JPH07508765A - トロンビンインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンビンインヒビター 発明の背景 本発明は新規のトロンビンインヒビター、とくに、ヒル組織およびヒル分泌物に 由来するトロンビンインヒビターに関する。

トロンビンは、フィブリン凝固の形成を触媒し、したがって血液凝固を阻害する 。さらに、トロンビンは、例えば血小板凝集の直接的活性化や内皮細胞によって 血小板活性化因子（ＰＡＦ）の合成を刺激することによる炎症性応答の活性化な どいくつかの他の生物調整的役割を有する。すなわち、トロンビンは、例えば心 臓血管系疾患などの血栓症関連障害において中心的役割を担っている。

このようなことから、新規あるいは改良トロンビンインヒビターおよび抗凝血剤 の不断の探求に大きな関心が寄せられている。

よく知られたトロンビンインヒビターの例としては、ヘパリンおよびヒルジンが ある。

ヘパリンは、抗トロンビンＩＩＩの抗凝血活性を促進する。これは、トロンビン 活性が血栓の形成または拡大の原因となっている静脈血栓塞栓症などの治療に広 く用いられている。これは抗トロンビンＩＩＩが減少している場合、例えばネフ ローゼまたは汎発性血管内血液凝固症候群（ＤＩＧ）を伴う血栓症の場合の治療 には有効ではない、さらに、ヘパリンは、出血および栓球減少症を含む多くの望 ましくない副作用をもたらす。

ヒルジンはトロンビンに特異的であることが知られたよく特徴づけされた公知の ポリペプチドであり、旦１ｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ種のヒルの唾液腺 抽出物および他の組織から分離することができる。ヒルジンおよびその誘導体は また、組み替え技術によっても得られる。ポリペプチドは比較的低分子量の７０ ００Ｄを有し、６５個のアミノ酸からなる。ヒルジンのアミノ酸配列は、Ｄｏｄ 　ｔら（ＦＥＢ、Ｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、１６５，１８０−１８４．１９８４）に よって初めて決定された。三つの主要なヒルジン変種（ＨＶｌ、）（Ｖ２、ＨＶ ３）が医用ヒルのＨｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓから見出だされ、これ らは全アミノ酸位置の約１０％が異なっているのみである。最も顕著な違いは、 分子のＮ末端の最初の二位置に見られる。すなわち、ヒルジン変種１　（ＨＶＩ ）ではＶａｌ−Ｖａ　ｌであり、ヒルジン変種２　（ＨＶ２）ではＩＩｅ−Ｔｈ ｒである。これらの相違は、あまり重要ではなく、機能にもヒルジン−トロンビ ン相互作用の特異性にも影響しない、ヒルジンは天然凝固阻害剤である。

これは静脈血栓症、血管シャント閉塞およびトロンビン誘導汎発性血管向凝固の 予防に効果を示すが、しかし出血時間を延長する。

系統発生学的には、医用ヒルのＨｉｒｕｄｏｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓはヒル科） １ｉ　ｒｕｄｉｎｉｄａｅの亜科Ｈｉ　ｒ　ｕ　ｄ　ｉ　ｎ　ｉ　ｎ　ａ　ｅに 属する（Ｒ，Ｔ、Ｓａｗｙｅｒ、ｒＬｅｅｃｈ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｅ ｈａｖｉｏｕｒＪ、○ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｖｏｌ 、２．６８８．１９８６）、より進化したヒル種はＩＩ　ｉ　ｒ　ｕ　ｄ　ｉ　 ｎ　ａ　ｒ　ｉ　ａ　ｍ　ａ　ｎ　１Ｉｌｅｎｓｉｓであり、これは同じ科Ｈｉ 　ｒ　ｕ　ｄ　ｉ　ｎ１ｄａｅの亜科Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉｉｎａｅに属する。

意外にも、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０１０５１４３に記述されるように、関連する が明らかに異なるヒルジンの同種型が最近Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ　ｍａｎｉｌ ｌｅｎｓｉｓに見出だされた。この同種型は、且ユｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａ ｌｉｓからのヒルジンと較べるとアミノ酸位置の約４０％が異なっている。上記 ［顎ヒル類Ｊ）に属する。Ａｒｈ　ｎｃｈｏｂｄｅｌｌ　ｉｄａ目に加えて、も う一つの主要なヒル目は１１Ｕ匹−上−立二ｂｄニー土−ｌ　ｉｄａ　（ｒ吻ヒ ル類」）である（Ｒ，Ｔ、Ｓａｗｙｅｒ、ｒＬｃｅｃｈ　Ｂｊｏｌｏｇｙ　ａｎ ｄ　Ｂｃｈａｖｉｏｕｒ」、○ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ 、Ｖｏｌ、２．６５１．１９８６）、唾液腺タンパク質に関して最もよく研究意 外にもこの種は抗トロンビンを含まないことが立証された（Ｂｕｄｚｙｎｓｋｉ ら、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ。

１：、Ｘ　ＩＩ　、　Ｂ　ｉ　ｏ　ｌ　、　Ｍ　ｃ　ｄ　、　、ｌ　６８．２５ り−２６５，１９８１）、代わりに、Ｉｌａｃｍｃｎｔｅｒｉａ−１」Ｌニー上 −し」一旦一旦」−はへメンチンと呼ばれるフィブリノーゲン溶解酵素（ＵＳ特 許４３９０６３０）および血液凝固因子Ｘａの阻害剤（Ｃ，Ｃｏｎｄｒａら、Ｔ ｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔ、　、６１．４３７−４４１．１９８６）　を含む 。

この発見および続いての研究に基づいて、抗トロンビン様活性は、Ｎ二几」−上 −几ｃｈ−ニー昼二［」−ニー１　ｉｄａ目のヒ、ルに限定されることが一般に 認められて、一方、抗トロンビン様活性は１几り立上エユ上１１ユニユニ」目に は欠損していると近年は考えられでいる。

上記のような進展にもかかわらず、ヘパリンおよびヒルジン以外の、凝固形成阻 害、トロンビン誘導血小板活性化または内皮細胞活性化において増強された効用 を有し、商業的にも有用な量の生産が可能な抗凝固剤および抗トロンビン剤が今 も要求されている。

発明の概要 驚いたことに、抗トロンビン様活性を有する化合物をＲｈ　ｎｃｈｏｂｄｅｌｌ ｉｄａ目、好ましくは工ｈｅｒｏｍ　ｚｏｎ科、最も好ましくはＴｈｅｒｏｍＬ 工工ｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍ種のヒルの組織および分泌物から分離できること が見出だされた。Ｔｈｅｒ上ユＬユニｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍ種は水鳥の鼻孔 から血を吸うという変わったライフスタイルを有する二とから、時に「鳥ヒルｊ と呼ばれる。

したがって、本発明の目的は、Ｒｈ　ｎｃｈｏｂｄｅｌｌｉｄａ目、好ましくは Ｔｈｅｒｏｍ　ｚｏｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍ種のヒルをトロンビン阻害化合物 の調製のために使用することである。

トロンビン阻害活性はこれらのヒルの水溶性成分からなる抽出物を測定すること で決定できることが見出だされた。したがって、本発明の目的は、ｋ種のヒルの 組織または分泌物からその水溶性成分を含むトロンビン阻害活性を有する抽出物 を調製することである。

活性のトロンビンインヒビターは該抽出物から分離することができた。すなわち 、本発明の目的は上記および請求の範囲に定義した抽出物から得られるトロンビ ン阻害活性を有するポリペプチドとして同定され得る本質的に精製されたトロン ビンインヒビターを提供することであって、これは頭部から三分の−の凍結およ び凍結乾燥したヒルを水／アセトンを用いて均質化して得た抽出物をトロンビン 特異性アフィニティークロマトグラフィーにかけて、次いで少なくとも一つのゲ ル濾過ステップおよび少な（とも一つの逆相ＨＰＬＣステップで精製することに よってなされる。

トロンビンインヒビターは好ましくは、分子量がそれぞれ約３ｋＤ、約９ｋＤお よび約１４ｋＤの活性ポリペプチド断片を含む、これらの活性ポリペプチドは、 オリジナルまたは前駆トロンビンインヒビターの分解産物とみなされる。

本発明によるトロンビンインヒビターは、公知の抗トロンビン剖、とくにヒルジ ンとは分子量および等電点およびＮ末端アミノ酸配列が異なり、他のトロンビン インヒビターとは限定された相同性（４０％以下）しか示さないことから新規で ある。

したがって、本発明のさらなる目的は該抽出物からトロンビン阻害活性を有し、 分子量が約３ｋＤである少なくとも一つのポリペプチドからなるトロンビンイン ヒビターを分離することである。

加えて、本発明の目的は、トロンビン阻害活性を有し、分子量が約９ｋＤであり 、Ｎ末端アミノ酸配列を有する少なくとも一つのポリペプチドからなるトロンビ ンインヒビターを提供することである。

加えて、本発明の目的は、トロンビン阻害活性を有し、分子量が約１４ｋＤであ り、Ｎ末端アミノ酸配列Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｃ ｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　５ｅｒＡｓ ｎ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙ ｓ。

を有する少なくとも一つのポリペプチドか−らなるトロンビンインヒビターを提 供することである。

本発明において、「約３（９，１４）ｋＤ」とは。

±ｌｋＤ、好ましくは０．５ｋＤの最大偏差を含むことを意味する。さらに、本 発明の目的にはまた、主要な生物学的性質を保存するアミノ酸交換が起きた上記 および下記の該配列が含まれる。これにはまた、変種、フラグメント、サブユニ ット、天然発生的突然変異体および無作為に生じる人為的突然変異体が寅まれる 。

また、開示されたペプチドから誘導される融合タンパク質などのバイブリドタン パク質が含まれる。

加えて、本発明は、Ｒｈ　ｎｃｈｏｂｄｅｌｌｉｄ１目、好ましくはＴｈｅｒｏ ｍ　ｚｏｎ　ｔｅｓｓｕｌａｊｕｍ種のヒルの組織または分泌物を均質化して、 その水溶性成分からなる両分を調製することによって上記および請求の範囲に定 義された抽出物を調製する方法に関する。

さらに１本発明の目的は、トロンビン特異性アフィニティークロマトグラフィー および少なくとも一つのさらなる標準クロマトグラフィーステップを用いて該抽 出物を精製することによって請求項４〜７に記載のポリペプチドを調製する方法 を提供することである。

本発明のトロンビンインヒビターは、抗凝固性および抗血栓性の性質を有する。

したがって、これは凝固系が関与する全ての臨床状態で用いられる。これらの使 用には、血栓症、卒中、心筋梗塞、深部静訊血栓症、四肢動脈の障害、肺血栓症 、髄質動脈血栓症またはその他の血栓症の治療が含まれる。さらに、トロンビン インヒビターは、動静脈シャントの患者または冠状バイパス手術を受けている患 者のために使用し得る９本発明のポリペプチドはまた。血栓症または動脈再閉塞 の予防のための抗凝固剤として、血液または血液製品の保存のため、および体外 血液または血漿循環のために用い得る。

本発明によるトロンビンインヒビター（ポリペプチド）は、基本的にはヒルジン に匹敵する生物学的活性を示す、トロンビンとの結合親和性（阻害定数）は。

今日最強のトロンビンインヒビターとして知られるヒルジンよりも僅か上回りさ えする。

このように、本発明のさらなる目的は、とくに血栓症関連障害のインビボ治療の ためおよび体外血液における血小板凝集および血液凝固の阻害のための医薬物と しての使用のための上記および請求の範囲に定義したポリペプチドを提供するこ とである。

最後に、本発明によってさらに、上記に定義したトロンビンインヒビターまたは ポリペプチド、および薬剤学的に容認し得る担体からなる上記のような血栓症関 連障害の治療のための薬剤組成物が提供される。

図面の簡単な説明 図面の詳細は実施例１〜１０中で説明される。

第１図は、アフィニティーカラムからの抗トロンビンの溶出プロフィールを示す 説明図である（実施例３）第２図は、工、ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍに由来する抗ト ロンビンのバイオゲルＰ４上でのゲル濾過分析を示す説明図である（実施例４） 。

第３図は、アフィニティーステップからの陽性画分の分析用ＲＰ−ＨＰＬＣを示 す説明図である（実施例５）。

第４図は、アフィニティーステップからの陽性画分の調製用ＲＰ　−ＨＰ　Ｌ　 Ｃを示す説明図である（実施例５　）　。

第５図は、ＨＰＬＣ上でのヒルジンと本発明によるインヒビターとの比較を示す 説明図である（実施例６）第６図は、ＲＰ　−１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラ（７）活 性ビーク２の再クロマトグラフィーを示す説明図である（実施例７）。

第７図は、ＲＰ−ＨＰＬＣがらの活性ビーク２のマススペクトルを示す説明図で ある（実施例７）。

第８図は、ＲＰ　−１（Ｐ　Ｌ　Ｃカラ０’）活性ビーク２ノＩＥＦトレースを 示す説明図である（実施例７）。

第９図は、ＲＰ−１−ＩＰＬ’Ｃがらの活性ビーク４の再クロマトグラフィーを 示す説明図である（実施例９）。

第１０図は、ＲＰ−ＨＰＬＣがらの活性ビーク４のマススペクトルを示す説明図 である（実施例９）。

発明の詳細な説明 本発明によるトロンビンインヒビターは、ｌエユ」ｃｈｏｂｄｅｌ　Ｉ　ｉｄａ 目、好ましくはＴｈｅｒｏｍＭ科のヒルの組織または分泌物から分離および精製 することができる。二ｈｅ二ｏｍユユユ」科のヒルからのトロンビンインヒビタ ーはいずれも同様の活性を有し、相違はごく僅がである。−１１上ｍｊｏｎ科の 適当な種の例は、工、ｂｉｎａｎｎｕｌａｔ二皿、工、ｃｏｏ　ｅｒｉ、工、　 ａｒ’ａｅｗｉ。

工、ｒｕｄｅ、工、ｓｅｘｏｃｕｌａｔｕｍおよび、とくに工、ｔｅｓｓｕｌａ ｔｕｍである。

好ましくは、ヒルの唾液腺が本発明の材料として用いられる。しかし、唾液腺の 調製は容易ではなく、かなりの材料ロスが避けられないことから、ヒルの頭部ま たは頭部から三分の−を材料として用いることも可能である。

通常、本方法の最初のステップは、通常アセトンまたはアセトン／水混合物中で 行う均質化に先だってヒル組織を好ましくは実質的な凍結および／または凍結乾 燥することである。しかし、非水溶性成分を除去するために他の極性有機溶媒を 用いることもできる。さらに好ましくは、ステップ１によって得られる抽出物を アフィニティークロマトグラフィーの前に遠心分離して不要な細胞砕片を除去す る。アフィニティークロマトグラフィーには［トロンビン活性部位」を備えたカ ラムを使用することが好ましい、ここで「トロンビン活性部位」とは、カラムに トロンビン部位が存在してそこにトロンビンインヒビターが吸着できることをい う、トロンビン活性部位の例としては、固定化天然または脱活性化トロンビン、 さらにトロンビン由来ペプチド、擬ポリペプチドまたは他のトロンビン銹導体が あげられる０本発明によると、トロンビンまたは該トロンビン読導体は、活性ゲ ルマトリックスに、好ましくは該ゲルマトリックスのアズラクトン基と公知の方 法で反応させることによって固定化される。とくに記載がなければ、アフィニテ ィークロマトグラフィーは標準法によって行った。

好ましくは、ゲル濾過法をアフィニティークロマトグラフィーとともに用いる。

本発明によるゲルマトリックスは、約５ｋＤの排除限界を有し、したがって、約 １ｋＤ〜５ｋＤの範囲の分画が可能である。

分離された抗トロンビン抽出物をさらなる精製のためにさらに逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ に供することが好ましい、上記したようなポリペプチド断片は、分離された抽出 物をＲＰ　−ＨＰ　Ｌ　Ｃによって精製することによって得られる。適当な逆相 材料の例としては、Ｃ２−Ｃ８脂肪族置換体によって修飾されたシリカゲルがあ る。しかし、本発明によるポリペプチドは、他のよく知られたクロマトグラフィ ー手法によって精製することもできる。ＨＰＬＣ精製の詳細は実施例において示 される。

抽出物および精製ステップの特定画分中のトロンビンインヒビターの活性は、凝 固時間の延長（Ｆ、Ｍａ−９３２，１９７０）によって、または酢酸トシル−グ リシル−プロリル−アルギニン−４−ニトロアニリド（クロモシム’ｒ１１、ペ ーリンガーマンハイム）などのトロンビン特異性色原性物質の切断の減少（Ｈ， Ｕ。

Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、Ａｎａｌ、、第三版、Ｖｏｌ、５，３ ６５−３９４．１９８８）によって、インビトロで測定される。

上記したように、本発明のポリペプチドは、薬剤組成物および配合物において薬 剤学的に有効な化合物として適している。

本発明による薬剤調製物は、ヒルジンまたはヘパリンなどの抗凝固剤またはプラ スミノーゲン活性化因子やヘメンチンなどの血栓溶解剤などの追加の有効成分を 適宜含むことができる。

本発明による新規のポリペプチドおよびトロンビンインヒビターは、任意の非毒 性有機または無機酸と薬剤学的に容認し得る塩を形成することができる。無機酸 は例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸または燐酸、およびオルト燐酸−水素ナトリ ウムおよび硫酸水素カリウムなどの酸金属塩がある。有機酸の例としては、モハ ジおよびトリカルボン酸、例えば酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロ ン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコ ルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸 、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸、およびメタンスルホン酸などのスルホン 酸がある。カルボキシ末端アミノ酸部の塩には、任意の適当なな無機または有機 塩基とで形成された非毒性カルボン酸塩が含まれる。これらの塩には例えば。

ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウム などのアルカリ土類金属、アルミニウムを含むＩＩＩＡ群の軽金属、および有機 −級、二級およびトリアルキルアミンなどの三級アミン、例えばトリエチルアミ ン、プロカイン、ジベンジルアミン、ｌ−エチレンアミン、Ｎ、Ｎ’　−ジベン ジルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミンおよびＮ−アルキルピペリジ ンなどが含まれる。

ここでいう［薬剤学的に容認し得る担体」とは、活性化合物または患者との間で 望ましくない反応を起こさない不活性、非毒性固体または液体の充填剤、希釈剤 またはカプセル用材料を意味する。適当な、好ましくは液体の担体は、当業者に 広く公知のもので、例えば滅菌水、生理的食塩水、液体デキストロース、糖溶液 、エタノール、グリコールおよび石油、動物油、植物油または合成油などのオイ ル、例えばピーナツ油、大豆油および鉱油などがある。

本発明による調製物は、従来の非毒性の薬剤学的に容認し得る担体、希釈剤、ア ジュバントおよび非経腸投与に典型的な基剤を含む単位用量として投与すること ができる。

ここでいう「非経腸」には、皮下、静脈内、関節内および気管内注射および注入 点滴などが含まれる。また、経口投与および局所適用などの他の投与も適してい る。非経腸組成物および配合物は、最も好ましくは、ポーラスのかたちであるい は定常輸液として公知の方法で静脈内投与される。

経口投与用の錠剤およびカプセルは、従来の賦形剤、例えば結合剤、充填剤、希 釈剤、錠化剤、潤滑剤、崩壊剤および湿潤剤を含む６錠剤は当業者に広く公知の 方法によって被覆してもよい。

経口用液体調製物は、水性または油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップまたは エリキシルのかたちでもよく、または水または他の適当な基剤で還元して使用す る乾燥物にしてもよい、そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化刑、非水性基剤 および保存剤などの従来の添加剤を含むことができる。

局所適用には、水性または油性の懸濁液、溶液、乳濁液、ゼリーまたは好ましく はエマルジョン軟膏のかたちが用いられる。

本発明による単位用量は、本発明のタンパク質の一日必要量、または必要総量を 複数分割したものを用いることができる。任意の対象体（ヒトを含む哨乳動物） への治療的に容認し得る最適投薬量および投与回数は、種々の因子、例えば用い る特定の有効成分の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食餌、投与時間 およびルート、クリアランス回数、投与の目的、すなわち治療または予防か、お よび治療対象の血栓症の性質、抗血小板または抗凝固活性などによって異なる。

したがって、患者治療（インビボ）における抗凝固剤として有効な組成物および 配合物においては、本発明のペプチドの薬剤学的に有効な日用量は約０．０１〜 １００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。適用型 によって、単一用量は０゜５〜１０ｍｇのトロンビンインヒビターを含むことが できる８体外血液において抗凝固効果を得るためには、本発明のペプチドの薬剤 学的有効量は、０．２〜１５０　ｍ　ｇ　／　Ｌ、好ましくは１〜２０ｍｇ／Ｌ 体外血液である。

さらにまた、本発明の目的は、装置表面を実質的に耐血栓性にするために上記お よび請求の範囲に定義した固定化ポリペプチドで被覆した、体液と接触して使用 するインブラント用または体外用の医用装置を提供することである３本発明のポ リペプチドを医用装置に固定化してその表面を生物適合性および耐血栓性にする 。そのような装置には血小板凝集を概して引き起こしがちな湿潤表面を有するも のがあり、これは血液や他の体液と接触して使用するインブラント用および体外 用装置において不都合である。プラスチック材料および合成繊維から通常つくら れるそのような装置の例としては、義肢、義眼、人工臓器、縫糸、人工脈管節、 カテーテル、透析器、血液輸送用チューブおよび容器がある。

本発明はさらに以下の実施例によって説明されるが、これらは説明を目的とした もので本発明の範囲を限定するものではない。

［実施例１］ Ｔ、ｔｃｓｓｕｌａＬｕｍにおける抗トロンビンの存在の立証 Ｔｈｃｒｏｍ　ｚｏｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍの頭１０個を等張生理的食塩水を 用いて均質化した。均質化物を短時間遠心分離して粒状物を除去して、上清を次 の抗トロンビンアッセイおよび他の必要な血液学的試験を行うために保存した。

抗トロンビン活性を推定するために、２０μｌの上記の抽出物を１０μｌのトロ ンビン（ＩＵ）と混合した。二の混合物に１００μｌの０．５ｍｇ／ｍ＋のフィ ブリノーゲン溶液を加えて、さらに混合して、３７℃で１分間インキュベートし た。

このアッセイのさらなる詳細については、Ｒ，Ｔ。

Ｓａｗｙｅｒら（Ｃａｍｐ、Ｈａｅｍａｔｏｌ、Ｉｎし、、ユ、３５−４１．１ ９９１）による記載がある。

表１はＴｈｅｒｏｍ　ｚｏｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍからの粗抽出物を用いた凝 固パラメターのインビトロ阻害作用を要約したものである。

表１：　Ｔ、ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍにおける抗トロンビン活性の存在の立証 正常対照　粗抽出物 （秒）　（秒） プロトロンビン時間　１５　４２ （外在性） 活性化ＰＴＴ　４０　２２０ （内在性） トロンビン時間　４５　＞６００ （抗トロンビン） レブチラーゼ時間　２０　２０ 上記データから、Ｔｈｅｒｏｍ　ｚｏｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍの頭部領域はト ロンビン凝固時間を有意に延長する一つまたはそれ以上の水溶性因子を含むこと がわかる。

［実施例２］ ｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）性アッセイ ａ）トロンビン阻害 ２０μｌのトロンビン溶液（５ＮＩＨ−Ｕトロンビン時間　Ｉ　（７）０．　０ ５％ＰＥＧ６０００を含む２５０ｍＭ燐酸塩緩衝液、ｐＨ６，５）を８８０μｌ のトロンビンアッセイ用緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭＮａＣ １，０，０５％ＰＥＧ、ｐＨ８，３）とともに光度計セル中で室温で５分間予備 インキユベートシた０反応を１００μｌの基質溶液（４ｍｇのクロモチームＴＨ （ベーリンガーマンハイム、ドイツ）の５ｍｌ水溶液）を添加することによって 開始して、吸収を４０５ｎｍで２５℃で３０秒間隔で５分間読みとった。

阻害活性の測定のために、１０〜２００μｍの試料または標準としてのヒルジン を２０μｍのトロンビン溶液と混合して、アッセイ用緩衝液で全量を９００μｌ にした。この混合物を室温で５分間予備インキュベートして、１００μｌの基質 溶液を加えることによって反応を開始した。

ｂ）Ｘａａ子活性の阻害 ２０μ１（７）Ｘａ囚壬子溶液ＩＯＵｌｏ、５ｍｌを水で２．０ｍｌに希釈した もの）を８８０μｌのＸａａ子アッセイ用緩衝液（ｌ　Ｏ０ｍＭトリス−ＨＣｌ 、２００ｍＭ　ＮａＣ１，０，０５％ＰＥＧ、ｐＨ８，３）とともに光度計セル 中で室温で５分間予備インキユベートシた８反応を１００μｌの基質溶液（３， ５ｍｇのクロモチームＸ（ベーリンガーマンハイム社製）の５ｍｌ水溶液）を添 加することによって開始して、吸収を４０５ｎｍで２５℃で３０秒間隔で５分間 読みとった。

阻害活性の測定のために、１０〜２００μｌの試料を２０μｌのＸａａ子溶液と 混合して、アッセイ用緩衝液で全量を９００μｍにした。この混合物を室温で５ 分間予備インキュベートして、１００μｌの基質溶液を加えることによって反応 を開始した。

［実施例３〕 Ｔｈｅｒｏｍ　ｚｏｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍからのトロンビンインヒビターの 精製 スー・・プ１ １０００秒間給餌したＴｈｅｒｏｍ　ｚｏｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍの頭から三 分の−を直ちに一７０℃で凍結させて凍結乾燥した。この材料に、３５ｍ１の４ ０％アセトンを加えて、懸濁物をｕｌｔｒａ−ｔｏｒａｘ中で３回それぞれ１０ 秒間均質化した。超音波処理機で２分間処理した後に、さらに均質化ステップを 繰り返した（３０秒間）、均質化物を６００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離して、 得られる上清を保存した（Ｓ　Ｌ）　。

ベレットｌにさらに３５ｍ１の４０％アセトンを加えて、２回目の均質化を行っ た（ＩＸＩＯ秒、超音波処理２分間、■×３０秒）、均質化物を再び６０００ｒ ｐｍで１５分間遠心分離した。上清２を保存しておいた上清ｌに加えて、合わせ た上清に８０％（Ｖ　／　Ｖ　）アセトンを加えた。

ｐＩＩを酢酸を用いて４．０に調整して、得られる懸濁液を６００Ｏｒｐｍで２ ０分間遠心分離した。ペレット３を廃棄した。上清３をロータリーエバポレータ （Ｓｐｅｅｄ　Ｖａｃ）によって４倍に濃縮した。

アセトンを除去した抽出物は、実施例１による凝固試験および実施例２による色 原性試験において抗トロンビン活性陽性であった。

スー・・ブ２ アセトン除去抽出物を緩衝液交換のためにＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製 ）に供した。カラムをアフィニティー緩衝液（２０ｍＭ）リスＨＣＩ、５０ｍＭ 　ＮａＣ１，ｐＨ７，４）で平衡にして、２．５ｍｌのステップｌからの抽出液 をカラムに供した。溶出液の抗トロンビン活性を試験した。

トロンビンアフィニティーカラムは以下のようにして調製した。

４００ｍｇの乾燥Ａｚｌａｃｔｏｎ　Ｔｅｎｔａｃｌｅ　Ｆｒａｃｔｏゲルマト リックス（Ｅ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を７ｍｌの力・ノブ リング用緩衝液（５０ｍＭ燐酸塩、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，５）中に室 温で２時間懸濁した。懸濁物を遠心分離およびカップリング緩衝液中での再懸濁 し二よって２回洗浄した。５００ＯＮＩＨ−Ｕのウシトロンビン（シグマ社製） を１ｍｌの水に溶解して、ｐＨを７゜５に調整した。このトロンビン溶液をＰＤ −１０ゲル瀘過によってカップリング用緩衝液と平衡にシた。平衡化したトロン ビン溶液に、硫酸ナトリウムを最終濃度ＬＭになるように加えた。トロンビン溶 液ノ（り質を直ちに活性化したゲルマトリックスにピペットで移して、緩やかに 混合しながら４℃で３時間カップ１ノングを行った。洗浄をそれぞれ５容量の力 ・ツブ１ノング用緩衝液で３回行った。マトリックスの脱活性のためｔ二、１． ５ｍｌのエタノールアミンを加えて、緩や力）（二振盪しながら４℃で一晩放置 した。マトリックスを５容量の酢酸塩緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナト１ノウム、５ ００　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ　、ｐ　Ｈ４、０）で２回洗浄した。最終の平衡化 を５容量のアフィニティー緩衝液で２回洗浄することによって行った。

ＰＤ−１０カラムからの活性溶出液を、アフイニティーカラムニ嬬動（ｐｅｒｓ ｉｓｔａｌｔｉｃ）ポンプを用いて載せた（１０ｍ　ｌ／時）、非結合画分を集 めて、カラムを１２ｍ１のアフィニティー緩衝液で洗浄した（洗浄液ｌ）、溶出 を６ｍｌの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４，０）で行って、各０．５ｍｌ容量のフラクシ ョンを集めた。このカラムからの溶出プロフィールを第１図に示す。

最初の溶出に続いて、６ｍｌの酢酸塩緩衝液（ｐＨ３，０）を用いて第２ステツ プを行った。各１．５ｍｌのフラクションを集めた。カラムを２５ｍ１のアフィ ニティー緩衝液を用いて再平衡化した。

抽出およびアブイニテイーステップの結果を表２Ｇ二要約して示す。

表　２：Ｔｈｅｒｏｍ　ｚｏｎ　ｔｃｓｓｕｌａＬｕｍ　力）らのトロンビンイ ンヒビターのアフィニティー精製の結果（ａｆｆｉ＝ｆｆミニアフィニティーク ロマトグラフィー　容量　凝固時間　トロンビン　Ｘａ因子（ｍｌ）（秒）　阻 害（ＩｔＪ）阻害（ＩｔＪ）ブランク　２０．５　０　０ アセトン　３４　５９．４　３３　検出せず抽出物 非結合ａｆｆｉ　３４　２４．３　１．８　１．１洗浄液１　２４　２０．２　 １．６　１．０ａｆｆｉ溶出液１４　＞６００　ｚ５　０．２ａｆｆｉ溶出液２ 　４　２２．１　０　０［実施例４］ Ｔｈｃｒｏｍ　ｚｏｎ　ＬｃｓｓｕｌａＬｕｍからの活性トロンビンインヒビタ ーのゲル濾過分析活性材料を２５ｍ１容量のバイオゲルＰ４ゲル瀘過カラム（バ イオラド社製）に供した。溶出を２０ｍＭトリス塩酸、５０ｍＭ　ＮａＣ１、ｐ Ｈ７，４を用いて流速４ｍｌ／時で行った。各１ｍｌのフラクションを用いて抗 トロンビン活性を試験した。

Ｐ４ゲルマトリックスは、５０００Ｄの排除限界を有し、■０００〜５０００Ｄ の分子量の範囲を分画することができる。驚いた二とに、抗トロンビン活性は分 画容量中に溶出され、すなわち５０００Ｄ以下の見かけの分子量を有することが 見出だされた（第２図）。

この挙動は同一条件で排除容量中に現れるヒルジン（分子量７０００　Ｄ）と対 照的である。Ｐ４カラムの検量線から、Ｔｈｅｒｏｍ　ｚｏｎ　ｔｅｓｓｕｌａ ｔｕ二からの抗トロンビン活性画分の分子量は約３０００Ｄと算出された。

［実施例５］ 二ｌ立エユユユユニｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍからの精製トロンビンインヒビタ ーの逆相ＨＰＬＣ実施例３によるアフィニティークロマトグラフィーステップ後 に得られた活性溶出液を、さらにＲＰ−ＨＰ＼ＬＣによって分析した。２０μｌ の試料を、ＨＰＬＣカラム（ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ３００ＲＰ−１８，５μｍ 、Ｅ、Ｍｅｒｃｋ＋　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）に注入して、次のようなア セトニトリル勾配を用いて流速１．Ｏｍｌ／分で溶出した。

緩衝液Ａ：０．１％トリフルオル酢酸水溶液緩衝液Ｂ：０．０８％トリフルオル 酢酸アセトニトリル溶液 勾配二　０〜２分、１０％Ｂ ２〜３分、注入 ３〜２８分、６０％Ｂ 第３図は、２２０ｎｍで記録された典型的な分析クロマトグラフィー溶出図を示 す、トロンビン阻害活性はビーク２およびビーク４に見出だされた０分析用ＨＰ ＬＣからの情報は、次いで同一の条件下で行う調製用分離のために使用した。

調製のための精製をアフィニティークロマトグラフィーからの試料５００μｍを 用いて行った（第４図）。

それぞれのピークを集めて、プールして、ロータリーエバポレーター５ｐｅｅｄ 　Ｖａｃを用（〜て濃縮した。

乾燥した両分を水で再構成して、抗トロンビン活性を実施例２に記述の凝固時間 および色素原性（ｃ　ｈ　ｒ　。

ｍｏｇｅｎｉｃ）試験によってアッセイした。

両試験系において主要活性がピーク２およびピーク４において見出だされた。い くらかの活性がビーク５においても見出だされたが、これはおそらくビーク５へ のビーク４の夾雑のためと考えられる。クロマトグラムの他のいずれのビークに ついてもトロンビンインヒビター活性は全く認められなかった。ビーク２および ４の活性の合計は、全活性の約９３％であった。

［実施例６コ 本発明のトロンビンインヒビターとヒルジンとの）ＩＰＬＣ上での比較 本発明によるインヒビターがヒルジンからの分子とは基本的に異なることをさら に示すために、次のような実験を行った。実施例５によってＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ後 に得られた活性ピーク２を、同様のタンパク質濃度の稍製ヒルジンに加えて、混 合物をアセトニトリル勾配（４０〜７０％）のＲＰ−ＨＰＬＣに供した。抗トロ ンビン活性を含む二つのビークが見出だされた（第５図）。

比較溶出から、それぞれ単一のインヒビターを注入した場合には第５図に示した ようなそれぞれのビークが現れた。

第５図から１本発明による抗トロンビンはヒルジンの抗トロンビンとはきわめて 異なる位置に溶出されることが明かである。同様のことが実施例５によるＨＰＬ Ｃ分離後の活性ビーク４においても認められた。

［実施例７］ 抗トロンビン活性を有するビーク２のさらなる特徴付は 屑り度 ＲＰ−ＨＰＬＣからのプールした活性ビーク２を。

第３図と同様の条件下で再クロマトグラフした。第６図に示すように、少量の夾 雑物が主要活性ビークから分離されたが、二回目のＲＰ−ＨＰＬＣ後は均一の調 製物が得られた（この両分の毛管電気泳動を示す第８図も参照されたい）。

一トエ≦仁イ２ＪＬ濱 ＲＰ−ＨＰＬＣからのビーク２は、実施例２による凝固試験（トロンビン時間〉 ６００秒１５μｌ）および色素原性（ｃ　ｈ　ｒ　ｏｍｏ、ｇｅ　ｎ　ｉ　ｃ） 抗トロンビン試験において活性を示した。後者の試験における活性は３．２ＩＵ ／２５０μｌであった。ビーク２のＸａ因子阻害活性は、実施例２に記述のアッ セイによって検出されなかった。すなわち、抗トロンビン活性のく〈１％の最大 抗Ｘａ因子活性であった。したがって、こ二に開示されたインヒビターはトロン ビンにきわめて特異的であることが結論づけられる。

Ｌ土星皿１］ トロンビンに対するインヒビタ一定数を、本発明によるインヒビターによって標 準化したトロンビン溶液本方法の詳細についてはＧ、Ｗ、Ｊ　ａｍｅｓｏｎら（ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、１３１．１０７＝１１７．１９７３）による記述がある 。

簡略に述べると、まず蛍光物質Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Δｒｇ−ＡＭＣを５０ μＭの濃度で滴定実験に用いた。アッセイを、１００ｍＭトリス塩酸、２００ｍ Ｍ　ＮａＣ１，０，０５％ＰＥＧ６０００　（ｐＨ７゜８）中で２５℃で行った 。２０９Ｍ活性部位滴定ヒトα−トロンビンを、インヒビターとともに０．２− ５ＸＥＣＩで１０分間インキュベートして、基質を加えた後に定常速度を測定し た０反応動力学定数を、非線型回帰分析プログラムＧｒａＦｉ　し　（Ｒ，Ｊ、 Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ、Ｅｒ１ｔｈａｃｕｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ、５ｔａ ｉｎｅｓ、ＵＫ、１９８０）を用いて決定した。に＋は１７８フ工ムトモルであ ることが見出だ活性ビーク２の分子Ｕを、ＭＡ　Ｌ　Ｄ　Ｉ　−Ｔ　ＯＦ法（Ｋ ｒａｔｏｓ）　を用いるレーザーディソープション質量分析によって決定した。

０．５μｍの試料をマトリックスの役目をするアセトニトリル中の２．３μｍの ジヒドロキシ安息香酸と混合した。混合物を銀製試料ホルダー上で冷気乾燥して 、分析機中に置いた。得られるマススペクトルを、分子量の知られた標準タンパ ク質を用いて構成した。ビークは分子量約９０００Ｄに対応した（第７図）。

ユｌ インヒビターの等電点を、ＩＥＦモード（Ａｐｐｌｉ　ｃ　ｄ　１３　ｉ　ｏ　 ｓ　ｙ　ｓ　ｔ　ｃ　ｍ　ｓ社製）における毛管電気泳動によって測定した。第 ８図に見られるように、インヒビターピークは、標準タンパク質と比較して４゜ ９のｐＩを示した。

［実施例８］ 抗トロンビン活性を有するビーク２の配列データ次のようなＮ末端配列を、ベッ クマンペプチド配列分析機で標準エドマン分解化学によってＲｉＰ　−ＨＰ　Ｌ Ｃ（実施例５）からのビーク２について得た。

Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　 Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ。

［実施例９〕 抗トロンビン活性を有するビーク４のさらなる特徴付は 剋り度 ＲＰ　−ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃからのプールした活性ビーク４を、同じ条件下で再ク ロマトグラフした。第９図に示すように、いくらかの夾雑物が主要活性ピークか ら分離されたが、二回目のＴ？、　Ｐ　−ＨＰ　Ｌ　Ｃ後は均一の調製物が得ら れた。

ロンビン ＲＰ−ＨＰＬＣからのビーク４は、実施例２による凝固試験（トロンビン時間〉 ６００秒１５μｌ）および色原性抗トロンビン試験において活性を示した。後者 の試験の活性は１．３１Ｕ／２５０μｍであった。

ビーク４のＸａ因子阻害活性は、実施例２に記述のアッセイの結果、抗トロンビ ン活性の＜＜１％の最大抗Ｘａ因子活性を示し、検出されなかった。したがって 、ここに開示されたインヒビターはトロンビンにきわめて特異的であることが結 論づけられる。

Ｌ土工豆ＪＭＵ トロンビンに対するインヒビタ一定数を、本発明によるインヒビターによって標 準化したトロンビン溶液を分光蛍光光度計で滴定することによって決定した。

本方法の詳細については実施例７を参照されたい、に１は２４０フ工ムトモルで あった。

光王１ 活性ビーク４の分子量を、ＭＡＬＤ　Ｉ−ＴＯＦ法（Ｋｒａｔｏｓ）　を用いる レーザーディソープション質量分析によって実施例７に記述のようにして決定し た。

得られるマススペクトルを、分子量の知られた標準タンパク質を用いて検量した 。ビークは分子量約１４ｋＤに対応した（第１Ｏ図）。

［実施例１０コ 抗トロンビン活性を有するビーク４の配列データ次のようなＮ末端配列を、ベッ クマンペプチド配列分析機で標準エドマン分解化学によってＲＰ−ＨＰＬＣ（実 施例５）からのビーク４について得た。

Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　５ｅｒＡＳｎ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｃ ｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ。

［実施例１１コ 上記の実施例１〜５に記述の手法を用いて、抗トロンビン活性を有するポリペプ チドを次のＴｈｅｒｏｍ−Ｌ」Ｌ」−二種から分離することができた。

Ｔ、ｓｅｘｏｃｕｌａｔｕｍ Ｆｉｇ、　２ ｆ！　メ　−メ 寸　０　〜　Ｓ！ 山Ｌｌｔ−０乙ＯＯ 分 Ｆｉｇ、　９ Ｆｉｇ、　１０ 分子量［Ｄ］ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１／１６ ７１０８　ＺＮＡ （７２）発明者　ヴオルフ、ザビーネ ドイツ連邦共和国　６４８５３　オツベルク１　アム　ヴエンデルスベルク　１ ７ Ｉ （７２）発明者　ドツト、ヨハネス ドイツ連邦共和国　４５６６５　レフリンクハウゼン　リープフラウエンシュト ラーセ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｐｈｙｎｃｈｏｂｄｃｌｌｉｄａ目のヒルの組織または分泌物からのその水 溶性成分を含むトロンビン阻害活性を有する抽出物。
2. ２．Ｔｈｅｒｏｍｙｚｏｎ科のヒルの請求項１に記載の抽出物。
3. ３．Ｔｈｅｒｏｍｙｚｏｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍ種のヒルの請求項２に記載の 抽出物。
4. ４．ヒル頭部から三分の一部を凍結して凍結乾燥したヒルを水／アセトンを用い て均質化して得た抽出物を、トロンビン特異性アフィニティークロマトグラフィ ーにかけて、次いで少なくとも一つのゲル濾過ステップおよび少なくとも一つの 逆相ＨＰＬＣステップによって精製することによって、請求項１、２または３に 記載の抽出物から得られるトロンビン阻害活性を有する本質的に精製されたポリ ペプチド。
5. ５．トロンビン阻害活性および約３ｋＤの分子量を有する少なくとも一つのポリ ペプチドからなる請求項４に記載のポリペプチド。
6. ６．トロンビン阻害活性、約９ｋＤの分子量およびＮ末端アミノ酸配列 【配列があります】． を有する少なくとも一つのポリペプチドからなる請求項４に記載のポリペプチド 。
7. ７．トロンビン阻害活性、約１４ｋＤの分子量およびＮ末端アミノ酸配列 【配列があります】 を有する少なくとも一つのポリペプチドからなる請求項４に記載のポリペプチド 。
8. ８．Ｒｈｙｎｃｈｏｂｄｅｌｌｉｄａ目、好ましくはＴｈｅｒｏｍｙｚｏｎ　ｔ ｅｓｓｕｌａｔｕｍ種のヒルの組織または分泌物を均質化して、その水溶性成分 からなる画分を調製することによる請求項１、２または３に記載の抽出物の調製 法。
9. ９．トロンビン特異性アフィニティークロマトグラフィーおよび少なくとも一つ のさらなる標準クロマトグラフィーステップによって請求項８に記載の抽出物を 精製することによる請求項４〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドの調製法 。
10. １０．医薬物としての使用のための請求項４〜７のいずれか１項に記載のポリペ プチド。
11. １１．血栓症関連疾患のインビボ治療のためのトロンビンインヒビターとしての 請求項１０に記載のポリペプチド。
12. １２．体外血液における血小板凝集を阻害すルためのトロンビンインヒビターと しての請求項１０に記載のポリペプチド。
13. １３．請求項４〜７および１０〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドおよ び薬剤学的に容認し得る担体からなる薬剤組成物。
14. １４．血栓症関連疾患のインビボ治療のための薬剤組成物の調製のための４〜７ のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
15. １５．体外血液における血小板凝集を阻害するための薬剤組成物の調製のための ４〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
16. １６．トロンビン阻害化合物を調製するためのＲｈｙｎｃｈｏｂｄｅｌｌｉｄａ 目、好ましくはＴｈｅｒｏｍｙｚｏｎ　ｔｅｓｓｕｌａｔｕｍ種のヒルの使用。