JPH062648B2 - 抗菌剤 - Google Patents
抗菌剤Info
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- JPH062648B2 JPH062648B2 JP1057815A JP5781589A JPH062648B2 JP H062648 B2 JPH062648 B2 JP H062648B2 JP 1057815 A JP1057815 A JP 1057815A JP 5781589 A JP5781589 A JP 5781589A JP H062648 B2 JPH062648 B2 JP H062648B2
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- polygalactosamine
- molecular weight
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- antibacterial agent
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明はグラム陽性及びグラム陰性の細菌に対する抗菌
剤に関するものである。更に詳細には、本発明はα-1,4
結合のポリガラクトサミンを有効成分とする抗菌剤に関
するものである。
剤に関するものである。更に詳細には、本発明はα-1,4
結合のポリガラクトサミンを有効成分とする抗菌剤に関
するものである。
本発明の抗菌剤は、その添加または散布によりグラム陽
性の細菌及びグラム陰性の細菌の成育を阻止することが
可能であり、例えばグラム陰性細菌であるEscherichia
属、Pseudomonas属及びグラム陽性細菌であるStaphyroc
occus属、Bacillus属の細菌の成育阻止剤として非常に
有効に利用できる。
性の細菌及びグラム陰性の細菌の成育を阻止することが
可能であり、例えばグラム陰性細菌であるEscherichia
属、Pseudomonas属及びグラム陽性細菌であるStaphyroc
occus属、Bacillus属の細菌の成育阻止剤として非常に
有効に利用できる。
(従来技術及び問題点) 従来の抗菌製剤はサルフア剤に代表されるような化学合
成製剤または主に放線菌の生産する抗生物質等多種の物
質が知られている。しかし、近年薬剤の急性毒性、慢性
毒性、発ガン性の他に遺伝毒性等にも関心が寄せられ、
より安全性の高い製剤が要求されている。
成製剤または主に放線菌の生産する抗生物質等多種の物
質が知られている。しかし、近年薬剤の急性毒性、慢性
毒性、発ガン性の他に遺伝毒性等にも関心が寄せられ、
より安全性の高い製剤が要求されている。
これらのことを反映して、天然の物質であるペクチン分
解物、プロタミン、スパイス類それにエビやカニの殻の
成分であるチキン、キトサンまたはその軽度分解物等に
ついての研究が行われ一部実用化の検討が行われてい
る。
解物、プロタミン、スパイス類それにエビやカニの殻の
成分であるチキン、キトサンまたはその軽度分解物等に
ついての研究が行われ一部実用化の検討が行われてい
る。
α-1,4ポリガラクトサミンも微生物の生産する天然の多
糖類で構造上グルコサミンを構成糖とするキトサンとは
類似しており、生理活性等の類似性も期待されている。
糖類で構造上グルコサミンを構成糖とするキトサンとは
類似しており、生理活性等の類似性も期待されている。
しかしながら、ポリガラクトサミン(α-1,4ガラクトサ
ミノガラクタン)は自然界では非常に珍しく、不完全菌
由来のPF-101及びPF-102が知られている程度である(特
公昭56-12639号、特開昭62-294093号)。
ミノガラクタン)は自然界では非常に珍しく、不完全菌
由来のPF-101及びPF-102が知られている程度である(特
公昭56-12639号、特開昭62-294093号)。
また、一般に多糖類は低分子化することにより物理化学
的性質が変わり、高分子の状態より取扱いが容易になっ
たり、生理活性が顕著になったりする等のことが知られ
ている。本ポリガラクトサミンに於いても、低分子化す
る方法として酸やアルカリで処理する方法だけでなく酵
素分解による方法、即ちシュードモナス属菌の生産する
ポリガラクトサミン分解酵素についても既に明らかにさ
れている(特開昭63-164884号、特開昭63-164885号)。
的性質が変わり、高分子の状態より取扱いが容易になっ
たり、生理活性が顕著になったりする等のことが知られ
ている。本ポリガラクトサミンに於いても、低分子化す
る方法として酸やアルカリで処理する方法だけでなく酵
素分解による方法、即ちシュードモナス属菌の生産する
ポリガラクトサミン分解酵素についても既に明らかにさ
れている(特開昭63-164884号、特開昭63-164885号)。
(問題点を解決するための手段) 本発明の目的は、より安全性の高い抗菌製剤を提供する
ことにある。
ことにある。
本発明はα-1,4結合のガラクトサミンを有効成分とする
抗菌剤に関するものである。本発明に於ける抗菌剤の有
効成分であるα-1,4結合のガラクトサミンは、不完全菌
ペエシロマイセスI-1(微工研条寄第1180 FERM BP-118
0)を培養することにより、PF-101及びPF-102として得
ることが出来る。また、PF-101、PF-102をシュードモナ
スsp H881(微工研菌寄第8955)の生産するポリガラク
トサミン分解酵素で加水分解することにより、または、
酸加水分解することにより得た分解物を限外濾過膜で分
画することにより各々、分画分子量5万以上、1万以上
〜5万未満、1万未満のα-1,4結合のポリガラクトサミ
ンとして得ることが出来る。
抗菌剤に関するものである。本発明に於ける抗菌剤の有
効成分であるα-1,4結合のガラクトサミンは、不完全菌
ペエシロマイセスI-1(微工研条寄第1180 FERM BP-118
0)を培養することにより、PF-101及びPF-102として得
ることが出来る。また、PF-101、PF-102をシュードモナ
スsp H881(微工研菌寄第8955)の生産するポリガラク
トサミン分解酵素で加水分解することにより、または、
酸加水分解することにより得た分解物を限外濾過膜で分
画することにより各々、分画分子量5万以上、1万以上
〜5万未満、1万未満のα-1,4結合のポリガラクトサミ
ンとして得ることが出来る。
本発明の抗菌剤としては、PF-101、PF-102、これらの分
解物及び分画物などα-1,4結合のガラクトサミンはすべ
て、単独もしくは混合して使用できるものである。
解物及び分画物などα-1,4結合のガラクトサミンはすべ
て、単独もしくは混合して使用できるものである。
次に、α-1,4ポリガラクトサミン、PF-101及びPF-102の
生産菌について説明する。
生産菌について説明する。
和歌山県の腐植層より分離した不完全菌I-1菌はペエシ
ロマイセス属(Paecilomyces)に属するものと認められ、
ペエシロマイセスI-1と命名され、該菌下部は微工研にF
ERM BP-1180として寄託されている。
ロマイセス属(Paecilomyces)に属するものと認められ、
ペエシロマイセスI-1と命名され、該菌下部は微工研にF
ERM BP-1180として寄託されている。
次にペエシロマイセスI-1(Paecilomyces I-1)の菌学的
性質を示す。
性質を示す。
〔a〕顕微鏡下での観察 本菌は分生胞子柄(conidiophore)を欠き、分生胞子は栄
養菌糸または栄養菌糸束から直接生えている一本一本独
立したフィアライド(phialide)の先端に長い連鎖をなし
て派生している。フィアライドは半透明で20〜45μの長
さを持ち、基部はやや太く(1.0〜1.5μ)先端はやや先
細り(0.5〜1.0μ)で、直線的あるいは先端部がやや湾
曲したものもある。分生胞子は電子顕微鏡により葉巻タ
バコ型(あるいは桿菌型)であり、そのサイズは4〜6
×1.0〜1.4μである。
養菌糸または栄養菌糸束から直接生えている一本一本独
立したフィアライド(phialide)の先端に長い連鎖をなし
て派生している。フィアライドは半透明で20〜45μの長
さを持ち、基部はやや太く(1.0〜1.5μ)先端はやや先
細り(0.5〜1.0μ)で、直線的あるいは先端部がやや湾
曲したものもある。分生胞子は電子顕微鏡により葉巻タ
バコ型(あるいは桿菌型)であり、そのサイズは4〜6
×1.0〜1.4μである。
分生胞子は普通25〜35個の連鎖をなしているが、まれに
はもっと長鎖のものも観察される。この分生胞子の連鎖
は非常にもろく、一寸したショックで簡単にくずれる。
はもっと長鎖のものも観察される。この分生胞子の連鎖
は非常にもろく、一寸したショックで簡単にくずれる。
〔b〕各培地における生育状態(25℃平面培養) (1)ツアペック寒天培地 コロニーの生育は良く14日目で直径約45mmに達する。白
色のビロード状から羊毛状の菌叢で、中央部に房状に盛
上りがあり、コロニー周辺は円形である。水滴・シワ共
になし。コロニー裏面は培養初期白色、培養後期中央部
が淡黄色を呈する。寒天への色素産生は認められない。
色のビロード状から羊毛状の菌叢で、中央部に房状に盛
上りがあり、コロニー周辺は円形である。水滴・シワ共
になし。コロニー裏面は培養初期白色、培養後期中央部
が淡黄色を呈する。寒天への色素産生は認められない。
(2)麦芽寒天培地 コロニーの生育は良く、14日目で直径約54mm、コロニー
周辺は円形にならず梅鉢状を呈する。
周辺は円形にならず梅鉢状を呈する。
菌叢の中央部は白色だが、周辺部は淡黄色を呈する。菌
叢の厚さは中程度で、中央部はやや凹状である。水滴・
シワ共に認められず、コロニー裏面は全面淡黄色を呈
す。寒天培地に淡黄色色素の産生あり。
叢の厚さは中程度で、中央部はやや凹状である。水滴・
シワ共に認められず、コロニー裏面は全面淡黄色を呈
す。寒天培地に淡黄色色素の産生あり。
(3)ポテトデキストロース寒天培地 コロニーの生育は非常に良く14日目に直径約60mmに達す
る。白色のビロード状乃至羊毛状の可成り厚い菌叢を形
成し、中央部はやや盛上り、亜中央部は淡い黄色を呈す
るやや薄い菌叢、その周辺部は白色の比較的厚い菌叢と
なる。表面にシワはないが数個のうすい褐色の水滴が認
められる。コロニー裏面に放射状の数本のシワがあり、
同心円状の黄色の濃淡が認められる。寒天への淡黄色色
素の拡散がある。
る。白色のビロード状乃至羊毛状の可成り厚い菌叢を形
成し、中央部はやや盛上り、亜中央部は淡い黄色を呈す
るやや薄い菌叢、その周辺部は白色の比較的厚い菌叢と
なる。表面にシワはないが数個のうすい褐色の水滴が認
められる。コロニー裏面に放射状の数本のシワがあり、
同心円状の黄色の濃淡が認められる。寒天への淡黄色色
素の拡散がある。
(4)YpSs寒天培地(組成スターチ1.5%、イースエキス
0.4%、K2HPO4 0.1%、MgSO4 0.05%、寒天2%) コロニーの生育は良好で14日目に直径約50mmに達する。
白色の全体にふっくらとした羊毛状の厚い菌叢である。
水滴・シワなし。コロニー裏面は特記すべき特徴なし。
色素産生なし。
0.4%、K2HPO4 0.1%、MgSO4 0.05%、寒天2%) コロニーの生育は良好で14日目に直径約50mmに達する。
白色の全体にふっくらとした羊毛状の厚い菌叢である。
水滴・シワなし。コロニー裏面は特記すべき特徴なし。
色素産生なし。
(5)MY20寒天培地(組成グルコース20%、ポリペプトン
0.5%、イーストエキス0.3%、モルトエキス0.3%、寒
天2%) コロニーの生育はあまり良くなく14日目で直径約30mmで
ある。気菌糸はあまりたたず細かいシワが多く、周辺部
は淡黄色、中央部は淡褐色を呈する。コロニーの裏面は
淡黄色で、細かいシワがある。色素産生なし。
0.5%、イーストエキス0.3%、モルトエキス0.3%、寒
天2%) コロニーの生育はあまり良くなく14日目で直径約30mmで
ある。気菌糸はあまりたたず細かいシワが多く、周辺部
は淡黄色、中央部は淡褐色を呈する。コロニーの裏面は
淡黄色で、細かいシワがある。色素産生なし。
ペエシロマイセスI-1は通常の糸状菌の液体培養方法で
培養することができる。
培養することができる。
ペエシロマイセスI-1の胞子または菌糸を液体培地に接
種し、好気的に培養する。炭素源としてはブドウ糖、麦
芽糖、蔗糖、澱粉、廃糖蜜等を使用することが出来るが
好ましくはブドウ糖を用いるのが良い。窒素源としては
硫酸アンモニウム、硝酸ソーダなどの無機窒素、ペプト
ン、酵母エキスなどの有機窒素が使用出来る。
種し、好気的に培養する。炭素源としてはブドウ糖、麦
芽糖、蔗糖、澱粉、廃糖蜜等を使用することが出来るが
好ましくはブドウ糖を用いるのが良い。窒素源としては
硫酸アンモニウム、硝酸ソーダなどの無機窒素、ペプト
ン、酵母エキスなどの有機窒素が使用出来る。
培養温度は本凝集活性物質生産菌が凝集活性物質を生産
する範囲内で適宜変更し得るが通常は20〜25℃で培養す
ることが好ましい。培養時間は培養条件によって異なる
が、通常4〜5日程度であり、凝集活性物質が最高に達
する時間を見積って適当な時間に終了すればよい。ここ
で培養濾液を減圧濃縮、限外濾過等の方法で濃縮して濃
縮液としてエタノール等の有機溶媒を加えて沈澱すれ
ば、特公昭56-12639号公報に記載のPF-101が得られるの
である。
する範囲内で適宜変更し得るが通常は20〜25℃で培養す
ることが好ましい。培養時間は培養条件によって異なる
が、通常4〜5日程度であり、凝集活性物質が最高に達
する時間を見積って適当な時間に終了すればよい。ここ
で培養濾液を減圧濃縮、限外濾過等の方法で濃縮して濃
縮液としてエタノール等の有機溶媒を加えて沈澱すれ
ば、特公昭56-12639号公報に記載のPF-101が得られるの
である。
また、PF-101生産菌であるペエシロマイセスI-1を培養
し、濾過し、得られた培養濾液または濾液濃縮液に各種
塩を添加し、沈澱が生じない場合は必要によってはアル
カリを添加してpHを7〜9として、析出させ、析出物を
分離し、水洗し、これを希酸水溶液に溶解し、再び塩を
添加するか、アルカリ等の添加によってpHを7〜9とし
て、析出させて、特開昭62-294093号公報に記載のPF-10
2を得ることができる。
し、濾過し、得られた培養濾液または濾液濃縮液に各種
塩を添加し、沈澱が生じない場合は必要によってはアル
カリを添加してpHを7〜9として、析出させ、析出物を
分離し、水洗し、これを希酸水溶液に溶解し、再び塩を
添加するか、アルカリ等の添加によってpHを7〜9とし
て、析出させて、特開昭62-294093号公報に記載のPF-10
2を得ることができる。
PF-101の理化学的性質は次の通りである。
(1)凝集活性;きわめて微量で懸濁微細物を凝集する。
(2)凝集活性pH範囲;pH2〜9で安定に凝集活性を示
す。
す。
(3)凝集活性温度範囲;0〜100℃で凝集活性が認めら
れる。
れる。
(4)凝集活性イオン強度;炭酸イオンおよびFe2(SO4)3
により凝集活性が阻害させるがそれ以外の各種イオン及
びイオン強度によって凝集活性に影響はなく、NaCl、K2S
O4で1Mまで全く影響を与えない。
により凝集活性が阻害させるがそれ以外の各種イオン及
びイオン強度によって凝集活性に影響はなく、NaCl、K2S
O4で1Mまで全く影響を与えない。
(5)元素分析;窒素5.44%、炭素37.45%、水素6.3%、
リン0.27%。
リン0.27%。
(6)紫外部吸収スペクトル;第1図に示すとおり。
(7)赤外部吸収スペクトル;第2図に示すとおり。
(8)呈色反応; ニンヒドリン反応 − キサントプロテイン反応 − エーリッヒ反応 − モーリッシュ反応 + フェノール硫酸反応 + レローゼンテスト − (9)酸による加水分解;6N塩酸、110°、20時間分解に
よりガラクトサミンとアンモニアが得られ、4N塩酸、10
0℃、16時間分解により標品の74%のガラクトサミンの
少量のアンモニアが得られる。
よりガラクトサミンとアンモニアが得られ、4N塩酸、10
0℃、16時間分解により標品の74%のガラクトサミンの
少量のアンモニアが得られる。
(10)電気泳動;密度勾配等電点電気泳動により単一物質
として確認され、等電点(pI)は8.5である。
として確認され、等電点(pI)は8.5である。
(11)物質の色;淡黄白色 (12)塩基性、酸性、中性の区別;等電点8.5でやや塩基
性を呈す。(0.1%水溶液のpHは6.2、脱イオン水のpHは
5.8) (13)溶剤に対する溶解性: ・熱水に可溶、溶解後冷却しても析出しない。
性を呈す。(0.1%水溶液のpHは6.2、脱イオン水のpHは
5.8) (13)溶剤に対する溶解性: ・熱水に可溶、溶解後冷却しても析出しない。
・冷水に難溶。
・希酸、希アルカリに難溶。
・アルコール類、アセトン、クロロホルム、ベンゼン、
酢酸エチル、n−ペンタンに不溶。
酢酸エチル、n−ペンタンに不溶。
PF-102の理化学的性質は次の通りである。
(1)凝集活性;きわめて微量で懸濁微細物を凝集する。
(2)凝集活性pH範囲;pH2〜9で安定に凝集活性を示
す。
す。
(3)凝集活性温度範囲;0〜100℃で凝集活性が認めら
れる。
れる。
(4)凝集活性イオン強度;炭酸およびFe2(SO4)3により
凝集活性が阻害されるがそれ以外の各種イオン及びイオ
ン強度によって凝集活性に影響はなく、NaCl、K2SO4で1M
まで全く影響を与えない。
凝集活性が阻害されるがそれ以外の各種イオン及びイオ
ン強度によって凝集活性に影響はなく、NaCl、K2SO4で1M
まで全く影響を与えない。
(5)元素分析;窒素8.64%&、炭素42.80%、水素6.87
% 一般式:(C6H11NO4・xH2O)n (6)紫外部吸収スペクトル;第3図に示すとおり。
% 一般式:(C6H11NO4・xH2O)n (6)紫外部吸収スペクトル;第3図に示すとおり。
(7)赤外部吸収スペクトル;第4図に示すとおり。
(8)呈色反応; ニンヒドリン反応 + キサントプロテイン反応 − エーリッヒ反応 − モーリッシュ反応 − フェノール硫酸法 ± レローゼンテスト − (9)電気泳動;密度勾配等電点電気泳動により単一物質
として確認され、等電点(pI)は8.5である。
として確認され、等電点(pI)は8.5である。
(10)物質の色;淡黄色 (11)塩基性、酸性、中性の区別 0.5%w/vで水に懸濁した場合のpHは7.5(脱イオン水のp
H5.8)である。
H5.8)である。
(12)溶剤に対する溶解性 ・熱水に難溶 ・冷水に難溶 ・希酸に易溶 ・希アルカリに難溶 ・アルコール類、アセトン、クロロホルム、ベンゼン、
n−ペンタンに不溶。
n−ペンタンに不溶。
(13)平均分子量 16万以上 上記PF-101及びPF-102はいずれもα-1,4ポリガラクトサ
ミンであると同定され、そして本発明においていずれも
抗菌性が認められ、更にそれらの分解物及び分解物の分
画物にも抗菌性が認められ、本発明が完成されたのであ
る。
ミンであると同定され、そして本発明においていずれも
抗菌性が認められ、更にそれらの分解物及び分解物の分
画物にも抗菌性が認められ、本発明が完成されたのであ
る。
α-1,4ポリガラクトサミンの分解、即ち低分子化に際し
ては、塩酸、硫酸等の酸による加水分解又はポリガラク
トサミン分解酵素による加水分解が行なわれる。
ては、塩酸、硫酸等の酸による加水分解又はポリガラク
トサミン分解酵素による加水分解が行なわれる。
次に、ポリガラクトサミン分解酵素の1例を説明する。
このポリガラクトサミン分解酵素はシュードモナスsp H
881 FERM P-8955によって生産されるものである。
このポリガラクトサミン分解酵素はシュードモナスsp H
881 FERM P-8955によって生産されるものである。
(1)作用及び基質特異性 本酵素は重合度n=4(テトラ−ガラクトサミン)以上
のオリゴ及びポリガラクトサミン(α-1,4ポリガラクト
サミン)に作用してオリゴガラクトサミンを生成する。
のオリゴ及びポリガラクトサミン(α-1,4ポリガラクト
サミン)に作用してオリゴガラクトサミンを生成する。
その他の多糖類、澱粉(α-1,4グルカン)、グリコーゲ
ン(α-1,4グルカン)、プルラン(α-1,4グルカン)、
デキストラン(α-1,6グルカン)、ラミナラン(β-1,3
グルカン)、カルボキシルセルロース(β-1,4-グルカ
ン)、キトサン(β-1,4グルコサミノグルカン)、エチ
レングリコールキチン(β-1,4N-アセチルグルコサミノ
グルカン)、 Pseudomonas solanacearumのポリN-アセチルガラクトサ
ミノガラクタン(ポリβ-1,3N-アセチルガラクトサミノ
ガラクタン)(Y.Akiyama.,et.al.,Agric.Biol.Chem.,50
(3)747,1986)などには全く作用しない。
ン(α-1,4グルカン)、プルラン(α-1,4グルカン)、
デキストラン(α-1,6グルカン)、ラミナラン(β-1,3
グルカン)、カルボキシルセルロース(β-1,4-グルカ
ン)、キトサン(β-1,4グルコサミノグルカン)、エチ
レングリコールキチン(β-1,4N-アセチルグルコサミノ
グルカン)、 Pseudomonas solanacearumのポリN-アセチルガラクトサ
ミノガラクタン(ポリβ-1,3N-アセチルガラクトサミノ
ガラクタン)(Y.Akiyama.,et.al.,Agric.Biol.Chem.,50
(3)747,1986)などには全く作用しない。
また、重合度n=3(トリ−ガラクトサミン)以下のα
-1,4ガラクトサミノオリゴ糖にも作用しない。
-1,4ガラクトサミノオリゴ糖にも作用しない。
(2)至適pH及び安定pH範囲 クエン酸リン酸緩衝液を用いた場合、至適pHは4.5〜7.0
である。また、安定pH範囲はpH4.5〜8.0である。この測
定は37℃で1時間放置した酵素の残存活性を相対値で示
した。
である。また、安定pH範囲はpH4.5〜8.0である。この測
定は37℃で1時間放置した酵素の残存活性を相対値で示
した。
(3)酵素活性の測定法 酵素活性は基質にPaecilomyces I-1菌の生産するPF-101
又はPF-102(その主構成糖はα-1,4ガラクトサミノガラ
クタン)を用いた。この0.5%/0.1モル酢酸緩衝液pH6.0
溶液0.5mlに酵素溶液0.5mlを加え、37℃、10分間反応さ
せ、生じる還元力をSomogyi-Nelson法で測定した。なお
酵素単位は1分間当りに1μモルのガラクトサミンに相
当する還元力を増加させる活性を1単位とした。
又はPF-102(その主構成糖はα-1,4ガラクトサミノガラ
クタン)を用いた。この0.5%/0.1モル酢酸緩衝液pH6.0
溶液0.5mlに酵素溶液0.5mlを加え、37℃、10分間反応さ
せ、生じる還元力をSomogyi-Nelson法で測定した。なお
酵素単位は1分間当りに1μモルのガラクトサミンに相
当する還元力を増加させる活性を1単位とした。
(4)作用適温及び温度安定性の範囲 この酵素の至適温度は55℃であり、それ以上で急激に低
下する。50℃、1時間で70%の活性が残存している。
下する。50℃、1時間で70%の活性が残存している。
α-1,4ポリガラクトサミンの溶液にポリガラクトサミン
分解酵素を添加して35〜40℃程度で酵素分解することに
よってα-1,4ポリガラクトサミンの分解物を得ることが
できる。
分解酵素を添加して35〜40℃程度で酵素分解することに
よってα-1,4ポリガラクトサミンの分解物を得ることが
できる。
α-1,4ポリガラクトサミンの分解物には抗菌性が認めら
れるので、そのまま抗菌剤として使用することができる
が、α-1,4ポリガラクトサミンの分解物を限外濾過膜等
によって分画することによって各種の分子量単位に分か
れた分画物を得ることができる。
れるので、そのまま抗菌剤として使用することができる
が、α-1,4ポリガラクトサミンの分解物を限外濾過膜等
によって分画することによって各種の分子量単位に分か
れた分画物を得ることができる。
α-1,4ポリガラクトサミンの分解物は限外濾過膜によっ
て、分子量5万以上、分子量1万以上5万未満、分子量
1万未満とそれぞれの分画物を得ることができるが、い
ずれの分画物も抗菌性を有しており、本発明の抗菌剤と
なるものである。
て、分子量5万以上、分子量1万以上5万未満、分子量
1万未満とそれぞれの分画物を得ることができるが、い
ずれの分画物も抗菌性を有しており、本発明の抗菌剤と
なるものである。
本発明は、α-1,4ポリガラクトサミン、その分解物又は
分解物の分画物を有効成分とする抗菌剤である。
分解物の分画物を有効成分とする抗菌剤である。
本発明において、有効成分はそのまま添加料として、又
は各種液剤、粉剤に製剤化して抗菌剤として有効に使用
されるものである。
は各種液剤、粉剤に製剤化して抗菌剤として有効に使用
されるものである。
次に本発明の製造例、実施例を示す。
製造例1 α-1,4ポリガラクトサミン(PF-102)の製造 グルコース600g、ポリペプトン60g、CaCl2・2H2O125
gを水道水17に溶解し、濃NaON溶液でpH7.0に調整し
た後30容ジャーファーメンターに移した。
gを水道水17に溶解し、濃NaON溶液でpH7.0に調整し
た後30容ジャーファーメンターに移した。
この培地溶液に蒸気を注入することにより加圧、加熱滅
菌(121℃、20分間)を行った。冷却後の培地(最終液
量20)に、500ml三角フラスコに150ml同組成の培地
(グルコース3%、ポリペプトン0.3%、CaCl20.5%、p
H7.0)で26℃、4日間振盪培養したペエシロマイセスI-
1、FERM BP-1180(FERM P-3928)を容量比で約10%無菌的
に接種した。接種後27℃、通気量0.5VVM、撹拌数200RPM
の条件で5日間培養した。
菌(121℃、20分間)を行った。冷却後の培地(最終液
量20)に、500ml三角フラスコに150ml同組成の培地
(グルコース3%、ポリペプトン0.3%、CaCl20.5%、p
H7.0)で26℃、4日間振盪培養したペエシロマイセスI-
1、FERM BP-1180(FERM P-3928)を容量比で約10%無菌的
に接種した。接種後27℃、通気量0.5VVM、撹拌数200RPM
の条件で5日間培養した。
培養終了後培養物を濾布濾過することにより培養濾液17
を得た。この培養濾液を50℃〜60℃に加熱しながら分
画分子量16万の限外濾過膜(三菱レイヨン・エンジニア
リング社製UF膜チューブラーモジュールFタイプ)を通
過させることにより、低分子画分を除き液量が約3に
なる迄濃縮した。更に、約14000×Gで遠心分離するこ
とにより菌体残渣、熱編成蛋白質を除去した。
を得た。この培養濾液を50℃〜60℃に加熱しながら分
画分子量16万の限外濾過膜(三菱レイヨン・エンジニア
リング社製UF膜チューブラーモジュールFタイプ)を通
過させることにより、低分子画分を除き液量が約3に
なる迄濃縮した。更に、約14000×Gで遠心分離するこ
とにより菌体残渣、熱編成蛋白質を除去した。
遠心分離後に上澄液画分3に食塩約750g(約25%濃
度)を加え撹拌し、溶解後、濃NaOHでpHを7.0〜8.5に調
整した。一夜放置し塩析物を十分析出させた後、サラン
製の布(塩化ビニリデンと塩化ビニール共重合体)上に
塩析物を回収した。更にこの塩析物の上から大量の微ア
ルカリ性の水(pH7.0以上)を撤布することにより余分
の食塩及び培養液に同時に混在している中性糖、その他
の夾雑物を洗い流した。
度)を加え撹拌し、溶解後、濃NaOHでpHを7.0〜8.5に調
整した。一夜放置し塩析物を十分析出させた後、サラン
製の布(塩化ビニリデンと塩化ビニール共重合体)上に
塩析物を回収した。更にこの塩析物の上から大量の微ア
ルカリ性の水(pH7.0以上)を撤布することにより余分
の食塩及び培養液に同時に混在している中性糖、その他
の夾雑物を洗い流した。
次に、水洗後の塩析物に0.1M塩酸溶液を容量比で約3倍
量加え溶解した。この溶解物に濃NaOH溶液を加えポリガ
ラクトサミンの等電点であるpH8.5に合せた。一夜放置
し十分析出物を析出させた後、上記と同様サラン製の布
上に析出物を回収し、大量の水道水で洗った。この水洗
物をもう1度0.1M塩酸に溶解後、等電点沈澱を行い水洗
を繰返すことにより精製した。
量加え溶解した。この溶解物に濃NaOH溶液を加えポリガ
ラクトサミンの等電点であるpH8.5に合せた。一夜放置
し十分析出物を析出させた後、上記と同様サラン製の布
上に析出物を回収し、大量の水道水で洗った。この水洗
物をもう1度0.1M塩酸に溶解後、等電点沈澱を行い水洗
を繰返すことにより精製した。
この精製した析出物を121℃、15分間滅菌後、凍結乾燥
することにより、ポリガラクトサミンを主成分とするPF
-102の精製粉末(α-1,4ポリガラクトサミンとしての純
度約99%を7g得た。
することにより、ポリガラクトサミンを主成分とするPF
-102の精製粉末(α-1,4ポリガラクトサミンとしての純
度約99%を7g得た。
製造例2 α-1,4ポリガラクトサミンの分画方法 精製α-1,4ポリガラクトサミン(PF-102)100gを4規定
塩酸2に分散させ、冷却管付き三角フラスコ中にて、
80℃、4時間塩酸加水分解した。
塩酸2に分散させ、冷却管付き三角フラスコ中にて、
80℃、4時間塩酸加水分解した。
分解後、この塩酸加水分解溶液を10規定水酸化ナトリウ
ムで中和しpH7とした。この、溶液を先ず分画分子量5
万の限外濾過膜で処理(グレースジャパン社製)し、更
に分画分子量1万の限外濾過膜で処理した。この様にし
て、各々分子量5万以上、1〜5万、1万未満のα-1,4
結合のポリガラクトサミンを得た。
ムで中和しpH7とした。この、溶液を先ず分画分子量5
万の限外濾過膜で処理(グレースジャパン社製)し、更
に分画分子量1万の限外濾過膜で処理した。この様にし
て、各々分子量5万以上、1〜5万、1万未満のα-1,4
結合のポリガラクトサミンを得た。
各々の画分を凍結乾燥することにより、粉末試料とし
た。
た。
製造例3 ポリガラクトサミン分解酵素の製造 シュードモナスsp H881、FERM P-8955を500ml三角フラス
コ中で、グルコース0.5%、酵母エキス0.05%、ポリペ
プトン0.05%の組成を有する種培地100mlに植菌し、30
℃で20時間培養する。
コ中で、グルコース0.5%、酵母エキス0.05%、ポリペ
プトン0.05%の組成を有する種培地100mlに植菌し、30
℃で20時間培養する。
得られた種培養液を30のジャーファーメンター中で、
ポリガラクトサミン(PF-102)0.25%、グルコース0.25
%、酵母エキス0.05%、ポリペプトン0.05%の酵素生産
培地18に植菌し、30℃で48時間通気(18/分)撹拌
(200rpm)培養する。
ポリガラクトサミン(PF-102)0.25%、グルコース0.25
%、酵母エキス0.05%、ポリペプトン0.05%の酵素生産
培地18に植菌し、30℃で48時間通気(18/分)撹拌
(200rpm)培養する。
得られた培養液を遠心分離(14000rpm)して、菌体を除
き、得られた培養濾液(酵素活性0.0035U/ml、総活性63
U/18)に冷却したエタノールを60%濃度まで加えて、
タンパク質を沈殿させ、この沈殿タンパク質を遠心し
て、溶液から分離する。得られたタンパク質を0.1モル
酢酸緩衝液(pH5.0)で平衡化したCM-セファデックスC-25
カラム(2.5×60cm)に吸着させ、0〜0.5モル食塩の濃度
勾配を有する同緩衝液を用いて溶出させる。
き、得られた培養濾液(酵素活性0.0035U/ml、総活性63
U/18)に冷却したエタノールを60%濃度まで加えて、
タンパク質を沈殿させ、この沈殿タンパク質を遠心し
て、溶液から分離する。得られたタンパク質を0.1モル
酢酸緩衝液(pH5.0)で平衡化したCM-セファデックスC-25
カラム(2.5×60cm)に吸着させ、0〜0.5モル食塩の濃度
勾配を有する同緩衝液を用いて溶出させる。
溶出した酵素活性区分を集め、限外濾過装置(分子量1
万保持)を使って濃縮する。次に、2モル食塩を含む0.
1モル酢酸緩衝液(pH6.0)溶液とし、同緩衝液で平衡化し
たセファデックスG-50カラム(5×90cm)クロマトグラフ
ィーにかける。次いで、活性区分の食塩濃度を4モルに
まで高め、同様な溶液で平衡化したフェニル−セファロ
ースCL-4Bカラム(2.5×20cm)に吸着させ、食塩の逆濃度
勾配を持つ0.1モル酢酸緩衝液で溶出して精製ポリガラ
クトサミン分解酵素50mg(収率23.1%、比活性52μg
galN/min/mg protein)を得た。
万保持)を使って濃縮する。次に、2モル食塩を含む0.
1モル酢酸緩衝液(pH6.0)溶液とし、同緩衝液で平衡化し
たセファデックスG-50カラム(5×90cm)クロマトグラフ
ィーにかける。次いで、活性区分の食塩濃度を4モルに
まで高め、同様な溶液で平衡化したフェニル−セファロ
ースCL-4Bカラム(2.5×20cm)に吸着させ、食塩の逆濃度
勾配を持つ0.1モル酢酸緩衝液で溶出して精製ポリガラ
クトサミン分解酵素50mg(収率23.1%、比活性52μg
galN/min/mg protein)を得た。
製造例4 α-1,4ポリガラクトサミンの分画方法 精製ポリガラクトサミン25gを4.8の0.1モル酢酸に溶
解し、次に水酸化ナトリウムでpH6.0に調整し、全液料
を5とした。このポリガラクトサミン溶液を基質と
し、これに製造例3で得た精製ポリガラクトサミン分解
酵素10mgを加え37℃で酵素分解した。この分解後の溶液
を先ず、分画分子量5万の限外濾過膜で処理(グレース
ジャパン社製)し、更に分画分子量1万の限外濾過膜で
処理した。この様にして、各々分子量5万以上、1〜5
万、1万未満のα-1,4結合のポリガラクトサミンを得
た。
解し、次に水酸化ナトリウムでpH6.0に調整し、全液料
を5とした。このポリガラクトサミン溶液を基質と
し、これに製造例3で得た精製ポリガラクトサミン分解
酵素10mgを加え37℃で酵素分解した。この分解後の溶液
を先ず、分画分子量5万の限外濾過膜で処理(グレース
ジャパン社製)し、更に分画分子量1万の限外濾過膜で
処理した。この様にして、各々分子量5万以上、1〜5
万、1万未満のα-1,4結合のポリガラクトサミンを得
た。
更に、各々の画分を凍結乾燥することにより、粉末試料
とした。
とした。
ここに得られた分画分子量5万以上のα-1,4結合のポリ
ガラクトサミンの理化学的諸性質は次の通りである。
ガラクトサミンの理化学的諸性質は次の通りである。
1 元素分析;窒素8.6%、炭素42.8%、水素6.9%、酸
素41.7% 2 比旋光度;▲〔α〕20 D▼=+215〜225 3 融点;160℃以上で褐変、210℃で炭化、230℃で灰
化 4 物質の色;淡黄色 5 呈色反応; ニンヒドリン反応 + キサントプロテイン反応 − エーリッヒ反応 − モーリッシュ反応 − フェノール硫酸反応 ± 6 溶剤に対する溶解性; ・水に難溶 ・希酸に可溶 ・メタノール、エタノール、アセトン、クロロフォル
ム、ヘキサンに難溶 7 紫外部吸収スペクトル;第5図に示される。
素41.7% 2 比旋光度;▲〔α〕20 D▼=+215〜225 3 融点;160℃以上で褐変、210℃で炭化、230℃で灰
化 4 物質の色;淡黄色 5 呈色反応; ニンヒドリン反応 + キサントプロテイン反応 − エーリッヒ反応 − モーリッシュ反応 − フェノール硫酸反応 ± 6 溶剤に対する溶解性; ・水に難溶 ・希酸に可溶 ・メタノール、エタノール、アセトン、クロロフォル
ム、ヘキサンに難溶 7 紫外部吸収スペクトル;第5図に示される。
8 赤外部吸収スペクトル;第6図に示される。
また、分画分子量1万以上5万未満のα-1,4結合のポリ
ガラクトサミンの理化学的諸性質は次の通りである。
ガラクトサミンの理化学的諸性質は次の通りである。
1 元素分析;窒素8.7%、炭素45.7%、水素3.2%、酸
素42.4% 2 比旋光度;▲〔α〕20 D▼=+210〜220 3 融点;特定の融点を持たず、160℃で褐変、210℃で
炭化、230℃で灰化 4 物質の色;淡黄色 5 呈色反応; ニンヒドリン反応 + キサントプロテイン反応 − エーリッヒ反応 − モーリッシュ反応 − フェノール硫酸法 ± 6 溶剤に対する溶解性; ・水に可溶 ・メタノールに微溶 ・ジメチルスルホオキシドに微溶 ・エタノール、アセトン、クロロホルム、ヘキサンに難
溶 7 紫外部吸収スペクトル;第7図に示される。
素42.4% 2 比旋光度;▲〔α〕20 D▼=+210〜220 3 融点;特定の融点を持たず、160℃で褐変、210℃で
炭化、230℃で灰化 4 物質の色;淡黄色 5 呈色反応; ニンヒドリン反応 + キサントプロテイン反応 − エーリッヒ反応 − モーリッシュ反応 − フェノール硫酸法 ± 6 溶剤に対する溶解性; ・水に可溶 ・メタノールに微溶 ・ジメチルスルホオキシドに微溶 ・エタノール、アセトン、クロロホルム、ヘキサンに難
溶 7 紫外部吸収スペクトル;第7図に示される。
8 赤外部吸収スペクトル;第8図に示される。
また、分画分子量1万未満のα-1,4結合のポリガラクト
サミンの理化学的性質は次の通りである。
サミンの理化学的性質は次の通りである。
1 元素分析;窒素8.6%、炭素44.3%、水素6.9%、酸
素40.2% 2 比旋光度;▲〔α〕20 D▼:+206.8 3 融点;特定の融点を持たず、160℃以上で炭化をは
じめる。
素40.2% 2 比旋光度;▲〔α〕20 D▼:+206.8 3 融点;特定の融点を持たず、160℃以上で炭化をは
じめる。
4 物質の色;淡黄色 5 呈色反応; ニンヒドリン反応 + インドール塩酸反応 + ソモギー−ネルソン反応 + フェノール硫酸反応 − ヨード反応 − 6 溶剤に対する溶解性; ・水に可溶 ・希酸に可溶 ・メタノールに微溶 ・ジメチルスルフォオキシドに微溶 ・エタノール、アセトン、クロロフォルムには難溶 7 紫外部吸収スペクトル;第9図に示される。
8 赤外部吸収スペクトル;第10図に示される。
実施例1 培養培地;肉エキス10g、ペプトン10g、塩化ナトリウ
ム5gを脱イオン水に溶解し、pHを6.0に調整した後、
1とした。
ム5gを脱イオン水に溶解し、pHを6.0に調整した後、
1とした。
別に、製造例1で製造したα-1,4ポリガラクトサミン(P
F-102)、製造例2で製造したα-1,4ポリガラクトサミン
の塩酸分解物及び製造例2で調整した塩酸分解物の分画
物で各々の分子量のものについて、各α-1,4ポリガラク
トサミンを0.1規定の酢酸に溶解し、各々最終濃度で0.
1、0.05、0.0125、0.006、0.003%になるように培養培
地に添加した。
F-102)、製造例2で製造したα-1,4ポリガラクトサミン
の塩酸分解物及び製造例2で調整した塩酸分解物の分画
物で各々の分子量のものについて、各α-1,4ポリガラク
トサミンを0.1規定の酢酸に溶解し、各々最終濃度で0.
1、0.05、0.0125、0.006、0.003%になるように培養培
地に添加した。
更に、寒天を最終1.5%になるように加え、121℃、15分
オートクレーブした後ポリガラクトサミン含有平板培地
とした。
オートクレーブした後ポリガラクトサミン含有平板培地
とした。
抗菌作用の判定は、接種した菌株の増殖阻止が確認され
た培地中のポリガラクトサミンの最小濃度で示した。菌
株の培養は、30℃、2日間行いその観察結果で判定し
た。
た培地中のポリガラクトサミンの最小濃度で示した。菌
株の培養は、30℃、2日間行いその観察結果で判定し
た。
試験に供した菌株は Escherichia coli IFO 12734, Bacillus subtilis IFO 3513, Pseudomonas aeruginosa IFO 3349, Micrococcus luteus IFO 12708, Mycobacterium phlei IFO 3158, Staphylococcus aureus IFO 12732である。
結果は、第1表に示した通りである。
第1図はPF-101の紫外部吸収スペクトルを示す図で、第
2図はPF-101の赤外部吸収スペクトルを示す図で、第3
図はPF-102の紫外部吸収スペクトルを示す図で、第4図
はPF-102の赤外部吸収スペクトルを示す図で、第5図は
PF-102の分解物の分子量5万以上の分画物の紫外部吸収
スペクトルを、第6図はその赤外部吸収スペクトルを示
す図で、第7図はPF-102の分解物の分子量1万以上5万
未満の分画物の紫外部吸収スペクトルを、第8図はその
赤外部吸収スペクトルを示す図で、第9図はPF-102の分
解物の分子量1万未満の分画物の紫外線吸収スペクトル
を、第10図はその赤外部吸収スペクトルを示す図であ
る。
2図はPF-101の赤外部吸収スペクトルを示す図で、第3
図はPF-102の紫外部吸収スペクトルを示す図で、第4図
はPF-102の赤外部吸収スペクトルを示す図で、第5図は
PF-102の分解物の分子量5万以上の分画物の紫外部吸収
スペクトルを、第6図はその赤外部吸収スペクトルを示
す図で、第7図はPF-102の分解物の分子量1万以上5万
未満の分画物の紫外部吸収スペクトルを、第8図はその
赤外部吸収スペクトルを示す図で、第9図はPF-102の分
解物の分子量1万未満の分画物の紫外線吸収スペクトル
を、第10図はその赤外部吸収スペクトルを示す図であ
る。
Claims (4)
- 【請求項1】α-1,4ポリガラクトサミン、その分解物又
は分解物の分画物を有効成分とする抗菌剤。 - 【請求項2】α-1,4ポリガラクトサミンの分解物の分画
物が分子量5万以上のα-1,4ポリガラクトサミンである
ことを特徴とする第1項記載の抗菌剤。 - 【請求項3】α-1,4ポリガラクトサミンの分解物の分画
物が分子量1万以上5万未満のα-1,4ポリガラクトサミ
ンであることを特徴とする第1項記載の抗菌剤。 - 【請求項4】α-1,4ポリガラクトサミンの分解物の分画
物が分子量1万未満のα-1,4ポリガラクトサミンである
ことを特徴とする第1項記載の抗菌剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1057815A JPH062648B2 (ja) | 1989-03-13 | 1989-03-13 | 抗菌剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1057815A JPH062648B2 (ja) | 1989-03-13 | 1989-03-13 | 抗菌剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02237905A JPH02237905A (ja) | 1990-09-20 |
| JPH062648B2 true JPH062648B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=13066416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1057815A Expired - Lifetime JPH062648B2 (ja) | 1989-03-13 | 1989-03-13 | 抗菌剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062648B2 (ja) |
-
1989
- 1989-03-13 JP JP1057815A patent/JPH062648B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02237905A (ja) | 1990-09-20 |
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