JPH0646697A - 外部から誘導し得るプロモーター配列を用いた小胞子形成の制御 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】小胞子形成の制御を遺伝子操作により行うこと
により、雄性不稔を得る方法。この方法においては、小
胞子形成に関する遺伝子に、外部から誘導し得るプロモ
ーターを接続し、植物に形質導入する。この制御可能な
遺伝子を、通常は「オフ」の状態にしておき、この植物
を雄性不稔にして雑種交雑の際に雌の個体として用い
る。雄性不稔の個体を増やしたいときにのみ、化学物質
によるプロモーターの誘導を行い、その植物を雄性稔性
にする。 【効果】この制御系を用いることで、植物の自家受粉が
人為的に回避され得、雑種植物の育種が、確実かつ安全
に行える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、雑種の種子の製造に小
胞子形成遺伝子および誘導し得るプロモーターを用いる
ことに関する。

【０００２】

【従来の技術】植物の育種の目的は、親の系統の様々な
所望の特性を、１つの品種／雑種に併合させることであ
る。農作物にとって、これらの特性は、病気および昆虫
への抵抗性、暑さおよび乾燥への耐性、作物が成長する
までの時間短縮、より多い収穫、およびよりよい作物学
的な性質を含み得る。多くの作物を機械的に収穫するに
当たり、例えば、発芽および植生の定着、成長程度、成
熟度、および果実の大きさなどの植物の性質が均質であ
ることが重要である。

【０００３】農作物は、植物の受粉方法の利点を活用す
る技術によって育種される。ある花の花粉が、同じ花あ
るいは同じ個体上の別の花に運ばれた場合、その植物は
自家受粉する。花粉が別の個体の花からくる場合、その
植物は他家受粉する。

【０００４】自家受粉し、何世代にもわたって型が選抜
された植物は、ほとんどすべての遺伝子座がホモ接合体
になり、純種の子孫の均質な個体群をつくる。二つのホ
モ接合体の系の交雑により、多くの遺伝子座がヘテロ接
合体であり得る雑種の、均質な個体群ができる。それぞ
れが多くの遺伝子座においてヘテロ接合体である２つの
植物の交雑により、遺伝的に異なり、そして均質ではな
い雑種植物の個体群ができる。

【０００５】トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．）
は、自家受粉と他家受粉のどちらによってでも育種し得
る。トウモロコシは、同じ個体上に、雄穂に位置する雄
花および雌穂に位置する雌花を有する。トウモロコシの
自然受粉は、雄穂上の花粉が、風によって成長初期の雌
穂の上に突出している絹糸に運ばれたときになされる。

【０００６】トウモロコシの雑種の育成には、ホモ接合
体の近交系の育成、これらの系を交雑すること、および
交雑の検定が必要である。個体群から近交系を育成する
のに用いられる育種方法のうちの２つは、系統育種およ
び循環選択である。育種プログラムは、２つあるいはそ
れ以上の近交系から、あるいは様々な広範囲にわたる原
型からの所望の特性を育種プール（ｂｒｅｅｄｉｎｇ
ｐｏｏｌｓ）に組み入れるもので、このプールのなかか
ら、自家受粉および所望の表現型を選抜することによっ
て、新しい近交系が育種される。この新しい近交系と他
の近交系とを交雑し、これらの交雑の雑種は、商業上利
用し得る物がどれであるかを決定するために検定に供さ
れる。

【０００７】系統育種は、２つの遺伝子型の交雑に始ま
る。この２つはそれぞれ、もう一方にない、あるいはも
う一方を補う１つあるいはそれ以上の所望の性質をもち
得る。２つのもとの親が、所望の性質をすべて提供する
わけではない場合、その育種個体群の中に他の起源の物
を有し得る。系統法では、優良植物は、自家受粉され、
継続世代の中で選抜される。次世代では、自家受粉と選
抜の結果から、ヘテロ接合体の状態は、ホモ接合体の系
へと変わる。代表的には、育種の系統法では、５世代あ
るいはそれ以上の世代にわたる自家受粉および選抜が行
われる。Ｆ₁→Ｆ₂；Ｆ₂→Ｆ₃；Ｆ₃→Ｆ₄；Ｆ₄→Ｆ₅な
ど。

【０００８】雑種トウモロコシの品種は、それぞれ、も
う一方にない、あるいはもう一方を補う１つあるいはそ
れ以上の所望の性質を有し得る２つの近交系の交雑物で
ある。雑種子孫の第１世代は、Ｆ₁と呼ばれる。雑種の
育成においてはＦ₁雑種のみが追求される。Ｆ₁は、その
近交系の親よりよく育つ。この生長力あるいは雑種強勢
は、植物の成長力の増加および収穫量の増加を含む多く
の点から証明され得る。

【０００９】雑種トウモロコシの品種の育成は、３つの
工程を包含する： （１）様々な生殖質プール（ｇｅｒ
ｍｐｌａｓｍ ｐｏｏｌｓ）から優良個体を選抜する；
（２）優良個体の自家受粉を数世代にわたって行い、互
いには異なっていて、そしてそれぞれは純種であり高度
に均質性がある近交系の群をつくる； および（３）選
抜された近交系と関連のない近交系とを交雑し、雑種の
子孫（Ｆ₁）を生成する。近親交雑のプロセスにおいて
系の生長力は減少する。２つの関連のない近交系を交雑
し、雑種子孫（Ｆ₁）をつくると生長力は回復する。近
交系のホモ接合性と均質性の重要な意義は、任意の２つ
の近交系間の雑種は、常に同じであるということであ
る。ひとたび最良の雑種が同定されれば、その雑種の種
子は、近交系の親が保持される限り、いつまでも再生し
得る。

【００１０】１回の交雑の雑種は、２つの近交系の交雑
の際に生成され、Ｆ₁子孫ができる。２回交雑の雑種
は、４つの近交系の対の交雑（Ａ×ＢとＣ×Ｄ）を行
い、次に２つのＦ₁を再び交雑させる（（Ａ×Ｂ）×
（Ｃ×Ｄ））ことによって生成される。Ｆ₁のもつ雑種
の生長力の多くが、次の世代（Ｆ₂）では失われる。そ
の結果、雑種の品種から取れる種子は、種蒔の株として
は使えない。同じく、雑種の種子をつくる際、自家受粉
および自家受粉による産物をさけ、そして近交系の種子
を消費者に売るのを避けることが重要である。

【００１１】雑種トウモロコシの種子は、手作業によっ
て雄穂を除去することによって製造され得る。トウモロ
コシの２つの近交系の品種を交互に畑に植え、花粉をつ
くる雄穂をそのうちの１つの近郊系から取り除く
（雌）。外来のトウモロコシの花粉の型から十分に隔離
しているので、雄穂除去処理した近交系の雌穂は、もう
一方の近交系（雄）の花粉でしか受粉されない。生じた
種子は、従って雑種であり、雑種の個体を形成する。残
念なことに、手作業の雄穂除去のプロセスは、完全に信
用できるものではない。時々、雌の個体が風で倒れたた
めに雄穂除去を免れたり、雄穂除去する者が、完全に個
体の雄穂を除去しない場合がある。どちらの場合におい
ても、雌の個体は、花粉を散らすことに成功し、雌の個
体のいくらかは、自家受粉する。この結果、普通につく
られた雑種種子と一緒に、雌の近交系の種子が収穫され
ることになる。

【００１２】代わりに、雌の近郊系の雄穂除去を機械的
になし得る。機械による雄穂除去は、手作業とほぼ同程
度に信頼し得るが、より早く、より経済的である。しか
し、ほとんどの雄穂除去機は、その植物に、手作業の時
より、大きな損傷を与える。従って、現在のところ、ど
の雄穂除去法も満足の行くものではなく、雑種種子製造
の際、更に生産コストを減じ、自家受粉をなくするよう
な代替法の必要性がある。

【００１３】面倒な雄穂除去のプロセスは、細胞質雄性
不稔（ＣＭＳ）近郊系を用いて避け得る。ＣＭＳ近郊系
の植物は、核ではなく、細胞質ゲノムによる細胞質因子
によって、雄性不稔になったものである。雌のみが、受
精させた種子に細胞質を提供するため、この性質は、も
っぱら雌の親を通じてのみ継承される。ＣＭＳの植物
は、別の、雄性不稔ではない近郊系からの花粉を受粉さ
せる。第２の近郊系からの花粉は、雑種の個体を雄性不
稔にする遺伝子に寄与し得る場合と寄与しえない場合と
がある。一般的に、同じ雑種の雄穂除去をした正常なト
ウモロコシからの種子と、ＣＭＳのつくった種子を混合
し、雑種植物が成長したとき、受粉に十分な量の花粉が
取れるのを確実にする。ＣＭＳには別の欠点がある。そ
の欠点の１つは、歴史的に観察されていることで、ＣＭ
Ｓの特定の変異体が、作物のある病気に対し、感受性が
あるということである。この問題により、雑種のトウモ
ロコシを生産するにあたって、このＣＭＳ変異体の使用
を事実上放棄せざるをえない。さらにＣＭＳは、時々、
作物学的性質、特に茎の質、早期実生の生長力、および
収穫において、好ましくない性質を有する。最後にＣＭ
Ｓは、時々、ある環境下で、不稔性の崩壊をみることが
あり、これによってＣＭＳ系は、雑種種子の製造のため
に信頼しえなくなる。

【００１４】別の形の不稔である遺伝子の雄性不稔が、
Ｂｒａｒらによる米国特許第４，６５４，４６５号およ
び第４，７２７，２１９号に開示されている。しかしこ
の形の遺伝子雄性不稔は、ゲノム中に離れて位置してい
る多数の変異遺伝子の維持を必要とし、また遺伝子の追
跡およびシステムを都合良く用いるための複雑なマーカ
ーシステムを必要とする。

【００１５】大豆や綿の様に自家受粉する種は、雄性雌
性の器官が、構造上並列に位置している。自然受粉で
は、ある花の雄の生殖器官からの花粉が、同じ花の雌の
生殖器官に受粉する。このことは、トウモロコシのよう
に他家受粉する種とは対照的である。他家受粉する種で
は、ある個体の雄穂からの花粉が、代表的には風による
散布によって、別の個体の絹糸に受粉する。このこと
は、雄と雌の生殖器官が離れているために、容易に起こ
る。雄と雌の生殖器官が近くにあるため、自家受粉する
作物間で雑種を形成することは、困難である。自家受粉
する作物で、雑種の形成が物理的に困難であることに加
え、雑種が持つ雑種強勢の量が、しばしば低すぎて、雑
種の種子を製造するために要した追加の経費を調整でき
ない。雄性不稔の信頼し得る形態によって、改善型雑種
植物の育種およびこれらの種の収穫の増加の機会が与え
られることになる。

【００１６】

【発明の要旨】本発明は、植物の育種および種子製造の
ために、雄性不稔に対してなされている従来のアプロー
チとは異なり、誘導し得るプロモーターを用い、小胞子
形成すなわち花粉の生成に必須であることが知られてい
る遺伝子の発現を調節するものである。従って、本発明
の実施における第１の工程は、小胞子形成が依存してい
る遺伝子の選択である。

【００１７】選択した遺伝子をクローン化し、その本来
のプロモーターを取り除き、その改変型遺伝子を外部か
らの制御に応答する誘導し得るプロモーターをもった発
現配列の中に挿入する。好ましくは、このプロモーター
は、特定の植物毒性のない化学物質を植物に付与したと
きに反応する。

【００１８】形質転換および遺伝子置き換えを用い、そ
の「必須の」遺伝子を、その植物のゲノムから除去し、
そして誘導し得るプロモーターの発現配列の中に組み込
まれた、遺伝子工学的に設計された遺伝子に置き換え
る。本発明は、誘導し得るプロモーターを不稔性ではな
く、稔性の誘導に用いる点で独特である。本発明におい
ては、選択した遺伝子のプロモーター配列を取り除き、
遺伝子が転写されずに、その個体が雄性不稔になるよう
にする。雄性不稔の植物を増加させようとするときは、
その必須の遺伝子の発現を誘導することで、雄性稔性が
回復する。好ましい実施態様において、このことは、成
長している雄性不稔の植物を、植物に無毒な特定の化学
物質で、処理することによってなされる。

【００１９】「必須の遺伝子」が「オフ」の状態で、発
現に化学物質が必要であるような方法、あるいは必須の
遺伝子が「オン」の状態で、不稔性を授与するために化
学物質による処理が必要であるような方法によって、不
稔性の授与が行われ得ることが判る。後者の方法は、Ｍ
ａｒｉａｎｉらのＰＣＴ公開ＷＯ８９／１０３９６に述
べられている（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ８９／００４
９５に基づく）。

【００２０】誘導し得るプロモーターの化学処理による
誘導は、化学処理そのものにおける様々な要因および処
理時の様々な環境状態によって決まる。必須の遺伝子が
通常「オン」であり、化学処理で失活させる場合、処理
の失敗は、雑種の種子を得るのではなく、自家受粉およ
びその生産物および近郊系の販売という結果をまねく。
雑種の種子の販売を定めている種子の法律（Ｓｅｅｄ
ｌａｗｓ）により、雑種の特性に合わない種子の割合
が、非常に低いような種子の高純度性が必要とされてい
る。１つのトウモロコシの個体が、６００万以上の花粉
粒を生成するため、わずかな処理の失敗でも、自家受粉
の割合が高まる結果になる。これらのことから、本発明
は、遺伝子が通常は「オフ」の状態で、対応する特性
は、発現しないような方法で実施され、通常の条件下で
は、自家受粉は、起こり得ないようにする。更に、必須
の遺伝子を通常「オフ」の状態にすることで、大規模な
雑種種子の製造のために、化学処理は必要ではなくな
る。このため、化学物質の使用（および、それに付随す
る費用）は最小限ですみ、処理の失敗の危険も、自家受
粉が所望され、注意深く制御された限られた規模の親種
子の製造の時に存在するのみである。このような場合の
処理の失敗は、花粉の低生産という結果を生み、また花
粉は、通常十分に余裕があるほど多く生産されるので、
本発明中の親種子生産のプロセスは、７０％から８０％
もの処理の失敗が許容され、親種子の収穫には、最低限
の影響しかない。

【００２１】

【発明の構成】雄性不稔遺伝子の同定およびクローニン
グの手順は、他の遺伝子のクローン化のため用いられ、
当業者に知られている方法と同じである。好ましい方法
は、トランスポゾン（転移因子）標識法であり、これ
は、トウモロコシ遺伝子雄性不稔が、劣性遺伝子の変異
によるものであるからである。雄性不稔遺伝子翻訳産物
であるタンパク質の配列の知識が必要なクローニングの
技術は、現時点では使用しえない。なぜならば、雄性不
稔遺伝子の産物は、まだ知られていないからである。

【００２２】転移因子によるトウモロコシ遺伝子の標識
の手順は公知であり、Ｈ．Ｐ．Ｄｏｒｉｎｇの“Ｔａｇ
ｇｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｍａｉｚｅ Ｔｒａ
ｎｓｐｏｓａｂｌｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ． Ａｎ Ｏｖ
ｅｒｖｉｅｗ”． Ｍａｙｄｉｃａ ３４ （１９８
９）： ７３−８８に概説されており、Ｆｅｄｅｒｏｆ
ｆの米国特許第４，７３２，８５６号（“Ｔｒａｎｓｐ
ｏｓａｂｌｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅ
ｓｓ ｆｏｒ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ”）に述べられて
いる。その開示内容は、本明細書にそのまま参考として
援用されている。このことを実施する１つの方法は、活
性転移因子および小胞子形成に関わる優性対立遺伝子を
持つトウモロコシの株と転移因子を持たない通常のトウ
モロコシとを交雑することである。好ましくは、特定の
遺伝子標識効率は、転移因子を目的の遺伝子座の近くに
位置させることで高められ得る。その交雑の子孫を自家
受粉させ、その後、最も有用な変異体をスクリーニング
する。好ましい表現型は、葯を出さず、花粉を生成しな
いものである。最も好ましくは、葯を出さない表現型で
ある。なぜならば、この表現型は、受粉時に先だって、
肉眼観察によって容易にスクリーニングし得るからであ
る。これらの雄性不稔体は、転移因子が本来の位置を抜
け出て、花粉の発達に必須の遺伝子のある座へ転移した
と思われる例を表している。ひとたびこのような位置に
転移因子が転移すると、遺伝子は不活性となる。次にそ
の遺伝子は、劣性遺伝子となり、雄性不稔を生じる。こ
れらの変異個体は、転移因子がまだ存在するかを確認す
るために検定株と交雑し得る。

【００２３】所望の転移因子が目的の遺伝子に転移した
事が確認されると、転移因子にハイブリダイズするゲノ
ムクローンが構築される。次にそのクローンの因子に隣
りあった配列を、変異遺伝子、復帰変異遺伝子、および
野生型遺伝子を持つ株のＤＮＡゲノムのサザンハイブリ
ダイゼーションのプローブとして用いる。大きさに違い
があると思われる（転移因子の存在あるいは非存在を反
映する）ｒＤＮＡは、所望の改変した目的の遺伝子を持
っている。

【００２４】実際には、特定の配座が転移因子の標的と
なる頻度は、一般的には１０^-5から１０^-6までの範囲で
ある（Ｄｏｒｉｎｇ、１９８９）。しかし、１００，０
００体のトウモロコシが、１０エーカーに満たない範囲
で容易に成長し得ることに加え、特定の環境下では、因
子によって誘導される変異の頻度は増加し得る。例え
ば、遺伝子標識に用いられ得る特定の転移因子は、因子
によって標識される遺伝子とつながれ得る。例えば、Ａ
ｃおよびＳｐｍ／Ｅｎという２つの異なる転移因子シス
テムでは、これらの因子の転移は、選択的に、染色体の
その因子が転移以前に位置していた部位に起こる。異な
る転移因子は変異誘導において異なる頻度を持つ場合も
ある。例えば、ミューテーター（Ｍｕ）と呼ばれる転移
因子は、コントロールの植物より、３０から５０倍の頻
度で新しい変異を誘導し得る。更に、変異誘導の割合
は、因子を持つ親の性別に左右され得る。どの相互交雑
の組み合せが高い変異の確立があるか予測できないが、
転移標識は簡単に行い得る。

【００２５】少なくとも今の時点で、７つの異なるトウ
モロコシ転移因子がクローン化されている。それは、Ａ
ｃ、Ｓｐｍ／Ｅｎ、Ｍｕ、Ｔｚ８６、Ｂｓ１、ｒＤｔ、
およびＭｐｉ１である。このうちのどの因子も転移因子
が存在する遺伝子のクローンに用い得る。

【００２６】当業者にはクローンＤＮＡをトウモロコシ
の中に導入するいくつかの方法が知られている。このな
かには、トウモロコシプロトプラストによるエレクトロ
ポレーション促進化のＤＮＡ取り込み（Ｒｈｏｄｅｓ
ら、“ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
Ｍａｉｚｅ Ｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｔｏｐ
ｌａｓｔｓ”． Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ．２４０
（８ Ａｐｒｉｌ １９８８））、トウモロコシプロト
プラストのポリエチレングリコールによる処理（Ｌｙｚ
ｎｉｋら、“Ｓｔａｂｌｅ Ｃｏ−Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ａｔｉｏｎ ｏｆＭａｉｚｅ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
ｗｉｔｈ Ｇｕｓ Ａ ａｎｄ ＮｅｏＧｅｎｅ
ｓ”． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ １３：１５１−１６１、１９８９）、およびＤＮ
Ａを持つ微小弾丸で、トウモロコシ細胞を砲撃する方法
（（Ｋｌｅｉｎら、“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｉｚｅ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ
Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ”． Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． （１９８９）９１、４４
０−４４４）および（Ｋｌｅｉｎら、“Ｆａｃｔｏｒｓ
Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒ
ｙ ｉｎｔｏ Ｚｅａ Ｍａｙｓ Ｃｅｌｌｓｂｙ Ｈ
ｉｇｈ−Ｖｅｌｏｃｉｔｙ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔ
ｉｌｅｓ”．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．
６，Ｍａｙ １９８８））等が含まれる。それぞれの技
術が短所と長所を併せ持っている。それぞれの技術にお
いて、プラスミド由来のＤＮＡは、遺伝子工学的に、目
的の遺伝子だけでなく、選択用、およびスクリーニング
を可能にするマーカー遺伝子を含有するように設計され
る。選択用マーカー遺伝子は、そのプラスミドの完全な
コピーを有する細胞のみを選択するのに用いる（目的の
遺伝子、並びに選択用およびスクリーニング可能な遺伝
子の構築物は、１単位として導入される）。スクリーニ
ングを可能にする遺伝子は、目的の遺伝子を持つ細胞だ
けを培養するため、別の制限を提供する。通常用いられ
る選択用マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ ＩＩ）である。この遺伝子
は、カナマイシン耐性を伝達し、このカナマイシンは、
細胞を増殖させる培地に直接加え得る。植物細胞は、通
常カナマイシン感受性であり、その結果死んでしまう。
ＮＰＴ ＩＩ遺伝子の存在は、カナマイシンの影響をな
くし、この遺伝子を持ったそれぞれの細胞は、生き残
る。本発明の実施に用い得る別の選択用マーカー遺伝子
は、除草剤のグリフォシネート（Ｂａｓｔａ）に対する
耐性を授与する。スクリーニングを可能にする遺伝子と
してよく用いられるのは、β−グルクロニダーゼ遺伝子
（ＧＵＳ）である。この遺伝子の存在は、組織化学的な
反応で確かめられる。この方法では、形質転換されたと
思われる細胞のサンプルをＧＵＳアッセイ溶液で処理す
る。適当にインキュベーションを行った後、ＧＵＳ遺伝
子を持つ細胞は、青色に変わる。スクリーニングを可能
にする別の遺伝子は、アントシアニン生合成の転写アク
チベーターであり、１９８９年８月１日申請の係属中の
同種出願であるＢｏｗｅｎら、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．第３８
７，７３９号に述べられているとおりである。この遺伝
子は、色素のアントシアニンの合成をおこさせる。この
遺伝子を持つプラスミドで形質転換した細胞は、赤色に
変わる。好ましくは、プラスミドは、選択用マーカー遺
伝子およびスクリーニングを可能にするマーカー遺伝子
の両方を持つ。

【００２７】これらの遺伝子を１個あるいはそれ以上有
するプラスミドを、前述した任意の技術で、トウモロコ
シプロトプラストあるいはカルス細胞に導入する。マー
カー遺伝子が選択用遺伝子である場合、そのＤＮＡパッ
ケージを有する細胞のみが、適当な植物毒性物質による
選択下で生き残る。ひとたび適当な細胞が同定され、増
殖すると、植物は再生される。形質転換した個体の子孫
は、そのＤＮＡパッケージがその植物のゲノムにうまく
取り込まれたかを確かめなければならない。

【００２８】このような変異遺伝子の１つのコレクショ
ンが既に知られており、Ａｌｂｅｒｔｓｅｎらの“Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｏｆ １
３Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｌｅ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｌｏｃ
ｉ ｉｎ Ｍａｉｚｅ”．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．
Ｃｙｔｏｌ．２３： １９５−２０８、１９８１）に述
べられている。これらは、雄性不稔（ｍｓ）遺伝子とし
て知られている。この遺伝子は、花粉の発達にのみ影響
を与え、雌の器官の発達には影響はない。この遺伝子は
また、花粉の発達の特性段階（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ
ｔｉｃ ｓｔａｇｅｓ）において小胞子形成を破壊し、
その個体を雄性不稔にする。

【００２９】前述した原型の任意の物から変異遺伝子が
クローン化されると、野生型対立遺伝子をクローン化す
るためにプローブとしてそれを用いる。このことは、変
異した遺伝子が野生型対立遺伝子と非常に類似してお
り、それ自体が野生型対立遺伝子とハイブリダイズでき
るために可能である。ひとたび正常な遺伝子が同定さ
れ、クローン化されると、プロモーター領域として知ら
れている遺伝子領域が同定される。この領域は、その遺
伝子の転写開始に関係している。

【００３０】花粉の発達に必要な遺伝子を同定すること
もできる。その際、花粉の発達の時にのみ存在するｍＲ
ＮＡを分離し、そして対応する遺伝子のゲノムライブラ
リーのプローブとして用い得るｃＤＮＡを構築すること
によって適量の変異体を用いる必要はない。

【００３１】本発明の実施にあたり、雄性稔性を担う遺
伝子で、クローン化したものからプロモーター領域を取
り除き、代わりに、ある特定の外部からの刺激にのみ反
応するプロモーターを入れる。従って、その遺伝子は、
外部からの刺激に反応する時以外は、転写されない。遺
伝子が転写されない限り、花粉の発達を完了させるのに
必要な遺伝子産物は生産されない。このことによって、
花粉の発達における１つあるいはそれ以上の生化学的／
生理学的な経路が崩壊し、雄性不稔を生じる。その個体
は、選択したプロモーターを活性化するような特定の刺
激によってのみ稔性となる。

【００３２】本発明の実施に用いる反応性のプロモータ
ーシステムの一例は、トウモロコシのグルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）システムである。ＧＳ
Ｔｓは、発芽前除草剤としてよく用いられ得る多くの疎
水性、親電子性化合物に対し解毒作用をし得る酵素のフ
ァミリーである（Ｗｉｅｇａｎｄら、“Ｍｅｓｓｅｎｇ
ｅｒ ＲＮＡ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ Ｇｌｕｔａｔｈ
ｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｒｅｓｐｏｎ
ｓｉｂｌｅ ｆｏｒ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ｔｏｌｅｒ
ａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｉｚｅ ｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ
ｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｓａｆｅｎｅｒ Ｔｒ
ｅａｔｍｅｎｔ”． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ７： ２３５−２４３、１９８
６）。ＧＳＴｓでトウモロコシの種子を処理すると、ト
ウモロコシの除草剤に対する耐性が高まることが判って
いる。これまでの研究で、ＧＳＴｓが直接この耐性増加
の原因であることが示されている。この作用は、はじめ
に特定の１．１ｋｂのｍＲＮＡ転写産物を通じて媒介さ
れる。つまり、トウモロコシは、既に存在する自然発生
的な静止遺伝子を有し、この遺伝子は、ＧＳＴｓに反応
し得、遺伝子産物を生産するため誘導され得る。この遺
伝子は、既に同定され、クローン化されている。従っ
て、本発明の実施態様の１つでは、ＧＳＴ反応性遺伝子
からプロモーターを取り出し、あらかじめその本来のプ
ロモーターを取り除いておいた雄性稔性遺伝子につけ
る。この設計された遺伝子は、外部の化学的な刺激に反
応するプロモーターと稔性の花粉の発達が依存している
遺伝子との組み合せである。

【００３３】前述の方法で設計された遺伝子を、公知の
形質転換技術によって、トウモロコシに再導入する。適
当なタイプ、すなわち雄性不稔の個体を選択する。分離
しクローン化した雄性稔性遺伝子が本来のプロモーター
を持たず、従って花粉の発達をなし得るために非常に重
要なその遺伝子産物をつくらないため、これらの個体は
雄性不稔となっている。従って、この設計された遺伝子
は、その遺伝子の劣性変異対立遺伝子となる。普通の植
物バイオテクノロジーでは、形質転換および再生によっ
て所望の遺伝子型が同定された場合、その個体同士を自
家受粉してその遺伝子型を回収する。しかし本発明の実
施においては、その所望の遺伝子型は、雄性稔であるた
め、第１世代で自家受粉できない。子孫を得るために
は、変更されたプロモーターを活性化して遺伝子の転写
を誘導するような化合物を、その個体に散布することで
稔性を誘導しなければならない。ＧＳＴプロモーターの
場合、その化合物は、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジアリル−
２−２−ジクロロアセトアミドのようなＧＳＴ−誘導性
化合物である。雄性稔性遺伝子に付けられたプロモータ
ーはこの化学物質に反応し、遺伝子の転写を開始させ
る。このことがひとたび起こると、その正常な遺伝子の
産物がこの遺伝子から生産され、ある程度の雄性稔性
が、誘導される。次にこの個体からの花粉を本来の選択
された遺伝子型の受粉のために用いる。

【００３４】所望の遺伝子型の最初の分離および増殖が
完了すると、手順はより簡単になる。雑種交雑で雌の親
として用いられた近郊系のみを雄性不稔の品種に形質転
換する。形質転換が行われると、雄性不稔／雌性稔性の
種子が増加する。このことは、隔離した場所（他のトウ
モロコシの花粉が届かないところ）に植えて、プロモー
ターが反応する化学物質を散布することによってなされ
る。散布によって、プロモーターに付いた遺伝子の転写
開始が誘導される。これによってある程度の稔性をつく
る。このシステムを、ＭａｒｉａｎｉらのＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ８９／１０３９６（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ８９／
００４９５に基づく）に開示されているような不稔性を
誘導する方法と比べたときに、特に注目すべき長所は、
処理が１００％効果的である必要がないことである。な
ぜならば、トウモロコシは一般的に、すべての絹糸が受
粉するのに実際に必要な量よりはるかに多くの花粉をつ
くるからである。従って、稔性の回復の割合が低くて
も、十分に許容量の種子を収穫する程の効果はある。同
時に、本発明の植物は通常雄性不稔で、稔性になるため
には処理が必要なことから、雑種の種子で、自家受粉は
おこらない。不稔性を誘導するようなシステムの中で
は、雑種の種子をつくるときに自家受粉を避けるため、
不稔性の誘導は１００％の効果がなくてはならない。

【００３５】収穫される種子は、ホモ接合体で、不稔で
あり続ける。なぜならば、稔性誘導の化学物質での処理
によって、１世代の親の稔性のみが回復するからであ
る。次にこの種子は雌の親として、雑種生産の畑に用い
られる。その個体は雄性不稔であるから、それらを雄穂
除去する必要はない。このような種子からつくられた雑
種個体の全ては雄性稔性である。なぜならば、生じた子
孫は、雌の親から改変遺伝子を１つおよび雄の親から正
常な遺伝子１つを受け継いでいるからである。正常な花
粉の生産がおこる。

【００３６】小胞子形成、すなわち花粉の生産に必須で
あることが知られている遺伝子の発現を調節するため
に、誘導可能なプロモーターを用いる。該当選択された
遺伝子制御配列は、その遺伝子が通常「オフ」の状態で
あり、その植物が雄性不稔になるように改変する。雄性
不稔の個体を再生したいとき、その個体を必須の遺伝子
の発現を誘導する植物毒性のない化学物質で処理して、
雄性稔性を回復させる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーク シー． アルバートセン アメリカ合衆国 ポーク カウンティ， アイオワ 50021， アンケニー， エヌ ダブリュー 70ティーエイチ 2489 (72)発明者 ラリー アール． ビーチ アメリカ合衆国 ポーク カウンティ， アイオワ 50311， デモイン， マクオ キタ ドライブ 3939 (72)発明者 ジョン ハワード アメリカ合衆国 ポーク カウンティ， アイオワ 50265， ウエスト デモイン, バレイ リッジ サークル 3211 (72)発明者 ゲーリー エー． ハフマン アメリカ合衆国 ポーク カウンティ， アイオワ 50311 デモイン， 41エステ ィー ストリート 1431

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】植物に、外部から制御し得る遺伝性の雄性
   不稔を提供する方法であって、以下のａ、ｂ、ｃ、ｄ、
   およびｅの工程を包含する方法： ａ）該植物の小胞子形成が依存する遺伝子産物をコード
   する遺伝子を選択する工程； ｂ）該選択された遺伝子をクローニングする工程； ｃ）外部の制御に応答する誘導可能なプロモーターを有
   する発現配列に該クローン化した遺伝子をつなぐ工程； ｄ）該クローン化した遺伝子の遺伝子産物をコードする
   遺伝子を、該植物の本来の核ゲノムから取り除く工程；
   および ｅ）該植物の核ゲノムに発現配列を挿入する工程。
2. 【請求項２】外部から制御し得る遺伝性の雄性不稔を有
   する植物を再生産する方法であって、 該雄性不稔が、小胞子形成が依存する遺伝子産物をコー
   ドする遺伝子を、同じ遺伝子産物をコードするが、外部
   の制御に応答する誘導可能なプロモーターを有する発現
   配列に連結された遺伝子に置き換えた結果生じ、 該方法が以下のａ、ｂ、ｃ、およびｄの工程を包含す
   る、方法： ａ）成長する雄性不稔植物を提供するために該植物の種
   子を植える工程； ｂ）該プロモーターを誘導する条件下で該植物を育てる
   ことによって、小胞子形成が依存している遺伝子産物を
   生産する遺伝子を発現させ、該成長する植物が雄性稔性
   へ変換するのを誘導する工程； ｃ）種子を生産するために、隔離したところで該成長す
   る植物を自然受粉させる工程； および ｄ）種子を収穫する工程。
3. 【請求項３】雑種種子を製造する方法であって、以下の
   ａ、ｂ、ｃ、およびｄの工程を包含する方法： ａ）選択した雄性稔性の雄の親の系からの第１種子と、
   選択した雄性不稔の雌の親の系からの第２種子とを他家
   受粉できるように並列に植える工程、ここで該雄性不稔
   は、小胞子形成が依存している遺伝子産物をコードする
   遺伝子を、同じ遺伝子産物をコードし、外部の制御に応
   答する誘導可能なプロモーターを有する発現配列に連結
   された遺伝子に置き換えた結果生じる； ｂ）該遺伝子の発現を誘導しない条件下で、該種子を成
   熟植物に成長させる工程； ｃ）雄性不稔の植物体を雄性稔性の植物体からの花粉で
   他家受粉させる工程；および ｄ）該雄性不稔の雌の植物体から雑種の種子を収穫する
   工程。