（１，３Ｘ８　ｃｆｆｉ）に直接注入
した。α−ＡＥ活性を有する両分が、流速０．５ａｅ／
ｗｉｎの平衡化緩衝液によって溶離されたく第２０図）
。α−アミド化活性を有するピーク画分をためて５０ｍ
Ｈトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に対して透析し、次
いで５０ｍＨトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０＞で予め平
衡化したモノＱＨＩＩ　１０／１０カラムに注入した。

０−３００ｍＨＮａＣｌの直線勾配液を３時間にわたっ
て流速２．０１１１ｉ！／ｍｉｎで用いて前記カラムか
ら酵素を溶離した（第２１図）。約２４０ｎＨ以下で溶
離したα−ＡＥ活性を有する両分をため５．トリトンＸ
−１００で０．００１％（Ｖ／Ｖ）に調整し、４℃で保
管した。精製酵素の比活性を測定した結果、ｐＨ７，０
で約１．５００ｍＵ／　Ｒ１Ｊ蛋白質であった。第■ピ
ークのα−ＡＥ活性体を、第■ビークについて記載した
のと同一の方法を用いて均一になるまで精製した。

腫瘍ピーク（実施例３のもの）と組織培養物の第４１Ｖ
ビーク（実施例４）が、分子量（７３、ＯＯＯ〜７５．
０００ダルトン）　、９８Ｍ適値（５，０〜５．５）　
、アミノ末端配列および溶離位置（ｐＨ８，０で実施し
た強アニオン交換クロマトグラフィにおける約２４０ｍ
ＨＮａＣ１より高濃度）を含む物理化学的特性を有して
いるということは、これら二つのピークが同じ酵素であ
ることを示している。

実施例５ サケとヒトのカルシトニン、ヒト成長ホルモン放出因子
およびヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドに属する基
質を含むいくつかの組換え体ペプチドホルモン基質を製
造し、この発明のα−アミド化酵素製剤で良好にα−ア
ミド化した。例示を目的として、組換え体サケカルシト
ニン、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドおよびヒト
成長ホルモン放出因子の製造に用いた手順を以下に要約
した。類似の方法を他の組換え体ペプチドに用いること
ができる。

サケカルシトニンは、カルボキシル末端にα−アミド化
プロリル残基を有する３２員ペプチドホルモンである。

微生物を遺伝子的に加工して、サケカルシトニンに相当
するアミノ酸配列を有する組換え体融合蛋白質を製造し
た。この厳合蛋白質遺伝子は、サケカルシトニン配列が
、そのアミン末端がメチオニル残基でブラケットされ、
またそのカルボキシル末端が、組換え体融合蛋白質を終
結するグリシル基によってブラケットされるように設計
された。このサケカルシトニン遺伝子をプラスミドに連
結させた後、このプラスミドで微生物を形質転換させ、
その融合蛋白質の発現が得られた。このカルシトニン含
有蛋白質は、組換え体微生物の溶解物から沈澱させて単
離し、そのシステイニル残基をＳ−スルホネ−１−に変
換させた。すケカルシトニンはメニオニンを含有してい
ないので、この組換え体融合蛋白質を臭化シアンで切断
すると、カルボキシ末端グリシン延長を有するサケカル
シトニン配列をもったペプチドが生成した。

このペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィまたは
イオン交換クロマトグラフィで単離し、その構造は、ア
ミノ酸組成および微細配列の分析によって確認した。

このペプチドの末端から２番目のプロリル残基を、α−
アミド化酵素の作用でプロリンアミドに変換した。この
ペプチドのα−アミド化に用いた条件の１例は次のとお
りである。凍結乾燥したペプチド基質（グリシンで延長
されたサケカルシトニン前駆体、２００〜３００ｎｍｏ
ｌ）を、約７５０μＵのα−アミド化酵素を含有する１
５０ｆｆｌＨトリス塩酸緩衝液（ｌｌＨ７）　　２００
μｇに溶解した。この酵素は、ＨＴＣｌｌｉ瘍、または
ラット（Ｃ＾−７７細胞系からの使用済組織培ｇ！基か
ら得ることができる。この酵素は、異質の蛋白分解酵素
活性がすべて除去されるまで精製しなければならない。

この精製は、通常、イオン交換クロマトグラフィとサイ
ズ排除クロマトグラフィを組合せて行うことによって達
成することがきる（実施例４参照）。純粋で均一な酵素
が要件ではない。アスコルビン酸と硫酸銅を、この混合
物に、Ｒ終濃度がそれぞれ約３ｍＭと２μＨとなるのに
十分な堡添加する。カタラーゼ（７，５μ（Ｊ　／Ｉｎ
Ｌ）　、エタノール（１％Ｖ／Ｖ　）およびヨウ化カリ
ウム（５０ｍＭ）も、α−アミド化サケカルシトニンの
収量を改善するため反応混合物に添加する。得られた溶
液を混合し、３７℃で５〜６時間培養した。

β−メルカプトエタノールで処理することによってＳ−
スルホネート基を除去した後、得られた組換え体サケカ
ルシトニンを、逆相高速液体クロマトグラフィで精製し
た。最終生成物は、逆相高速液体クロマトグラフィでの
保持時間、定量トリプシン地図およびアミノ酸分析によ
って特性を決定した。すべての点で、組換え体サケカル
シトニンは、合成サケカルシトニンから識別することが
できなかった。

ヒトカルシトニン遺伝子ＩＩｌ連ペプチドは、そのカル
ボキシル末端にα−アミド化フェニルアラニル残基を有
する３７員のペプチドホルモンである。

その融合蛋白質遺伝子は、サケカルシトニン（上記参照
）の場合と同様に設計した。すなわちそのヒトカルシト
ニン遺伝子関連ペプチド配列は、そのアミノ末端がメチ
オニル残基でブラケットされ、またそのカルボキシル末
端が、組換え体融合蛋白質を終結させるグリシル残基で
ブラケットされている。組換え体ヒトカルシトニン遺伝
子関連ペプチド前駆体の遊離、精製、α−アミド化およ
び特性決定も、組換え体サケカルシトニンに用いたのと
類似の方法で行った。

ヒト成　ホルモン放出因子（ｈＧＨＲＦ）は、そのカル
ボキシル末端に、α−アミド化ロイシル残基を有する４
４員ペプチドホルモンである。ｈＧｌｌＲＦの融合蛋白
質遺伝子は、そのペプチドホルモンのアミノ酸配列が、
そのアミノ末端がトリプトファニル残基でブラケットさ
れ、そのカルボキシル末端が組換え体融合蛋白質を終結
するグリシル基でブラケットされるように設計した。ｈ
ＧＨＲＦ含有の融合蛋白質は、組換え体微生物の溶解物
から沈澱させて単離した。融合蛋白質の非−ｈＧＨＲＦ
部分は、そのシステイニル残基をＳ−スルホネート誘導
体に変換することによって変性した。ｈＧＨＲＦはトリ
プトファンを含有していないので、組換え体融合蛋白質
を試薬ＢＮＰＳ−スカトールで化学的に消化して融合蛋
白質を酸化切断し、カルボキシル末端グリシン延長を有
するアミド化されていないｈＧＨＲＦを生成させた。同
時に、ｈＧＨＲＦ分子中２７位のメチオニル残基が酸化
されてメチオニンスルホキシドになった。このグリシン
が延長したペプチドは、ゲル濾過法と逆相高速液体クロ
マトグラフィを用いて単離した。その構造は、トリプシ
ン消化で生成したペプチドの断片のアミノ酸分析によっ
て確認した。

末端から２番目のロイシル残基を、この発明のα−アミ
ド化酵素の作用でＯイシンアミドに変換した。α−アミ
ド化ｈＧＨＲＦの製造に用いた条件の一例は次のとおり
である。凍結乾燥したベプチド基質（２０〜４０ｎａｎ
ｏ　ｎｏ　ｌ　）を１５０μｊｌの脱塩水に溶解し、ラ
ットＨＴＣ腫瘍由来の、またはＣＡ−７７細胞系からの
使用済組繊細胞培地由来のα−アミド化酵素製剤９０１
　（５００μｔｌ）　（ｐＨ７，０＞と混合した。

酵素を、サイズ排除法とイオン交換クロマトグラフィを
組合わせて精製し、異質の蛋白分解酵素活性をすべて除
去した。次にアスコルビン酸と硫酸銅を、酵素と基質の
混合物に、それぞれ３ｆｆｌＨと２μＨの濃度になるよ
うに添加した。得られた溶液を混合し、３７℃で４〜６
時間培養した。トリプシンによる消化によって遊離され
た断片のアミノ酸分析に基づいた。基質の生成物への一
般的な変換百分率は９５％である。最後に、メチオニン
スルホキシド残基を、１０ｍＨの酢酸ナトリウムでｐＨ
４に緩衝した４Ｍメルカプｉ・エタノールを８０℃で１
時間作用させてメチオニンに還元した。最終生成物を、
逆相高速液体クロマトグラフィで精製し、その保持時間
、トリプシン消化分析およびアミノ酸分析によって特性
を決定した。組換え体のα−アミド化生成物も、生物学
的活性を試験した。すべての点で、組換え休ｈＧｌｌＲ
Ｆは、合成ｈＧＨＲＦと識別することができなかった。

上記の研究に加えて、２種の市販されているグリシン延
長ペプチドホルモンを、α−アミド化酵素に対する基質
として作用する性能について評価した。これらのペプチ
ドは、α−メラニン細１抱刺戦ホルモンとサブスタンス
Ｐの前駆物質である。

両方の場合、両ペプチドがα−アミド化酵素に対する適
切な基質であるという結果を示している。

実施例６ 精製ラットα−アミド化酵素の配列分析ラットＨＴＣ腫
瘍組織またはＣＡ−７７細胞培養物の上澄液由来の精製
α−アミド化酵素を含有する両分を集め、その酵素のス
ルフヒドリル基を還元し次いでカルボキシメチル化した
。次に、得られた反応混合物を、０．１％三フッ化酢酸
水溶液で平Ｉｊｉ化したＶｙｄａｃ　Ｃ４逆相高速液体
クロマトグラフィのカラム（粒径５μＨ，ｆｊ／ｉ細孔
の大きさ３３ｎｍ　）に注入した。このカラムを上記溶
液で洗浄して過剰の！ｌｌｊ塩を除去した。０．０８％
の三フッ化酢酸を含有する８０％アセトニトリルで溶離
することによって前記高速液体クロマトグラフィのカラ
ムから脱塩された酵素を分離した。カラムからの溶出液
は、２２０ｎｍでＵｖ検出を行って監視した。得られた
蛋白質画分を集めてため凍結乾燥した。この物質を、ｉ
ｏｏ！ｉ、ａの０．１％ＳＯ８に再び溶解し次にアブラ
イドバイオシステムズ（＾ｌ１ｌ）ｔｉｅｄ　ａ；ｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）　４７０Ａ形蛋白質シーケンサ−（ｐｒ
ｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ）にかけた。微細配列
分析に自いた手順は、アプライドバイオシステムズ社指
定のものを用いた。得られたフェニルチオヒダントイン
アミノ酸類を、ヒユーレット・パラカード１０９０液体
クロマトグラフィシステムを用い、２６９ｎｍと３１３
ｎｍの吸光度で監視しながら、ハイパーシル（Ｈｙｐｅ
ｒｓｉｌ）　ＣＩ８カラム（粒径５μｍ、微細孔の大き
さ１０ｎｍ）による高速液体クロマトグラフィで分析し
た。腫瘍組織由来の多量成分酵素のピーク（第■ビーク
）のアミノ末端のアミノ酸配列は次のとおりであった。

Ｎｌ２−３ｅｒ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−＾５ｎ−Ｇｌｕ−Ｃ
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−νａ　ｌ　−Ｔｂｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−へ５ｐ−Ａ
ｌａ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−１１ｅ−八ｒｇ−Ｎｅｔ−ＰｒＯ ＣＡ−７７細胞組織培養物の上澄液由来の多量成分の酵
素（第１Ｖビーク）のアミノ末端のアミノ酸配列のデー
タは、その配列が腫瘍組織酵素（第■ビーク）の配列と
同じであることを示している。しかし少量成分も、多量
成分のα−アミド化酵素に比べてアミン末端延長を有し
ていると考えられるこの酵素の微細配列分析中に検出さ
れた。この成分が存在するのは、恐らく、酵素の、確認
翻訳後処理（ｄｉＨｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｏｓｔ−ｔｒ
ａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）が原
因であろう。この成分のアミノ末端のアミノ酸配列は次
のとおりであった。

Ｎｌ２−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａ
ｒｇ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙ
ｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ラットのＨＴＣ腫瘍組織由来のα
−アミド化酵素について、追加のアミノ酸配列のデータ
を以下の方法で得た。約４００μ９のＮ製酵素を還元し
カルボキシメチル化した。この処理に続いて、酵素溶液
を透析管に移し、２５ｍＨトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）　／　０．５Ｈ尿素に対して１８時間透析した。残
った液を、１，５１の遠心分離管に移して減圧下で６０
０μ［の容積まで濃縮した。この酵素溶液に２μＮ　　
（２μ９）のトリプシンを添加し、混合物を３７℃で１
時間培養した。この時点でトリプシンの第２のアリコー
ト（２μｇ）を添加して３７℃で２時間培養を続けた。

４Ｍ尿素／１０％酢酸２００μＬを添加して消化を停止
させた。次に消化物を、予め０．１％三フッ化酢酸水溶
液で平衡化したＶｙｄａｃ　ｃ１８逆相高速液体クロマ
トグラフィカラム（粒径５μｍ１微細孔の大きさ３３ｎ
ｍ　）に注入した。次いでアセトニトリル５０％濃度ま
での直線勾配液を用い４時間にわたってこのカラムを溶
離し、２分間隔で両分を集めた。この酵素のトリプシン
消化物について得られた特徴的な逆相高速液体クロマト
グラフィの溶出ピークのグラフを第２３図に示す。

得られた三つのトリプシンペプチドを前記と同様にして
自動アミノ酸配列分析に付した。結果は次のとおりであ
る。（各ペプチドはその両分番号で示しである。

トリプシンペプチドＮｏ、　６５ 一８ｅｒ−Ｈｅｔ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−
Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−旧ｓ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｒ
ｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−実施例
７ 子クローニング いくつかの重要な情報と試薬に基づいて、α−アミド化
酵素をコードする遺伝子もしくはＯＮへの塩基配列をク
ローニングすることが可能になる。

酵素のメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）のソースと
してまた最終的にｍＲＮＡの相補的ＤＩＩＡ　（ｃＤｔ
４Ａ）として順に働く酵素蛋白質の信頼できるソースを
見つけなければならない。酵素の遺伝子もしくはｃＤＮ
Ａを単離するには、問題にしている酵素に特異的な分子
プローブが必要である。一般にこの分子プローブは、二
つの形のうちの一つをとり、塩基配列が酵素の遺伝子の
一部と相補的であるオリゴヌクレオチドであるか、また
は酵素蛋白質を特異的に認識する抗体分子（もしくは抗
体分子の集合体）である。

これらの分子プローブを得るためには、酵素に特異的な
抗体が製造可能であるとか、またはオリゴヌクレオチド
のプローブを設計するための酵素のアミノ酸配列が測定
可能であるとかいうような酵素を精製する方法を、見つ
ける必要がある。精製法を見出す前記の条件は、本願の
α−アミド化酵素については充足されたのである。

α−アミド化酵素は、ラットＨＴＣ組織と、ラットＣ＾
−７７細胞のならし培地から精製して得た。この事は、
これらの細胞源が前記の酵素蛋白質をコードするｍＲＨ
Ａを含有しているということを証明している。発明者ら
がα−アミド化酵素用のＣＤＮ八を製造するのに用いた
方法は、分子生物学の技術分野で公知の方法である。こ
れら各種の方法の具体的な記録は、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　’Ｃ１ｏｎｉｎｏ　　（ｔ９８２年）；す＾Ｃｌ０ｎ
ｉｎ（１（第１巻’）　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ＡＩ
）ｌ）ｒｏａｃｈ　（１９８５年）のような実験室マニ
ュアルまたはガブラー・ヴイ（Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｖ、　
）およびホフマン・ビイ・ジエイ（Ｈｏｆｆｅ＋ａｎ、
　Ｂ、Ｊ、　）のＧｅｎｅ、　２５巻、２６２−６９頁
、１９８３年またはヤング・アール・エイ（Ｙｏｕｎｇ
。

Ｒ，Ａ、）およびデイビス・アール・ダブリュ（ＤａＶ
ｉｓ、　　Ｉｔ、帽）のＰＮＡＳ、　８０巻、　１，１
９４〜９８頁、１９８３年のような重要な参照文献に見
ることができる。これら方法は一般的に利用可能であり
、利用されるｍＲＨＡのソースが重要な変数になってい
る。アミド化酵素に特異的なｃＤＮＡを製造するため、
発明者らは、ラットＨＴＣ組織のｍＲＮＡとＣＡ−７７
細胞のｍＲＮＡを用いた。合成した二重鎖ｃＤＮＡの試
料を、公知の方法で別々の遺伝子ライブラリーを作製す
るのに順に用いた。

先に検討したように、α−アミド化酵素ｍＲＮＡに対す
る特定のＣＤＮへの固定には、これらの組換え体を、特
定のライブラリーの他の組換え体から識別できる分子プ
ローブが必要である。実施例３と４に、分子プローブを
得るのに必要な酵素を製造するのに用いた精製法が詳細
に述べられている。実施例６には、この蛋白質のアミノ
酸配列決定への利用が記載され、また実施例８には、精
製蛋白質の酵素特異性抗体製造への利用法が記載されて
いる。

実施例６のアミノ酸配列は、特異的な選択オリゴヌクレ
オチドプローブを生成するのに十分なものである。オリ
ゴヌクレオチドプローブを製造する際は、プローブを選
択性にするためにいくつかの因子が重要である。これら
の考察を十分に検討したものとして、レイス・アール・
ジエイ（Ｌａｔｈｅ、　　Ｒ，Ｊ、　　）のＪ、　Ｈｏ
ｔ、　　Ｂｉｏｌ、　１８３巻、１−１２頁、１９８５
年がある。一般に、一つ以上のヌクレオチドの配列が同
じアミノ酸配列をコードすることができるので（遺伝子
暗号の縮重として知られている原理）、いずれの単一の
ヌクレオチド配列も、多数の可能性がある遺伝子配列の
一つを示しているにすぎない。オリゴヌクレオチドプロ
ーブが問題としている遺伝子を固定するということを保
証するために、アミド化酵素の特異的なアミノ酸配列を
コードできる可能性のあるすべてのヌクレオチド配列の
等モル混合物を作製することができる。

かような混合物は複雑なために、絶対選択性が低下する
ことが多い。従って一般に、蛋白質由来のアミノ酸配列
の一つ以上の領域に対応するオリゴヌクレオチド混合物
を、所定の遺伝子に対して絶対に特異的な選択性を得る
ために用いねばならない。

代わりに、所望の遺伝子に対する相補性がわずかに不完
全であっても安定なハイブリッドを生成するのに十分な
長さを有する独特のヌクレオチド配列を作製することに
よって、問題としている遺伝子に対して選択的なオリゴ
ヌクレオチドを製造することができる。この独特な配列
が他の遺伝子配列を有する安定なハイブリッドを形成す
る確率は非常に小さい（長さに依存する）ｅこの独特の
配列は、蛋白質の配列の各アミノ酸生成に最も多く用い
られるコドンで構成されている。所定の種に対するコド
ン使用の頻度は、公知の遺伝子配列と、その種の蛋白質
に対応するアミノ酸配列とをコンパイルして決定するこ
とができる。これらの方法は、分子生物学の分野の当業
者にとっては公知のものである。

特異的なオリゴヌクレオチドプローブの製造に利用でき
るさらに池の方法として、デオキシイノシン残基を、オ
リゴヌクレオチドの最大縮重位置に結合させる方法があ
る。このヌクレオチド置換法は、プローブ試料の縮重性
を減少させる動きがあり、プローブの選択プロセスに有
利な効果を与えることができる。〈オリゴヌクレオチド
プローブへのデオキシイノシンの利用に関する検討につ
いては、オーツカら（Ｏｈｔｓｕｋａ　ａｔ　ａｌ）の
Ｊ、　ＢｉｏｌＣｈｅｍ、　　２６０巻、２，６０５−
０８頁、１９８５年を参照のこと）。

発明者らは、α−アミド化酵素の蛋白質配列を用いて、
アミド化酵素のＣＤＮ＾を単離するのに有用な各種オリ
ゴヌクレオチドプローブを計画した。

使用した配列と、発明者らが製造したプローブを第■表
に示す。アミノ酸配列が与えられれば、プローブのハイ
ブリッド形成によって遺伝子を単離する別の方法を、分
子生物学の当業者が開発することができるということは
認識されるべきである。

このようにして生成したオリゴヌクレオチドプローブは
、プラスミドとバクチリオフ？−ジｃＤＮＡライブリイ
の両者を選別し、α−アミド酵素ｃＤＮＡを単離するた
めに、うまく確立された方法（Ｈｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　１９８２年参照）に使用された。

第■表 この表は、α−アミド化酵素蛋白質の選択された領域に
対応する可能性のあるすべての遺伝子配列を示す。設計
した配列の下に、ｃＤＮＡの同定と単離に有用な、遺伝
子と相補的なオリゴヌクレオチドプローブをいくつか示
す。

（以下余白次頁につづく） トリプシンの消化ｋ ＡＡ善：　　　　　　　　　　　　　　　１２３配　　
　　列　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｓｎ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｎ計画された遺伝子配列　　　　　　５′
ＡＡＴ　ＧＧＣＣＡＧ ＡＭ ■ オリゴヌクレオチドプローブＡＥ４　３’ＴＴＡ　ＣＣ
Ｇ　ＧＴＣ ＧＴＴ オリゴヌクレオチドプローブＡＥ５　３’ＴＡＡ　ＣＣ
Ｇ　ＧＴＣ ＡＴ 二よって生成したビーク婁５８ Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ３′ ＴＧＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＡＴＴ　ＧＧＣＣＧＧＴＴＣＣ
ＡＡＡ ＴＡＧＣ ＧＧ　　　　ＴＴ ５゛ ＡＣＣＴＧ ５゛ ＡＣＣＴＧ トリプシンの消化によ； ＡＡ魯：　　　　　　　　　　　　　　　　１２３４配
　　　　列　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓｅｒ
　Ｈｅｔ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。

計画された遺伝子配列　　　　　　５゛ＴＣＣＡＴＧ　
ＣＡＧ　ＣＣＴ ＧＴＡＡ ＾　　　　　Ｃ Ｇ　　　　　　Ｇ オリゴヌクレオチドプローブＡＥ６　３゜ＴＡＣＧＴＣ
ＧＧＩ　ＣＣＩ ■ オリゴヌクレオチドプローブＡＥ７　３゜ＴＡＣＧＴＣ
ＧＧＩ　ＣＣＩ ■ オリゴヌクレオチドプローブＡＥ１０ オリゴヌクレオチドプローブＡＥ１１ νで生成したピーク＃６５ Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｐ
ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ３゛ ＧＧＣＴＣＴ　ＧＡＣＣＡＧ＾＾ＣＣＡＣＴＴＣＴＣＣ
ＣＡＧ　ＣＣＣＡＣＴＡＡＧＣＴ　　　　＾　　　ＴＴ
Ｔ　　八ＧＴ　　　　Ａ　　　　Ｔ　　　　ＡＧＡ　　
　　　　　　　　　　Ａ　　　　ＡＣＴＧ　　　　　　
　　　　　　Ｇ　　　　ＧＧ５゜ ＡＧＩ　ＣＴＧ　ＧＴＣＴＴ Ｔ ５゜ ＴＣＡ　　ＣＴＧ　　ＧＴＣＴＴ ＣＡＴ ３°　　　　　　　　　５゛ ＣＴＧ　ＧＴＣＴＴＧ　ＧＴＧ　ＡＡ Ａ　　　　ＡＡ ３°　　　　　　　　　５゜ ＣＴＧ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　　　　ＡＡ へ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　いコ ム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Φく ト く　−−六 く幅　ＩＩＩｃＬ 大Ｊ１九旦 １１匹のＢａ１ｂ／ｃＪマウスを、アミド化酵素の精製
製剤によって、免疫性とし次いで追加免疫化処理をした
。これらのマウスから採血し、血清をとり、エリザ検定
法（ＥＬＩＳＡ　ａｓｓａｙ　）によって、精製酵素に
対して滴定した。この検定法は（採用された方法は十分
に確立されている）、精製酵素をポリスチレンのプレー
トに吸収させ、次に洗浄し、（抗体がプレートに異質の
結合をするのを防止するために）ウシ血清アルブミン（
ＢＳＡ）でブロックすることによって実施した。次に希
釈したマウスの血清（アミド化酵素に対する推定上の抗
体を含有する）を、アミド化酵素で被覆したプレート上
で培養し、洗浄した。第２の抗体（マーカーのアルカリ
性ホスファターゼで標識化されている。この標識によっ
て、第１抗体が、プレートに結合した酵素と結合したの
を容易に確認できるようになる）を次にウェル内で培養
した。洗浄して基質溶液を添加した後、信号を、分光光
度計のレコーダによって比色によって監視した。“陽性
゛°の血清は、少なくとも２：１のＳ／Ｎ比を示した。

マウス＃７は、エリザ法において高い滴定値を示したが
、最後の追加免疫化を行ってから４日後に殺した。牌臓
を無菌的に取出し、（機械的に破砕し）牌臓５ｔｕ１を
剥離させて合計１３２．６Ｘ　１０６個得た。これを、
１．２８　ｄのＰＥＧ　　（ポリエチレングリコール）
　　４，０００を用いて、１２２．８Ｘ　１０６の８３
−１骨髄腫細胞と融合させた。得られた細胞を、予めＢ
ａ１ｂ　／ｃＪ胸腺細胞と牌臓細胞とで被覆された、５
枚の２４ウエルプレートに分配した。これらの細胞は支
持細胞の働きをする。これらＩｌｌ胞は選択ＨＡＴ培地
内で保管した。この培地には雑種細胞だけが生存するこ
とができる。クローンが生育していることを示した１１
Ｇのウェル由来の上澄液を、抗体生産性についてラジオ
イムノアッセイとエリザ法によって選定した。ラジオイ
ムノアッセイは、第２抗体を１２５Ｉで標識をつけるこ
とと放射能カウントをガンマカウンターで測定すること
を除けば、先に述べたエリザ法と類似している。

前記の１１６ウエルのうち５６は、抗体生産性について
陽性であり、次いでα−アミド化酵素に対する反応性に
ついて選択した。α−アミド化酵素に対して陽性を示し
た２５のクローンについて、連続希釈法でクローン化を
行った。初代のクローンがα−アミド化酵素と８ＳＡの
両者に対してスクリーニングされ、初代クローンがアミ
ド化酵素に対して実際に特異的であるのか否かを決定し
たくなおポリスチレンプレートはＢＳＡでブロックされ
ているので、プレートと結合した抗体は、単に結合して
いるのか、または非特異的なしかたでＢＳＡに吸収され
ているのかいずれかである）。α−アミド化酵素に対し
て信号を示すクローンは、ＢＳＡに信号を示すクローン
の少なくとも２倍であるが、１細胞／２ウエルの分配比
でクローン比された。

２１の陽性ハイブリドーマ（第■表参照）が三次のクロ
ーニング段階に導入され、そのうちの２０について、オ
フテルロニー法とエリザ法によって抗体のクラスに関す
る特性決定を行った。１７のクロ−ンが、ＩｇＧ２ａの
Ｈｕ４を有し、３のクローンが１ｇＧ１のＨ鎖を有する
。検出された２０のクローンのすべてが、カッパのＬ鎖
を有する抗体を分泌している。

各細胞系は、バルク培地で別個に培養され、細胞のアリ
コートを液体窒素で凍結した。ブリスタンをプライムし
たＢａ　ｌ　ｂ／ｃＪマウスに５　Ｘ　１０６のハイブ
リドーマ細胞を腹腔内注射した。１週間後、腹水腫瘍の
徴候を示さなかったマウスにはＩ胞の追加免疫注射を行
った。１〜２週間後に腹水と血液を採取した。処理した
後、腹水と血清を選んで、α−アミド化酵素と、負の抗
原（例えばウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カルボ
ニックアンヒドラ−ぜおよび成長ホルモン放出因子）と
に対しで滴定し、抗体特異性を確認した。

第ｍ表 Ｂａ　Ｉ　ｂ／ｃ　　α−アミド化酵素単クり−ン性細
胞系１　腹水を、固相エリザ法で、純粋酵素１００ｕ７
を用いて滴定した。

Ｂ、マウス中に産生じた単クローン性抗体の精製法 前記の方法で作製された、α−アミド化酵素に特異的な
単クローン性抗体は、次のようにして精製した。同じク
ローンを接種した浅凹かのマウスから収集した腹水を抗
体のソースとして使用した。

腹水を１０ｍＨメス緩衝液（ｐＨ５，６）で希釈した（
５倍）。希釈した腹水を、１０ｍＭメス緩衝液（ｐＨ５
，（ｉ）で予め平衡化した４０μｍＡＢＸ混合モードシ
リカ樹脂［ジエイ・ティ・ベーカ−（Ｊ、Ｔ、　Ｂａｋ
ｅｒ）　］の入ったカラム（１，５Ｘ２０ｃ虞）に注入
した。Ｏ−０−５Ｏ０酢酸ナトリウムの勾配液（ｐｌ＋
７．０＞を用いてこのカラムから、単クローン性抗体を
溶離した。精製された抗体を含有する両分を合して比活
性を試験し、使用するまで４℃で貯蔵した。

リビ補強剤（Ｒｉｂｉ　ｏｄｊｕｖａｎｔ　）に含有さ
れている全量的５０μりの精製α−アミド化酵素を、産
卵中の２羽の雌鶏の各々に、静脈注射、筋肉注射、およ
び皮下注射で投与した。リビ補強剤は、鶏のリンパ球に
対するマイトジェンで構成されている、完全に代謝可能
な脂質エマルジョン系のもので、家禽類の抗原に対する
抗体の応答を促進する補強剤である［リビ・インムノケ
ム・リサーチ社（Ｒｉｂｉ　Ｉｒ＋ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　、米国、モンタナ州］。最初
の免疫化の後に、１羽の鶏当り約３０μ９の酵素を２′
ｉｊ４間毎に２回追加免疫の注射をした。

この鶏から２１日目と３５日目に採血し、血清をとり、
特異的抗体が存在しているか否かを下記のようにして検
査した。０日日（免疫化前）、２１日目および３５日目
の両方の鶏由来の血清を、固相エリザ法を用いて１１０
０ｎの精製α−アミド化酵素に対して検査した。ウシ血
清アルブミンを、非特異的抗体結合性の陰性対照物とし
て用いた。酵素特異性の抗体を、ラビット抗チキンＩＯ
Ｇアルカリ性ホスファターゼで標識を付けた血清で検出
した。

上記の方法から得た結果は、鶏２５７の３５日目の血清
中に特異的抗体が検出できたということを示している。

１：　１０，０００に希釈された血清は、約４：１のＳ
／Ｎ比を示した。鶏２５８は、２１日目と３５日目に酵
素特異性抗体を示した。両方の日の血液からの血清を１
　：　１０，０００に希釈したものは約４：１のＳ／Ｎ
比を示した。両方の雌鶏からの卵収集は５６日から始め
た。免疫化前の卵と免疫化後の卵の、ポリエチレングリ
コール（ＰＥｉで沈澱させて単離したＩＯＹを、オフテ
ルロニー法で分析し、酵素特異性抗体をエリザ法で検査
した。

Ｄ、鶏ＩＱＹ抗体の精製 α−アミド化酵素に対して特異性の多クローン性トリ抗
体を上記のようにして層内に生成させた免疫化した雌鶏
の卵を集め、Ｉｏ？の精製のために用いるまでパラフィ
ン中に埋めるか凍結した。卵白を卵黄から分離した。こ
の卵黄がα−式［特異性抗体を含有している。０．１Ｈ
Ｍａｉｌと００１％のアジ化ナトリウムを含有する１０
１１１８リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５＞を用い
て卵黄を３倍に希釈した最初のＰＥＧによる沈澱工程は
、３．５％の最終濃度のＰＧ８０００を用いて行った。

沈澱を室温で３０分間形成させ、次に遠心分離して、上
澄液（１ｌｊＹを含有している）をためた。追加のＰＥ
Ｇを上澄液に添加してＰＥＧの最終濃度を１２．５％に
した。１（ＩＹ抗体がこのＰＥＧ　１度で沈澱し、遠心
分離によってペレット化した。この精製段階での１（Ｉ
Ｙ抗体をさらに二つの方法で精製した。

１）沈澱シタ１ｇＶ抗体ヲ１０１１８）（ス１を前液（
１）Ｈ５，６）に再懸濁させ、次いでこの同じ緩衝液に
対して４℃で一夜透析した。得られた試料を次に４０μ
ｍの混合モードのＡＢＸシリカ樹脂（ジエイ・ティ・ベ
イカー社）の入った　１．５Ｘ２０αカラムに注入。　
　した。続く精製手順は、腹水について記載したのと同
じである。

２）代わりに、Ｉ（ＩＹを含有するベレットを出発の緩
衝液に再懸濁させ、次に飽和５Ａ酸アンモニウム溶液（
３：ＩＶ／Ｖ）を用いて再沈澱させる。Ｉ（ＩＹを含有
するペレットを少量の蒸溜水に再懸濁さ。　　せ、使用
するまで４℃で貯蔵した。鶏ＩＱｙの固定化法について
は実施例１２に記載しである。

実施例９ α−アミド化酵素活性の動力学的研究 発明者らが均質化するまで精製したα−アミド化酵素は
（髄様甲状腺癌腫ＣＡ−７７＠胞の培養物および実験用
ラットから採取した対応する腫瘍組織由来のもの）、不
活性のグリシン延長ペプチドプロホルモンを生物活性を
有するＣ末端アミドに変換する機能を有する。発明者ら
の研究によれば、このプロホルモンのＣ末端アミノ酸は
、酵素がこれを認識して次のようにアミド化するために
は、グリシン残基でなければならない。

アミド化酵素 Ｒ−Ｘ−ＧＩＶ−ＣＯＯＨ＋０２−＋　Ｒ−Ｘ−Ｃ０Ｍ
Ｍ２＋ＨＣＯ−ＣＯＯＨ＋Ｈ２０還元剤　　酸化された
還元剤 ペプチド基質、分子酵素および還元剤（Ｌ−アスコルビ
ン酸）に加えて、この活性を生体外で再構成することが
絶対に必要である。しかし発明者らは、Ｃｕ＋２イオン
（硫Ｉｒｆ４）とカタラーゼを添加すると酵素活性がか
なり増大することを見出したこの外因性の銅が酵素によ
って結合され、分子酵素が結合して活性化させる部位と
して利用される一方カタラーゼは、過酸化水素を除去す
る動きをする酵素であって、これがなければ、酵素、ア
スコルビン酸イオン、銅を含む副反応によって過酸化水
素が蓄積してアミド化酵素を破壊する。

発明者らは、α−アミド化酵素活性を検出するための高
感度の非放射線検定法の開発に成功した。

この検定法には合成のトリペプチド基質の使用が組込ま
れている。これら基質のアミド化反応は、高速液体クロ
マ１−グラフィを用いて、生成物（アミド化ジペプチド
と基質のトリペプチド）を分離・定量することによって
簡便に監視される。開発された検定法中退も高感度なも
のは、モノダンシルＬ−Ｔｙｒ−ＶａへＧｌｙ　＠基質
として使用する方法である。この化合物は、ダンシル基
が螢光を発するので、極端な低濃度でも検出することが
できる。その結果、この検定法の感度は、他の研究所で
開発された類似のｔｌｌ射線検定法の感度に匹敵するも
の。

　である。

発明者らは、この検定法を、α−アミド化酵素。　の動
力学的特性の研究に用いた。特に、）１１度を変化させ
た場合の酵素活性に対する影響を試験することによって
、動力学的パラメータにｍとｖｍａｘを決定した。Ｋｍ
は、酵素が特定の基質に対してもっている親和力の尺度
である。にｍが小さければ小さいほど親和力が大きい。

ＶｍａＸは、酵素が基質を生成物に変換する最大速度で
あり、基質が飽和濃度の場合（すなわら基質が酵素に対
して大過剰に存在している）に観察される。

代表的なアミド化酵素検定法では、反応系（５０μｆＪ
）は、酵素（約７μヒ）、ダンシルＬ−Ｔｙｒ−Ｖａ＋
−ｃｒｙ　　（４０μＨまで）、シーアスコルビン酸（
３＋＋＋Ｈ）、カタラーぜ（０〜１００μｇｍ＋２−’
）および（流酸銅（Ｏ〜２μＨ）を、６０ｍＨテス緩酌
液（ａｌ１７．ｏ）に含有させたものである。反応は、
３７℃で酵素を添加することによって開始つれ、所定の
時間経過後、０．１８　ＥＤＩ＾（最ｎ′ｃＪ度）を添
加して停止される。この［ＤＴＡは銅を覆って酵素が利
用できないようにする。

α−アミド化酵素は、ダンシルＬ−Ｔｙｒ−Ｖａ　ｌ　
−Ｇ　ｌ　ｙの酵素によるアミド化反応に対してにｍが
１〜２μＨの部間にあり高い親和力を示している。この
数値は、酵素の精製状態にかかわらず一定のようである
。従って、セファクリルＳ−３００クロマ１〜グラフイ
によってためた酵素は、ｐＨ８，０の七）Ｑクロマトグ
ラフィ由来の電気泳動上純粋な酵素製剤またはｐｌ＋　
６．０のモノＱクロマトグラフィで分離される低分子吊
型のものと同じにｍを示す。一方、予想されるように、
ＶｆｆｉａＸの数値（１■の蛋白質当りで表わされる）
は、精製の状態でかなり変化する。

セファクリルＳ−３００由来のためた酵素のＶｍａｘは
、１ｆｎ９の蛋白質当り１分間に形成された生成物が約
５０〜１００ｎ　ｍｏｌであるという値であるが、純粋
の腫瘍酵素のｖｍａｘは、１　ｍｙ蛋白質当り形成され
る生成物が約５，０ＯＯｎ　ｎｏｔであるという数値で
ある。

発明者らは、アスコルビン酸イオンと［１が、いくつか
の条件下で、酵素に対して互に競合するということを見
出した。例えば、基質の濃度が、飽和濃度を超えて実質
的に増大すると、酵素とアスコルビン酸間の相Ｈ作用が
減退して酵素活性が低下する。このように、各特定の基
質について、基質／アスコルビン酸の最適濃度に適切な
バランスが存在１）、しからこのバランスが酵素の特定
の基質に対する親和性によってきまるようである。

アミド化酵素のグリシン延長ペプチドに対する親和力 発明者らは、アミド化酵素といくつかのグリシン延長ペ
プチドプロホルモンとの反応の感受性プローブとして、
モノダンシルＬ−Ｔｙｒ−ＶａへＧｌｙのアミド化反応
の検定法を用いた。この研究の目的は、酵素が、結合す
るある種の異なるタイプのペプチド基質に対する相対的
親和力を試験することにある。発明者らは、すでに、ヒ
トカルシトニンのグリシン延長前駆体基質およびヒ］・
成長ホルモン放出因子を、酵素によってアミド化するこ
とに成功したことを示したが、これらのペプチドまたは
互いに関連のある他のペプチドと優先的に結合する、酵
素の性能については何も述べていない。

発明者らは、グリシン延長α−メラニン細胞刺激ホルモ
ン、サブスタンスＰ１バソプレッシン類似体および成長
ホルモン放出因子が、高い親和力でアミド化酵素と相互
に作用し、酵素がダンシルＬ−１ｙｒ−ＶａへＧｌｙを
代謝するのを阻害するのを示した。さらに、グリシン延
長ヒトカルシトニンの五つのＣ末端アミノ酸残基に対応
するペンタペプチドモデル、神経ペプチドＹ１コレシス
トキニン、コルチコトロフィン放出因子およびカルシト
ニン遺伝子関連ペプチドは、この検定法で競合性を示す
。換言すれば、この酵素は、これらのグリシン延長ペプ
チド基質のすべてと結合しておそらくアミド化する性能
を有すると考えられる。

これとは対照的に、これらの基質に対応するアミド化さ
れたペプチドを試験したところ、この酵素とほとんど反
応できないことが見出された。この酵素の触媒部位は広
範囲のグリシン延長基質を認識する性能を有するので、
この酵素は、組換えＯＮへ技術で精製したペプチドプロ
ホルモンを商業的にアミド化するのに非常に有用な汎用
試薬になるにちがいない。

実施ＰＡｌＯ 第■ビークのα−アミド化酵　をコードするＤＮＡ配列
の単離 １１ＮＡの製造 全ＲＩＩＡを、グアニジンチオシアネート法を用いて、
ラットＨＴＣ細胞から調整した。ポリＡ　ＲＮＡをオリ
ゴｄＴセルロースで選別した。

ｃＤＮＡの合成 二重鎖ｃＤＮＡを公知の方法で製造した。鋳型としてラ
ットＨＴＣ組織由来のポリＡ　ＩＩＮＡを用い、プライ
マーとしてはオリゴｄＴ　１２−１８を用いて、第１鎖
の合成を逆転写酵素との酵素反応で実施した。ＣＤＮＡ
とＲＮＡを分離し、ＩＩＮＡをアルカリで分解した。

ＣＤＮＡの第２１１の合成は、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて自己感作させて
行った。ＣＤＮＡ中のヘアピンループを除き、かつｃＤ
ＮＡのいずれの一重鎮領域も分解するために８１ヌクレ
アーゼによる消化法を採用した。ＯＮへポリメラーゼＩ
と反応させて、ｃＤＮＡにフラッシュ末端を生成させた
後、その二重鎖ｃＤＮＡを、Ｅｃｏｌ１１メチラーゼと
Ｓ−アデノシルメチオニンとで処理しＥＣｏＩｔｌ部位
をメチル化して、その部位を以後の酵素による切断から
保護した。ＥＣ０Ｉｔｌ　リンカ−をｃＯＮＡに連結さ
せた。ＥｃｏＲ１消化後、過剰のリンカ−をｃＯＮＡか
ら除去し、ｃＤＮＡをセファロース４Ｂカラムによって
サイズ分画した。−回のこのような合成で、５（１０塩
基対を超える大きさの分子を集め、２回目の合成で１，
０００塩塁対よりも大きい分子をためてクローニング用
とした。

２０口１　ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーの構築リンカ−で改変
して二重鎖ｃＤＮＡを合成した後、その分子をλ９０１
内にｃＤＮＡライブラリーを生成させるのに用いた。こ
の処理は、予めＥｃｏＲｌで切断し、ホスファターゼで
処理してベクターＤＮＡの自己連結を防止したλｇｔ１
１にｃＤＮＡを連結さゼることによって実施した。この
ＤＮＡの連結反応に続いて、組換え体ＤＮＡを生体外で
パッケージして感染性バクテリオファージの粒子を作製
した［パッケージング用のエキストラクトは、プロメガ
・バイオチック社（ｐｒｏｍｅｇａ　８ｉｏｔｅｃｈｌ
またはりｏンテツク・ラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ　Ｌａ１ｌＯｒａｔＯｒｉＯ８）から市販されており
、また標準方法で作製することもできる１゜ ＤＮＡをパッケージした後、パッケージング混合物のア
リコートを試験してライブラリー中の組換え体の数を決
定した。ライブラリーの一つに、約２．５７　ｘ１０６
の感染性粒子が含有されていることが見出され、その約
７８％が見掛は組換え体（ＩＰＴＧの存在下で培養する
とＸ−Ｇａ１プレート上に透明なプラークを与える）で
あった。他のライブラリーは、合計的２．７５　ＸＩＯ
のプラーク形成単位を有し、はぼ８１％が見掛は組換え
体であることが見出された。

ライブラリーの選別 どの組換え体バクテリオファージが、α−アミド化酵素
蛋白質に対するｃＤＮＡを含有しているかを固定するた
めに、α−アミド化酵素の特異的アミノ酸配列に基づい
て段別され、放射線標識がなされたオリゴヌクレオチド
プローブを用いて、ファージを選別した（実施例７、第
■表参照）。選別は、バクテリオファージの試料をブレ
ーティングし、そのファージをニトロセルロースフィル
ターのディスクにのせる。ファージの二１〜口セルロー
スフィルターへの固定化法は広く知られている。

各プレートからの２枚のフィルターを、３２Ｐで標識を
つけたオリゴヌクオチド＾［９と雑種形成させた。雑種
形成反応は、６ＸＮＥＴ、０．５％ＮＰ４０．５Ｘテン
ハルト溶液、１００μｇ／Ｉｄサケ精液ＤＮＡ中、０．
３〜０．４ｐｍｏｌ／　蔵のオリゴヌクレオチドプロー
ブとともに、３７℃で２０〜２４時間実施した。雑種形
成反応後、フィルターを、ＳＣＣ中４４〜４５℃で数時
間づつ６回洗浄し、Ｘ腺フィルムに暴露させた。確実に
雑種形成がなされている）７−ジが、２枚のフィルター
上に完全に一致したスポットとして固定された。これら
のファージを何回かのブレーティングと雑種形成を通じ
て連続的に濃縮して精製した。選別された約４〜５　Ｘ
　１０’のファージから、１８がＡＥ９によって固定さ
れた。

選別に特異性を与えるために、第２のα−アミド化酵素
オリゴヌクレオチドＡＥ８との雑種形成を行った。この
ブロービングによって、１８のファージ中少なくとも４
のファージが、α−アミド化醇素蛋白質配列に対するｃ
ＤＮＡをもっていることが分かった。この知見は、ＤＮ
Ａ配列分析のみならず、追加の特定のオリゴヌクレオチ
ド雑種形成反応によっても確認された。

α−アミド化酵素の発現 発明者らが蛋白質配列を決定した第■ピークα＾Ｆは、
約７５，０００ダルトンの分子量を有する。一つのアミ
ノ酸の平均分子量が１２０ダル！・ンとすると、アミド
化１素は６２５個までのアミノ酸をもっていることにな
る。６２５個のアミノ酸に対する遺伝子は、少なくとも
１，８７５個の塩基対をもっていなければならない。発
明者らが、アミド化酵素特異性であるとして単離した四
つのｃＤＮＡはすべて、α−アミド化酵素蛋白質を完全
にコードするのに十分に大きなものである。ＣＤＮＡク
ローンの一つであるλ＾Ｅｌ　４よ、約　２，２００個
のヌクレオチドの長さを有する。このクローンは、一端
から最初の５０箇のヌクレオチドまでの間で、第■ビー
クの酵素のアミン末端として固定されたアミノ酸配列を
コードし始める。それ故に、このｃＤＮＡは、第■ビー
ク酵素として必要な全コーディング容量を有していると
推測することができる。、前記の２，２００個の塩基対
（ｂｐ）を有するＣＯＭＡの両端に、上記の情報とヌク
レオチド配列があると仮定すれば、このｃＤＮＡを、発
現クローニング用にイー・コリのような原核生物の宿主
に適用することは、比較的簡単なことである。

λＡＥ１　ｃＤＮＡに適用する可能性のある一つの方法
を第２２図に要約した。例えば、組換え体バタテリオフ
ァージＤＮＡのＥｃｏＲｌによる消化とアガロースゲル
の電気泳動に続いて、２，２００個の塩基対挿入ｃＤＮ
ＡであるλＡＥＩが単離される。これが、ＰＢＲ３２２
のＥｃｏＲ１部位にクローンされ、プラスミドｐＡ［８
−１が生成する。Ｉ）ＡＥ８−ＩＧ；！、ｃＤＮＡ配列
中ニ唯一ノにｐｎｌｎｌ部所部位し、またｐＢＲ３２２
配列内には唯一の旧ｎｄ１１［部位を有する。ｐＡＥ８
−１をにｐ旧と１ｌｉｎｄｌｌで消化することによって
、（前記ｃＤＮＡのアミノ末端のコーディング端におい
て）　ｃＤＮへの約６２個の塩基対を失った約２．　ｔ
５ｋｂの断片が得られる。ｍｍピークのアミド化酵素の
アミノ末端において見出されたアミノ酸を構築しなおし
て、このｃＤＮＡを発現プラスミドにクローニングでき
るように改変するために、にｐｎへ旧ｎｄ　ｍ末端断片
をオリゴヌクレオチドリンカーアダプターに連結した。

示した実施例では、ファーマシア社から購入したイー・
コリ発現プラスミドｐｋｋ２３３−２を用いている。２
．１５ｋｂのｃＤＮＡ断片を ＡＥ１７（＋１３０”ＣＡ丁ＧＴＣ＾ＴＴＴＴＣＣＡＡ
ＴＧ＾＾ＴＧＣＣＴＴＧＧＴ＾ｃ３’および 山８（−）２２”ＣＡＡＧＧＣＡＴＴＣＡＴＴＧＧＡＡ
Ａ＾ＴＧＡ３’からなる二重鎖リンカ−アダプターに連
結する。

次に、改造された断片を、予めＮＣ０ＩとＨｉｎｄｌｌ
ｌによって切断されたプラスミドＩ）ｋｋ２３２−２　
ＤＮＡに連結された４、　６ｋｂの線上ベクタを得る。

連結された生成物、ｐＡＥ１２は、ＡＴＧ出発コドンと
、リポソーム結合部位と、ハイブリッドの制御下にある
ＩＰＩＧ誘導プロモーターのｔｒｃ、とで先導された、
α−アミド化酵素のｃＤＮＡを含有している。この遺伝
子には、５ＳＲＮＡ遺伝子と転写終結部位が続いている
。ｐＡＥ１２のＩＰＴＧ誘導発現は、このプラスミドＤ
ＮＡを、１ａＣ１ｑ遺伝子型を有するイー・コリ菌株に
形質転換した後に得られる。

２、２ｋｂの挿入部を、λＡＥ１をＥｃｏＲｌで消化す
ることによって切り取り、これに　Ｐで標識を付した。

１ｌｉｎｅ［で２次消化を行った後、得られた１、６ｋ
ｂと０．６ｋｂの断片を７クサムーギルバーへ化学的分
解法によって塩基配列を決定した。

λＡＥ１のＥｃｏＲｔ末端がら６００ｂｐの断片のマク
サム−ギルバート塩基配列決定法によって得たＤＮＡ配
列は次のとおりである。

λＡＥ−１４７）　ＥｃｏＲｌ　末端／、１　ラ１　、
６００ｂ１１１７）断片（７）　？　りサム−ギルバー
ト塩基配列決定法によって得たＤＮＡ配列は次のとおり
である。

ブＯ−ブ４Ｅ８　（Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−１１ｅ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＶａへＴｈｒ）を生成させるのに使用
したアミノ酸と、λ＾［１の６００ｂｐの断片の部分［
ＩＮＡ配列の翻訳との間の相同性についてコンピュータ
による調査を行った完全相同の領域が得られた。そして
この領域には、そのＤＮＡ配列とアミノ酸の大文字の上
部に星印を付けて明示した。精製アミド化酵素の、に１
１２−末端配列決定法によって固定されたアミノ酸は括
弧内に入れた。ＤＮＡ配列によって予測された割当て位
置と異なることが見出されたアミノ酸の割当て位置は°
゛＋°゛で示した。

Ｌｐｖｆｋｒｆｋｅｔｔｒ（ｓｆｓｎｅ★★＊☆★★★
宵★☆★★★＊★★責★＊責★★ａｌｄｉｒｍｐ）ｇｖ
ｔｐｋｅｓｄｔｙ＋ ｆｌｈｖｈａｓｔ。

α−八への精製 固定化する前に、α−アミド化酵素を、弱アニ０　　オ
ン交換クロマトグラフィとゲル濾過クロマトグラフィに
よって精製した（実施例４）。いくつかの場合には、酵
素製剤を、インムノアフィニティクロマトグラフィまた
はフェニルセファロースクロマドグラフィを用いてさら
に精製した。次の固定化工程は精製工程に影響されない
が、通常、比活性は少なくとも２５ｆｆｉＵでなければ
ならず、５０ｍＵ以上が好ましい。

α−ＡＥの固定化 α−アミド化酵素の固定化技術は、３成分すなわち酵素
、アクリルアミドの水溶性コポリマー（ＰＡＮ）および
低分子量の架橋剤（ＴＥＴ）の並発反応に基づく技術で
ある。予め作製されたポリマー（ＰＡＮ）は、テトラヒ
ドロフラン（ＴＨＥ）溶液中、アゾビス（イソブチロニ
トリル）を用いて熱で重含をを開始させて重合させた、
アクリルアミドとＮ−アクリルオキシスクシンイミドと
で構成されている。

架橋剤は、α、Ｗ−ジアミン、トリエチレンテトラミン
（ＴＥＴ）　、シスタミンであってもよい。ジアミンと
、ＰＡ１４の活性エステル基との反応によって、ポリマ
ー鎖が、アミド結合によって架橋結合し、不溶性のゲル
を形成する。酵素のアミノ機能［好ましくは、リシン（
ｌｙｓｌのε−アミノ基］が、同時にゲルの残留活性エ
ステルと反応して安定な共有アミド結合を形成する。固
定化処理は基質と補因子の存在下で行われる。高親和力
の基質と補因子がｋｍ、：り大きい濃度で存在すると、
ＰＡＮの活性エステルと、酵素の触媒部位またはその近
傍の求核基との反応を阻害して、酵素が化学的に失活す
るのを防止する。

固定化の条件 精製が完全でないα−八へを、３０ｍＭへペス緩衝液（
＋）Ｈ７，０）に可溶化した。ＰＡＮとＴＥＴの比は、
α−アミド化酵素に対する結合部位として働く活性エス
テルが１５％未反応のままで残るように設定される。標
準のＰＡＮ溶液は２０％（Ｗ／Ｗ）である。α−アミド
化酵素の反応混合物は、０．２μＨＣａ５ｏ４．４０μ
Ｍダンシル旧５−Ｐｈｅ−Ｇ［Ｙ１１０ｍＨアスコルビ
ン酸イオンおよび０．５〜２．０ｍｇ（Ｘ　−ＡＥ／（
ｌ　ＰＡＮで構成されている。ＴＥＴの濃度は、第一ア
ミンの当量／活性エステルの当量の数値０．８５に等し
いように算定される。通常、最適条件を決定する目的で
、ゲル化時間を設定するために酵素なしの反応が行われ
る。すなわちこのゲル化時間は、ＴＥＴ添加後に続くゲ
ル形成を達成するのに必要な時間である。

α−アミド化酵素の固定化に対する最適の収量は、酵素
の添加をゲル化点の一層近傍に移した場合に得られる。

−殻内な法則は、酵素がゲル形成前にＰＡＮにさらされ
る時間が短ければ短い程、活性固定化酵素の収市が高い
ということである。はと／υどの反応に対して、α−Ａ
Ｅ（約２．０Ｒｇ／　ｇＰＡＮ　）は、ＴＥＴ添加して
から４５〜６０秒後に添加される。

この酵素含有ゲルは、室温で約１時間静置させ、カップ
リング反応を完了させる。６０分後にゲルを乳鉢ですり
つぶして平均の大きさが１００μの断片が得られる。こ
れらの粒子をｆＸｔＭアンモニウムで洗浄して未結合の
反応体を除去し、次に残留活性エステル基をアミド基に
返還することによって反応性の基のキトツピング（Ｃａ
ｐＤｉｎＯ）を行う。固定化後の活性α−アミド化酵素
の収率は、６０％より低いと予想される。固定化後の洗
浄水には、出発時の活性の３０〜４０％が含まれている
。α−アミド化酵素は、洗浄水の硫酸アンモニウムの濃
度を４５％にまで増大して活性α−アミド化酵素を沈澱
させることによって洗浄水から回収することができる。

固定化されたゲル粒子は、粒子が機械的撹拌礪によって
懸濁されているバッチ式α−アミド化反応に好適である
。その酵素反応が完了した後、粒子を沈降させ、アミド
化ペプチドの生成物を含有する上澄液をデカントする。

この方法は大規模な反応には不適である。酵素を含有す
るゲル粒子は、カラムに充填して合理的な流速を得るの
に十分な、はどｌＩ！質ではない。この問題点を回避す
るのに二つのかわりの方法が可能である。

１、ゲルをガラスピーズの存在下で重合させるが、一般
に、ゲル化点の一分曲に、ガラスピーズを反応混合物に
添加し、該ビーズがＰＡＮ溶液の層で覆われるまで機械
的攪拌−で攪拌される。この複合物質の流動特性は、ゲ
ル粒子だけのそれよりもはるかに侵われている。

２、代りに、ＰＡＮ粒子を、濾過助剤のセライト５４５
（Ｃｅｌｉｔｅ　５４５）と混合する。一般に、ＰＡＮ
どセライトの混合物は、ＰＡＮが混合物の８％訂−（乾
燥重量）を超えない構成で製造される。この種のカラム
を作るために、ゲル粒子を５０ｍＨトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，０）中に懸濁さけ、次に絶えず攪拌しながらセ
ライト　５４５を添加し、２時間混合する。

カラムにこのスラリーを充ｌ眞しく３Ｘ４０ｃｍ）、カ
ラム温度を３７℃に保持してアミド化反応を容易に行わ
させる。この方法を用いる場合、　流速を８〜１０Ω／
日に保持する。

カラムクロマトグラフィに代わる興味深い方法は、接線
流システムを利用する方法である。ゲル化点前のＰＡＮ
ポリマーを、０４５μｍの細孔を有する１枚のポリスル
ホンの支持体上に注ぐ。ゲル形成後、このシートは、ミ
リボール（Ｈｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｒｅ）またはニューブ
ランズウィック（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）の接線
流限外濾過装置に合わせて裁断することができる。この
設計では、ポリスルホン−ＰＡＮ固定化酵素ゲルの複合
シートを復数層重ねて表面積を著しく増大させることが
できる。この方法は、１分間当り数ρもの流速まで直接
スケールアップすることができる。またこのタイプのシ
ステムは、反応混合物を循環して、ペプチド基質のアミ
ド化を最大にする簡便な方法を提供する１゜ α−アミド化酵素の固定によって与えられる利点には、
酵素の回収と再使用が含まれる。第２に、固定化された
マトリックスが、酵素の安定性を増大し、長期間にわた
る大規模なアミド化反応（ｇ〜Ｋｙ単位の基質最）が可
能な酵素の作動形態が提供される。

実滴例１２ Ａ、固定化方法 使用した固定化マトリックスは、臭化シアンで活性化し
たセファ０−ス４Ｂ（）７−マシア社）テあった。乾燥
ゲルをまず１１Ｈ塩酸（２００ｒｄ、”ｉ樹脂）で洗浄
して、固定の支持体を膨潤させて洗浄した。鶏の卵黄由
来の精製多クローン性抗体の約４０■ヲ、０．５ＨＮａ
Ｃ１を含有すル１００８　ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８，３）
に対して透析した。カップリングを、予め膨潤させ洗浄
した固体支持体の８ｄを用いて行った。この反応は、５
００ｍＨＭａｉｌを含有する１００ｍＨ重炭酸ナトリウ
ム！１衝液（ｐＨ８，３）中、室温で３時間行われたが
、このＮａＣ１は、蛋白質が固体の支持体に非特異的に
結合するのを減少させるために添加されている。ゲルの
残留活性基を０．２Ｈのグリシンを用いてブロックした
。このプロツキング工程に続いて、高いｐｌ＋と低いｐ
Ｈの！ｌ衝前液ザイクル（高ｐｌ＋緩衝液：　　１００
ｎ＋ＨＮａＨＣＯ３（ＤＨ８，３）＋５００ｍＭ　Ｎａ
Ｃｌ　；低ｐｔｌ緩衝液：　１００ｍＭ　＃＠緩衝液（
１）１１４．０）＋５００ｍＭ　ＮａＣ１）を用いてゲ
ルを洗浄した。この洗浄工程で、すべての未結合蛋白質
とブロッキング剤（グリシン）とを樹脂から除去した。

このインムノアフィニティ樹脂を、静菌剤としてのマー
チオレートを含有するアルカリ性ｐＨの緩衝液に４℃で
貯蔵した。その後のインムノアフィニティクロマトグラ
フィはすべて４℃で行われる。類似の方法も精製された
単クローン性抗体を固定化するのに用いることができる
。

Ｂ、インムノアフィティクロマトグラフイα−八Ｅの精
製に、代わりの高効率の工程としてインムノアフィニテ
ィ力ラムが用いられる。ＣＡ−７７細胞由来の組織培養
物（実施例４参照）を蒸溜水で希釈し、２０ｍＨビス・
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６，０）で予め平衡化したＤ
［ＡＥアニオン交換カートリッジをポンプを用いてて通
過させた。５００ｍＭ　ＮａＣ１を含有する５０ｍＨト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）によってカートリッジか
らα−アミド化酵素を溶離した。α−ＡＥ活性を有する
両分を、インムノアフィニティクロマトグラフィにか１
Ｊる前に、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透
析するが、またはゲル濾過クロマトグラフィ（実施例４
）を用いて精製する。α−ＡＥを含有する試料を、中性
ｐｌ＋でインムノ吸着カラムを通過させた。抗体がα−
アミド化酵素と特異的に結合し、一方汚染山白質は結合
せず溶出液中に放出される。α−酊活性が、１００ｍＭ
グリシンＦＡＩ！１緩衡液（ｐｌ＋３．０）を用いてカ
ラムから溶出される（尿素、ジオキサン、エヂレングリ
コールおよびＮａｌを含む他の脱着剤を用いてもよい）
。両分を、１．０Ｈトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）中
に集めてその緩衝系を中和してα−ＡＥ活性を保持する
。

【図面の簡単な説明】

第１図から第５図は実施例１に関係するグラフ図であり
、第６図から第１２図は実施例２に関係する説明図並び
にグラフ図であり、第１３図から第１６図は実施例３に
関係する説明図並びにグラフ図であり、第１７図から第
２１図は実施例４に関係する説明図並びにグラフ図であ
り、第２２図は実施例１０に関係する説明図であり、第
２３図は実施例６に関係するグラフ図である。 ばか１名 図面の淳書（内容：こ変］なし） 一一一：ｚ：コヒ１ ４ｒが醤号 二Σ＝＝又Ｅ −二三：＝シー ＭＷｘｌＱ　　　　　　Ｉ　　２ 三ヲ ＺＸ二−ノＥ 會＆によｐ−Ｒ＃え停りＥトつ力Ｉレントニ／（Ａ（ニ
ア）つア之ノ漬（ゑＬ久−７＝ミヲーｊｌテ 扇方青号 Ａり８〜ｍ（−） ２ノトイ４　Ｘ／（）　′Ｊ（ｒｈ／２．！／Ｍ／　）
　　　　　（−１ＡつＱｒｋｎｈ　←−→ ｊＡ；−ｆｌ　　メ／（）　−’（ａｎ／１５　／／Ｉ
＋／　）　　　　　（ヨｌ方＋１ Ｊノｇｓ１０−’（ｐｍｏ／ｓユ、へ例／アツ２イクｐ
Ｈ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１個のα−アミド化酵素を含んで成り
   、酸素および還元剤の存在下で、そのペプチド鎖の少な
   くともＣ−末端においてグリシン残基を有するペプチジ
   ル化合物から前記Ｃ−末端グリシンの代わりにアミノ基
   を有する対応するペプチジルアミド化合物への変換を触
   媒することができる酵素組成物において、前記酵素組成
   物はα−アミド化酵素において十分に純粋であって、前
   記酵素組成物中に存在する蛋白質のｍｇ当たり少なくと
   も約２５ｍＵの特異的活性を示し、そして前記酵素組成
   物は、前記ペプチジル化合物、前記対応するペプチジル
   アミドおよび前記α−アミド化酵素から成る群から選択
   される少なくとも１種類を分解することができる蛋白質
   分解活性を殆ど含んでいないため、前記ペプチジル化合
   物がＬ−アミノ酸を含んで成る場合前記組成物をして前
   記変換を触媒させることを特徴とする酵素組成物。
2. （２）ペプチジル−グリシン−α−アミド化モノオキシ
   ゲナーゼを含有し、ペプチド鎖の少なくともＣ−末端に
   おいてグリシン残基を有するペプチジル化合物から前記
   Ｃ−末端グリシンの代わりにアミノ基を有する対応する
   ペプチジルアミドへの変換を触媒することができ、前記
   ペプチジル化合物は天然供給源から精製されるか、組換
   えＤＮＡ技法によって生成される均質に精製されたもの
   である酵素調整物において、前記調整物中に存在する蛋
   白質のｍｇ当たり少なくとも約２５ｍＵの特異的活性を
   示し、そして前記精製された酵素生成物は、前記ペプチ
   ジル化合物、前記対応するペプチジルアミドおよび前記
   α−アミド化酵素から成る群から選択される少なくとも
   １種類を分解することができる蛋白質分解活性を殆ど含
   んでいないため、前記ペプチジル化合物がＬ−アミノ酸
   を含んで成る場合前記組成物をして前記変換を触媒させ
   ることを特徴とする調製物。
3. （３）少なくとも１種類のα−アミド化酵素であって、
   酸素および還元剤の存在下で、少なくともそのＣ−末端
   においてグリシン残基を有するペプチジル化合物から前
   記Ｃ−末端グリシンの代わりにアミノ基を有する対応す
   るペプチジルアミドへの変換を触媒することができるも
   のを生成する方法において、前記α−アミド化酵素を含
   む組成物に対し、見掛け分子量約５８，０００乃至約６
   ７，０００ダルトンを有する蛋白質種を分離させること
   ができるサイズ排除クロマトグラフィーおよび前記α−
   アミド化酵素を結合させることができる陰イオン交換樹
   脂を利用する強力陰イオン交換クロマトグラフィーの両
   者を施す工程と、α−アミド化酵素を塩溶液をもって溶
   離させる工程とを含んで成ることを特徴とする方法。
4. （４）天然または組換え供給源から少なくとも１種類の
   不純α−アミド化酵素を収集する工程と、前記不純酵素
   に対し、見掛け分子量約５８，０００乃至約６７，００
   ０ダルトンを有する蛋白質種を分離させることができる
   サイズ排除クロマトグラフィーおよび前記酵素を結合さ
   せることができる陰イオン交換樹脂を利用する陰イオン
   交換クロマトグラフィーの両者を施す工程とを含んで成
   り、この場合α−アミド化酵素が前記陰イオン交換樹脂
   から濃度２５０ｍＭを有する塩溶液により溶離され、こ
   こで前記溶離された酵素は十分に純粋であって、前記組
   成物中に存在する蛋白質ｍｇ当たり少なくとも約２５ｍ
   Ｕの特異的活性を示すことを特徴とするα−アミド化酵
   素組成物の有効な調製方法。
5. （５）請求項１記載の酵素組成物を提供する工程と、ペ
   プチド鎖の少なくともＣ−末端においてグリシン残基を
   有するペプチジル化合物を、酵素的有効量の前記組成物
   の存在下、前記ペプチジル化合物を前記Ｃ−末端グリシ
   ンの代わりにアミノ基を有する対応するペプチジルアミ
   ドへ変換させるに足る時間に亙り反応させる工程とを含
   んで成ることを特徴とするα−アミド化ペプチジル生成
   物の製造方法。
6. （６）少なくとも１種類のカルシトニン種のアミノ酸シ
   ーケンスに対応するアミノ酸シーケンスを含む基質を提
   供する工程であって、前記基質シーケンスはそのカルボ
   キシル末端にグリシン残基を有するものと、次いで前記
   基質を、少なくとも１個のα−アミド化酵素を有するα
   −アミド化酵素組成物の存在下で反応させる工程であっ
   て、前記組成物は酸素および還元剤の存在下で、そのペ
   プチド鎖の少なくともＣ−末端においてグリシン残基を
   有するペプチジル化合物から前記Ｃ−末端グリシンの代
   わりにアミノ基を有する対応するペプチジルアミドへの
   変換を触媒することができ、ここで前記酵素組成物はα
   −アミド化酵素において十分に純粋であって、前記酵素
   組成物中に存在する蛋白質のｍｇ当たり少なくとも約２
   ５ｍＵの特異的活性を示すものとを含んで構成されるこ
   とを特徴とするカルシトニンの製造方法。
7. （７）少なくとも１個の成長ホルモン放出因子種のアミ
   ノ酸シーケンスに対応するアミノ酸シーケンスを有する
   基質を提供する工程であって、前記基質シーケンスは少
   なくともそのカルボキシル末端にグリシン残基を有する
   ものと、次いで前記基質を、少なくとも１個のα−アミ
   ド化酵素を有するα−アミド化酵素組成物の存在下で反
   応させる工程であって、前記組成物は酵素および還元剤
   の存在下で、少なくともそのＣ−末端においてグリシン
   残基を有するペプチジル化合物から前記Ｃ−末端グリシ
   ンの代わりにアミノ基が存在する対応するペプチジルア
   ミドへの変換を触媒することができ、ここで前記酵素組
   成物はα−アミド化酵素において十分に純粋であって、
   前記酵素組成物中に存在する蛋白質のｍｇ当たり少なく
   とも約２５ｍＵの特異的活性を示すものとを含んで構成
   されることを特徴とする成長ホルモン放出因子の製造方
   法。
8. （８）少なくとも１個のカルシトニン遺伝子−関連ペプ
   チド種のアミノ酸シーケンスに対応するアミノ酸シーケ
   ンスを有する基質を提供する工程であって、前記基質シ
   ーケンスはそのカルボキシル末端にグリシン残基を有す
   るものと、次いで前記基質を、少なくとも１個のα−ア
   ミド化酵素を有するα−アミド化酵素組成物の存在下で
   反応させる工程であって、前記組成物は酸素および還元
   剤の存在下で、少なくともそのＣ−末端においてグリシ
   ン残基を有するペプチジル化合物から前記Ｃ−末端グリ
   シンの代わりにアミノ基を有する対応するペプチジルア
   ミドへの変換を触媒することができ、ここで前記酵素組
   成物はα−アミド化酵素において十分に純粋であって、
   前記酵素組成物中に存在する蛋白質のｍｇ当たり少なく
   とも約２５ｍＵの特異的活性を示す（前記酵素組成物中
   の存在により測定されたとき）ものとを含んで構成され
   ることを特徴とするカルシトニン遺伝子−関連ペプチド
   の製造方法。
9. （９）α−アミド化酵素用のコーディングを行うことの
   できるＤＮＡシーケンスを提供する工程と、前記ＤＮＡ
   シーケンスを発現ベクターに結合する工程と、前記発現
   ベクターの形質転換を宿主細胞であって、前記ＤＮＡシ
   ーケンスを発現し得るものに誘導する工程と、前記ＤＮ
   Ａシーケンスを有し、かつ発現する宿主細胞を優先的に
   選択する工程とを含んで構成されることを特徴とするα
   −アミド化酵素組成物の製造方法。
10. （１０）請求項９記載の方法により調製された、少なく
    とも１個の優先的に選択された宿主細胞を含んで成るこ
    とを特徴とする遺伝子工学的に処理された微生物。
11. （１１）少なくとも１個のα−アミド化酵素種であって
    、酸素および還元剤の存在下で、ペプチド鎖の少なくと
    もカルボキシル−末端においてグリシン残基を有するペ
    プチジル化合物から前記Ｃ−末端グリシンの代わりにア
    ミノ基を有する対応するペプチジルアミド化合物への変
    換を触媒することができるものを含んで成り、 前記酵素種は共有結合により直接または間接的に支持体
    に結合されるものであるが、該支持体は単独もしくは他
    の物質との組み合わせにおいてα−アミド化活性の実質
    的損失を伴うことなく、２４時間を超えるグリシン−延
    長ペプチジル基質の連続的な流れに耐えるために十分な
    剛性を有するものとし、ここで前記組成物はα−アミド
    化酵素において十分に純粋であって、前記組成物中に存
    在する蛋白質のｍｇ当たり少なくとも約２５ｍＵの特異
    的活性を示し、 そしてここにおいて前記組成物は、基質化合物、対応す
    るペプチジルアミド生成物およびα−アミド化酵素から
    成る群から選択される少なくとも１種類を分解すること
    ができる蛋白質分解活性を殆ど含んでいないため、前記
    ペプチジル化合物がＬ−アミノ酸を含んで成る場合前記
    組成物をしてα−アミド化反応を触媒させることを特徴
    とする固定α−アミド化酵素組成物。
12. （１２）α−アミド化酵素の不純試料生成用の免疫親和
    性カラムにおいて、前記カラムは免疫親和性樹脂であっ
    て、水性溶液には可溶ではなく、かつα−アミド化酵素
    、グリシン延長ペプチジル化合物または対応するペプチ
    ジルアミドの作用により分解可能ではない固定化マトリ
    ックスを含んで構成され、前記マトリックスは蛋白質を
    結合し得る官能基を有するが、この場合前記基は、α−
    アミド化酵素を選択的に結合するモノクローナルまたは
    ポリクローナルオリジンの抗体に対し、共有的に結合さ
    れることを特徴とするカラム。