JPH06261795A

JPH06261795A - ポリヌクレオチド検出法

Info

Publication number: JPH06261795A
Application number: JP4895593A
Authority: JP
Inventors: Kazunobu Okano; 和宣岡野; Hideki Kanbara; 秀記神原; Keiichi Nagai; 啓一永井; Katsuji Murakawa; 克二村川; Masahiko Sugiura; 正彦杉浦; Toshikazu Yamaguchi; 敏和山口
Original assignee: B M L KK; Hitachi Ltd
Current assignee: B M L KK; Hitachi Ltd
Priority date: 1993-03-10
Filing date: 1993-03-10
Publication date: 1994-09-20

Abstract

(57)【要約】【目的】高感度で精度の高い定量的なポリヌクレオチ
ドの検出法を提供する。【構成】蛍光体が２分子づつ結合した５種の塩基長の
短い蛍光標識プローブ２〜６と標的ポリヌクレオチド鎖
１をハイブリダイゼーション条件下で反応させ、反応液
を電気泳動担体の試料添加部２１に添加し電気泳動する
と分子サイズの小さな未反応蛍光標識プローブ１１は泳
動され除かれる。蛍光標識プローブと標的ポリヌクレオ
チド鎖の複合体１０は分子サイズが大きく、試料添加部
付近に残ると同時に濃縮される。試料添加部を加熱し、
標的ポリヌクレオチド鎖に結合していた蛍光標識プロー
ブ２０が解離し泳動し、蛍光標識プローブが電気泳動担
体の一定部位を照射するレーザー光を横切り螢光を発し
て検出器で検出される。【効果】１００コピーオーダーの標的ポリヌクレオチ
ドが検出できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明の目的は、疾病の原因とな
るウィルス、リケッチャ、細菌等の外来性ポリヌクレオ
チド、あるいは、生物中の特定の遺伝情報を担うポリヌ
クレオチドの有無およびその変異を検出する診断的方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】標的となるポリヌクレオチド（ＤＮＡま
たはＲＮＡ）試料に標識物を結合した標識ポリヌクレオ
チドを会合させる従来のポリヌクレオチド検出法は、プ
ロシーディングスオブナチュラルアカデミーサ
イエンスユーエスエー８０巻（１９８３年）第２
７８頁から２８２頁（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，２７８−２
８２）に記載されている。この方法は、まず、電気泳動
により分子量分離したポリヌクレオチド断片試料をニト
ロセルロース膜に転写して固定した後に、この膜を放射
性同位元素標識されたポリヌクレオチドプローブを含む
溶液に浸してハイブリダイゼーション反応を行う。反応
後、未反応の標識プローブを洗浄により膜から洗い流
す。その後に、膜に結合した残留標識プローブの量をオ
ートラジオグラフィーにより検出することで標的ポリヌ
クレオチドの有無を判定する。

【０００３】また、血液や排泄物等の試料中の細菌やウ
ィルス等の外来性の標的ポリヌクレオチドを検出する方
法が、特開昭５８−３１９９８号公報に開示されてい
る。この方法では、精製した試料中のポリヌクレオチド
を加熱等により変性させて一本鎖とした後、これを、ニ
トロセルロース膜に固定する。次に、検査したい細菌や
ウィルスのポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を持つ
放射性同位元素標識されたポリヌクレオチドプローブを
反応させた後、この膜を洗浄する。もし、試料中に細菌
やウィルスのポリヌクレオチドが含まれていれば、これ
に標識ポリヌクレオチドプローブがハイブリダイゼーシ
ョン反応により会合して膜上に残る。これをオートラジ
オグラフィーにより検出することで標的ポリヌクレオチ
ドの有無を判定できる。

【０００４】また、標的ポリヌクレオチドの特定部分を
一組のＤＮＡプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより増
殖する方法が、特開昭６１−２７４６９７号公報に記載
されている。この方法では、標的となる二本鎖ＤＮＡの
センス鎖とアンチセンス鎖のお互いに２００〜１０００
塩基程度離れた部位に相補的な一組のＤＮＡプライマ
ー、４種のデオキシヌクレオチド３リン酸、耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼを含む反応液に標的ポリヌクレオチドを
を加え、反応液の温度を繰返し上下させ、ポリヌクレオ
チドの変性、標的ポリヌクレオチドとＤＮＡプライマー
とのアニーリング、相補鎖合成反応を繰返すことにより
標的ポリヌクレオチドの特定部位を増殖する。この方法
によれば、４時間程度で特定部位のポリヌクレオチド断
片を１０万倍程度に増幅できる。増幅生成物の検出は、
上記第１あるいは第２の方法、あるいは生成物の量が十
分多いときには電気泳動後にエチジウムブロマイド染色
し、この色素の発する螢光を検出することによる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記第１および第２の
従来技術は、標的ポリヌクレオチドと標識プローブのハ
イブリダイゼーション反応を膜担体上で行っていた。ま
た、標識プローブの標識に放射性同位元素を必要とし
た。このため、標的ポリヌクレオチドの膜担体への固
定、ハイブリダイゼーション反応を個体表面で行うので
反応時間が長い上に、オートラジオグラフィーを必要と
するために分析に通常数日という長時間を要した。ま
た、この方法は検出に長時間を要する上に感度が足りな
い場合がある。これは、トレーサー量の放射性同位元素
しか標識することができないため、プローブ当たりの比
放射活性を高くとれないこと、プローブがニトロセルロ
ース膜に非特異的に吸着することに依存するバックグラ
ンドの放射線が原因である。また、従来法では定量的な
計測は難しくほとんどが標的ポリヌクレオチドの有無の
判定かオートラジオグラムのフィルムの黒化度より半定
量的な測定が行われるにすぎない。さらにオートラジオ
グラフィーを用いるため自動化することが難しく、作業
者が放射線被爆を受けるため、臨床フィールドで多量の
検体を検査するには難があった。

【０００６】上記第３の方法では、標的ポリヌクレオチ
ドの特定部位を増殖出来るものの、検出手段は第１およ
び第２のオートラジオグラフィーを用いる場合が多く、
上記と同様な問題点がある。また、エチジウムブロマイ
ド染色を用いる方法は時間短縮が可能であるが、自動化
には適さない。増殖方法も精密に温度を上下させる必要
がある。反応条件や試料の状態により増幅量が異なるう
え、増幅が非直線的であるために定量測定が難しい問題
点があった。

【０００７】本発明の目的は、第一に、ハイブリダイゼ
ーション反応および検出を短時間で行える高感度で精度
の高い定量的なポリヌクレオチドの検出法を提供するこ
とにある。また、本発明の他の目的は、ポリヌクレオチ
ドプローブの非放射性同位元素化を実現することにあ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的のうち標識プロ
ーブの非放射性同位元素化を実現するために、本発明で
は、標識物に蛍光体を用いることにした。本発明では、
電気泳動と蛍光検出を組み合わせて用いるが、蛍光体の
検出限界は１０^-20〜１０^-21ｍｏｌ／バンドである。遺
伝子診断で検出すべき最小のコピー数は当面１００コピ
ーといわれており、現在の蛍光検出能力を１０倍程度高
める必要がある。そこで、標的ポリヌクレオチドを高感
度で短時間に検出するに当たり、本発明で特に留意した
点は、標的ポリヌクレオチドにいかに多くの蛍光体を導
入するかにあった。そこで、測定対象ポリヌクレオチド
の異なる部位に会合しうる複数の標識プローブを用い、
これを同時に測定対象ポリヌクレオチド鎖に会合させ
る、また、各々の標識プローブには複数の蛍光体が結合
した物を用いる方法を考案した。さらに、高感度検出に
は未反応蛍光標識プローブの除去が重要なポイントとな
る。本発明では、複数の標識プローブを測定対象ポリヌ
クレオチド鎖に会合させた後、標識プローブの結合した
測定対象ポリヌクレオチド鎖と標識プローブを分子サイ
ズで除去する担体を用いて未反応の標識プローブを除去
する工程と、測定対象ポリヌクレオチド鎖に結合した複
数のプローブを変性条件下で解離させる工程を設け、解
離した標識プローブを検出することとした。具体的に
は、ハイブリダイゼーション反応の終了した試料をポリ
アクリルアミド等の電気泳動担体に添加し、電気泳動を
行い未反応蛍光標識プローブを除去する。標的ポリヌク
レオチドとハイブリダイゼーションした蛍光標識プロー
ブは分子量が大きいので電気泳動担体の試料添加部付近
に留まる。次に、電気泳動担体の温度を標的ポリヌクレ
オチドと蛍光標識プローブの複合体の変性温度以上にす
ると、標的ポリヌクレオチドに結合していた蛍光標識プ
ローブが解離し泳動されるようになる。この標的ポリヌ
クレオチドに結合していた蛍光標識プローブを螢光検出
することで達成される。螢光検出は電気泳動担体の一定
部分を照射する光源と検出器を用いて検出する。本発明
では、検出に電気泳動を用いるため、複数の標識プロー
ブの泳動速度が等しく１本のバンドとして検出されるこ
とが高感度化にとって必要である。本発明で使用される
電気泳動は未反応蛍光標識プローブの分離除去用なので
分離能は低くてよい。よって、各標識プローブの塩基長
の違いが１０％以下望ましくは均一の塩基長にすること
で均一のバンドが得られる。また、標識プローブの長さ
はハイブリダイゼーション効率の制約から１２塩基以上
が望ましい。また、電気泳動分離のしやすさや化学合成
の点から、１００塩基以下が望ましい。

【０００９】本発明の概念を、図１の概念図を用いて説
明する。塩基長の等しい複数の蛍光標識プローブ２〜６
と標的ポリヌクレオチド鎖１をハイブリダイゼーション
条件下で反応させる。この時点で反応液中に存在するの
は蛍光標識プローブと標的ポリヌクレオチド鎖の複合体
１０と未反応蛍光標識プローブ１１である。蛍光体が２
分子づつ結合した５種のプローブを用いることで標的ポ
リヌクレオチド１分子に１０分子の蛍光体を導入でき
る。これによりえられる蛍光強度は約一桁向上するの
で、電気泳動と蛍光検出の組合せで１００コピーオーダ
ーの標的ポリヌクレオチドが検出できるようになる。蛍
光検出法をより具体的に述べる。ハイブリダイゼーショ
ンの終了した反応液を電気泳動担体の試料添加部２１に
添加し電気泳動すると分子サイズの小さな未反応蛍光標
識プローブ１１は泳動され除かれる。蛍光標識プローブ
と標的ポリヌクレオチド鎖の複合体１０は分子サイズが
大きいので、試料添加部付近に残ると同時に濃縮され
る。試料添加部を加熱すると、標的ポリヌクレオチド鎖
に結合していた蛍光標識プローブ２０が解離し泳動され
る。解離した蛍光標識プローブが電気泳動担体の一定部
位を照射するレーザー光を横切ると螢光を発し、検出器
で検出される。

【００１０】

【作用】標的ポリヌクレオチド上に相補的に結合しうる
複数の標識プローブと標的ポリヌクレオチドをハイブリ
ダイゼーション条件下で反応させると、標的ポリヌクレ
オチドと標識プローブのハイブリッドが形成される。未
反応標識プローブは前記したように電気泳動で分離除去
できる。標的ポリヌクレオチドと標識プローブのハイブ
リッドは電気泳動中に試料添加部に濃縮される。１つの
標的ポリヌクレオチドに複数の蛍光標識プローブをハイ
ブリダイズすることにより高感度化が可能である。分離
された標的ポリヌクレオチドと標識プローブのハイブリ
ッドを変性温度以上に加熱すると、標的ポリヌクレオチ
ドと標識プローブが解離するので未反応標識プローブか
ら標的ポリヌクレオチドに結合していた標識プローブを
分離して検出することが可能である。

【００１１】ポリヌクレオチドプローブ標識用の蛍光体
としては、ローダミン、フルオレッセイン、４−ニトロ
ベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾール、フタロシア
ニン等とこれらの誘導体、ならびにこれら蛍光体を含む
ポリマーを用いることができる。電気泳動担体の散乱光
の問題から、望ましくは長波長蛍光体がよく、また、励
起用のレーザー光の制約からスルホローダミン１０１と
Ｈｅ／Ｎｅレーザーの組合せがよい。

【００１２】

【実施例】

実施例１本実施例では、標的ポリヌクレオチド試料としてＭ１３
ｍｐ８１本鎖ＤＮＡを用いた。この標的ＤＮＡに相
補的なプローブは、配列番号１、２、３、４及び５のそ
れぞれ２４塩基よりなる一本鎖ポリヌクレオチドであ
る。各プローブは５’末端と１２番目のＴにアミノ基を
介してスルホローダミン１０１が結合している。これら
のプローブは、それぞれ、Ｍ１３ｍｐ８の２００〜２
２３、５１０〜５３３、６２７２〜６２９５、６３１２
〜６３３５、６５６１〜６５８４番目の塩基部分に相補
的に結合する。この螢光標識プローブの調製法を示す。

【００１３】配列番号１〜３の構造の２４塩基のポリヌ
クレオチドをホスホアミダイト法（マックブライド、
エル．ジェー．、カルサーズ、エム．エッチ．、テトラ
ヘドロンレターズ（ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｌ．Ｊ．ａ
ｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．２４，２４５−３
４８（１９８３））に従い合成する。この際、合成の最
終段において、Ｎ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ
−６−オキシ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルアミノホスホアミダイトを反応させてアミノ基を
５’末端に導入する。また、１２番、のチミン残基に
は、ウリジンの５位にアミノ基を導入した式１記載のア
ミノ化チミジンの５’水酸基を４、４’−ジメトキシト
リチル基保護したものを用いる。この構造のアミノ化チ
ミジンはジィフリービー．他、プロシーディングナ
ショナルアカデミーサイエンスユーエスエ（Ｇｅ
ｏｆｆｒｅｙＢ．ｅｔａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２，９６８−９
７２（１９８５））の方法に従い調製する。遊離のアミ
ノ基をトリフルオロアセチル化し、３’水酸基をクロロ
−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィンで
活性化して用いる。上記手法により合成した粗製ポリヌ
クレオチドは３０％アンモニア水に溶解している。氷冷
下酢酸で中和した後２．５倍容量のエタノールを加え合
成ポリヌクレオチドを回収する。沈殿を１ＭＮａＣｌ
に溶解し再度２．５倍容量のエタノールで沈殿させる。
この操作をさらに２回繰り返すことにより、アンモニア
や未反応ヌクレオチド等の低分子の反応夾雑物が除かれ
る。次に合成ポリヌクレオチドを０．５Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９）に溶解し、２５０倍ｍｏｌのスルホローダミ
ン１０１酸クロライドを添加する。スルホローダミン１
０１酸クロライドはあらかじめアセトニトリルに溶解し
て使用するが、アセトニトリルは反応時に２０％前後に
なることが重要である。アセトニトリル濃度が高すぎる
とポリヌクレオチドが沈殿しやすく、低すぎるとスルホ
ローダミン１０１酸クロライドが沈殿しやすくなる。遮
光下１６時間室温で反応させた後、塩酸で中和し、２．
５倍容量のエタノールを加え沈殿を回収する。このよう
にして調製した粗製のスルホローダミン１０１標識プロ
ーブを７Ｍ尿素を含む１９％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により精製する。このようにして調製した標識プ
ローブは電気泳動的に単一バンドの純品である。

【００１４】次に、標的ポリヌクレオチド試料であるＭ
１３ｍｐ８の測定手順を示す。調整した５種の螢光標
識プローブ（各１ｆｍｏｌ）１μｌ（マイクロリット
ル）をいれた図２に記載の反応容器２０１に各種濃度の
標的Ｍ１３ｍｐ８１本鎖ＤＮＡ溶液を１μｌ（マイ
クロリットル）加える。９５℃で３０秒間加熱した後６
５℃で５分間保温する。さらに４５℃で３０分間保温し
ハイブリダイゼーション反応を終了する。次に、反応液
を電気泳動担体２０３に添加する。電気泳動担体は内径
が０．２ｍｍの石英管に１２％のポリアクリルアミドゲ
ルが充填されており、先端の試料添加部から４ｃｍの位
置にＨｅ／Ｎｅレーザーが照射される構造になってい
る。また、レーザー照射部近傍には蛍光検出用の光電子
増倍管が配置されている。ここで、反応容器２０１表面
は電気泳動用の電極を兼ねるために金あるいは白金製で
ある。容器と電極を一体化することで微量溶液でもロス
なく直接電気泳動担体に添加できる利点がある。反応容
器中の反応液に電気泳動担体２０３を図２のように直接
接触させ、容器表面の電極と電気泳動担体の他端との間
に電界をかけると反応溶液中の標的ポリヌクレオチドと
標識プローブの複合体や未反応の標識プローブは電気泳
動担体中に取り込まれる。一定時間後、電気泳動担体の
反応容器側を８９ｍＭＴｒｉｓ−８９ｍＭほう酸、
２．５ｍＭＥＤＴＡからなるｐＨ８．３の電極液を含
む電極槽に入替え、４５℃で電界をかけ続ける。ここで
は電気泳動担体の温度上昇を防ぐため、４０ｖ／ｃｍで
泳動を行なった。約３０分間で未反応の標識プローブは
除かれる。この時点では、標的ポリヌクレオチドと標識
プローブの複合体は電気泳動担体の試料添加部近傍にト
ラップされている。次に、電気泳動担体の試料添加部近
傍を７０℃に加熱する。３０秒間電圧を２００ｖ／ｃｍ
に上げた後、４０ｖ／ｃｍで泳動を続行する。検出器で
検出される蛍光強度の経時変化の結果を図３に示した。
未反応の標識プローブの電気泳動分離バンド３０１とは
明らかに異なる溶出時間に標的ポリヌクレオチドから解
離した標識プローブ由来の電気泳動分離バンド３０２が
検出された。図３ではコントロールとして、５’末端の
みを蛍光標識した配列番号１の標識プローブ１種のみを
標的ポリヌクレオチドに反応させた結果も併せて記載し
た。５種の標識プローブを用いた時に得られる標的ポリ
ヌクレオチド由来の蛍光強度３０２は１種の標識プロー
ブを用いた時の蛍光強度３０３の約８倍であった。本実
施例では、それぞれ２分子の蛍光体が結合した５種の蛍
光標識プローブを用いるので、最大１０分子の蛍光体が
標的ポリヌクレオチドに導入される。本来ならば、従来
法に比べ１０倍の蛍光強度が得られるはずであるが、蛍
光分子間の距離が近いため約２０％の濃度消光が起きて
いると考えられる。

【００１５】本発明を用いれば、強い信号強度が得られ
るので、標的ポリヌクレオチドをより精度良く検出でき
る利点がある。また、ハイブリダイゼーション反応を溶
液中で行なうので反応効率が良く、従来数時間ないし１
日かかっていたハイブリダイゼーション反応を約３５分
間の短時間で行なえる利点がある。さらに、本発明では
次の利点がある。本実施例で用いたＭ１３ｍｐ８のよ
うな１本鎖ＤＮＡは泳動速度が極端に遅いため、ポリア
クリルアミドを用いた電気泳動では通常分析は困難であ
る。しかし、本発明では、Ｍ１３ｍｐ８１本鎖ＤＮ
Ａにハイブリダイズした標識プローブを遊離させて分析
するので、Ｍ１３ｍｐ８のような泳動速度の遅いポリ
ヌクレオチドでも標識プローブを用いて分析できる利点
がある。さらに本方法では、一端試料を電気泳動担体の
試料添加部に濃縮できる利点があるので高感度検出に適
している。

【００１６】実施例２本実施例では複数の蛍光標識プローブを標的ポリヌクレ
オチドにハイブリダイゼーションさせた後、さらに蛍光
標識プローブの３’末端を蛍光標識することで、より多
くの蛍光体を標的ポリヌクレオチドに導入し、高感度で
定量的に標的ポリヌクレオチドを検出する方法について
説明する。本実施例でも、実施例１と同様にＭ１３ｍ
ｐ８１本鎖ＤＮＡを標的ポリヌクレオチド試料として
用いた。

【００１７】この標的ＤＮＡに相補的なプローブは、配
列番号１〜５のそれぞれ２４塩基よりなる一本鎖ポリヌ
クレオチドで、実施例１と同様に５’末端と１２番目の
Ｔにアミノ基を介してスルホローダミン１０１が結合し
ている。実施例１の方法に従い上記３種の蛍光標識プロ
ーブ（各１ｆｍｏｌ）を各種濃度のＭ１３ｍｐ８にハ
イブリダイゼーションさせる。次に蛍光体の結合した４
種のダイデオキシヌクレオチド３リン酸とＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ
ＮａＣｌ、２ｍＭＭｎＣｌ₂、１５ｍＭイソクエ
ン酸のｐＨ８．５の溶液条件下で反応させ、標的ポリヌ
クレオチドにハイブリダイゼーションした各蛍光標識プ
ローブの３’末端に蛍光体の結合した塩基を導入する。
ここで、蛍光体の結合した４種のダイデオキシヌクレオ
チド３リン酸の蛍光体は、蛍光標識プローブに用いたの
と同じスルホローダミン１０１でヌクレイックアシッ
ドレサーチ第２０巻（１０）２４７１−２４８３頁
（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖ
ｏｌ．２０，Ｎｏ．１０２４７１−２４８３）記載の
３−アミノ−１プロピル−１イルリンカーを持つダイ
デオキシヌクレオチド３リン酸と結合している。この状
態で標的ＤＮＡ１分子あたり最大１５分子の蛍光体が導
入されることになる。実施例１と同様に、反応液を電気
泳動担体に添加し、電気泳動分析する。未反応の、蛍光
標識プローブや蛍光体の結合した４種のダイデオキシヌ
クレオチド３リン酸由来の蛍光が検出されなくなった後
に、試料添加部近傍を７０℃に加熱する。３０秒間電圧
を２００ｖ／ｃｍに上げた後、４０ｖ／ｃｍで泳動を続
行する。検出器で検出される蛍光強度を試料溶液中の標
的ポリヌクレオチドであるＭ１３ｍｐ８の量に対して
プロットした結果を図４に示す。図４より明らかなよう
に、約０．３ｚｍｏｌ（０．０００３ａｍｏｌ）のＭ１
３ｍｐ８が検出できた。

【００１８】本実施例では、複数の蛍光体の結合した複
数種のプローブを用い、さらに標的ポリヌクレオチドに
ハイブリダイゼーションした蛍光プローブの３’末端に
ポリメラーゼを用いて蛍光体を導入し、標的ポリヌクレ
オチドになるべく多くの蛍光体を導入している。これに
より得られる信号強度が、従来用いられている蛍光体１
分子が結合した１種のプローブに比べ、約１２倍強くな
る。よって、より高感度で精度のよい測定が可能になる
利点がある。

【００１９】

【発明の効果】本発明を用いれば、短いプローブでも標
的ポリヌクレオチドに複数の蛍光体を導入できる利点が
ある。また、本発明では、ハイブリダイズした蛍光標識
プローブを電気泳動で分離して検出するので、非特異的
に伸長したプローブは泳動速度が異なるために除去でき
る利点がある。このため、高感度で、信頼性の高い定量
検出が可能である。本方法でえられる感度は、遺伝子診
断で必要となる感度をほぼクリアーしている。また、短
時間で分析ができるため、実際の遺伝子診断に有用であ
る。

【００２０】［配列表］配列番号：１配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の構造体を含む合成ポリマー配列：ＧＣＴＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＧＣＴＣＡＡ配列番号：２配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の構造体を含む合成ポリマー配列：ＡＴＡＧＣＧＴＣＣＡＡＴＡＣＴＧＣＧＧＡＡＴＣＧ配列番号：３配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の構造体を含む合成ポリマー配列：ＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣ配列番号：４配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の構造体を含む合成ポリマー配列：ＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＡＧＴＴＧＧＧＴＡＡＣ配列番号：５配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の構造体を含む合成ポリマー配列：ＣＧＧＡＴＴＧＡＣＣＧＴＡＡＴＧＧＧＡＴＡＧＧＴ

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の概念を示す図。

【図２】本発明に使用した反応容器と電気泳動担体の関
係を示す概念図。

【図３】本発明の実施例１で検出された蛍光強度の経時
変化の結果を示す図。

【図４】本発明の実施例２で得られた標的ポリヌクレオ
チドの検量線の一例を示す図。

【符号の説明】

１…標的ポリヌクレオチド、２〜６…蛍光標識プロー
ブ、１０…標的ポリヌクレオチドと蛍光標識プローブの
複合体、１１…未反応蛍光標識プローブ、２０…標的ポ
リヌクレオチドと蛍光標識プローブの複合体から遊離し
た蛍光標識プローブ、２１…試料添加部、２０１…反応
容器兼陰電極、２０２…陰電極リード線、２０３…電気
泳動担体、２０４…陽極、３０１…未反応蛍光標識プロ
ーブの電気泳動分離バンド、３０２…標的ポリヌクレオ
チドと複数種の蛍光標識プローブの複合体から遊離した
蛍光標識プローブの電気泳動分離バンド、３０３…標的
ポリヌクレオチドと１種の蛍光標識プローブの複合体か
ら遊離した蛍光標識プローブの電気泳動分離バンド。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者永井啓一東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者村川克二東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者杉浦正彦東京都杉並区高円寺南１丁目34番５号株式会社ビー・エム・エル内 (72)発明者山口敏和東京都杉並区高円寺南１丁目34番５号株式会社ビー・エム・エル内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被測定物である測定対象ポリヌクレオチド
に標識プローブをハイブリダイゼーションさせる工程と
会合したプローブの量を測定する工程からなるポリヌク
レオチド検出法において、前記測定対象ポリヌクレオチ
ドの異なる部位に会合しうる複数の標識プローブを用
い、これを前記測定対象ポリヌクレオチド鎖に会合させ
ることを特徴とするポリヌクレオチド検出法。
【請求項２】前記複数の標識プローブを前記測定対象ポ
リヌクレオチド鎖に会合させた後、前記標識プローブの
結合した前記測定対象ポリヌクレオチド鎖と未反応の前
記標識プローブを分子サイズで除去する担体を用いて未
反応の前記標識プローブを除去する工程と、前記測定対
象ポリヌクレオチド鎖に結合した前記複数の標識プロー
ブを変性条件下で解離させる工程を設け、解離した前記
標識プローブを検出することを特徴とする請求項１に記
載のポリヌクレオチド検出法。
【請求項３】前記複数の標識プローブのポリヌクレオチ
ド塩基長が１２塩基以上１００塩基以下で、各々の標識
プローブの塩基長の違いが１０％以下望ましくは均一の
塩基長であることを特徴とする請求項１あるいは請求項
２に記載のポリヌクレオチド検出法。
【請求項４】前記標識プローブの標識物が蛍光体であ
り、各々の標識プローブに複数の蛍光体が結合している
ことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記
載のポリヌクレオチド検出法。