JPH01148184A - 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 - Google Patents
耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法Info
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- JPH01148184A JPH01148184A JP30680987A JP30680987A JPH01148184A JP H01148184 A JPH01148184 A JP H01148184A JP 30680987 A JP30680987 A JP 30680987A JP 30680987 A JP30680987 A JP 30680987A JP H01148184 A JPH01148184 A JP H01148184A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は耐熱性に優れたマンニトールデヒドロゲナーゼ
に関するものである。特にアクチノバチルス（Ａｃｔｉ
ｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物から得られる
耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼに関する０本発明
の酵素は血清、尿中のα−アミラーゼ等の酵素活性測定
用に用いられる。
に関するものである。特にアクチノバチルス（Ａｃｔｉ
ｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物から得られる
耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼに関する０本発明
の酵素は血清、尿中のα−アミラーゼ等の酵素活性測定
用に用いられる。
（従来の技術）
従来からマンニトールデヒドロゲナーゼを生産する微生
物としてニジエリシア・コリー（ＩＥｓｃｈｅ−ｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）＋ アエロバクタ−・アエロバクタ
（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、アス
ペルギルス・オリジエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒ
ｙｚａｅ）アスペルギルス・ニガー（八ｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｎｉｇｅｒＬアスペルギルスディダス（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ）などが知られて
いる。
物としてニジエリシア・コリー（ＩＥｓｃｈｅ−ｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）＋ アエロバクタ−・アエロバクタ
（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、アス
ペルギルス・オリジエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒ
ｙｚａｅ）アスペルギルス・ニガー（八ｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｎｉｇｅｒＬアスペルギルスディダス（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ）などが知られて
いる。
しかし、これらの微生物が生産するマンニトールデヒド
ロゲナーゼは熱安定性が十分でなかった。
ロゲナーゼは熱安定性が十分でなかった。
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー第８９巻第２号第
３２６頁（１９６５年）には、アスペルギルス・オリゼ
ー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のＮ
ＡＤ−ｌｉｎｋｅｄマンニトールデヒドロゲナーゼはｐ
Ｈ７、６．３７℃．３分間処理で８０％の残存活性を有
することが記載されている。
３２６頁（１９６５年）には、アスペルギルス・オリゼ
ー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のＮ
ＡＤ−ｌｉｎｋｅｄマンニトールデヒドロゲナーゼはｐ
Ｈ７、６．３７℃．３分間処理で８０％の残存活性を有
することが記載されている。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者らは、従来の微生物が生産するマンニトールデ
ヒドロゲナーゼよりも熱安定性に優れたマンニトールデ
ヒドロゲナーゼを見い出す目的で種々鋭意検討した。
ヒドロゲナーゼよりも熱安定性に優れたマンニトールデ
ヒドロゲナーゼを見い出す目的で種々鋭意検討した。
（問題を解決するための手段）
本発明者らはアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属に属する微生物から熱安定性に優れたマン
ニトールデヒドロゲナーゼを見い出し本発明に到達した
。すなわち本発明は下記反応を触媒し、かつｐＨ７、６
． ３分間処理で４５℃まで安定であることを特徴とす
る耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼである。
ｌｌｕｓ）属に属する微生物から熱安定性に優れたマン
ニトールデヒドロゲナーゼを見い出し本発明に到達した
。すなわち本発明は下記反応を触媒し、かつｐＨ７、６
． ３分間処理で４５℃まで安定であることを特徴とす
る耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼである。
反応式：
また本発明はアクチノバチルス（八ｃｔｉｎｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属に属する耐熱性マンニトールデヒドロゲナ
ーゼ生産菌を栄養培地で培養し、該培養物から耐熱性マ
ンニトールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とす
る耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼの製造法である
。
ｌｌｕｓ）属に属する耐熱性マンニトールデヒドロゲナ
ーゼ生産菌を栄養培地で培養し、該培養物から耐熱性マ
ンニトールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とす
る耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼの製造法である
。
本発明のマンニトールデヒドロゲナーゼはアクチノバチ
ルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生
物、例えばアクチノバチルス属ｓｐ．ＣＲＨ−１２７１
（微工研菌寄第７７２１号）などが生産する。
ルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生
物、例えばアクチノバチルス属ｓｐ．ＣＲＨ−１２７１
（微工研菌寄第７７２１号）などが生産する。
本発明のマンニトールデヒドロゲナーゼは上記菌株を栄
養培地で培養し、該培養物から分離、精製して得られる
。
養培地で培養し、該培養物から分離、精製して得られる
。
栄養培地の炭素源としては、クレアチン、クレアチニン
、グルコース、シュクロース、フラクトース、澱粉、廃
糖蜜、アルコール類、有機酸類が利用でき、天然栄養源
としてはペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステ
イープリカー等が利用でき、窒素源としてはクレアチン
、クレアチニン、アンモニア、硫安、塩安、尿素等が利
用でき、無機塩類としてはリン酸カリウム、塩化カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等が利用できる
。
、グルコース、シュクロース、フラクトース、澱粉、廃
糖蜜、アルコール類、有機酸類が利用でき、天然栄養源
としてはペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステ
イープリカー等が利用でき、窒素源としてはクレアチン
、クレアチニン、アンモニア、硫安、塩安、尿素等が利
用でき、無機塩類としてはリン酸カリウム、塩化カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等が利用できる
。
これらの栄養源は、それぞれ単独で用いることもでき、
また組合せて用いることもできる。菌株を培養するに当
っては、通常振盪培養または通気撹拌培養で行なうこと
ができる．一般に培養温度は２５〜３５℃、培地ｐＨは
６．５〜７。５であるのが好ましく、通常、１〜２日間
培養を行なうと菌体中にマンニトールデヒドロゲナーゼ
が生成蓄積する。培養条件は使用する菌株、培地組成な
どに応じ、マンニトールデヒドロゲナーゼの生産量が最
大になるように設定することは当然である。
また組合せて用いることもできる。菌株を培養するに当
っては、通常振盪培養または通気撹拌培養で行なうこと
ができる．一般に培養温度は２５〜３５℃、培地ｐＨは
６．５〜７。５であるのが好ましく、通常、１〜２日間
培養を行なうと菌体中にマンニトールデヒドロゲナーゼ
が生成蓄積する。培養条件は使用する菌株、培地組成な
どに応じ、マンニトールデヒドロゲナーゼの生産量が最
大になるように設定することは当然である。
該方法によって生成蓄積されたマンニトールデヒドロゲ
ナーゼを採取するに当っては、培養液に遠心分離濾過等
の操作をして、培養液から菌体を集め、得られた菌体を
ビーズ破砕もしくは超音波破砕等の操作をして菌体中か
らマンニトールデヒドロゲナーゼを取り出す．このよう
にして得られた粗酵素液からマンニトールデヒドロゲナ
ーゼを単離するに当っては、通常の酵素精製に使用され
る方法を使用できる．例えば塩析、有機溶媒、透析、等
電点沈澱イオン交換法、ゲル濾過等の方法を組合せて使
用できる．精製マンニトールデヒドロゲナーゼを得るた
めには例えば粗酵素液を遠心分離し、上清を得る．さら
にその上清の硫安塩析画分（０．３５〜０．５５飽和）
を得る。−液透析後、［ＩＥＡＥ−セファロースＣＬ４
Ｂイオン交換体に吸着溶出させる．活性画分を濃縮後、
セファアクリルＳ２００のゲル濾過を行なうことにより
高度に精製されたマンニトールデヒドロゲナーゼを単離
することができる。
ナーゼを採取するに当っては、培養液に遠心分離濾過等
の操作をして、培養液から菌体を集め、得られた菌体を
ビーズ破砕もしくは超音波破砕等の操作をして菌体中か
らマンニトールデヒドロゲナーゼを取り出す．このよう
にして得られた粗酵素液からマンニトールデヒドロゲナ
ーゼを単離するに当っては、通常の酵素精製に使用され
る方法を使用できる．例えば塩析、有機溶媒、透析、等
電点沈澱イオン交換法、ゲル濾過等の方法を組合せて使
用できる．精製マンニトールデヒドロゲナーゼを得るた
めには例えば粗酵素液を遠心分離し、上清を得る．さら
にその上清の硫安塩析画分（０．３５〜０．５５飽和）
を得る。−液透析後、［ＩＥＡＥ−セファロースＣＬ４
Ｂイオン交換体に吸着溶出させる．活性画分を濃縮後、
セファアクリルＳ２００のゲル濾過を行なうことにより
高度に精製されたマンニトールデヒドロゲナーゼを単離
することができる。
得られた酵素（粗酵素液または精製酵素）の活性は次の
方法で測定される。下記条件で１分間に１マイクロモル
のＮＡＤＨを生成する酵素活性を１単位とする。
方法で測定される。下記条件で１分間に１マイクロモル
のＮＡＤＨを生成する酵素活性を１単位とする。
活性測定用試薬
（＾） ６．ＯｍＭＮＡＤ溶液（０，４２９ｇのＮＡＤ
を蒸留水に溶解し１００ｍとする） （Ｂ） ０．５Ｍマンニトール（０，９１１ｇのマンニ
トールを蒸留水に溶解し１０．０１１とする）（Ｃ）酵
素溶液（酵素標品を予め氷冷した６０ｍＭリン酸緩衝液
ＰＨ７，６で０．０７〜０．３０Ｕ／＋ｄに希釈する）
手 順 （１） 試験管に上記試薬（＾）１．０ｄ （Ｂ）０
．２ｍｇに６０−Ｍリン酸緩衝液９Ｈ１，６を１．０ｄ
、蒸留水０．８ｍを加え混合し３７℃で予備加温する。
を蒸留水に溶解し１００ｍとする） （Ｂ） ０．５Ｍマンニトール（０，９１１ｇのマンニ
トールを蒸留水に溶解し１０．０１１とする）（Ｃ）酵
素溶液（酵素標品を予め氷冷した６０ｍＭリン酸緩衝液
ＰＨ７，６で０．０７〜０．３０Ｕ／＋ｄに希釈する）
手 順 （１） 試験管に上記試薬（＾）１．０ｄ （Ｂ）０
．２ｍｇに６０−Ｍリン酸緩衝液９Ｈ１，６を１．０ｄ
、蒸留水０．８ｍを加え混合し３７℃で予備加温する。
（２）上記酵素溶液（Ｃ）０．１ｍを加え反応を開始す
る。
る。
（３） ３７℃に制御された分光光度計で３４０ｍｍ
の吸光度変化を４〜５分間記録し、その初期直線部分か
ら１分間当りの吸光度変化を求める。
の吸光度変化を４〜５分間記録し、その初期直線部分か
ら１分間当りの吸光度変化を求める。
（４） 盲検は酵素溶液（Ｃ）０．１ｍの代りに６０
＋ｗＭ’Ｊン酸緩衝液ｐｌ！７．６を加え、上記と同様
な操作を行って１分間当りの吸光度変化を求める。
＋ｗＭ’Ｊン酸緩衝液ｐｌ！７．６を加え、上記と同様
な操作を行って１分間当りの吸光度変化を求める。
計算式
％式％
６．２２ ＝ ＮＡＤｌｌのミリモル分子吸光係数（ｃ
ｍ”／５ｉｃｒ。
ｍ”／５ｉｃｒ。
ｍｏｌｅ）１．０＝光路長（１）
アクチノバチルス属ｓｐ、ＣＲＨ−１２７１（微工研菌
寄第７７２１号）の生産するマンニトールデヒドロゲナ
ーゼは次の性質を有している。
寄第７７２１号）の生産するマンニトールデヒドロゲナ
ーゼは次の性質を有している。
■ 基質特異性：マンニトールに特異的に作用する。
■ 至適ｐＨ： ９．０〜１１．０ （第１図参照）■
至適温度：５０℃（第２図参照） ■ Ｋ−値：約９．７Ｘ１０−’Ｍ ■ 分子量：約５７゜０００（ゲル濾過法）［６］ 等
電点：３．９±０．１（キャリアーアンフオライトによ
る焦点電気泳動法） ■ ｐＨ安定性：ｐｌ＋９以下（第３図参照）■ 温度
安定性８４５℃以下（ｐＨ７，６，３分間処理）（第４
図参照） （実施例） 本発明を具体的に実施例により説明する。
至適温度：５０℃（第２図参照） ■ Ｋ−値：約９．７Ｘ１０−’Ｍ ■ 分子量：約５７゜０００（ゲル濾過法）［６］ 等
電点：３．９±０．１（キャリアーアンフオライトによ
る焦点電気泳動法） ■ ｐＨ安定性：ｐｌ＋９以下（第３図参照）■ 温度
安定性８４５℃以下（ｐＨ７，６，３分間処理）（第４
図参照） （実施例） 本発明を具体的に実施例により説明する。
実施例１
０．２％クレアチン、０．５ポリペプトン、０．５％酵
母エキス、１．４％ＫＪＰＯｎ、０．３％ＫＨＩＰＯ４
，０，０１％Ｍ、ＳＱ。
母エキス、１．４％ＫＪＰＯｎ、０．３％ＫＨＩＰＯ４
，０，０１％Ｍ、ＳＱ。
・７ ＨｚＯ−ＰＩ１７．Ｏからなる培地５０ｊｄを５
００ ｍの坂ロフラスコに入れ、１２１℃で１０分間オ
ートクレーブ殺菌した。アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属ｓｐ。
００ ｍの坂ロフラスコに入れ、１２１℃で１０分間オ
ートクレーブ殺菌した。アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属ｓｐ。
ＣＲＨ−１２７１（微工研菌寄第７７２１号）の１白金
耳の上記培地に接種し、３０℃、２０時間振盪培養し、
種培養液とした。別に同条件にて殺菌した培地６２を含
む１０１容ジヤーフアメンターへ上記種培養液５０ｄを
接種した。 ３００ｒｐｍ、通気量３１／分、３０℃で
１６時間培養した。得られた培養液の酵素活性は０．２
９０／ｄであった。
耳の上記培地に接種し、３０℃、２０時間振盪培養し、
種培養液とした。別に同条件にて殺菌した培地６２を含
む１０１容ジヤーフアメンターへ上記種培養液５０ｄを
接種した。 ３００ｒｐｍ、通気量３１／分、３０℃で
１６時間培養した。得られた培養液の酵素活性は０．２
９０／ｄであった。
培養液６２を遠心分離し、菌体を集め５０ｍＭ’Ｊン酸
緩衝液に懸濁し、１１としてビーズ破砕機（ダイノミル
ｉ［ＯＬ ＞により破砕した。菌体破砕液を遠心分離し
、上清を得た。上清液に０．３５飽和になるよう硫安を
加え、遠心分離し、上清を得た。その上清液にさらに０
．５５飽和になるよう硫安を加え遠心分離し、沈澱物を
得た。５０ａＭＩＪン酸緩衝液ｐｉ＋７．５．２５（ｌ
ｄに再溶解した。再溶解液を５０ｍＭリン酸緩衝液ＰＨ
７，５で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２
１）で脱塩した。脱塩液をＤＥＡＲ−セファロースＣＬ
４Ｂカラム５０ｄに吸着させ、０．４ＭＮａＣｌにて溶
出した。 ＤＥＡＲ−セファロールのマンニトール画分
を試料として酵素の理化学的性質を測定したところ、前
述の通りであった。溶出液を限外濾過にて濃縮し、セフ
ァアクリルＳ−２００カラムにて分子篩を行なう、活性
画分の比活性は０．８１Ｕ／ｍｇ蛋白であった。
緩衝液に懸濁し、１１としてビーズ破砕機（ダイノミル
ｉ［ＯＬ ＞により破砕した。菌体破砕液を遠心分離し
、上清を得た。上清液に０．３５飽和になるよう硫安を
加え、遠心分離し、上清を得た。その上清液にさらに０
．５５飽和になるよう硫安を加え遠心分離し、沈澱物を
得た。５０ａＭＩＪン酸緩衝液ｐｉ＋７．５．２５（ｌ
ｄに再溶解した。再溶解液を５０ｍＭリン酸緩衝液ＰＨ
７，５で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２
１）で脱塩した。脱塩液をＤＥＡＲ−セファロースＣＬ
４Ｂカラム５０ｄに吸着させ、０．４ＭＮａＣｌにて溶
出した。 ＤＥＡＲ−セファロールのマンニトール画分
を試料として酵素の理化学的性質を測定したところ、前
述の通りであった。溶出液を限外濾過にて濃縮し、セフ
ァアクリルＳ−２００カラムにて分子篩を行なう、活性
画分の比活性は０．８１Ｕ／ｍｇ蛋白であった。
（発明の効果）
本発明ではｐＨ７，６，３分間処理で４５℃まで安定で
ある耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼが得られる。
ある耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼが得られる。
第１図は本発明により得られた酵素のｐｉと活性の関係
を表わす。 第２図は温度と活性の関係を表わす。 第３図は２５℃でそれぞれのｐｏで１６時間処理したと
きのｐＨと活性の関係を表わす。 第４図はｐ Ｉ＋ ７ 、６でそれぞれの温度で３分間
処理したときの温度と活性の関係を表わす。 第５図は従来酵素（アスペルギルスオリゼー由来）の温
度安定性を示す。 特許出願人 東洋紡績株式会社 芥 ＩＩｉ！Ｉ 至遁ｐ）（ （ｐＨン 早２Ｘ！Ｉ ；ａｈ ｉ（”Ｃ） 早 ３ 図 Ｈ ＄４ 図 早 ５ｒｇ 手続補正書（方式） １、事件の表示 昭和６２年特許願第３０６８０９号 ２、発明の名称 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 昭和６２年 ２月 ３日 （発送臼：昭和６２年 ２月２３日） ５、補正の対象 ６、補正の内容 発明の名称を「耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼお
よびその製造法」に訂正する。
を表わす。 第２図は温度と活性の関係を表わす。 第３図は２５℃でそれぞれのｐｏで１６時間処理したと
きのｐＨと活性の関係を表わす。 第４図はｐ Ｉ＋ ７ 、６でそれぞれの温度で３分間
処理したときの温度と活性の関係を表わす。 第５図は従来酵素（アスペルギルスオリゼー由来）の温
度安定性を示す。 特許出願人 東洋紡績株式会社 芥 ＩＩｉ！Ｉ 至遁ｐ）（ （ｐＨン 早２Ｘ！Ｉ ；ａｈ ｉ（”Ｃ） 早 ３ 図 Ｈ ＄４ 図 早 ５ｒｇ 手続補正書（方式） １、事件の表示 昭和６２年特許願第３０６８０９号 ２、発明の名称 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 昭和６２年 ２月 ３日 （発送臼：昭和６２年 ２月２３日） ５、補正の対象 ６、補正の内容 発明の名称を「耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼお
よびその製造法」に訂正する。
Claims (3)
- （１）下記反応を触媒し、かつｐＨ７．６、３分間処理
で４５℃まで安定であることを特徴とする耐熱性マンニ
トールデヒドロゲナーゼ。 反応式： ▲数式、化学式、表等があります▼ - （２）下記の性質を有する特許請求の範囲第１項記載の
耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼ。 ［１］基質特異性：マンニトールに特異的に作用する。 ［２］至適ｐＨ：９．０〜１１．０ ［３］至適温度：５０℃ ［４］Ｋｍ値：約９．７×１０＾−＾４Ｍ ［５］分子量：約５７，０００（ゲル濾過法）［６］等
電点：３．９±０．１（キャリアーアンフォライトによ
る焦点電気泳動法） - （３）アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ）属に属する耐熱マンニトールデヒドロゲナーゼ生産
菌を栄養培地で培養し、該培養物から耐熱性マンニトー
ルデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする耐熱性
マンニトールデヒドロゲナーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30680987A JPH0630571B2 (ja) | 1987-12-03 | 1987-12-03 | 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30680987A JPH0630571B2 (ja) | 1987-12-03 | 1987-12-03 | 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01148184A true JPH01148184A (ja) | 1989-06-09 |
| JPH0630571B2 JPH0630571B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=17961523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30680987A Expired - Lifetime JPH0630571B2 (ja) | 1987-12-03 | 1987-12-03 | 耐熱性マンニトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630571B2 (ja) |
-
1987
- 1987-12-03 JP JP30680987A patent/JPH0630571B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0630571B2 (ja) | 1994-04-27 |
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