JPH0640995A - 四環性化合物、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 サブスタンスＰの受容体拮抗活性を有する、
抗炎症剤として有用な新規化合物の提供。 【構成】 一般式 【化１】 [式中、Ｒはメチル基またはアミノ基を示す]で表される
化合物またはその塩。 【効果】 本発明によれば、サブスタンスＰの受容体拮
抗作用を有する、抗炎症剤や消炎鎮痛剤として有用な新
規化合物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗炎症剤として有用な
新規四環性化合物、さらに詳しくは、生理活性ペプチド
であるサブスタンスＰの受容体拮抗活性を有する新規四
環性化合物、その製造法および用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】サブスタンスＰはサブスタンスＫ(ニュ
ーロキニンＡ)、ニューロキニンＢと共にタキキニン群
に属するペプチドで、多様な生理活性を示すことが知ら
れている[エム・オーツカ(Ｍ．Ｏtuka)およびケイ・ヨ
シオカ(Ｋ．Ｙoshioka)、フィジオロジカル・プレビュ
ーズ(Ｐhysiological Ｐreviews)、１、１(１９９
１)]。特に、脊髄後根に投射する無髄知覚神経の痛覚に
関わる神経伝達物質として、また炎症のメディエイター
として重要な働きをしていることから、その拮抗物質は
新規な鎮痛抗炎症剤としての利用が期待される。

【０００３】これまでにサブスタンスＰ受容体拮抗作用
を有するものとしては、放線菌の代謝産物 ＷＳ−９３
２６ およびその誘導体(特開平３−１４８２２７号公
報)や関連ペプチド(特開平３−２７３９９号公報)など
が知られている。また、アクチノマイシンＤやサイクロ
スポリンにもサブスタンスＰ受容体拮抗作用のあること
が知られている[日本農芸化学会誌 ６５(３)、１７９
(１９９１)]。

【０００４】また、四環性化合物の抗炎症の分野への応
用としては、コラゲナーゼ阻害活性を有する非抗菌性テ
トラサイクリンと抗炎症性化合物とが結合してなる化合
物の炎症治療への応用(特開平４−５４１６０号公報)、
抗コラーゲン性を有する非抗菌性テトラサイクリン組成
物のリウマチ性関節炎治療への応用(特開昭６１−２４
３０２３号公報)、およびテトラサイクリン誘導体であ
るミノサイクリンおよびドキシサイクリンの抗炎症作用
の報告[第５５回アメリカリウマチ学会(１９９１、１
１、ボストン(Boston)]等が知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、新規な
骨格を有するサブスタンスＰ受容体拮抗物質を見いだす
ことができれば、鎮痛抗炎症作用等を有する従来にない
治療剤が得られると確信し、その起源を微生物代謝産物
の中に求め、後記する方法で鋭意探索した結果、ＴＡＮ
−１６１２およびＴＡＮ−１６５２と命名した新規化合
物を培養液中より単離することに成功し、これがサブス
タンスＰ受容体結合阻害作用を示し、イン・ビボ(in vi
vo)テストにおいて強い抗炎症作用を示すことを見出
し、本発明を完成するに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、(１)一般式
[I]

【０００７】

【化２】

【０００８】(式中、Ｒはメチル基またはアミノ基を示
す。)で表される化合物またはその塩、(２)ペニシリウム
属に属し、一般式[Ｉ](式中Ｒはメチル基を示す。)で表
される化合物を生産する能力を有する微生物を培地中に
培養し、培養物中に該化合物を生成蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とする該化合物またはその塩の製造
法、(３)メタルリジウム属に属し、一般式[Ｉ](式中Ｒ
はアミノ基を示す。)で表される化合物を生産する能力を
有する微生物を培地中に培養し、培養物中に該化合物を
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該化
合物またはその塩の製造法、および(４)一般式[Ｉ]で表
される化合物またはその塩を含有してなる抗炎症剤を提
供するものである。

【０００９】本明細書においては、一般式[Ｉ]でＲがメ
チル基を示すものを化合物ＴＡＮ−１６１２(以下、単
にＴＡＮ−１６１２と略すこともある)、Ｒがアミノ基
を示すものを化合物ＴＡＮ−１６５２(以下、単にＴＡ
Ｎ−１６５２と略すこともある)と称する。これらの化
合物には立体異性体が存在するが、本発明はこれらすべ
てを包含する。

【００１０】化合物ＴＡＮ−１６１２はペニシリウム属
に属する糸状菌によって生産される。ＴＡＮ−１６５２
はメタルリジウム属に属する糸状菌によって生産され
る。例えば、ＴＡＮ−１６１２は岩手県の土壌から新た
に分離された一菌株ＦＬ−２７３３７によって生産する
ことができる。例えば、ＴＡＮ−１６５２は愛知県の土
壌から新たに分離された一菌株ＦＬ−２５７９８によっ
て生産することができる。

【００１１】ＴＡＮ−１６１２生産菌株は以下の性質を
示す。 a)形態的特徴 本菌株ＦＬ−２７３３７は麦芽エキス寒天培地、バレイ
ショ・ブドウ糖寒天培地に良好に生育し、分生子を豊富
に形成する。ツァペック寒天培地に中程度に生育し、分
生子を形成する。菌糸は透明で、隔壁を有している。分
生子柄は基底菌糸あるいは気生菌糸から生じ、その表面
は滑面で、幾分不規則に分枝し、著しく束状を呈し、分
生子柄束を形成する。分生子柄束は堅く、単生の分生子
柄は希である。分枝の先端にとっくり型の４〜８本のフ
ィアライド(Ｐhialides)を着生する。フィアライドの表
面は滑面で、５〜７ × １.２〜１.８μmである。その
先端部に単一か２〜４本のメトレ(metula)が群生する。
メトレの大きさは５〜６× ２〜３μmでその先端にフィ
アロ型の分生子を形成する。分生子は楕円形、その表面
は平滑、大きさは１〜２ × ２〜３μmで長い連鎖を形
成する。また、調べた寒天培地上では菌核の形成は認め
られなかった。

【００１２】b)寒天培地上の性状 ｉ)麦芽エキス寒天培地 生育は良好であり、２４℃に保つと２週間後にコロニー
の直径は３０mmとなる。表面は、盛り上がった綿状の菌
糸体が束状となり、明瞭な分生子柄束がコロニー全体に
多数形成され、高さ６〜８mmとなる。外縁はやや不規則
に縁どられている。気生菌糸の発達、分生子の形成は良
好である。コロニー表面の色調は、はじめ白から明灰
色、１週間後には暗灰緑色となる。集落裏面は黄褐色を
呈する。可溶性色素の生成は認められない。

【００１３】ii)バレイショ・ブドウ糖寒天培地 生育は良好で、２４℃に保つと２週間後にコロニーの直
径は２０mmとなる。表面は、盛り上がった綿状の菌糸体
が束状となり、分生子柄束を形成し、コロニー中央部と
外周部に疎らに立ち上がり、高さ８〜１２mmとなる。外
縁はやや不規則に縁どられている。気生菌糸の発達、分
生子の形成は良好である。コロニー表面の色調は、中央
部から外周部は灰色から明灰色を呈し、分生子形成部は
灰緑色から暗緑色を呈する。集落裏面中央部は暗黄褐
色、中間部および外周部は黄褐色を呈する。可溶性色素
の生成は認められない。

【００１４】iii)ツァペック寒天培地 生育は中程度で、２４℃に保つと２週間後にコロニーの
直径は２１mmとなる。表面は羊毛状の菌糸体よりなり、
中央部と外周部は隆起し、中央部から放射状にしわが見
られる。外縁はやや不規則に縁どられている。分生子柄
束は２週間後から形成し始める。気生菌糸の発達、分生
子の形成は中程度である。コロニー表面の色調は、はじ
め白から明灰色、その後灰緑色から暗灰緑色となる。集
落裏面は淡黄緑色から古くなると褐色となる。可溶性色
素の生成は認められない。

【００１５】c)生理学的性状 本菌株の生育条件をバレイショ・ブドウ糖寒天培地で調
べる。pＨ３〜pＨ１０のいずれにおいても生育は良好で
ある。生育温度範囲は５℃〜３１℃、至適温度は２３℃
〜２７℃である。３５℃では生育しない。

【００１６】以上の諸性質を、ディー・マロチ(Ｄ．Ｍa
lloch)著、宇田川俊一訳「かびの分離・培養と同定」(昭
和５８年、医歯薬出版株式会社)５１頁記載の同定検索
表と照合すると、本菌株ＦＬ−２７３３７はペニシリウ
ム(Ｐenicillium)属に属することが明らかである。さら
に、宇田川俊一、椿啓介ら著「菌類図鑑(下)」(１９７８
年、講談社サイエンティフィク)を参照すると、本菌株
はペニシリウム・クラビフォルメ(Ｐenicillium clavi
forme)の記載とよく性質が一致することから、ペニシリ
ウム・クラビフォルメ(Ｐenicillium claviforme)ＦＬ
−２７３３７株と同定した。

【００１７】本菌株は、平成３年１２月２７日に財団法
人発酵研究所(ＩＦＯ)に受託番号ＩＦＯ ３２４３６と
して、また平成４年３月１１日に通商産業省工業技術研
究所(ＦＲＩ)に、ブタペスト条約の下、受託番号 ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３７９３としてそれぞれ寄託されている。

【００１８】ＴＡＮ−１６５２生産菌株は以下の性質を
示す。 a)形態的特徴 本菌株ＦＬ−２５７９８はオートミール寒天培地で良好
に生育し、分生子を豊富に形成する。菌糸は無色で隔壁
を有し、１〜２μmの直径の太さでその表面は滑らかで
ある。分生子柄は基底菌糸あるいは気生菌糸から生じ、
分枝を繰り返し、各分枝から数本の分枝を生じる。最後
の分枝の先端に数本のフィアライド(Ｐhialides)を着生
する。分生子柄は無色で隔壁が有り、その表面は滑面で
ある。また、多数の分生子柄が集合し、暗縁色の乾燥し
た円柱状の分生子塊を形成する。おおよそ縦１３０〜１
５０μm、横１４０〜１６０μmの大きさであるが、大き
さも形も一定しない。フィアライドは３〜６本が輪生
し、円筒形で先端は幾分細くなりフィアロ型の分生子を
着生する。フィアライドの表面は滑らかで、大きさは１
〜３ × ５〜７μmである。分生子は１０〜１４の長い
連鎖を形成するが、円筒形で単一細胞であり、その表面
は滑面で、大きさは１.３〜１.５ × ６.０〜６.５μm
である。

【００１９】b)寒天培地上の性状 ｉ)麦芽エキス寒天培地 生育は良好で、２４℃に保つと１４日後にコロニーの直
径は４５mmとなる。表面は平坦で、中央部が幾分盛り上
がった菌糸体からなり、中心から放射状にしわが見られ
る。外縁は規則正しく縁取られている。気生菌糸の発達
は中程度で、中央部から中間部にかけてビロード状の気
生菌糸が同心円状に広がる。中央部は黄白色、中間部は
白色ないし淡黄白色、外周部は白色を呈する。中央部か
ら中間部は疎らに、外周部は同心円状に暗縁色で円柱状
の分生子塊が形成される。裏面の色調は中央部から中間
部にかけて黄白色、外周部は象牙色を呈する。可溶性の
色素は認められない。

【００２０】ii)バレイショ・ブドウ糖寒天培地 生育は良好で、２４℃に保つと１４日後にコロニーの直
径は５０mmとなる。表面は平坦で、中央部、周辺部が幾
分盛り上がった菌糸体からなり、外縁は規則正しく縁取
られている。気生菌糸の発達は中程度で、ビロード状の
気生菌糸が同心円状に広がり淡い黄色を帯びた乳白色を
呈する。中央部から外周部にかけて同心円状に暗縁色で
円柱状の分生子塊が形成される。裏面中央部は暗黄褐
色、中間部および外周部は淡黄褐色を呈する。可溶性の
色素は認められない。

【００２１】iii)ツァペック寒天培地 生育は中程度で、２４℃に保つと１４日後にコロニーの
直径は３０mmとなる。表面は平坦で、中央部が幾分盛り
上がった菌糸体からなり、しわが見られる。外縁はやや
不規則に縁取られている。気生菌糸の発達は悪く、短い
羊毛状の気生菌糸が全体に広がり白色を呈する。菌糸の
密な中央部に暗縁色で円柱状の分生子塊が認められる。
裏面中央部はクリーム色、中間部から外周部にかけて白
色を呈する。可溶性の色素は認められない。

【００２２】iv)オートミ−ル寒天培地 生育は良好で、２４℃に保つと１４日後にコロニーの直
径は５０mmとなる。表面は平坦で、中央部が盛り上がっ
た菌糸体からなり、外縁はやや規則正しく縁取られてい
る。全体が淡黄白色を呈し、中央部に羊毛状の気生菌糸
が認められ灰白色を呈する。コロニー全体に暗縁色で円
柱状の分生子塊が認められる。特に、中央部に大きな分
生子塊が多数見られる。裏面全体の色調は、淡黄褐色か
ら黄褐色を呈する。可溶性の色素は認められない。

【００２３】c)生理学的性状 本菌株の生育条件をバレイショ・ブドウ糖寒天培地で調
べる。pＨ３〜pＨ１２のいずれにおいても生育は良好で
ある。生育温度範囲は１０℃〜３２℃、至適温度は１５
℃〜２５℃である。３５℃では生育しない。

【００２４】以上の諸性質を基に、宇田川俊一・椿啓介
ら著「菌類図鑑(下)」(１９７８年、講談社サイエンティ
フィク)およびジョウジ・エル・バロン(Ｇeorge Ｌ Ｂa
rron,Ｐh.Ｄ.)著「ザ・ジェネラ・オブ・ヒポミセテス・
フロム・ソイル(Ｔhe Ｇenera of Ｈyphomycetes from
Ｓoil)」[１９６８年、２２２〜２２５頁、ロベルテ・
クリーゲルプブリシング(Ｒoberte Ｋriegerpublising)
社]およびケー・エッチ・ドムシュ、ダブリュ・ガムス
とトラウト−ヘイデ・アンダーソン(Ｋ.Ｈ.Ｄomsch,Ｗ.
Ｇams and Ｔraute-Ｈeide Ａnderson)著「コンペンディ
ウム・オブ・ソイル・ファンジャイ(Ｃompendium of Ｓ
oil Ｆungi)[１９８０年、１巻、４１３〜４１５頁、ア
カデミック プレス(Ａcademic Ｐress)社出版]を参照す
ると、本菌株は、分生子が一細胞で、集合して暗縁色の
分生子塊を形成するなどの性質から、ミロセシウム(Ｍy
rothecium)属に近似であると考えられる。しかし、分生
子は乾燥型で円柱状に連鎖する分生子座を形成すること
から、ミロセシウム属とは異なり、メタルリジウム(Ｍe
tarrhizium)属に属すると判断された。従って、本菌株
をメタルリジウム・スピーシーズ(Ｍetarrhizium sp．)
ＦＬ−２５７９８と同定した。

【００２５】本菌株は、平成３年１２月２７日に財団法
人発酵研究所(ＩＦＯ)に受託番号ＩＦＯ ３２４３５と
して、また平成４年３月１１日に通商産業省工業技術研
究所(ＦＲＩ)に、ブタペスト条約の下、受託番号 ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−３７９２としてそれぞれ寄託されている。

【００２６】本発明の一般式[I]で表される化合物は、
これらの菌株に限らず、遺伝子操作技術を含め、自体公
知の方法により、それらから誘導される一般式[I]で表
される化合物の生産能を有する変異株をはじめ、当該生
産能を有する微生物を培地中で培養し、一般式[I]で表
される化合物を培養中に生成蓄積せしめ、それを採取す
ることにより製造できる。

【００２７】本発明の化合物生産菌の培養に用いる培地
は、該菌が利用し得る栄養源を含むものなら液状でも固
状でもよいが、大量に処理するときには液体培地を用い
るのがより適当である。培地には、当該化合物生産菌が
同化し得る炭素源、窒素源、無機物質、微量栄養源を適
宜配合する。炭素源としては、たとえばブドウ糖、乳
糖、ショ糖、麦芽糖、デキストリン、澱粉、グリセリ
ン、マンニトール、ソルビトール、油脂類(例、大豆
油、ラード油、チキン油など)、n−パラフィンなどが、
窒素源としては、例えば、肉エキス、酵母エキス、乾燥
酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、ペプト
ン、綿実粉、廃糖蜜、尿素、アンモニウム塩類(例、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウムなど)などを用いる。

【００２８】さらに、ナトリウム、カリウム、カルシウ
ム、マグネシウムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜
鉛、コバルト、ニッケルなどの金属塩類、リン酸、ホウ
酸などの塩類や酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類
を適宜用いてもよい。その他、アミノ酸(例、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸、アラニン、リジン、メチオニ
ン、プロリンなど)、ペプチド(例、ジペプチド、トリペ
プチドなど)、ビタミン類(例、Ｂ₁、Ｂ₂、ニコチン酸、
Ｂ₁₂、Ｃなど)、核酸類(例、プリン、ピリミジン、その
誘導体など)等を含有させてもよい。もちろん、培地のp
Ｈを調節する目的で無機または有機の酸またはアルカリ
類、緩衝剤等を加え、あるいは消泡の目的で油脂類、界
面活性剤等の適量を添加して差し支えない。

【００２９】液体培養に際しては、培地のpＨは中性付
近、特にpＨ５.５〜７が好ましい。培養温度は約２０℃
〜３０℃、培養時間は約４８時間〜１６８時間が好まし
い。

【００３０】培養の経過にともなって生産されるＴＡＮ
−１６１２およびＴＡＮ−１６５２の定量は、ラットの
前脳の膜画分を受容体とし、¹²⁵Ｉ−ＢＨＳＰ[ボルトン
・ハンター(Ｂolton and Ｈunter)標識[Ｌys³]サブス
タンスＰ、８１.４ＴＢq／mmol、エム・イー・エヌ・リ
サーチ・プロダクツ(ＭＥＮ Ｒesearch Ｐroducts)、
米国]をラジオ・リガンドとする結合阻害測定を用いる
か、バチルス・ズブチリス(Ｂacillus subtilis) Ｎ
ＩＨＪ ＰＣＩ−２１９株を被検菌とするペイパー・デ
ィスク法によって行う。通常、４〜６日の培養でＴＡＮ
−１６１２およびＴＡＮ−１６５２の生産量は最高に達
する。

【００３１】目的とする化合物ＴＡＮ−１６１２あるい
はＴＡＮ−１６５２を培養物から採取する方法として
は、以下のようなものが挙げられる。一般式[I]で表さ
れる化合物は酸性で脂溶性を示すため、この性質を利用
する一般的手段を採用すればよい。まず、培養液をpＨ
２〜７、好ましくはpＨ２.５〜５に調整後、水と混和し
ない有機溶媒、たとえばクロロホルム、酢酸エチル、メ
チルイソブチルケトンあるいはブタノールなどを加え、
ＴＡＮ−１６１２あるいはＴＡＮ−１６５２を抽出す
る。抽出液を重曹水あるいは炭酸ナトリウム水溶液で転
溶後、転溶液を酸性にして前記の水と混和しない有機溶
媒で再抽出する。また、転溶液を吸着性樹脂、例えば、
アンバーライトＸＡＤ−II(ローム・アンド・ハース社
製、米国)、ダイヤイオンＨＰ−２０(三菱化成社製)ま
たはダイヤイオンＳＰ−２０７(三菱化成社製)などを用
いたクロマトグラフィーに付す方法も有利に用いること
ができる。なお、吸着性樹脂を用いたカラムから目的の
活性物質を溶出するには、水または含水溶媒、たとえば
含水メタノール、含水アセトンなどを用いる。かくして
得られる抽出液あるいは溶出液を減圧下濃縮すると、Ｔ
ＡＮ−１６１２あるいはＴＡＮ−１６５２を含有する粗
物質が得られる。

【００３２】粗物質をさらに精製し、純粋なＴＡＮ−１
６１２あるいはＴＡＮ−１６５２を得るには種々のクロ
マトグラフィー法を有利に用いることができる。例え
ば、通常のカラムクロマトグラフィーを使用する場合、
担体としてはシリカゲル、結晶セルロース、セファデッ
クスＬＨ−２０(ファルマシア社製、スウエーデン)など
を使用することができる。カラムから活性物質を溶出す
るには適当な有機溶媒、例えば、n−ヘキサン、クロロ
ホルム、トルエン、酢酸エチル、ジクロロエタン、アセ
トン、メタノール、酢酸、蟻酸などを単独であるいは混
合して用いることができる。

【００３３】また、分取用高速液体クロマトグラフィー
(ＨＰＬＣ)によってもＴＡＮ−１６１２あるいはＴＡＮ
−１６５２を精製することができる。担体としてはオク
タデシルシラン(ＯＤＳ)系およびシリカゲル系のものを
有利に使用することができる。例えば、ＯＤＳの場合、
メタノールあるいはアセトニトリルと塩類含有水溶液の
混合溶液が有利に用いられる。溶出液を濃縮、あるいは
水溶液の場合は水と混和しない適当な有機溶媒で抽出し
て濃縮し、残渣を粉末化するか、濃縮残渣を適当な結晶
化溶媒、例えば、石油ベンジン、石油エーテル、n−ヘ
キサン、ジエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチ
ル、メタノールあるいはこれらの混合液で溶解し、冷所
で放置すると結晶が得られる。

【００３４】ＴＡＮ−１６１２あるいはＴＡＮ−１６５
２は酸性物質なので、適当な塩基で処理することによっ
てＴＡＮ−１６１２あるいはＴＡＮ−１６５２の塩が得
られる。これらは自体公知の方法によって調製される。
塩の種類としてはたとえば、ナトリウム塩、カリウム
塩、カルシウム塩あるいはアンモニウム塩などがあげら
れる。これらの塩も本発明の範囲内のものである。

【００３５】後記する実施例１および２で得られたＴＡ
Ｎ−１６１２およびＴＡＮ−１６５２の物理化学的性状
を以下に示す。

【００３６】ＴＡＮ−１６１２の物理化学的性質 (１)外観：黄色結晶 (２)融点：２０２−２０６℃ (分解) (３)旋光度：[α]_D ＋２９°(c ０.３４、メタノール、
２３℃) (４)分子量：m／z ４１４(Ｍ⁺)(ＥＩ−マス・スペクト
ルより) (５)元素分析値：(％) 計算値；Ｃ,６０.８７;Ｈ,４.３８ 実測値；Ｃ,６０.７０;Ｈ,４.３３ (６)分子式：Ｃ₂₁Ｈ₁₈Ｏ₉

【００３７】(７)紫外部吸収(ＵＶ)スペクトル：極大値
nm(ε)、メタノール中 ２２８(２７,２００),２７６(４４,４００),３２０(６,
８００),３３６(肩、５,３００),４０７(１１,８００) 紫外部吸収スペクトルを図１に示す。 (８)赤外部吸収(ＩＲ)スペクトル:ＫＢr錠剤中、主な吸
収を示す(波数、cm^-1) ３４２０,１６８０,１６４０,１５８０,１５１０,１４
６０,１４２０,１３９０,１３４０,１３１０,１２００,
１１６０,１０９０,１０４０,１０００,９６０,８７０ 赤外部吸収スペクトルを図２に示す。

【００３８】(９)¹³Ｃ核磁気共鳴(ＮＭＲ)スペクトル:
７５ＭＨz、重クロロホルム中、δppm ２０２.６(Ｑ),１９６.２(Ｑ),１９４.８(Ｑ),１９０.
４(Ｑ),１６７.３(Ｑ),１６４.５(Ｑ),１５９.９(Ｑ),
１４１.２(Ｑ),１３３.１(Ｑ),１１８.４(ＣＨ),１１
０.６(Ｑ),１０７.９(Ｑ),１０６.１(Ｑ),１０１.７(Ｃ
Ｈ),１００.５(ＣＨ),７９.５(Ｑ),７１.８(Ｑ),５５.
６(ＣＨ₃),４０.５(ＣＨ₂),３８.６(ＣＨ₂),２７.９(Ｃ
Ｈ₃) 図３にＮＭＲスペクトルを示す。

【００３９】(１０)呈色反応： 陽性：リンモリブデン酸、濃硫酸、バートン反応 陰性：ニンヒドリン、坂口反応 (１１)高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)： 担体：ＯＤＳ、ＹＭＣ−Ｐack Ａ−３１２ 移動相：５０％ v/v アセトニトリル／０.０１Ｍリン酸
緩衝液(pＨ３) 流速：２ml／min 検出法：ＵＶ吸収、２１４nmおよび２５４nm 溶出時間：８.２min (１２)薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)： 担体：Ｓilica gel ６０Ｆ₂₅₄(Ｅ．Ｍerck ＡＧ.) 展開溶媒：トルエン−酢酸エチル−蟻酸(６０:４０:２) Ｒf値：０.４７ (１３)性質：酸性脂溶性物質

【００４０】ＴＡＮ−１６５２の物理化学的性質 (１)外観：黄色粉末 (２)旋光度：[α]_D −６０°(c ０.４８、メタノール、
２３℃) (３)分子量：m／z ４１５(Ｍ⁺)、(ＥＩ−マス・スペク
トルより) (４)元素分析値：(％) (水分０.５モルとして計算) 計算値：Ｃ,５６.６１;Ｈ,４.２８;Ｎ,３.３０ 実測値：Ｃ,５６.６０;Ｈ,４.１１;Ｎ,３.０６ (５)分子式：Ｃ₂₀Ｈ₁₇ＮＯ₉

【００４１】(６)紫外部吸収(ＵＶ)スペクトル：極大値
nm(ε)、メタノール中 ２２９(２５,０００),２７２(４１,１００),３２０(６,
４００),３３６(肩、５,１００),４０７(１１,４００） 図４に紫外部吸収スペクトルを示す。 （７)赤外部吸収(ＩＲ)スペクトル：ＫＢr錠剤中、主な
吸収を示す(波数、cm^-1) ３３９０,１６４０,１５７０,１４６０,１４３０,１３
９０,１３３０,１３１０,１２１０,１１６０,１０９０,
９９０,９６０,８５０ 図５に赤外部吸収スペクトルを示す。

【００４２】(８)呈色反応： 陽性：リンモリブデン酸、濃硫酸、バートン反応 陰性：ニンヒドリン、坂口反応 (９)高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)： 担体：ＯＤＳ、ＹＭＣ−Ｐack Ａ−３１２ 移動相：５０％ v/v アセトニトリル／０.０１Ｍリン酸
緩衝液(pＨ３) 流速：２ml／min 検出法：ＵＶ吸収、２１４nmおよび２５４nm 溶出時間：４.２min (１０)薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ): 担体：Ｓilica gel ６０Ｆ₂₅₄(Ｅ．Ｍerck ＡＧ.) 展開溶媒：トルエン−酢酸エチル−蟻酸(６０:４０:２) Ｒf値：０.３５ (１１)性質：酸性脂溶性物質

【００４３】本発明の化合物ＴＡＮ−１６１２およびＴ
ＡＮ−１６５２またはこれらの塩は低毒性で、優れた抗
炎症作用を有し、哺乳動物（例、ヒト、ウシ、ウマ、ヤ
ギ、イヌ、家兎、マウス、ラット等）の抗炎症剤、消炎
鎮痛剤として有用である。かかる本発明の抗炎症剤、消
炎鎮痛剤は、常法に従い、一般式[I]で表される化合物
またはそれらの塩を薬理学的に許容される担体と混合す
ることにより得られ、たとえば、点滴剤、注射剤、カプ
セル剤、錠剤、座剤、液剤、懸濁液およびその他の医薬
として適切な剤型で提供される。これらは自体公知の方
法によって製造される。

【００４４】非経口剤、例えば、注射剤を製造する際に
は、該化合物またはそれらの塩に等張化剤(例、グルコ
ース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナト
リウム等)、保存剤(例、ベンジルアルコール、クロロブ
タノール、パラヒドロキシ安息香酸メチル、パラヒドロ
キシ安息香酸、プロピル等)、抗凝固剤(例、デキストラ
ン硫酸、ヘパリン等)および緩衝剤(例、リン酸緩衝液、
酢酸ナトリウム緩衝液等)等を加えてもよい。経口剤と
しては、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、散剤、顆粒剤
等の剤型が好ましく、該化合物またはその塩と共に添加
剤、たとえば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色
剤、矯味剤、安定剤等を含有させてもよい。

【００４５】ＴＡＮ−１６１２、ＴＡＮ−１６５２また
はそれらの塩を、注射剤として非経口的に皮下、静脈内
または筋肉内に投与する場合、その投与量は成人１人に
対し約０.５〜１００mg／kg／日、好ましくは１〜５０m
g／kg／日である。また、経口剤として投与する場合の
投与量は、成人１人に対し約１〜１００mg／kg／日、好
ましくは２〜５０mg／kg／日である。

【００４６】

【実施例】以下に実施例および試験例をあげて本発明を
更に詳しく説明するが、これによって本発明が限定され
るものではない。なお、培地におけるパーセント(％)
は、特に断わりのない限り、重量／容量パーセントを表
示する。 実施例１ 化合物ＴＡＮ−１６１２の製造法 ポテト・デキストローズ・ブロス(ディフコ社製、米国)
２４g、寒天２０gおよび水１リットルからなる斜面培地
上で、２８℃で、７日間培養したペニシリウムクラビフ
ォルメ ＦＬ−２７３３７株を２％ブドウ糖、３％麦芽
糖、１.５％生大豆粉、１.０％コース・スティープ・リ
カー、０.５％ペプトン、０.３％酵母エキス、０.３％
塩化ナトリウムを含む４０mlの種培地(pＨ６.０)に接種
し、２００ml容三角フラスコ中で、２８℃、４８時間回
転振とう機上で培養し、種培養を得た。得られた種培養
液１ml容を２００ml容フラスコ内の４０mlの５.０％ブ
ドウ糖、２.０％生大豆粉、０.５％ペプトン、０.３％
塩化ナトリウム、０.５％炭酸カルシウムを含む醗酵培
地(pＨ７.０)に移植し、２４℃、６日間回転振とう機上
で培養した。

【００４７】得られた培養液(４.６リットル)をpＨ２.
６に調整し、酢酸エチル(４リットル)で抽出した。抽出
液をハイフロスーパーセル(ジョンズ・マンビル社製、
米国)で濾過し、有機溶媒層と水層を分離した。得られ
た有機溶媒層を２％炭酸水素ナトリウム水溶液(３リッ
トル)で転溶し、転溶液をpＨ２.７に調整後、酢酸エチ
ル(２.５リットル)で再抽出した。再抽出液を水(１リッ
トル)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃縮乾
固した。残渣を酢酸エチル−ヘキサンで処理してＴＡＮ
−１６１２の粗粉末(５.５g)を得た。この粗粉末をシリ
カゲル(１５０g)のカラムクロマトグラフィーに付し、
クロロホルム−酢酸(９８:２)で溶出分画した。ＴＬＣ
で単一スポットを与える画分を集め、濃縮乾固してＴＡ
Ｎ−１６１２の黄色粉末(３.０g)を得た。この粉末(３
００mg)をクロロホルム−エーテルで結晶化して、ＴＡ
Ｎ−１６１２の結晶(２４０mg)を得た。

【００４８】ＴＡＮ−１６１２(７９０mg)に炭酸水素ナ
トリウム(３２０mg)を含む水(２０ml)を加えた。得られ
た懸濁液にメタノールを加え溶解後、濃縮し凍結乾燥し
てＴＡＮ−１６１２の二ナトリウム塩(８８５mg)を得
た。その物性は以下のとおりであった。 ＵＶ λmax nm(ε)、水中： ２２７(２２,７００),２７４(５０,６００),４０５(１
３,０００) ＩＲ(ＫＢr,cm^-1)： ３４３０,１６３０,１６００,１５２０,１３５０,１２
００,１１６０,１０５０,８４０,７７０

【００４９】¹³Ｃ ＮＭＲ(７５ＭＨz,Ｄ₂Ｏ)： ２０６.２(Ｑ),１９６.８(Ｑ),１９５.７(Ｑ),１９５.
５(Ｑ),１７７.０(Ｑ),１６６.８(Ｑ),１６４.７(Ｑ),
１４３.１(Ｑ),１３９.６(Ｑ),１１７.７(Ｑ),１１５.
４(Ｑ),１１４.６(Ｑ),１１１.５(Ｑ),１００.７(Ｃ
Ｈ),１００.１(ＣＨ),８４.１(Ｑ),７５.１(Ｑ),５８.
０(ＣＨ₃),４８.７(ＣＨ₂),４１.６(ＣＨ₂),３３.８(Ｃ
Ｈ₃) 元素分析：計算値 Ｃ₂₁Ｈ₁₆Ｏ₉Ｎa₂・２Ｈ₂Ｏとして Ｃ,５１.０２;Ｈ,４.０８;Ｎa,９.３０ 実測値：Ｃ,５０.７８;Ｈ,４.４２;Ｎa,９.２

【００５０】実施例２ 化合物ＴＡＮ−１６５２の製造法 ポテト・デキストローズ・ブロス(ディフコ社製、米国)
２４g、寒天２０gと水１リットルからなる斜面培地上
で、２８℃で７日間培養したメタルリジウム属の一菌株
ＦＬ−２７３３７株を、２％ブドウ糖、３５％麦芽糖、
１.５％生大豆粉、１.０％コーン・スティープ・リカ
ー、０.５％ペプトン、０.３％酵母エキスおよび０.３
％塩化ナトリウムを含む４０mlの種培地(pＨ６.０)に接
種し、２００ml容三角フラスコ中で、２８℃で４８時間
回転振とう機上で培養し、種培養を得た。得られた種培
養液１ml容を２００ml容フラスコ内の４０mlの１.０％
グリセロール、３.０％麦芽糖、２.０％綿実粉(トレー
ダーズ オイル ミール社製、米国)、１.０％コーン・
スティープ・リカー、０.５％乾燥酵母および０.５％炭
酸カルシウムを含む醗酵培地(pＨ６.５)に移植し、２８
℃で６日間回転振とう機上で培養した。

【００５１】得られた培養液(６リットル)をpＨ２.５に
調整し、酢酸エチル(６リットル)で抽出した。抽出液を
ハイフロスーパーセルで濾過し、有機溶媒層と水層に分
離した。得られた有機溶媒層を２％炭酸水素ナトリウム
水溶液(３リットル)で転溶した。転溶液を０.９リット
ルに濃縮後、pＨ７.５に調整し、ダイヤイオンＨＰ−２
０(５０ml)のカラムクロマトグラフィーに付し、水(１
５０ml)、８０％メタノール水(２００ml)、メタノール
(２００ml)で順次溶出した。水(５０ml)、８０％メタノ
ール水(２００ml)、メタノール(１００ml)で溶出される
画分を集め濃縮後、pＨ２.５に調整し、酢酸エチルで抽
出した。抽出液を水洗後、濃縮乾固してＴＡＮ−１６５
２の粗粉末(７００mg)を得た。この粗粉末をシリカゲル
(３０ml)のカラムクロマトグラフィーに付し、クロロホ
ルム−メタノール−蟻酸[９８:２:２(１００ml)、９５:
５:２(１００ml)、９０:１０:２(５０ml)]で順次溶出分
画した。ＴＬＣで単一スポットを与える画分を集め、濃
縮乾固してＴＡＮ−１６５２の黄色粉末(３５０mg)を得
た。

【００５２】ＴＡＮ−１６５２(５０mg)に炭酸水素ナト
リウム(２０mg)を含む水(１０ml)を加えた。得られた懸
濁液にメタノールを加えて溶解後、濃縮し凍結乾燥して
ＴＡＮ−１６５２の二ナトリウム塩(５５mg)を得た。そ
の物性はつぎのとおりであった。 ＵＶ λmax nm(ε)、水中: ２２９(２２,３００),２７１(４１,３００),４０６(１
１,４００) ＩＲ(ＫＢr,cm^-1)： ３４３０,１６３０,１５００,１４１０,１３５０,１１
９０,１１６０¹³ Ｃ ＮＭＲ(７５ＭＨz,Ｄ₂Ｏ)： １９５.９(Ｑ),１９５.６(Ｑ),１９４.３(Ｑ),１７７.
３(Ｑ),１７５.０(Ｑ),１６７.１(Ｑ),１６４.８(Ｑ),
１４３.２(Ｑ),１３９.８(Ｑ),１１５.２(ＣＨ),１１
４.８(Ｑ),１１１.７(Ｑ) １０８.５(Ｑ),１００.５(ＣＨ),１００.１(ＣＨ),８
３.９(Ｑ) ７５.３(Ｑ),５８.１(ＣＨ₃),４８.４(ＣＨ₂),４１.５
(ＣＨ₂) 元素分析：計算値：Ｃ₂₀Ｈ₁₅ＮＯ₉Ｎa₂・２Ｈ₂Ｏとして Ｃ,４８.５０;Ｈ,３.８７;Ｎ,２.８３;Ｎa,９.２８ 実測値：Ｃ,４８.５３;Ｈ,４.０７;Ｎ,２.７９;Ｎa,９.
９

【００５３】次に化合物ＴＡＮ−１６１２およびＴＡＮ
−１６５２の生物活性試験を示す。 試験例１ ラジオ・リガンド レセプター結合阻害活性試験 [方法]アール・キリオン(Ｒ.Ｑirion)およびシー・ピラ
ピル(Ｃ．Ｐilapil)[ニューロペプタイド(Ｎeuropeptid
e) ４、３２５(１９８４)]の方法を改変して用いた。受
容体はウイスター ラット(雄、８週齢、チャールス リ
バー社製)の脳から調製した。ラットを断頭によって犠
牲にし、前脳を取り出し、１匹分当り３０mlの１２０m
Ｍ塩化ナトリウム、５mＭ塩化カリウムを含む１５０mＭ
トリス塩酸緩衝液(pＨ７.４)中でポリトロン・ホモゲナ
イザー[キネマチカ(Ｋinematika)社製、ドイツ]を用い
て破砕し、４０,０００×gで２０分間遠心した。沈渣を
３０mlの３００mＭ塩化カリウムと１０mＭエチレンジア
ミン四酢酸を含む５０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.４)
中に懸濁し、氷冷下に３０分緩やかに攪拌する。懸濁液
を４０,０００×gで２０分間遠心し、沈渣を３０mlの５
０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.４)で洗浄し、受容体標
品として凍結(−８０℃)保存した。

【００５４】この標品を１.５mg／mlの蛋白濃度になる
ように反応緩衝液[５０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.
４)、０.０２％牛血清アルブミン、１mＭフェニールメ
チルスルホニウムフルオリド、２μg／mlキモスタチ
ン、４０μg／mlバシトラシン、３mＭ塩化マンガン]に
懸濁し、１００μl容量を反応に使用した。サンプルお
よび¹²⁵Ｉ−ＢＨＳＰ(０.４６ＫＢq)を加え、０.２mlの
反応緩衝液中で２５℃、３０分反応させた。サブスタン
スＰをその濃度が２×１０^-6Ｍとなるよう添加し、非特
異的結合量を求めた。反応後、セルハーベスター[２９
０ＰＨＤ、ケンブリッジ・テクノロジー・インコーポレ
イション(Ｃambridge Ｔechnology,Ｉnc.)社製、英国]
を用いて、グラスフィルター[ＧＦ／Ｂ、ワットマン(Ｗ
hatman)社製、米国]上に急速濾過して反応を停止し、２
５０μlの０.０２％牛血清アルブミンを含む５０mＭト
リス塩酸緩衝液(pＨ７.４)で３回洗浄し、フィルター上
に残った放射活性をガンマ・カウンターで測定した。フ
ィルターは使用前に０.１％ポリエチレンイミンに一昼
夜浸漬後風乾したものを用いた。 [結果]化合物ＴＡＮ−１６１２およびそのナトリウム塩
は、それぞれ０.３６および０.４０μg／mlで、ＴＡＮ
−１６５２およびそのナトリウム塩は、それぞれ０.２
４および０.３０μg／mlで５０％阻害を示した。

【００５５】試験例２ ラットカラゲニン足蹠浮腫試験 [方法] 雄性Ｊcl:ＳＤ系ラット(６週令、体重１８０−２３０
g、日本クレア)を１群６匹として用いた。右後肢足蹠部
の容積を測定した後ＴＡＮ−１６１２・Ｎa塩を５％ア
ラビアゴム溶液に懸濁し表１の投与量をラットに経口投
与した。なお、非治療対照群には、５％アラビアゴム溶
液を経口投与した。検体投与１時間後に１％カラゲニン
生理食塩水０.０５mlを右後肢足蹠に皮下注射して浮腫
を惹起した。これより３時間後再び右後肢足蹠部の容積
を測定した。検体の効果は、カラゲニン注射前と注射後
３時間後の足容積の差を求め、それにより非治療対照群
に対する抑制率で算出した。 [結果]結果を表１に示す。

【００５６】

【表１】 投与量 個体数 足容積値 阻害度 化合物 mg／kg、p.o. ml±Ｓ.Ｅ. ％ 対照 −− ６ ０.４７０±０.０２８ −− ＴＡＮ− １６１２ ５０ ６ ０.３６３±０.０４６ ２２.８ ・Ｎa塩

【００５７】試験例３ ラットカラゲニン胸膜炎試験 ［方法] 雄性Ｊcl:ＳＤ系ラット(７週令、体重１８０−２３０
g、日本クレア)を１群７−８匹として用いた。０.２５
％カラゲニン生理食塩水０.２mlを胸膜内に投与し、４
時間後放血致死させた。開胸し２mlのリン酸緩衝化生理
食塩水で胸膜内を洗浄して浸出液を回収し、浸出液量お
よびそれに含まれる浸潤細胞数を測定した。無処置ラッ
トにおいて２ml生理食塩液注入後の回収液量は１.８±
０.０４ml(n＝７)であったので各ラットでのリン酸緩衝
化生理食塩水回収液から１.８mlを差し引いた値を浸出
液量とした。浸潤細胞数はコールターカウンター(ＺＭ
型、コールター・エレクトニクス社製)を用いて測定し
た。ＴＡＮ−１６１２・Ｎa塩は５％アラビアゴム溶液
に懸濁し表２に示す投与量をカラゲニン投与１時間前に
経口投与した。 [結果]結果を表２に示す。

【００５８】

【表２】 投与量 個体 浸出液量(ml／rat) 浸潤細胞数 化合物 数 (×１０⁶／rat) mg／kg、p.o. mean±Ｓ.Ｅ.(％阻害) mean±Ｓ.Ｅ.(％阻害) ５％アラビ アゴム液 −− ８ １.１５±０.０５ １０２±９ ＴＡＮ− １６１２ ５０ ７ ０.７６±０.０９(３４)＊ ６９±７(３２)＊＊ ・Ｎa塩 ＊p＜０.０５、＊＊p＜０.０１

【００５９】表１および２から明らかなように、ＴＡＮ
−１６１２・Ｎa塩はインビボ(in vivo)抗炎症試験にお
いて有効性を示した。ＴＡＮ−１６１２およびＴＡＮ−
１６５２ナトリウム塩について、マウスを用い、静脈内
投与して急性毒性を調べたところ１００mg／kgまで死亡
するものは認められなかった。

【００６０】本発明のＴＡＮ−１６１２およびＴＡＮ−
１６５２化合物またはその塩は抗炎症作用を有し、毒性
も低く、医薬品として有用な化合物である。

【００６１】

【発明の効果】本発明によれば、サブスタンスＰの受容
体拮抗活性を有する、抗炎症剤や消炎鎮痛剤として有用
な新規化合物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＴＡＮ−１６１２の紫外線吸収(ＵＶ)スペク
トルを示す。

【図２】 ＴＡＮ−１６１２の赤外部吸収(ＩＲ)スペク
トルを示す。

【図３】 ＴＡＮ−１６１２の¹³Ｃ核磁気共鳴(ＮＭＲ)
スペクトルを示す。

【図４】 ＴＡＮ−１６５２の紫外線吸収(ＵＶ)スペク
トルを示す。

【図５】 ＴＡＮ−１６５２の赤外部吸収(ＩＲ)スペク
トルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 15/00 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 15/00 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 [式中、Ｒはメチル基またはアミノ基を示す]で表される
   化合物またはその塩。
2. 【請求項２】 ペニシリウム属に属し、請求項１記載の
   式中Ｒがメチル基である化合物を生産する能力を有する
   微生物を培地中に培養し、培養物中に該化合物を生成蓄
   積せしめ、これを採取することを特徴とする該化合物ま
   たはその塩の製造法。
3. 【請求項３】 メタルリジウム属に属し、請求項１記載
   の式中Ｒがアミノ基である化合物を生産する能力を有す
   る微生物を培地中に培養し、培養物中に該化合物を生成
   蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該化合物
   またはその塩の製造法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の化合物またはその塩を含
   有してなる抗炎症剤。