JPH0787780B2

JPH0787780B2 - 新規なザルコシンオキシダーゼおよびその製法

Info

Publication number: JPH0787780B2
Application number: JP1086611A
Authority: JP
Inventors: 秀喜上村; 三千代南; 起美萩野; 俊郎菊地; 重典愛水
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1989-04-04
Filing date: 1989-04-04
Publication date: 1995-09-27
Anticipated expiration: 2010-09-27
Also published as: JPH02265478A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は熱安定性に優れ、かつKm値の小さい新規なザル
コシンオキシダーゼ及びその製法に関するものである。

本発明の新規なザルコシンオキシダーゼは、血清、尿中
のクレアチン、クレアチニンの定量に用いられる。

（従来の技術）従来からザルコシンオキシダーゼは、バチルス属（特開
昭54-52789号公報）、コリネバクテリウム属（J.Bioche
m.89,599,（1981））、シリンドロカルポン属（特開昭5
6-92790号公報）、アルスロバクター属（特開昭54-2889
3号公報）、シュードモナス属（特開昭60-43379号公
報）等の菌株が生産することが知られている。しかしな
がらいずれの菌株の生産するザルコシンオキシダーゼも
熱安定性が十分でなく、もしくはKm値が大きく、実用上
問題があった。

（発明が解決しようとする問題点）本発明者らは上記の背景を踏まえ、従来のザルコシンオ
キシダーゼよりも熱安定性に優れ、かつKm値の小さい、
より実用的なザルコシンオキシダーゼを見い出そうと試
みた。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは上記問題点を解決するため鋭意研究を重ね
た結果、石川県加賀市内の土壌より分離した、アルスロ
バクター属に属すると同定された菌株、TE1826から従来
のザルコシンオキシダーゼよりも熱安定性に優れ、かつ
Km値の小さいザルコシンオキシダーゼを見い出した。

すなわち本発明は、下記性質〜を有する新規なザル
コシンオキシダーゼである。

下記の反応を触媒する。

ザルコシン＋H₂O＋O₂→グリシン＋ホルムアルデヒド＋H
₂O₂ 安定pHが6.5〜9.0付近である。

至適pHが7.0〜8.5付近である。

熱安定性が約55℃以下である。

至適温度が40〜50℃付近である。

ザルコシンに対するKm値が約2.8×10^-3Mである。

分子量が約65,000である（ゲルろ過法）。

また本発明は、上記性質〜を有する新規なザルコシ
ンオキシダーゼを産生するアルスロバクター属菌を栄養
培地にて培養し、該培養物から前記ザルコシンオキシダ
ーゼを採取することを特徴とする新規なザルコシンオキ
シダーゼの製法である。

本発明に用いる微生物は、上記性質を有するザルコシン
オキシダーゼを産生しうるアルスロバクター属菌であっ
て、好適な例としてはアルスロバクター・エスピー（Ar
throbacter sp.）TE1826があげられる。アルスロバクタ
ー・エスピー（Arthrobacter sp.）TE1826は本発明者ら
が土壌中より新たに分離した菌株であり、その菌学的性
質は下記のとおりである。

（ａ）形態（１）細胞の大きさ:0.5〜0.7×1.0〜10.0μｍの桿菌。

（２）細胞の多形性：生活環にともなう多形性有り。

（３）運動性：なし。

（４）胞子の有無：なし。

（５）グラム染色性：陽性。

（６）抗酸性：陰性。

（ｂ）各培地における生育状態（１）肉汁寒天平板培養:37℃、24時間培養で淡褐色円
形のコロニーを形成する。表面はなめらかで鈍い光沢を
有し、不透明である。色素の生成はない。

（２）肉汁寒天斜面培養：生育は良好で（１）に同じ。

（３）肉汁液体培養：静置培養は生育悪く、振とう培養
にて良好に生育する。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：上部のみ生育し、層状に
液化する。

（５）リトマスミルク：全く変化しない。

（ｃ）生理的性質（１）硝酸塩の還元：陽性。

（２）脱窒反応：陰性。

（３）MRテスト：陰性。

（４）VPテスト：陰性。

（５）インドールの生成：陰性。

（６）硫化水素の生成：陰性。

（７）デンプンの加水分解：陽性。

（８）クエン酸の利用：シモン培地で陰性、クリステン
セン培地で陽性。

（９）無機窒素源の利用：アンモニウム塩は利用するが
弱い。硝酸塩はほとんど利用しない。

（10）色素の生成：陰性。

（11）ウレアーゼ：陽性。

（12）オキシダーゼ：陰性。

（13）カタラーゼ：陽性。

（14）生育の範囲：生育pH域は5.0〜8.5、生育温度域は
10〜45℃。

（15）酸素に対する態度：好気性。

（16）O-Fテスト:O（酸化）（17）糖からの酸の生成Ｌ−アラビノース − Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース＋Ｄ−マンノース − Ｄ−フラクトース − Ｄ−ガラクトース − 麦芽糖（マルトース）＋ショ糖（サッカロース）＋乳糖（ラクトース） − トレハロース＋Ｄ−ソルビット＋Ｄ−マンニット＋イノシット − グリセリン＋デンプン＋上記菌学的性質の同定のための実験法は主として長谷川
武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」学会出版セン
ター（1985年）によって行った。

また分類同定の基準として「バージィス・マニュアル・
オブ・デタミネイティブ・バクテリオロジー」第８版
（1974年）を参考にした。

以上の菌学的性状における本菌TE1826は生活環にともな
う多形性が認められ、グラム染色は陽性の無胞子桿菌
で、通常栄養培地に良好に生育し、極めて好気的である
ことより、アルスロバクター属に属するとみなされ、ア
ルスロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）TP1826
と命名した。なお本菌は工業技術院微生物工業技術研究
所に、微工研菌寄第10637号として寄託されている。

本発明の酵素を製造するにあたっては、上記ザルコシン
オキシダーゼ生産菌を酵素を生産する通常の方法で培養
する。使用する培地組成としては使用菌株が資化しうる
炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含
有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用
できる。本発明においてはクレアチン又はクレアチニン
又はザルコシンを含有する培地で培養したときにザルコ
シンオキシダーゼが最も収量良く得られる。培養は通常
振とう培養あるいは通気撹拌培養で行う。培養温度は30
℃〜40℃で行うことが好ましい。これら以外の条件下で
も使用する菌株が生育すれば実施できる。通常１〜２日
の培養期間で生育し、菌体内にザルコシンオキシダーゼ
が生成蓄積される。

本発明酵素の精製法は一般に使用されている精製法を用
いることができる。例えば抽出法には超音波破砕、ガラ
スビーズを用いる機械的破砕、フレンチプレス、界面活
性剤、溶菌酵素などいずれを用いてもよい。さらに抽出
液については硫安や芒硝などの塩析法、塩化マグネシウ
ムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやエ
チレンイミンポリマーなどの凝集法、熱処理、さらには
イオン交換クロマトグラフィーなどにより精製すること
ができる。

次に本発明のザルコシンオキシダーゼの活性測定法を示
す。95mMザルコシン、0.47mM4−アミノアンチピリン、2
mMフェノール、4.5U/mlペルオキシダーゼ、0.045％トリ
トンX-100を含む48mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）を調製
した後、1.0mlを試験管に分取し、37℃で予備加温す
る。適当な濃度の酵素液0.05mlを添加し、37℃、10分間
反応させ、次にこれに0.25％ラウリル硫酸ナトリウム水
溶液を添加して反応を停止させ、分光光度計にて500nm
における吸光度変化を求める。ザルコシンオキシダーゼ
の活性の表示は、上記条件下で１分間に１マイクロモル
のH₂O₂を生成する酵素活性を１単位（Ｕ）とする。

次に本発明の酵素の理化学的な性質について述べる。

（１）作用及び基質特異性ザルコシンを酸化分解して、グリシン、ホルムアルデヒ
ドと過酸化水素を生成する反応を触媒する。なおザルコ
ミンに対するKm値は37℃、pH8.0（トリス塩酸緩衝液）
で約2.8×10^-3Mである。

（２）安定pH 本発明の酵素と0.1Mジメチルグルタル酸−NaOH緩衝液
（pH5.5〜6.5）、0.1MK−リン酸緩衝液（pH6.5〜7.
5）、0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5〜8.5）、0.1Mグリ
シン−NaOH緩衝液（pH8.5〜9.5）、0.1Mグリシン−NaCl
-NaOH緩衝液（pH9.0〜10.0）中で25℃、24時間保温後、
残存する酵素活性を測定した。その結果は第１図に示す
通りであって、安定pHは6.5〜9.0付近であった。

（３）至適pH 0.1MK−リン酸緩衝液（pH5.5〜7.5）、0.1Mトリス塩酸
緩衝液（pH7.5〜8.5）、0.1Mグリシン−NaOH緩衝液（pH
8.0〜9.0）、0.1Mグリシン−NaCl-NaOH緩衝液（pH9.0〜
10.0）中での酵素活性を測定した。その結果は第２図に
示す通りであって、至適pHは7.0〜8.5付近であった。

（４）熱安定性本発明の酵素を50mMK−リン酸緩衝液（pH7.5）中で25〜
60℃、10分間保温した後、残存する酵素活性を測定し
た。その結果は第３図に示す通りであって約55℃まで安
定であった。

（５）至適温度 25〜60℃の各温度における酵素活性を測定した。その結
果は第４図に示す通りであって、至適温度は40〜50℃付
近であった。

（６）分子量 HPLC用カラムAsahipak GFA-50（旭化成工業製）を用い
たゲルろ過法を行った結果、分子量は約65,000であっ
た。

（７）等電点アンホライン（LKB製）を用いた電気泳動の結果、等電
点は約pH4.9であった。

（実施例）以下、実施例をあげ本発明を具体的に示す。

実施例１ザルコシン0.5％、クレアチン0.5％、肉エキス0.3％、
ポリペプトン0.3％、酵母エキス0.3％、KH₂PO₄0.1％、K
₂HPO₄0.22％、MgSO₄・7H₂O0.05％を含む培地（pH7.0）5
mlを30ml容試験管に移し、121℃、15分間オートクレー
ブ殺菌を行なった。種菌としてアルスロバクター・エス
ピー（Arthrobacter sp.）TE1826（微工研菌寄第10637
号）を１白金耳植菌し、37℃で16時間振とう培養し、種
培養液とした。次に同培地500mlを2l容坂口フラスコに
移し、121℃、15分間オートクレーブを行った。これに
種培養液5mlを移し、37℃で24時間振とう培養した。培
養終了時のザルコシンオキシダーゼ活性は0.3U/mlであ
った。

培養液500mlを遠心分離にて集菌し、50mMK−リン酸緩衝
液（pH7.5）50mlにて懸濁した。超音波破砕機（海上電
気製、19KHz）にて20分間処理し、遠心分離にてその上
清液45mlを得た。硫酸アンモニウム22gを添加、溶解
し、遠心分離にて塩析沈殿物を得た。これを50mMK−リ
ン酸緩衝液（pH7.5）25mlにて懸濁し、遠心分離にて上
清液を得た。上清液を50mMK−リン酸緩衝液にて平衡化
したセファデックスG-25（ファルマシア製）で脱塩を行
なった。次に同緩衝液にて平衡化したDEAE−セファロー
スCL-6B（ファルマシア製）カラムクロマトグラフィー
に供し、０〜0.4MNaCl容出画分にザルコシンオキシダー
ゼ酵素活性を得た。溶出液を55℃、１時間熱処理した
後、50mMK−リン酸緩衝液（pH7.5）にて平衡化したセフ
ァデックスG-25（ファルマシア製）で脱塩を行った。そ
の結果65Uの酵素が得られた。得られた酵素の理化学的
性質は前述の通りであった。

比較例１比較のために先行技術文献に記載されているザルコシン
オキシダーゼの理化学的性質を第１表に示す。

（発明の効果）本発明では熱安定性に優れ、かつKm値の小さい新規なザ
ルコシンオキシダーゼが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のザルコシンオキシダーゼのpH安定性を
示す。第２図は本発明のザルコシンオキシダーゼの至適pHを示
す。第３図は本発明のザルコシンオキシダーゼの熱安定性を
示す。第４図は本発明のザルコシンオキシダーゼの至適温度を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者愛水重典福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀酵素工場内審査官種村慈樹 (56)参考文献特開昭54−28893（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−162174（ＪＰ，Ａ)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記性質〜を有する新規なザルコシン
オキシダーゼ。下記の反応を触媒する。ザルコシン＋H₂O＋O₂→グリシン＋ホルムアルデヒド＋H
₂O₂ 安定pHが6.5〜9.0付近である。至適pHが7.0〜8.5付近である。熱安定性が約55℃以下である。至適温度が40〜50℃付近である。ザルコシンに対するKm値が約2.8×10^-3Mである。分子量が約65,000である（ゲルろ過法）。
【請求項２】下記性質〜を有する新規なザルコシン
オキシダーゼを産生するアルスロバクター属菌を栄養培
地にて培養し、該培養物から前記ザルコシンオキシダー
ゼを採取することを特徴とする新規なザルコシンオキシ
ダーゼの製法。下記の反応を触媒する。ザルコシン＋H₂O＋O₂→グリシン＋ホルムアルデヒド＋H
₂O₂ 安定pHが6.5〜9.0付近である。至適pHが7.0〜8.5付近である。熱安定性が約55℃以下である。至適温度が40〜50℃付近である。ザルコシンに対するKm値が約2.8×10^-3Mである。分子量が約65,000である（ゲルろ過法）。