JPH06500465A - 有機巨大分子またはバイオポリマーを重合体質の膜に固定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有機巨大分子またはパイオポリマーを重合体質の膜に固定する方法 産業上の利用分野 本発明は、有機巨大分子またはパイオポリマーを重合体質の膜または重合体質の フィルムに固定する方法に関するものである．本発明は特に、酵素、抗体、抗原 、ＤＮＡ／ＲＮＡおよび微生物たとえば細菌の細胞の固定方法に関する．この種 の膜はバイオセンサ用のトランスデューサの重要な成分であり、選択的な化学的 性質を有する。また、この種の膜は反射性または透過性の測定等の光学的分析方 法によって分析できる。このような膜を使用する分析方法は、主として医学的診 断や環境調査の際の分析操作のときに利用されている．従来の技術 バイオセンサ、特に電気化学的トランスデューサを使用するバイオセンサにおい て、従来充分に解決できなか９た技術的問題は、インジケータとして使用される 生物学的成分（たとえば抗体、抗原、ＤＮＡ，ＲＮＡ）または触媒として使用さ れる生物学的成分（たとえば酵素）を実際のトランスデエーサに取り付けること である。これらの分子は一般に有機溶剤に敏感である．有機溶剤との接触によっ て、パイオポリマーは少な《とも部分的に変性するであろう．したがって、固定 化操作は非水性溶剤の不存在下に行わなければならない．最も広く利用されてい る技術は、ラジカル反応によってパイオポリマーの側鎖を介して共有結合を形成 させて固定することである，（ｃｏｖａｌｅｎｔ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏ ｎ），この結果として、既に存在する重合体、たとえば側鎖としてアルデヒド蟇 を含む重合体に結合される．別の方法は、その場で重合体（たとえばポリアクリ ルアミドゲル）を生成させることであって、その結果として、その中に前記巨大 分子が物理的に閉し込められる．固定化のためのラジカル反応には一般に生物学 的活性の大なる損失が伴い、その補償のために、高価な当該活性物質を多量使用 しなければならない。

さらに、バイオセンサ用の半導体トランスデューサ（たとえばｒ　Ｓ　Ｆ　ＥＴ ）はそのゲート領域における固定化用ラジカル反応のときにしばしば不安定であ る．その結果として、その破損率が高い．なぜならばラジカル反応剤が薄膜たと えばゲートの絶縁体の薄膜にも反応し、その構造を破壊するからである．現在、 酵素の固定化のために下記の諸方法が利用されている。

１．非水溶性の活性担持物質（その主な例として多ｖｉ類、珪酸塩、伝導性重合 体があげられる）に共存結合で結合させること。

２．ポリアクリルアミドゲル等のマトリノクス中に封入すること．３．表面に唆 着させること。

酵素および他の種々のパイオポリマーの固定化のための公知方法に関する説明は 、たとえば、「ケミカル、アナリシス」第５６巻（Ｐ．　Ｊ．工Ｊレビングおよ びＪ．　Ｄ．　ワインフオードナー編、Ｊ．ウイリ、アンド、サンズ（ニューヨ ーク）発行）に掲載されたＰ，Ｗ，　力一およびＬ．　Ｄ．バウワーズの論文「 インモビライズド、エンザイムズ、イン、アナリチカル、アンド、クリニカル、 ケミストリＪに記載されている． 化学センサまたはバイオセンサの製造のだめの次の２種の固定化方法が文献に記 載されている．その１つは、ボリピロール等の伝導性重合体を用いる酵素の固定 化方法であり（’Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｆａｒａｄａｙ　Ｔｒａｎｓ，１． 」第８２巻（１９８６年）第１２５９頁一第１２６４真に掲載されたＮ．　Ｃ． ファウルズおよびＣ，　Ｒ．　ローウエの論文「エンザイム、エントラノブメン ト、イン、エレクトリカリ、コンダクチング、ポリマーズｊ）、別の１つは、石 炭の懸濁液またはペーストを使用してこれを酵素と混合し、そしてスクリーンブ リンチング等の技術によって表面に付着させることである（欧州特許第０３５１ ８９１号明細書（Ａ２））． 基層にパイオポリマー含脊層を取り付ける方法は、その場合に利用される固定化 技術の種類に応じて適宜選択しなければならない．多《の場合におレ）て、トラ ンスデューサに生物学的成分を取り付けるときと、トランスデエーサの実際の製 造のときとの両者において、同一の技術すなわち同一の方法（たとえばスクリー ンプリンチング）を利用することは不可能である。

代表的なトランスデューサおよびその形状ならびに構造に関する説明は、Ｊ．ｍ ．　Ｊ第６０巻（１９８８年）第６２Ｒ頁一第７４Ｒ頁）、およびＣ．ナイラン ダーの論文「ケミカル、アンド、バイオロジカル、センサズＪ　（’Ｊ．　Ｐｈ ｙｓ．Ｅ：Ｓｃｉ，Ｉｎｓｔｒｕｍ、」第１８巻（１９８５年）第７３６頁一第 ７５０頁）に記載されている． 本発明が解決しようとする課題は、生物学的活性の損失を伴うことなぐバイオポ リマーを重合体賞の膜に固定する方法を開発することである．固体の基層（たと えば紙、セラミック、金属、ガラスまたはプラスチック）に固定されたノマイオ ポリマーを含有する重合体フイルムは、乾燥した状態で貯蔵でき、そして再水和 後に高い生物学的活性を示すであろう．この種の膜がバイオセンサの製造の際に 使用される場合に要求される他の重要な条件は、該膜が測定感度に関し高度の再 現性を示し、かつ、バイオセンサ用のトランスデューサの製造の際に使用される 装置や器具と同じ装置や器具を用いて製造できることである．本発明に従えば、 前記の課題が次の手段によって解決され、すなわち本発明の特徴は、固定すべき 巨大分子またはパイオポリマーを、液状溶剤非含有ノニオン系重合体の分散物と 混合し、その結果得られた混合物を基層にコヒーレン｝（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）フ イルムの形で取り付け、次いで注意深く乾燥操作を行うことである。したがって 、前記分散物（または分散液）の水性液相の部分は有機または無機溶剤を含まな いものであるべきである．前記の用語「注意深く乾燥」番よ、パイオポリマーの 損傷を避けるために充分低い乾燥温度で、かつ乾燥時間を充分短くして乾燥を行 うことを意味する．パイオポリマーの損傷は活性低下の原因となる。一般に、重 合体フイルムを室温において乾燥したときに良い結果が得られる。したがって、 この固定化の目的は大量のパイオポリマー（たとえば酵素）を、高度の活性を保 ちながら膜に固定することである．この点に関して所望される性質は、活性型の 酵素を得るための膜の水分吸収性、酵素の基層の透過性、および或種の成分（た とえば赤血球）を排除する性質である．用語ｒノ二オン系Ｊ！よ、重合体の側鎖 または末端に本来存在する基は別として、アニオン系またはカチオン系の基が存 在しないことを意味する．しかしてこのことは、該重合体がその全体からみて電 荷を存しないことを意味する．イオン性の基を有する重合体の膜を電気化学的測 定操作に使用した場合には、該イオン性の基が操作のひどい混乱の原因となるこ とがあり得る。

直径０．１−１μｍの粒子を６０−９９％（好ましくは９０−９７％）含み、残 部の粒子が１−１０μｍの直径のものである多分散型の重合体分散物が、前記の フィルムまたは膜の製造のために有利に使用できる。大部分の粒子が直径０゜３ −０．　８ｕｍのものであり、残部の粒子の直径が２−５μｍであるという条件 をみたすものが好ましい、このような小粒子はその全体の表面積が大であるから 、このような小粒子はバイオポリマーの吸収のために、あるいはそのマトリック ス中への閉じ込めのために通しており、したがって非常に重要であることが見出 された。これはまた、前記フィルムを実際に製造するときおよび付着させるとき に良い効果を示し、したがってバイオポリマーの固定化の際に良い効果を示す。

一方、比較的大きい直径すなわち直径１−１０μｍ（好ましくは２−５μｍ）の 粒子からなる部分は、フィルム構造の形成のために役立ち、水分吸収能を決定し 、さらにまた、フィルムの平均空隙寸法分布に大なる影響を与え、したがって、 基層の透過性に大なる影響を与え、たとえば固定化酵素に大なる影響を与える。

前記の寸法の差に基づく２種の粒子の存在濃度比を適宜選定することによって、 センサの性能に関連する性質（たとえば基層の透過性、バイオポリマーのための ハイドレートキャビチイ（ｈｙｄｒａｔｅ　ｃａｖｉｔｉｅｓ）、固定化容量等 ）を種々変えることができ、すなわち所望に応じて適宜調節できる。

別の改善方法は、重合体の分散物に内部可塑剤および／または外部可塑剤を添加 することである。たとえばエチレンとの共重合によって前記重合体内に導入でき る内部可塑剤は、フィルムの可とう性を高め、さらにまた、永久接着性の改善に 役立ち、この効果は温度変化があった場合でさえ充分に保たれる。

たとえばフタル酸ジブチル（ＤＢＰ）のごとき外部可塑剤は拡散によって逸失す るおそれがあるけれども、これはサンドウィッチ構造の膜のごとき或特定の構造 の膜に有利に使用でき、たとえば、ＰＶＣ系のマトリックスを含む下側の電位差 測定用の膜に効果を与える（ｉＰＶｃ系のマトリックス自体もＤＢＰで可塑化さ れる）。

内部可塑剤と外部式可デ剤とを組み合わせて使用することによって膜の諸性質が 改善でき、たとえば他の膜との積層性が改善でき、また、膜の性状を変えること ができ、さらにまた、低温時および高温時の膨張性（永久可とう性）が改善でき 、したがって、熱膨張係数の異なる種々の物質の表面（たとえばセラミック、エ ポキシド、紙等の表面）への接着性が改善できる。

表面活性剤はその表面活性化特性のために一般にバイオポリマーに悪影響を与え る。すなわち、表面活性剤はしばしばバイオポリマーを変性させ、バイオポリマ ーの活性を低下させる。

ポリビニルアルコールは酵素との混和性の良好な保護コロイドであって、重合体 の分散物の安定化に役立つものであることが見出された。

乾燥後に、重合体フィルムは基層から剥離でき、或一定の空隙率（表面積基準） を有するコヒーレントな膜が得られる。この方法によって、破断時の伸びの値が 大きく（たとえば約５５０％）、かつ引張強度も大きい（たとえば約４Ｎ／ｍｍ Ｊ膜が製造できる。しかしながら、多くの利用分野では膜は剥離せずに基層に付 着したまま使用される。特に、バイオセンサ用のトランスデユーサの測定電極は 前記の場合の基層に相当し、これは本発明の方法に従って重合体の膜で被覆でき る。バイオセンサ用の適当なトランスデユーサは厚い層または薄い層の形の回路 を用いて製造でき、そしてこれは電界効果トランジスタやその変改物（ＩｓＦＥ Ｔ、ＣｈｅｍＦＥＴ）のごとき半導体デバイスと組み合わせることができる再現 性の良好な基層被覆方法の好ましい一例を示す、予じめ決められた量のバイオポ リマーと重合体分散物との混合物をカートリッジから圧縮空気の作用によって基 層の表面に歳時間を要して供給する。電子部品の製造分野で常用されているＳＭ Ｄディスペンサが、この方法の実施のために使用できる。該ディスペンサの排出 用開口の位置を正確に調節することによって、基層への供給の際の供給点をかな り正確に決めることができる。供給量の再現性の誤差は一般に１％程度にすぎな い、この方法の主な利点は、ディスペンサのチップすなわち先端部の表面積が小 さいために、加工処理の時間が比較的長い場合でさえ水の損失が実質的になく、 バイオポリマーと重合体分散物と混合物の組成が変化しないことである。

また、この方法によれば、バイオポリマーを含むためにかなり価値の高い前記混 合物を用いる加工処理操作が実際に実質的に完全に実施できる。さらにまた、こ の方法は融通のきく方法であって、トランスデユーサに種々の種類の膜が単純な 操作で被覆できる。マルチプルディスペンサ（これはたとえば回転テーブル上に 装着される）を使用した場合には、トランスデユーサの位置決めを行った後に、 単純な操作によってすべての電極点を種々の種類の膜で被覆できる。

前記のバイオポリマーと重合体分散物との混合物に親油性染料を添加することに よって、膜を光線不透過性のものにすることができ、これによって、１を掻の表 面における好ましくない光線の影響を避けることができる。また、金属またはグ ラファイトの添加によって、膜の電気伝導度を高めることができる。たとえばレ ドンクスプロセスで生じた電荷担体を除去しなければならない場合には、電気伝 導度は重要な性質である。

本発明の別の態様について説明する。溶剤を含まない重合体分散物を逐次的に複 数回供合し付着させることによって、相互に堅固に付着した複数の膜からなる積 層物を生成させる。ただし、このうちの少なくとも１つの層には巨大分子またば バイオポリマーを添加しておく。このような積層物の形の膜の製造は、前記のＳ ＭＤディスペンシング技術またはスクリーンブリンチング技術によって最も有利 ニ実施できる。積層物の形の膜層を有するバイオセンサの製造の分野への応用に ついては、後で説明する。

本発明に従って製造されたバイオポリマー含有膜は下記のごとき好ましい性質を 存する。

（ａ）酸膜は永久弾性を有し、すなわち酸膜は機械的応力下においても基層に緊 密に接着した状態で存在する。

（ｂ）乾燥した状態で貯蔵でき、すなわち貯蔵中に酵素活性が低下することはな い。

（ｃ）永久接着性を有し、すなわち酸膜を基層から剥離することは、全く不可能 というわけではないが非常に困難である。

（ｄ）水に不溶であり、すなわち酸膜はアナライトとの接触の際に溶解しない（ 溶解する膜は長期間にわたって使用できない）。

（ｅ）９収性を有し、すなわち固定化されたバイオポリマーの再水和が確実に実 施できる。

（ｆ）多孔性であり、この多孔性は再現性を有し、この孔隙は酵素基質のごとき 小形の分子の通過のために適したものであるが、アナライト中の固体粒子や赤血 球のごとき巨大成分は通過できない。

他の重要な利点は、バイオポリマー含′４ｉｒｌｌ！の製造の際に利用される技 術や装置と同じ技術や装置を用いてトランスデユーサが被覆できることである。

この方法によってバイオセンサの製造操作全体が単純化でき、操作費が安くなり 、いわゆる使い捨て型のセンサすなわち再使用不能センサの製造が可能になる。

本発明の種々の態様について具体的に例示するために、次に寞施例を添付図面の 参照下に示す。

図１および図２は、バイオセンサ中の測定電極にバイオポリマー／重合体分散物 を被覆する操作を図示した図面である。

図３は、グルコースセンサのための２層型の重合体膜積層物を示す図面である図 ４は、厚みの大なるハイブリッドセンサのための基本的な測定フィールドの構成 を示す図面である。

図５は、全反射の原理に基づいて作動するバイオポリマー／重合体層を備えた光 学センサを示す図面である。

膜にバイオポリマーを固定するときに使用される適当な重合体分散物を選択する 際の注意事項を以下の文節に示す。

１、フィルムの調製のときに化学反応特に架橋反応が起こらないようにすべきで ある。なぜならば、もしそうでないと共有結合による酵素の固定化を介して活性 が失われるからである。

２、多分散粒子径特性は、重合体全体にわたる不均質孔隙直径分布の原因となる ことがある。

３、重合体分散物は単量体を含有すべきでない（酵素活性と融和しない）６４、 前記のフィルムまたは膜は非常に良好な再現性を以て製造できる。なぜならば、 観察が必要な操作条件は空気の湿度および温度だけであり、化学反応の条件の調 節または監視は全く不必要であるからである。

５、該重合体は電荷を有しないものであるべきであり、すなわち、前記の膜が電 気化学的センサに使用された場合に相互作用を示しかつ混乱の原因となり得るイ オン性の基を含まないものであるべきである。

６、深冷凍結された状態の場合でも貯蔵可能性を確実に保っている。該フィルム はもろくならず、永久弾性を保っている。

下記の実施例では、溶剤を含まないビナバス（Ｖｉｎｎａｐａｓ）の水性分散液 （ワソカーヘミー社製の’Ｍ５４／２５ＣＪ）を使用した。この分散液は、可塑 剤としてフタル酸ジブチルを含有する外部可塑化によって可塑化されたポリ酢酸 ビニルのホモ重合体の分散液であって、粒子径は０．５−２μｍであった。バイ オポリマー／重合体混合物を製造するために、緩衝液中に存在する酵素をビナバ ス分散液と混合した。この酵素／重合体混合物は貯蔵可能である。

図１に示すように、マイクロディスペンサ（１）を用いて酵素／重合体混合物の 小滴（２）を、パシベーション（ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ）層（３）で被覆され たバイオセンサの測定電極（４）に付着させた。測定電極（４）はセラミック製 の担体（５）上に配置されていた。この種のバイオセンサの詳細な説明は独国公 開特許第３，８２７．３１４号公報に記載されている。測定電極（４）はタッピ ングまたは振動技術により担体上に担持できるが、測定電極（４）を湿潤させた 後にその表面に均質な重合体フィルムを形成させた。これを室温において約５− ２０分間乾燥させ、均質な膜（６）（図２参照）を形成させた。酵素は酸膜の中 に固定された。

また、前記の酵素／重合体分散液混合物をスクリーンプリンチング技術によって 付着させることも可能である。乾燥した重合体の層（６）は水に不溶のフィルム になり、該フィルムは、グルコースのごとき分子を充分通過させて、固定化され た生物学的成分の方への進行を許容するが、赤血球等は通過させない程度の多孔 性を有するものであった。これらの酵素含を膜の乾燥時の貯蔵可能性は非常に良 好である。酵素反応のために好ましい局部的な緩衝系は、前記重合体の側鎖の適 当な選択によって形成できる。乾燥は、酵素がその生物学的融和性を保つことが できる限り比較的高い温度において実施でき、すなわち乾燥時に生物学的活性が 失われない限り比較的高い温度において実施できる。

図３に示すように、電極領域（７）を覆う二重層の形の膜（すなわち、層（８） と層（９）からなる積層物）は、既に乾燥した第１１１ＩＪｉ！（８）の表面に 、第２膜層（９）を被覆することによって形成できる。電極領域（７）もまたセ ラミック製の基層（５）上に配置し、そして接続部材（１０）を介して外部に接 続させる。バイオセンサにおけるこの種の積層膜の形成方法の具体例を以下の文 節に示す。

１、血液から血清を分離するために使用される寸法選択性の保護層を有するグル コースセンサ 比較的大なる多孔性を有する酵素非含有第２膜を、グルコースオキシダーゼ（Ｃ ＯＤ）を含有する膜（８）の上に被覆して積層膜を形成させる。この上部膜（９ ）によって血液から血清が分離され、非特異性作用によるグルコースの誤作用の おそれが最小限に少なくなる。

２、リニアリティ（ｌ　１ｎｅａｒｉｔｙ）の範囲が広いグルコースセンサ酵素 カタラーゼを含有する第２膜（９）を、同様な構成のグルコースセンサ上に積層 させて積層物を形成させる。ＣＯＤ反応のときに発生し電極では反応しないＨｆ ｌ　Ｏ８をカタラーゼ層で反応させＯｌｌを生成させる。これによって、グルコ ースセンサのりニアリテイの範囲を、一層高いグルコース濃度の領域まで拡張で きる。

３、尿素センサ ウレアーゼを含有する膜（９）を通常のアンモニウム選択性ＰＶＣ膜（８）の上 に積層させて積層物を形成させる。これによって、尿素センサが得られる。

すべての場合において、膜層（８）および膜層（９）は互いに明確に区別される が、これらは互いに堅固に接着している（高接着力）、ここに記載された層構造 体は、独国公開特許第３，８２７，３１４号公報に記載のバイオセンサの主構成 成分として使用できるものである。

図４に記載の厚みの大きいハイブリッドセンサの製造の場合には、複数の測定電 極フィールド（４）をセラミνり製の担体（５）上に形成させる。図１に記載の 方法と同様な方法で、測定フィールド（４）を絶縁層（パシベーション層）（３ ）の中に封じ込める。既述のごとく、測定フィールド（測定電極）（４）の上に 酵素／重合体分散物を被覆し、そして、個別的に接続用のラグ（ｌＯ）を取り付 ける。

全く別の種類の測定用器具への利用方法を図５に示す、この配列体は、全反射の 原理に基づいて光学センサとして作動するものである。この場合には、ガラスプ リズム（１２）の下側に酵素／重合体分散物の層（１１）を形成させる。測定面 において活性を示す固定化された酵素は、参照番号（１３）で示されている。

このセンサの原理について述べると、測定面において数回全反射した光線ビーム （１４）の強度は、測定面に隣接する被検媒質中で酵素の反応によって変化し、 そしてこの変化は特徴的な変化である。既に知られているように、この場合の測 定値は、出射光線ビーム（１５）と入射光線ビーム（１４）との強度の比である ＦＩ［３，１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ Ｆｉｏ、５ 国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｑ　１１００　Ｂ 　６８０７−４８ＧＯＩＮ　２１／７７　Ｂ　７９０６−２Ｊ３３１５４７　９ ０１５−２Ｊ ７２３５−２Ｊ Ｉ ＧＯＩＮ　２７／３０　３５３　Ｂ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．有機巨大分子またはバイオポリマー、特に酵素、抗体、抗原、ＤＮＡ／ＲＮ Ａ、微生物を固定する方法において、固定すべき前記巨大分子またはバイオポリ マーを水性の溶剤非含有ノニオン系重合体分散物と混合し、その結果得られた混 合物を基層にコヒーレントフィルムの形で付着させ、次いで該フィルムを注意深 く乾燥することを特徴とする固定方法。
2. ２．直径０．１−１μｍの粒子を６０−９９％好ましくは９０−９７％含有し、 残部の粒子が直径１−１０μｍのものである多分散重合体分散物を使用する請求 の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．大部分の粒子が直径０．３−０．８μｍのものであり、残部の粒子が直径２ −５μｍのものである請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．前記重合体分散物が内部可塑剤および／または外部可塑剤を含有し、そして 好ましくは、該可塑剤が酵素との融和性を有する保護コロイドを含むものである 請求の範囲第１項一第３項に記載の方法。
5. ５．基層として、バイオセンサ用のトランスデューサの測定電極を使用する請求 の範囲第１項一第４項に記載の方法。
6. ６．再現性を以て基層を被覆するために、予め決められた量のバイオポリマーと 重合体分散物との混合物をカートリフジから基層の表面に圧縮空気によって或時 間を要して供給する請求の範囲第１項および第５項に記載の方法。
7. ７．バイオポリマーと重合体との混合物に、親油性の染料を添加する請求の範囲 第１項一第６項に記載の方法。
8. ８．金属またはグラファイトの添加によって、バイオポリマーと重合体との混合 物に伝導性を付与することを包含する請求の範囲第１項一第７項に記載の方法。
9. ９．溶剤非含有重合体分散物を供給する操作を逐次的に複数回行うことによって 、互いによく接着した複数の膜層からなる積層物を形成させ、ただし少なくとも １つの層には巨大分子またはバイオポリマーを添加しておくことを包含する請求 の範囲第１項一第８項に記載の方法。