JPH0630570B2 - 付着性細胞の連続大量培養法 - Google Patents
付着性細胞の連続大量培養法Info
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- JPH0630570B2 JPH0630570B2 JP60205822A JP20582285A JPH0630570B2 JP H0630570 B2 JPH0630570 B2 JP H0630570B2 JP 60205822 A JP60205822 A JP 60205822A JP 20582285 A JP20582285 A JP 20582285A JP H0630570 B2 JPH0630570 B2 JP H0630570B2
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、付着性細胞の連続大量培養法に関する。
更に詳しくは、本発明は、繊維状担体をカラムにつめ、
付着性細胞を繊維状担体に付着させ、固定し、カラム内
を下方から上方へ培地を循環させることによりなる連続
大量培養法に関する。
付着性細胞を繊維状担体に付着させ、固定し、カラム内
を下方から上方へ培地を循環させることによりなる連続
大量培養法に関する。
〔従来技術〕 付着性細胞の大量培養には、培養担体として、ローラボ
トル及びマイクロキァリアビーズが用いられている。ロ
ーラボトルを用いる場合には、培地交換に時間がかか
り、培養面積も大きくとれないために、大型の装置が必
要である。マイクロキァリアビーズを用いる場合には、
マイクロキァリアビーズを培地中に浮遊させるため、ビ
ーズと培地上清を分離するためにフィルターまたは沈澱
管（米国特許第4,335,215号明細書参照）を用いる必要
があり、フィルターの目詰まりの問題や、沈澱管の場合
には、流速を一定以上あげることが出来ない等の問題が
ある。
トル及びマイクロキァリアビーズが用いられている。ロ
ーラボトルを用いる場合には、培地交換に時間がかか
り、培養面積も大きくとれないために、大型の装置が必
要である。マイクロキァリアビーズを用いる場合には、
マイクロキァリアビーズを培地中に浮遊させるため、ビ
ーズと培地上清を分離するためにフィルターまたは沈澱
管（米国特許第4,335,215号明細書参照）を用いる必要
があり、フィルターの目詰まりの問題や、沈澱管の場合
には、流速を一定以上あげることが出来ない等の問題が
ある。
このような問題点を解決するために、先に本発明者ら
は、細胞担体に繊維状担体を用いることによって細胞を
固定し培地との分離を容易にし、また、目的物の産生を
向上しうる製造方法を提供している（特願昭６０−１１
３９３８）。
は、細胞担体に繊維状担体を用いることによって細胞を
固定し培地との分離を容易にし、また、目的物の産生を
向上しうる製造方法を提供している（特願昭６０−１１
３９３８）。
しかしながら、この方法は、バッチ方式であり、pHの低
下、乳酸の蓄積、栄養物の消費、老廃物の蓄積により培
養条件の変動が生じるという問題点がある。
下、乳酸の蓄積、栄養物の消費、老廃物の蓄積により培
養条件の変動が生じるという問題点がある。
本発明は、先の特願昭６０−１１３９３８号記載の発明
の改良に関するものである。
の改良に関するものである。
即ち、本発明は、培養条件の変動をなくし、一定期間最
適な培養条件下での培養が持続し得、かくして、細胞培
養の効率化および当該生産物の高収率化を提供すること
を目的としている。
適な培養条件下での培養が持続し得、かくして、細胞培
養の効率化および当該生産物の高収率化を提供すること
を目的としている。
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重
ねた結果、連続培養装置を用いることにより、上記問題
点を解決し本発明を完成した。
ねた結果、連続培養装置を用いることにより、上記問題
点を解決し本発明を完成した。
即ち、本発明は、繊維状担体をカラムにつめ、付着性細
胞を長さ１０mm以上の繊維状担体に付着させ、固定し、
カラム内を下方から上方へ培地を循環させることを特徴
とする連続大量培養法に関する。
胞を長さ１０mm以上の繊維状担体に付着させ、固定し、
カラム内を下方から上方へ培地を循環させることを特徴
とする連続大量培養法に関する。
(1)付着性細胞の調製 本発明で使用される付着性細胞は、抗体に付着しうる細
胞であれば特に限定されず、たとえばヒト腎細胞、メラ
ノーマ、ＣＨＯ細胞、線繊芽状細胞が例示される。好適
には、ウロキナーゼ前駆体産生性の繊維芽細胞様細胞が
例示される。
胞であれば特に限定されず、たとえばヒト腎細胞、メラ
ノーマ、ＣＨＯ細胞、線繊芽状細胞が例示される。好適
には、ウロキナーゼ前駆体産生性の繊維芽細胞様細胞が
例示される。
付着性細胞の調製にあたっては、従来既知の手段を用い
ればよい。例えば、ウロキナーゼ前駆体産生性の繊維芽
細胞様細胞（以下プロ−ＵＫ産生細胞という）の場合に
は、特願昭58-170354号明細書に開示の方法またはこれ
に準じる方法が挙げられる。
ればよい。例えば、ウロキナーゼ前駆体産生性の繊維芽
細胞様細胞（以下プロ−ＵＫ産生細胞という）の場合に
は、特願昭58-170354号明細書に開示の方法またはこれ
に準じる方法が挙げられる。
(2)培養条件 培養条件は、付着性細胞の種類によって異なるが、たと
えばプロ−ＵＫ産生細胞の場合には、基本培地として、
ウェイマウス培地あるいはドゥルベコの変性ＭＥＭ培地
に０．０５〜０．２ｗ／ｖ％ヒト血清アルブミンを添加
した無血清培地が用いられる。
えばプロ−ＵＫ産生細胞の場合には、基本培地として、
ウェイマウス培地あるいはドゥルベコの変性ＭＥＭ培地
に０．０５〜０．２ｗ／ｖ％ヒト血清アルブミンを添加
した無血清培地が用いられる。
また、この培地中には空気（Air ９５％，ＣＯ2５％）
を適宜導入（流速：１０〜５００ml／分）することが好
ましく、温度２０〜３７℃が好ましい。カラム内の培地
は下方から上方へ循環され、その速度としては0.01〜10
カラウ容量／時間であることが好ましい。さらに、一定
の速度で培地を変換することが好ましく、その速度とし
ては0.1〜10カラム容量／日が特に好ましい。
を適宜導入（流速：１０〜５００ml／分）することが好
ましく、温度２０〜３７℃が好ましい。カラム内の培地
は下方から上方へ循環され、その速度としては0.01〜10
カラウ容量／時間であることが好ましい。さらに、一定
の速度で培地を変換することが好ましく、その速度とし
ては0.1〜10カラム容量／日が特に好ましい。
そして、この交換した培地中に存在する生産物を回収す
る（特願昭５８−１７０３５４号明細書）。
る（特願昭５８−１７０３５４号明細書）。
培地からの生産物の回収は公知の手段を用いて行えばよ
く、たとえば当該培地を遠心分離、減圧濃縮、塩析分
画、ゲル濾過、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせて処
理することによって行われる。
く、たとえば当該培地を遠心分離、減圧濃縮、塩析分
画、ゲル濾過、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィーを適宜組み合わせて処
理することによって行われる。
(3)培養用担体 本発明において使用される培養用担体は繊維状担体であ
る。かかる担体の材質としては、生産目的細胞が付着可
能なものであればよく、この分野で既知のものを使用す
ればよい。
る。かかる担体の材質としては、生産目的細胞が付着可
能なものであればよく、この分野で既知のものを使用す
ればよい。
例えば、その表面がプラスに電荷されたものが使用され
る。プラスに電荷されたものとしては、ガラス繊維、そ
の表面がプラスに電荷処理（例えば、コラーゲンによる
コーティング処理など）されたダクロン、テフロン、ナ
イロン、オルロンなどのプラスチック繊維などが挙げら
れる。当該繊維状担体は長さ１０mm以上のものが使用さ
れ、また直径１０〜３００μｍ程度のものであることが
好ましい。
る。プラスに電荷されたものとしては、ガラス繊維、そ
の表面がプラスに電荷処理（例えば、コラーゲンによる
コーティング処理など）されたダクロン、テフロン、ナ
イロン、オルロンなどのプラスチック繊維などが挙げら
れる。当該繊維状担体は長さ１０mm以上のものが使用さ
れ、また直径１０〜３００μｍ程度のものであることが
好ましい。
この繊維状担体は、通常、培地に対して0.001〜0.5g/cm
3、好ましくは0.001〜0.20g/cm3程度の密度で培養器に
つめる。
3、好ましくは0.001〜0.20g/cm3程度の密度で培養器に
つめる。
(4)培養用装置 第１図は、本発明の実施に使用する培養装置の一例であ
る。
る。
培養容器としては、カラム型１のものが用いられ、カラ
ム１の上下両側とリザーブタンク５をシリコンチューブ
につなぎ、下側のチューブ側に細胞注入口７を設け、ペ
リスタポンプ３をカラム１との間に置いている。
ム１の上下両側とリザーブタンク５をシリコンチューブ
につなぎ、下側のチューブ側に細胞注入口７を設け、ペ
リスタポンプ３をカラム１との間に置いている。
リザーブタンク５は、Ｏ2補給のためにエアーフィルタ
ー６を設けてエアレーションしている。また新鮮培地８
をペリスタポンプ３で送り、古い培地が送り出せるよう
接続され培地交換が出来るようにしてある。
ー６を設けてエアレーションしている。また新鮮培地８
をペリスタポンプ３で送り、古い培地が送り出せるよう
接続され培地交換が出来るようにしてある。
カラム１内に培養担体として繊維状担体２をつめる。付
着性細胞を細胞注入口７から入れ、繊維状担体に付着さ
せ、循環系に細胞がまわらないように固定し、連続培養
が行えるようにする。
着性細胞を細胞注入口７から入れ、繊維状担体に付着さ
せ、循環系に細胞がまわらないように固定し、連続培養
が行えるようにする。
本発明においては、担体として長さ１０mm以上の繊維状
担体を用いたので、当該担体を培地の下方に沈めること
なく培地交換が行えるので、培養操作が極めて簡便であ
る。また、連続培養のために、バッチ方式による培養条
件の変化がおこらず、最良条件下の培養を持続すること
ができ、従来法に比し、有意に目的の産生が増強する。
担体を用いたので、当該担体を培地の下方に沈めること
なく培地交換が行えるので、培養操作が極めて簡便であ
る。また、連続培養のために、バッチ方式による培養条
件の変化がおこらず、最良条件下の培養を持続すること
ができ、従来法に比し、有意に目的の産生が増強する。
以下、実施例の基づいて本発明をより詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 ３２×Ｈ２１０のカラムに２０ｇのガラスウールをつ
め、第１図のように組み立てた。ガラスウールを0.1Ｍ
リン酸緩衝液（pH７．０）に懸濁し、オートクレーブ滅
菌する。次に変方ウェイマウス培地にヒト血清アルブミ
ン（Human Serum Albumin）0.1％（ｗ／ｖ）を加えた培
地に置換したのち、５００×１０4cells/mlを１００ml
加えて２時間静置した後、カラム内循環スピード2500ml
／分、培地交換スピード５００ml／日で連続培養を開始
する。
め、第１図のように組み立てた。ガラスウールを0.1Ｍ
リン酸緩衝液（pH７．０）に懸濁し、オートクレーブ滅
菌する。次に変方ウェイマウス培地にヒト血清アルブミ
ン（Human Serum Albumin）0.1％（ｗ／ｖ）を加えた培
地に置換したのち、５００×１０4cells/mlを１００ml
加えて２時間静置した後、カラム内循環スピード2500ml
／分、培地交換スピード５００ml／日で連続培養を開始
する。
コントロール実験としては、培養担体として同様にガラ
スウールを用いた、バッチ方式の培養を行い、一日おき
に１００mlの培地交換を行い比較実験した。
スウールを用いた、バッチ方式の培養を行い、一日おき
に１００mlの培地交換を行い比較実験した。
結果は第２図に示すように、本発明の方法（○印）によ
る時、培養開始後４０日目において、コントロール（●
印）に比して、約1.3倍の産生量を示した。第２図中、
Ｕはウロキナーゼの国際単位である。
る時、培養開始後４０日目において、コントロール（●
印）に比して、約1.3倍の産生量を示した。第２図中、
Ｕはウロキナーゼの国際単位である。
第１図は、本発明の実施に使用する連続培養装置の一例
を示す説明図である。 １……カラム ２……繊維状担体 ３……ペリスタポンプ ４……三方活栓 ５……リザーブタンク ６……エアーフィルター ７……細胞注入口 ８……新鮮培地 ９……回収培地 第２図は、培養日数と、プロ−ＵＫの産生量の関係を示
すグラフである。 ○印は本発明の連続培養法によるものであり、●印は培
地交換培養法による場合である。
を示す説明図である。 １……カラム ２……繊維状担体 ３……ペリスタポンプ ４……三方活栓 ５……リザーブタンク ６……エアーフィルター ７……細胞注入口 ８……新鮮培地 ９……回収培地 第２図は、培養日数と、プロ−ＵＫの産生量の関係を示
すグラフである。 ○印は本発明の連続培養法によるものであり、●印は培
地交換培養法による場合である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 5/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 有村 博文 大阪府豊中市上野坂２丁目18番地１―401 号 (56)参考文献 特開 昭59−21388（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−24183（ＪＰ，Ａ) Ｂ．アトキンソン「バイオリアフター− 微生物・生化学の反応器−」産業図書株式 会社（昭52．７．29）Ｐ．35
Claims (2)
- 【請求項１】長さ１０mm以上の繊維状担体をカラムにつ
め、付着性細胞を繊維状担体に付着させ、固定し、カラ
ム内を下方から上方へ培地を循環させることを特徴とす
る連続大量培養法。 - 【請求項２】付着性細胞が繊維芽細胞である、特許請求
の範囲第(1)項記載の連続大量培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60205822A JPH0630570B2 (ja) | 1985-09-18 | 1985-09-18 | 付着性細胞の連続大量培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60205822A JPH0630570B2 (ja) | 1985-09-18 | 1985-09-18 | 付着性細胞の連続大量培養法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6265681A JPS6265681A (ja) | 1987-03-24 |
| JPH0630570B2 true JPH0630570B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=16513275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60205822A Expired - Lifetime JPH0630570B2 (ja) | 1985-09-18 | 1985-09-18 | 付着性細胞の連続大量培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630570B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3406707A1 (en) | 2015-01-26 | 2018-11-28 | Ube Industries, Ltd. | Long-term cell-cultivation using polyimide porous membrane and cell-cryopreservation method using polyimide porous membrane |
| EP3406710A1 (en) | 2015-01-26 | 2018-11-28 | UBE Industries, Ltd. | Method, device and kit for mass cultivation of cells using polyimide porous membrane |
| US10519478B2 (en) | 2015-01-26 | 2019-12-31 | Ube Industries, Ltd. | Method of producing substance |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW202122569A (zh) | 2019-08-09 | 2021-06-16 | 日商宇部興產股份有限公司 | 應用小片多孔膜的細胞培養法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5921388A (ja) * | 1982-07-29 | 1984-02-03 | Japan Synthetic Rubber Co Ltd | 細胞培養方法 |
| US4546083A (en) * | 1983-04-22 | 1985-10-08 | Stolle Research & Development Corporation | Method and device for cell culture growth |
-
1985
- 1985-09-18 JP JP60205822A patent/JPH0630570B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｂ．アトキンソン「バイオリアフター−微生物・生化学の反応器−」産業図書株式会社（昭５２．７．２９）Ｐ．３５ |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3406707A1 (en) | 2015-01-26 | 2018-11-28 | Ube Industries, Ltd. | Long-term cell-cultivation using polyimide porous membrane and cell-cryopreservation method using polyimide porous membrane |
| EP3406710A1 (en) | 2015-01-26 | 2018-11-28 | UBE Industries, Ltd. | Method, device and kit for mass cultivation of cells using polyimide porous membrane |
| US10443037B2 (en) | 2015-01-26 | 2019-10-15 | Ube Industries, Ltd. | Long-term cell-cultivation using polyimide porous membrane and cell-cryopreservation method using polyimide porous membrane |
| US10479974B2 (en) | 2015-01-26 | 2019-11-19 | Ube Industries, Ltd. | Method, device and kit for mass cultivation of cells using polyimide porous membrane |
| US10519478B2 (en) | 2015-01-26 | 2019-12-31 | Ube Industries, Ltd. | Method of producing substance |
| US10626365B2 (en) | 2015-01-26 | 2020-04-21 | Ube Industries, Ltd. | Long-term cell-cultivation using polyimide porous membrane and cell-cryopreservation method using polyimide porous membrane |
| US10696943B2 (en) | 2015-01-26 | 2020-06-30 | Ube Industries, Ltd. | Method, device and kit for mass cultivation of cells using polyimide porous membrane |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6265681A (ja) | 1987-03-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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