JPH0630571B2 - 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 - Google Patents
耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法Info
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- JPH0630571B2 JPH0630571B2 JP30680987A JP30680987A JPH0630571B2 JP H0630571 B2 JPH0630571 B2 JP H0630571B2 JP 30680987 A JP30680987 A JP 30680987A JP 30680987 A JP30680987 A JP 30680987A JP H0630571 B2 JPH0630571 B2 JP H0630571B2
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- Japan
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- mannitol
- thermostable
- mannitol dehydrogenase
- dehydrogenase
- approximately
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は耐熱性に優れたマンニトールデヒドロゲナーゼ
に関するものである。特にアクチノバチルス（Actinoba
cillus）属に属する微生物から得られる耐熱性マンニト
ールデヒドロゲナーゼに関する。本発明の酸素は血清、
尿中のα−アミラーゼ等の酵素活性測定用に用いられ
る。
に関するものである。特にアクチノバチルス（Actinoba
cillus）属に属する微生物から得られる耐熱性マンニト
ールデヒドロゲナーゼに関する。本発明の酸素は血清、
尿中のα−アミラーゼ等の酵素活性測定用に用いられ
る。
（従来の技術） 従来からマンニトールデヒドロゲナーゼを生産する微生
物としてエシェリシア・コリー（Escherichia coli），
アエロバクター・アエロゲネス（Aerobacter aerogene
s），アスペルギルス・オリジェ（Aspergillus oryza
e）アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger），ア
スペルギルス・キャンディダス（Aspergillus candidu
s）などが知られている。
物としてエシェリシア・コリー（Escherichia coli），
アエロバクター・アエロゲネス（Aerobacter aerogene
s），アスペルギルス・オリジェ（Aspergillus oryza
e）アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger），ア
スペルギルス・キャンディダス（Aspergillus candidu
s）などが知られている。
しかし、これらの微生物が生産するマンニトールデヒド
ロゲナーゼは熱安定性が十分でなかった。
ロゲナーゼは熱安定性が十分でなかった。
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第89巻第２号第32
6頁（1965年）には、アスペルギルス・オリゼー（Asper
gillus oryzae）由来のNAD-linkedマンニトールデヒド
ロゲナーゼはpH7.6，37℃，３分間処理で80％の残存活
性を有することが記載されている。
6頁（1965年）には、アスペルギルス・オリゼー（Asper
gillus oryzae）由来のNAD-linkedマンニトールデヒド
ロゲナーゼはpH7.6，37℃，３分間処理で80％の残存活
性を有することが記載されている。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、従来の微生物が生産するマンニトールデ
ヒドロゲナーゼよりも熱安定性に優れたマンニトールデ
ヒドロゲナーゼを見い出す目的で種々鋭意検討した。
ヒドロゲナーゼよりも熱安定性に優れたマンニトールデ
ヒドロゲナーゼを見い出す目的で種々鋭意検討した。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らはアクチノバチルス（Actinobacillus）属に
属する微生物から熱安定性に優れたマンニトールデヒド
ロゲナーゼを見い出し本発明に到達した。すなわち本発
明は下記性質〜を有することを特徴とする耐熱性マ
ンニトールデヒドロゲナーゼである。
属する微生物から熱安定性に優れたマンニトールデヒド
ロゲナーゼを見い出し本発明に到達した。すなわち本発
明は下記性質〜を有することを特徴とする耐熱性マ
ンニトールデヒドロゲナーゼである。
反応式： 基質特異性：マンニトールに特異的に作用する。
至適pH：９．０〜１１．０ 至適温度：５０℃ Km値：約９．７〜１０-4Ｍ 分子量：約５７，０００（ゲル濾過法） 等電点：３．９±０．１（キャリアーアンホライトに
よる焦点電気泳動法） 熱安定性：pH７．６、３分間処理で４５℃まで安定で
ある。
よる焦点電気泳動法） 熱安定性：pH７．６、３分間処理で４５℃まで安定で
ある。
また本発明はアクチノバチルス（Actinobacillus）属に
属する上記性質〜を有する耐熱性マンニトールデヒ
ドロゲナーゼ生産菌を栄養培地で培養し、該培養物から
下記性質〜を有する耐熱性マンニトールデヒドロゲ
ナーゼを採取することを特徴とする耐熱性マンニトール
デヒドロゲナーゼの製造法である。
属する上記性質〜を有する耐熱性マンニトールデヒ
ドロゲナーゼ生産菌を栄養培地で培養し、該培養物から
下記性質〜を有する耐熱性マンニトールデヒドロゲ
ナーゼを採取することを特徴とする耐熱性マンニトール
デヒドロゲナーゼの製造法である。
本発明のマンニトールデヒドロゲナーゼはアクチノバチ
ルス（Actinobacillus）属に属する微生物、例えばアク
チノバチルス属sp.CRH-1271（微工研菌寄第7721号）な
どが生産する。
ルス（Actinobacillus）属に属する微生物、例えばアク
チノバチルス属sp.CRH-1271（微工研菌寄第7721号）な
どが生産する。
本発明のマンニトールデヒドロゲナーゼは上記菌株を栄
養培地で培養し、該培養物から分離、精製して得られ
る。
養培地で培養し、該培養物から分離、精製して得られ
る。
栄養培地の炭素源としては、クレアチン、クレアチニ
ン、グルコース、シュクロース、フラクトース、澱粉、
廃糖蜜、アルコール類、有機酸類が利用でき、天然栄養
源としてはペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンス
ティープリカー等が利用でき、窒素源としてはクレアチ
ン、クレアチニン、アンモニア、硫安、塩安、尿素等が
利用でき、無機塩類としてはリン酸カリウム、塩化カリ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等が利用でき
る。
ン、グルコース、シュクロース、フラクトース、澱粉、
廃糖蜜、アルコール類、有機酸類が利用でき、天然栄養
源としてはペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンス
ティープリカー等が利用でき、窒素源としてはクレアチ
ン、クレアチニン、アンモニア、硫安、塩安、尿素等が
利用でき、無機塩類としてはリン酸カリウム、塩化カリ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等が利用でき
る。
これらの栄養源は、それぞれ単独で用いることもでき、
また組合せて用いることもできる。菌株を培養するに当
っては、通常振盪培養または通気攪拌培養で行なうこと
ができる。一般に培養温度は25〜35℃、培地pHは6.5〜
7.5であるのが好ましく、通常、１〜２日間培養を行な
うと菌体中にマンニトールデヒドロゲナーゼが生成蓄積
する。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応じ、
マンニトールデヒドロゲナーゼの生産量が最大になるよ
うに設定することは当然である。
また組合せて用いることもできる。菌株を培養するに当
っては、通常振盪培養または通気攪拌培養で行なうこと
ができる。一般に培養温度は25〜35℃、培地pHは6.5〜
7.5であるのが好ましく、通常、１〜２日間培養を行な
うと菌体中にマンニトールデヒドロゲナーゼが生成蓄積
する。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応じ、
マンニトールデヒドロゲナーゼの生産量が最大になるよ
うに設定することは当然である。
該方法によって生成蓄積されたマンニトールデヒドロゲ
ナーゼを採取するに当っては、培養液に遠心分離濾過等
の操作をして、培養液から菌体を集め、得られた菌体を
ビーズ破砕もしくは超音波破砕等の操作をして菌体中か
らマンニトールデヒドロゲナーゼを取り出す。このよう
にして得られた粗酵素液からマンニトールデヒドロゲナ
ーゼを単離するに当っては、通常の酵素精製に使用され
る方法を使用できる。例えば、塩析、有機溶媒、透析、
等電点沈澱イオン交換法、ゲル濾過等の方法を組合せて
使用できる。精製マンニトールデヒドロゲナーゼを得る
ためには例えば粗酵素液を遠心分離し、上清を得る。さ
らにその上清を硫安塩析画分（0.35〜0.55飽和）を得
る。一液透析後、DEAE−セファロースCL4Bイオン交換体
に吸着溶出させる。活性画分を濃縮後、セファアクリル
Ｓ200のゲル濾過を行なうことにより高度に精製された
マンニトールデヒドロゲナーゼを単離することができ
る。
ナーゼを採取するに当っては、培養液に遠心分離濾過等
の操作をして、培養液から菌体を集め、得られた菌体を
ビーズ破砕もしくは超音波破砕等の操作をして菌体中か
らマンニトールデヒドロゲナーゼを取り出す。このよう
にして得られた粗酵素液からマンニトールデヒドロゲナ
ーゼを単離するに当っては、通常の酵素精製に使用され
る方法を使用できる。例えば、塩析、有機溶媒、透析、
等電点沈澱イオン交換法、ゲル濾過等の方法を組合せて
使用できる。精製マンニトールデヒドロゲナーゼを得る
ためには例えば粗酵素液を遠心分離し、上清を得る。さ
らにその上清を硫安塩析画分（0.35〜0.55飽和）を得
る。一液透析後、DEAE−セファロースCL4Bイオン交換体
に吸着溶出させる。活性画分を濃縮後、セファアクリル
Ｓ200のゲル濾過を行なうことにより高度に精製された
マンニトールデヒドロゲナーゼを単離することができ
る。
得られた酵素（粗酵素液または精製酵素）の活性は次の
方法で測定される。下記条件で１分間に１マイクロモル
のNADHを生成する酵素活性を１単位とする。
方法で測定される。下記条件で１分間に１マイクロモル
のNADHを生成する酵素活性を１単位とする。
活性測定用試薬 (A)6.0mMNAD溶液（0.429ｇのNADを蒸留水に溶解し100ml
とする） (B)0.5Ｍマンニトール（0.911ｇのマンニトールを蒸留
水に溶解し10.0mlとする） (C)酵素溶液（酵素標品を予め氷冷した60mMリン酸緩衝
液pH7.6で0.07〜0.30U/mlに希釈する） 手順 (1)試験管に上記試薬(A)1.0ml(B)0.2mlに60mMリン酸緩
衝液pH7.6を1.0ml、蒸留水0.8mlを加え混合し37℃で予
備加温する。
とする） (B)0.5Ｍマンニトール（0.911ｇのマンニトールを蒸留
水に溶解し10.0mlとする） (C)酵素溶液（酵素標品を予め氷冷した60mMリン酸緩衝
液pH7.6で0.07〜0.30U/mlに希釈する） 手順 (1)試験管に上記試薬(A)1.0ml(B)0.2mlに60mMリン酸緩
衝液pH7.6を1.0ml、蒸留水0.8mlを加え混合し37℃で予
備加温する。
(2)上記酵素溶液(C)0.1mlを加え反応を開始する。
(3)37℃に制御された分光光度計で340nmの吸光度変化を
４〜５分間記録し、その初期直線部分から１分間当りの
吸光度変化を求める。
４〜５分間記録し、その初期直線部分から１分間当りの
吸光度変化を求める。
(4)盲検は酵素溶液(C)0.1mlの代りに60mMリン酸緩衝液p
H7.6を加え、上記と同様な操作を行って１分間当りの吸
光度変化を求める。
H7.6を加え、上記と同様な操作を行って１分間当りの吸
光度変化を求める。
計算式 6.22＝NADHのミリモル分子吸光係数（cm2/micromole）
1.0＝光路長（cm） アクチノバチルス属sp.CRH-1271（微工研菌寄第7721
号）の生産するマンニトールデヒドロゲナーゼは次の性
質を有している。
1.0＝光路長（cm） アクチノバチルス属sp.CRH-1271（微工研菌寄第7721
号）の生産するマンニトールデヒドロゲナーゼは次の性
質を有している。
基質特異性：マンニトールに特異的に作用する。
至適pH：９．０〜１１．０（第１図参照） 至適温度：５０℃（第２図参照） Km値：約９．７×１０-4Ｍ 分子量：約５７，０００（ゲル濾過法） 等電点：３．９±０．１（キャリアーアンフォライト
による焦点電気泳動法） pH安定性：pH９以下（第３図参照） 温度安定性：45℃以下（pH7.6，３分間処理）（第４
図参照） （実施例） 本発明を具体的に実施例により説明する。
による焦点電気泳動法） pH安定性：pH９以下（第３図参照） 温度安定性：45℃以下（pH7.6，３分間処理）（第４
図参照） （実施例） 本発明を具体的に実施例により説明する。
実施例Ｉ 0.2％クレアチン、0.5ポリペプトン、0.5％酵母エキ
ス、1.4％K2HPO4、0.3％KH2PO4、0.01％MgSO4・７H2O、
pH7.0からなる培地50mlを500mlの坂口フラスコに入れ、
121℃で10分間オートクレーブ殺菌した。アクチノバチ
ルス（Actinobacillus）属sp.CRH-1271（微工研菌寄第7
721号）の１白金耳の上記培地に接種し、30℃，20時間
振盪培養し、種培養液とした。別に同条件にて殺菌した
培地６を含む10容ジャーファメンターへ上記種培養
液50mlを接種した。300rpm、通気量３／分、30℃で16
時間培養した。得られた培養液の酵素活性は0.29U/mlで
あった。
ス、1.4％K2HPO4、0.3％KH2PO4、0.01％MgSO4・７H2O、
pH7.0からなる培地50mlを500mlの坂口フラスコに入れ、
121℃で10分間オートクレーブ殺菌した。アクチノバチ
ルス（Actinobacillus）属sp.CRH-1271（微工研菌寄第7
721号）の１白金耳の上記培地に接種し、30℃，20時間
振盪培養し、種培養液とした。別に同条件にて殺菌した
培地６を含む10容ジャーファメンターへ上記種培養
液50mlを接種した。300rpm、通気量３／分、30℃で16
時間培養した。得られた培養液の酵素活性は0.29U/mlで
あった。
培養液６を遠心分離し、菌体を集め50mMリン酸緩衝液
に懸濁し、１としてビーズ破砕機（ダイノミルKDL）
により破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、上清を得
た。上清液に0.35飽和になるよう硫安を加え、遠心分離
し、上清を得た。その上清液をさらに0.55飽和になるよ
う硫安を加え遠心分離し、沈澱物を得た。50mMリン酸緩
衝液pH7.5，250mlに再溶解した。再溶解後を50mMリン酸
緩衝液pH7.5を平衡化したセファデックスＧ−25カラム
（２）で脱塩した。脱塩液をDEAE−セファロースCL4B
カラム50mlに吸着させ、0.4MNaClにて溶出した。DEAE−
セファロールのマンニトール画分を試料として酵素の理
化学的性質を測定したところ、前述の通りであった。溶
出液を限外濾過にて濃縮し、セファアクリルＳ−200カ
ラムにて分子篩を行なう。活性画分の比活性は0.81U/mg
蛋白であった。
に懸濁し、１としてビーズ破砕機（ダイノミルKDL）
により破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、上清を得
た。上清液に0.35飽和になるよう硫安を加え、遠心分離
し、上清を得た。その上清液をさらに0.55飽和になるよ
う硫安を加え遠心分離し、沈澱物を得た。50mMリン酸緩
衝液pH7.5，250mlに再溶解した。再溶解後を50mMリン酸
緩衝液pH7.5を平衡化したセファデックスＧ−25カラム
（２）で脱塩した。脱塩液をDEAE−セファロースCL4B
カラム50mlに吸着させ、0.4MNaClにて溶出した。DEAE−
セファロールのマンニトール画分を試料として酵素の理
化学的性質を測定したところ、前述の通りであった。溶
出液を限外濾過にて濃縮し、セファアクリルＳ−200カ
ラムにて分子篩を行なう。活性画分の比活性は0.81U/mg
蛋白であった。
（発明の効果） 本発明ではpH7.6、３分間処理で45℃まで安定である耐
熱性マンニトールデヒドロゲナーゼが得られる。
熱性マンニトールデヒドロゲナーゼが得られる。
第１図は本発明により得られた酵素のpHと活性の関係を
表わす。 第２図は温度と活性の関係を表わす。 第３図は25℃でそれぞれのpHで16時間処理したときのpH
と活性の関係を表わす。 第４図はpH7.6でそれぞれの温度で３分間処理したとき
の温度と活性の関係を表わす。 第５図は従来酵素（アスペルギルスオリゼー由来）の温
度安定性を示す。
表わす。 第２図は温度と活性の関係を表わす。 第３図は25℃でそれぞれのpHで16時間処理したときのpH
と活性の関係を表わす。 第４図はpH7.6でそれぞれの温度で３分間処理したとき
の温度と活性の関係を表わす。 第５図は従来酵素（アスペルギルスオリゼー由来）の温
度安定性を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】下記性質〜を有することを特徴とする
耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼ。 反応式： 基質特異性：マンニトールに特異的に作用する。 至適pH：９．０〜１１．０ 至適温度：５０℃ Km値：約９．７×１０-4Ｍ 分子量：約５７，０００（ゲル濾過法） 等電点：３．９±０．１（キャリアーアンホライトに
よる焦点電気泳動法） 熱安定性：pH７．６、３分間処理で４５℃まで安定で
ある。 - 【請求項２】アクチノバチルス（Actinobacillus）属に
属する下記性質〜を有する耐熱性マンニトールデヒ
ドロゲナーゼ生産菌を栄養培地で培養し、該培養物から
下記性質〜を有する耐熱性マンニトールデヒドロゲ
ナーゼを採取することを特徴とする耐熱性マンニトール
デヒドロゲナーゼの製造法。 反応式： 基質特異性：マンニトールに特異的に作用する。 至適pH：９．０〜１１．０ 至適温度：５０℃ Km値：約９．７×１０-4Ｍ 分子量：約５７，０００（ゲル濾過法） 等電点：３．９±０．１（キャリアーアンホライトに
よる焦点電気泳動法） 熱安定性：pH７．６、３分間処理で４５℃まで安定で
ある。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30680987A JPH0630571B2 (ja) | 1987-12-03 | 1987-12-03 | 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30680987A JPH0630571B2 (ja) | 1987-12-03 | 1987-12-03 | 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01148184A JPH01148184A (ja) | 1989-06-09 |
| JPH0630571B2 true JPH0630571B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=17961523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30680987A Expired - Lifetime JPH0630571B2 (ja) | 1987-12-03 | 1987-12-03 | 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630571B2 (ja) |
-
1987
- 1987-12-03 JP JP30680987A patent/JPH0630571B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01148184A (ja) | 1989-06-09 |
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